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Vacunas

Uso de plantas para la produccin de


vacunas y otros productos inmunobiolgicos
Rodolfo E Bgu, MD
Profesor Asociado de Pediatra, Jefe de Infectologa Peditrica. E-mail: rbegue@lsuhsc.edu
Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans, Louisiana, USA
Childrens Hospital, Infectious Diseases
200 Henry Clay Avenue, New Orleans, LA 70118. PHO: (504) 896-9583

ABREVIATURAS: INTRODUCCION
Ac-m = anticuerpo monoclonal
ADN= cido desoxi-nucleico El desarrollo de vacunas y la implementacin de programas
AgsHB = antgeno de superficie del virus de la hepatitis B de vacunacin en el siglo XX han revolucionado la salud de
AP = Antgeno Protectivo (de ntrax) nuestra sociedad moderna. La Organizacin Mundial de la
ARN= acido desoxi-ribo-nucleico Salud (OMS) estima que vacunacin de la poblacin
ADNc = ADN complementario previene 3.2 millones de muertes al ao, haciendo de sta
CaHu = calicivirus humano una de las acciones de salud ms costo-efectivas. 1
CMV = citomegalovirus Probablemente debido a que la vacuna inicial contra la
CSA = clulas secretoras de anticuerpos viruela fue administrada por va intradrmica, la ruta
ECEP = E. coli enteropatognica parenteral ha sido la norma para la aplicacin de vacunas.
ECET = E. coli enterotoxignica Sin embargo, a pesar de ser ltamente efectiva, esta ruta
ECEH = E. coli enterohemorrgica ha generado problemas. El uso de inyecciones requiere de
i.d. = va intradrmica materiales y entrenamiento que encarece los costos, un
i.g. = via intragstrica problema que tiene mayor repercusin en pases de escasos
i.n. = via intranasal recursos
i.m. = via intramuscular .
i.p. = va intraperitoneal Como los seres humanos se exponen a agentes patgenos
OMS = Organizacin Mundial de la Salud (bacterias, virus, hongos, etc) principalmente a travs de
PC proteina de la cpsida mucosas (respiratoria, gastrointestinal y genital)
PCVN = PC del virus Norwalk recientemente ha crecido el inters en el uso de mucosas
PVAs = partculas virales artificiales para administrar vacunas. Por diferentes razones, la mucosa
PVH = papilomavirus humano intestinal, via administracin oral de la vacuna, es la ms
RE = retculo endoplsmico conveniente. La inmunizacin oral estimula el tejido linfoide
RV = rotavirus intestinal. Las clulas M son clulas especializadas del
s.c. = va subcutanea epitelio intestinal con capacidad de reconocer partculas
TC = toxina colrica extraas - bacterias o virus procesarlas y transportarlas a
TC-B = subunidad B de TC las linfocitos T y B subyacentes, iniciando la respuesta
TL = toxina lbil de E. coli inmune. La principal molcula efectora de la respuesta
TL-B = subunidad B de TL inmune intestinal es la inmunoglobulina A secretoria (sIgA)
TMV = tobacco mosaic virus que acta inactivando el patgeno o sus productos.
VHA = virus de la hepatitis A Lamentablemente es ms difcil inducir una respuesta
VHB = virus de la hepatitis B inmune usando la va enteral que la va parenteral. Una
VHE = virus de la hepatitis E razn es la presencia de barreras naturales en el intestino
VHS = virus herpes simplex (acidez gstrica, proteasas, etc) que inactivan y degradan
VIH = virus de la inmunodeficiencia humana a los patgenos, incluso antes de que lleguen a estar en
VMA = virus mosaico de alberja contacto con la mucosa. Y segundo, el sistema inmune de
VMAl = virus mosaico de alfalfa las mucosas normalmente no responde a los antgenos a
VMCo = virus mosaico de la coliflor menos que stos sean considerados de peligro, lo cual
VMT = virus mosaico del tabaco depende de caractersticas tales como tipo, cantidad,
VN = virus Norwalk tamao, y otros. An as, ha sido posible preparar vacunas
VSR = virus del sincicio respiratorio orales contra polio, rotavirus y Salmonella typhi, as como
una vacuna intranasal contra influenza. Todas estas vacunas
usan cepas vivas atenuadas.

