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Ensaio de ramificao de clulas EpH4

1 Etapa: Preparo dos clusters


1) Cobrir os poos da placa de 24 poos com 250 L de agarose 2%
em PBS.
2) Depois que a agarose gelificar, adicionar 1,5 mL de meio completo
(growth medium) em cada poo e incubar (37C, 5% CO2) por 30
minutos. Descarte o meio.
3) Adicionar 5.104 clulas, suspensas em 500 L de meio completo
contendo 1 KU DNase I (sigma), no topo do gel de agarose e incubar a
37C, com rotao de 100 rpm, overnight.
*Depois deste passo, sero formados clusters arredondados de 150-
200 m em dimetro (cheque ao microscpio).
4) As clulas nicas remanescentes sero removidas por
centrifugao por 30 segundos a 160g (160 RCF). Cheque a
concentrao dos clusters, dever ter 2500-4000 clusters/mL.
* Sempre cortar a ponta da ponteira antes de transferir os clusters,
para evitar a desestruturao dos mesmos.
2 Etapa: Cultura em gel de colgeno 3 mg/mL e 1 mg/mL
* Sempre mantenha as solues de colgeno no gelo.
** Preparo de 3 poos em uma placa de 48 poos.
1) Manter o tubo no gelo. Em um tubo de 50 mL, adicionar 50 L de
DMEM/F12 10x e 50 L de NaOH 0,1 M e misturar.
Para a soluo de colgeno 1 mg/ml, usar: 17 L de
DMEM/F12 10x e 17 L de NaOH 0,1 M
2) Transferir 400 L do colgeno 5 mg/mL (soluo estoque) para o
tubo de 50 mL no gelo. Pipete up and down para garantir que todo o
colgeno seja transferido para a soluo. Est soluo ter 4 mg/mL
de colgeno.
Para a soluo de colgeno 1 mg/ml, usar: 133 L do
colgeno 5 mg/mL. Essa soluo tambm ter 4 mL/mL de
colgeno.
3) Diluir a soluo de 4 mg/mL de colgeno com meio ITS/G para uma
concentrao de 3 mg/mL. Para isto adicionar 166 L de ITP/G.
Para uma soluo de colgeno 1 mg/ml, usar 501 L de
ITP/G.
4) Adicionar 80 L da soluo de colgeno 3 mg/mL por poo da placa
de 48 poos. Espalhar o gel com uma ponteira p200.
Aplicar o mesmo volume para a soluo de colgeno 1
mg/mL.
5) Incubar a placa na estufa (37C, 5% CO 2) por 5 minutos para
gelificar a matriz de colgeno.
6) Centrifugar 300 L do meio contendo os clusters a 160g por 30
segundos e ressuspenda com 300 L da soluo 3 mg/mL de
colgeno. Adicionar a mistura colgeno-clulas nos poos com a
camada de colgeno e retornar a placa estufa.
Usar os mesmos volumes para a soluo de colgeno 1
mg/mL.
7) Esperar 5 minutos para o colgeno gelificar e adicionar 30 L da
soluo de colgeno 3 mg/mL em cada poo. Retornar a placa a
estufa e aguardar 5 minutos.
Usar os mesmos volumes para a soluo de colgeno 1
mg/mL.
8) Adicionar 200 L do meio ITP/G com ou sem 50 nM de EGF.
9) Trocar o meio a cada 2 dias e fotografar. Fotografar e coletar as
estruturas aps 5 dias.

Preparo do meio ITS/G:


Meio DMEM/F12 suplementado com ITS 1x e gentamicina 1x.