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COLORACIN
(INFORME)
INTRODUCCIN
Las bacterias son seres generalmente unicelulares que pertenecen al grupo de los
protistos inferiores. Son clulas de tamao variable cuyo lmite inferior est en las 0,2 y
el superior en las 50; sus dimensiones medias oscilan entre 0,5 y 1. Las bacterias
tienen una estructura menos compleja que la de las clulas de los organismos superiores:
son clulas procariotas. Igualmente son muy diferentes a los virus, que no pueden
desarrollarse ms dentro de las clulas y que slo contienen un cido nucleico.
Para efectuar una observacin del microorganismo, los mtodos de coloracin son
diversos y adems, constituyen un tem ms que posibilita realizar una clasificacin, es
decir, que hay tcnicas que permiten hacer un diagnstico informando cmo reacciona
una clula microbiana a ciertas manipulaciones fsicas y qumicas con los colorantes (ej:
mtodos de Gram-Nicole, cido-alcohol resistencia, etc.). El descubrimiento del
microscopio de contraste de fases y el uso del microscopio electrnico para exmenes de
microorganismos, han dejado de lado muchas de las tcnicas de coloracin. A pesar de
ello, los colorantes y las coloraciones se siguen usando en trabajo de diagnstico y de
investigacin por ser de un manipuleo sencillo y de fcil comprensin e interpretacin. A
continuacin realizaremos un estudio microbitico aplicando algunas tcnicas de
coloracin.
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS ESPECFICOS
Las bacterias, junto con los protozoarios, algas microscpicas, hongos microscpicos
(incluyendo levaduras) y virus, constituyen los llamados microorganismos. El trmino
microorganismo no tiene un significado taxonmico preciso sino que agrupa a todos los
organismos de dimensiones microscpicas (< 0.1 mm) aunque presenten grandes
diferencias entre si. As por ejemplo incluye organismos procariotas (bacterias), eucariotas
(hongos, protozoarios, algas) y virus. Tambin difieren notablemente en el tamao aunque
sean todos microscpicos; en una escala comparativa tenemos:
Bacterias
- elipsoidal o esfrica
- cilndrica o en forma de bastn
- espiral o helicoidal.
Las bacterias esfricas o elipsoidales se denominan COCOS. Muchas bacterias con esta
forma presentan modelos de agrupacin que derivan de los diversos planos de divisin
celular. As tenemos:
Las bacterias vivas, en suspensin acuosa tienen propiedades pticas similares a las del
agua y, por lo tanto, son difciles de observar con el microscopio de campo claro debido a
la falta de contraste con el medio que las rodea.
Aunque las bacterias no difieren en sus propiedades pticas del medio externo, si son
muy diferentes desde el punto de vista qumico; esto es lo que permite distinguir las
bacterias por tincin, pues generalmente el colorante reacciona con la clula bacteriana
pero no lo hace con el medio.
* aumentar el contraste de las clulas con el medio que las rodea. Esto implica mejorar la
visualizacin de las bacterias y permitir la distincin de formas y tamao.
* diferenciar grupos bacterianos por su reaccin frente a determinados colorantes.
* revelar la presencia de distintas estructuras internas.
Colorantes
Son compuestos qumicos que poseen un grupo cromforo que otorga color a la molcula
y un grupo auxocromo que otorga al colorante la capacidad de disociarse
electrolticamente y por lo tanto, formar sales. El grupo auxocromo es el que facilita la
unin del colorante a otras sustancias con carga elctrica.
Colorantes cidos, bsicos y neutros. Los colorantes ms usados son sales, las cuales
estn constituidas por un in cargado positivamente y un in cargado negativamente. Por
ejemplo, azul de metileno es actualmente la sal cloruro azul de metileno.
a) Tincin bsica es aquella en que el color est dado por el ion cargado positivamente.
b) Tincin cida es aquella en que el color est dado por el ion cargado negativamente.
c) Tincin neutra es aquella resultante de mezclas entre soluciones acuosas de ciertos
colorantes cidos y bsicos.
El pH del medio tiene gran influencia en la tincin ya que permite una mayor o menor
disociacin electroltica del grupo auxocromo, permitiendo de esta manera una mayor o
menor afinidad por los grupos qumicos sobre los cuales se une.
Si se aumenta el pH del medio existe una mayor afinidad del colorante por la bacteria,
sucediendo lo contrario si el pH se hace ms cido.
La fijacin de colorantes a la clula bacteriana se facilita con el uso de mordientes, con los
que forman compuestos insolubles (yodo, fenol, cido tnico, oxalato de amonio, etc.).
Tinciones
a) Tinciones simples. Son aquellas en que se utiliza un solo colorante. Las bacterias se
tien en forma homognea de la misma coloracin.
La utilidad de esta tincin es relativa, ya que slo es factible observar forma y agrupacin
celular.
En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes etapas:
extensin, fijacin, tratamiento con colorantes y observacin.
2. FLUJOGRAMAS
2.1 Frotis.
Colocarla en el portaobjetos
Secar al aire
Dejar enfriar
Teir
Enfriar
Teir
Secar al aire
Colorear
Reportar la morfologa y
disposicin de las bacterias
Secar al aire
Secar
Secar al aire
Calentar 10 min.
Enfriar
Secar
Reportar la morfologa y
disposicin de las bacterias
Secar
Calentar 30seg
Enfriar
Secar
Reportar lo observado
cultivo de
Realizar frotis Klebsiella
pneumonie de 36-
48h.
Secar
con colorante de Hiss
o solucin acuosa de 1%
Cubrir portaobjetos de cristal violeta
Solucin acuosa al
Lavar 20% de sulfato de
Cu.
Secar
Reportar lo observado
3. RESULTADOS
Las bacterias se observaron de color azul, en forma de una mezcla de bastones y esferas.
Las bacterias para los dos frotis (cultivo en medio slido y lquido) se observaron de color
rojo-fucsia, tenan forma de esferas en racimos.
Los bacilos cido alcohol resistente se ven rojos o fucsias, los dems se ven azules.
4. ANLISIS DE RESULTADOS
Los microorganismos adquirieron un color rojo lo que indica que son gramnegativos, estos
adquieren esta coloracin debido a que contienen una pared celular estructuralmente muy
diferente a la de los microorganismos Gram positivos, que adquieren un color violeta.
En todas las tinciones ordinarias se sabe que la pared celular no se tie, sino solo el
protoplasma fuertemente reducido por el proceso de fijacin.
Debido a la coloracin roja se puede decir que presentaban clulas vegetativas, adems
debido a su forma clasificamos a la bacteria como Staphilococos. (ver anexo 4)
Los datos importantes que se obtienen como resultado de esta coloracin son:
presencia o ausencia de esporas
deformacin o no del cuerpo celular
posicin dentro del cuerpo celular
En base a la posicin de la espora dentro de la clula se las clasifica en:
5. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
El mecanismo de la tincin de gram aun no se entiende del todo. Se supone que se basa
en una diferencia de permeabilidad entre las paredes celulares de los organismos
grampositivos y gramnegativos: el yodo forma con el cristal violeta un barniz que se une al
protoplasto. Este barniz no es soluble en agua, pero si lo es en alcohol-acetona. En la
decoloracin la pared celular de las bacterias grampositivas no permite la salida del
colorante, mientras que esto es lo que sucede en las gramnegativas. Los grmenes
gramnegativos quedan sin teir despus del lavar con alcohol y se tien de rojo con el
colorante de contraste, fucsina, mientras los grampositivos mantienen el color violeta.
Cualquier tincin precisa una fijacin previa de la preparacin que en la mayoria de los
casos se hace en la llama. Con la fijacin se pretende adherir fuertemente la preparacin
al portaobjetos, matar al germen, conservar las estructuras visibles de la clula y mejorar
su capacidad de tincin.
El lugol es importante debido a que se utiliza como mordiente, para fijar el colorante sobre
el sustrato. Este refuerza la accin de un colorante.
COLORANTES BSICOS
Son sales, que estn en relacin con el componente bsico de su molcula. Su grupo
aminado forma una sal con un cido, el cual es soluble en agua; tie estructuras cidas
(lacas de hematoxilina, fucsina bsica, azul de metileno, verde de metileno). Existen
sustancias tales como las Basofilas, que muestran afinidad por colorantes bsicos
alcalinos.
Son sales que estn con relacin con el componente cido de su molcula; tie
estructuras bsicas, contenidas en el citoplasma celular (eosina, fucsina cida), son
colorantes citoplasmticos. Adems, se dan sustancias tales como las cido filas, las
cuales logran la afinidad por medio de este tipo de colorantes.
RODAMINA-AURAMINA
Los cidos miclicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para
los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que
aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato
de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecfica. Todos los
microorganismos cido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parsitos, se
tien con estos colorantes.
NARANJA DE ACRIDINA
BLANCO DE CALCOFLOR
Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflor aumentando
considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Segn fue descrito por
Hageage y Harrington, este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen
inicial de los materiales clnicos. Tambin se emplea para aumentar la visualizacin de los
elementos morfolgicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratorios ha
suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con
luz blanco-azulada o verde manzana, segn la fuente luminosa que se utilice.
Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en
su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las
condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas
extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.) formndose una espora por cada forma
vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la
espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una
nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. Algunas de las
bacterias productoras de endosporas son patgenas para el hombre, por lo que su
estudio y observacin son de enorme inters.
La preparacin fijada se tie con safranina alcalina, se decolora con cido sulfrico diluido
y finalmente se tie en contraste con azul de metileno. Las brucelas y las rickettsias
tambin se presentan como pequeas estructuras cocoides rojas, en grupos porque se
encuentran localizadas intracelularmente, ante un fondo azul claro.
Esta tincin tiene un valor extraordinario para el diagnstico diferencial, puesto que
permite la deteccin de brucelas en la placenta de una vaca que ha abortado, an
cuando exista una contaminacin masiva con bacterias de la putrefaccin. Es unas de las
pocas tinciones que proporciona un diagnstico puramente microscpico. Un aborto por
brucela puede ser diagnosticado microscpicamente en tanto el investigador aplique las
precauciones necesarias, teniendo en cuenta la eliminacin de Coxiella burnetti.
COLORACIN DE HONGOS
grasas: color rosa o rojo debido al Sudn III (colorante liposoluble). Esto se debe a que el
colorante es ms soluble en los lpidos que en el solvente que lo contiene (alcohol) y
tiende a abandonar la solucin para ser incorporado en el interior de las gotas de lpidos
presentes en la preparacin (proceso de difusin y solubilidad).
glicgeno: aparece de color caoba debido a la presencia del iodo.
Por medio del anterior laboratorio realizado y con la ayuda de la bibliografa citada
podemos concluir los siguientes aspectos:
Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada
con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia
se denomina mordiente; un mordiente habitual es el cido tnco. El mordiente se
combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr
atacar el colorante.
BIBLIOGRAFA
http://coli.usal.es/web/educativo/micro2/tema02.html
http://www.danival.org/notasmicro/tincion/_madre_tincion.html
http://bilbo.edu.uy/~microbio/morfologia.html
http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/general.php?
Mostrar=introduccion
http://www.manant.unt.edu.ar/Departamentos/Ecologia/microbiologia/examen_
coloracion.htm
http://agronomia.uchile.cl/webcursos/microbiologiagral/pagina
%20microbiologia1/word/Guia_Lab_07_(1).doc