En 1992, la OMS anunci la Iniciativa para la Inmunizacin


de los Nios, 2 un llamado a desarrollar vacunas de bajo

2
costo, que no necesiten refrigeracin, que puedan promotor (por ejemplo para clulas bacterianas y
administrarse oralmente y que incluyan varios antgenos mamferas); algunos promotores son ms activos que otros
en simultaneo. Esta lista de prioridades ha renovado el y expresan mayores cantidades de protena.
inters en vacunas enterales, pero como los inmungenos Inmediatamente despus del promotor viene la zona de
orales son naturalmente ineficaces debe explorarse formas insercin donde se introduce el ADN de la protena de
novedosas de producir y presentar el antgeno, tales como inters (inserto). Esta zona est formada por una serie de
el uso de sistemas de plantas. Tradicionalmente los sitios de insercin, que son secuencias de 6-8 nucletidos
antgenos a usarse como vacunas son extrados reconocibles por endonucleasas de alta especificidad (eg,
directamente de los patgenos cultivados en el laboratorio BamHI, HindIII, XhoI, etc). Las endonucleasas cortan el ADN
o son sintetizados por bacterias u hongos recombinantes. circular del vector en estos sitios especficos abrindolo para
Estos sistemas requieren de mtodos laboriosos y costosos poder colocar el inserto y luego cerrarlo nuevamente con
de produccin, fermentacin y purificacin que acrecientan una enzima denominada ligasa. El plsmido tambin tiene
los costos del producto final. Como las clulas vegetales un gen de resistencia antibitica. Esto permite identificar
comparten procesos biosintticos bsicos con clulas las clulas trasformadas ya que estas crecen en un medio
humanas, tericamente es posible alterar genticamente con antibiticos, mientras que las clulas originales no
plantas para que sinteticen protenas humanas o protenas transformadas son destruidas por el antibitico. Y adems
de patgenos que normalmente infectan humanos. Y, si fuerza a la clula transformada a conservar el vector ya
estas protenas pudieran usarse luego de un procesamiento que favorece su supervivencia. A veces el promotor es
simple, an cuando el costo inicial de manipulacin gentica inducible de modo que se activa y la protena se sintetiza
sea alto, la produccin a larga escala sera barata. An ms, - slo bajo ciertas circunstancias (eg, cambios fsicos o
la clula vegetal puede actuar como un sistema natural de qumicos). Esto permite controlar la cantidad y el momento
bio-encapsulamiento: las capas de pared celular, membrana en que se expresa la protena, lo cual puede ser importante
celular y membrana interna encapsulan y protegen al especialmente si la protena es txica.
antgeno de la barrera gstrica y favorecen la activacin
del sistema inmune intestinal. Una forma especial de transformacin, peculiar en plantas,
es el uso de Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium son
CONCEPTOS BASICOS DE bacterias de plantas que contienen el plsmido Ti. Una
seccin de ste plsmido es denominada T-ADN que tiene
INGENIERIA GENTICA Y la habilidad de introducirse en el genoma de la planta. T-
EXPERIMENTACION EN VACUNAS ADN ha sido manipulado para poderse usar como un vector.
Transformacin es el proceso de insercin artificial de ADN ADN forneo puede insertarse en T-ADN, el vector
forneo en una clula, de modo que esta clula adquiera la construido introducirse en Agrobacterium y la bacteria
capacidad de producir (o expresar) la protena fornea. La usarse para infectar clulas vegetales (hojas, callo, etc). El
clula receptora se denomina transformada (porque ha resultado final es que el ADN foraneo termina insertado en
adquirido una caracterstica que no tena antes) o el cromosoma de la planta (no extra-cromosomal como un
transgnica (porque tiene ADN forneo). Una forma de plsmido) y la clula transgnica puede usarse para
transformacin es con el uso de virus especficos para la reconstituir una planta completa. Esta transformacin es
clula receptora. Primero se modifica genticamente el virus estable y puede transmitirse a la progenie pero
de modo que el gen correspondiente a la protena de inters, desafortunadamente resulta en cantidades limitadas de
o mejor an una secuencia de ADN correspondiente a un protena. Una forma de aumentar la cantidad de protena
segmento de la protena (o polipptido) que incluye el expresada es insertando el ADN forneo en genoma de
eptopo inmunognico, se inserta en el ADN viral creando cloroplastos (en vez del genoma nuclear) que al tener copias
un virus mixto o quimera. El siguiente paso es infectar la mltiples resulta en mayor sntesis de protenas. Por
clula con el virus modificado, el que se replica generando conveniencia la mayora de investigadores empiezan
miles de copias. Estos virus hbridos o quimeras pueden transformando plantas modelos tales como Arabidopsis
entonces ser purificados y usados para inmunizar sujetos thaliana o tabaco (Nicotiana spp); y luego proceden con
lo que usualmente resulta en una respuesta mixta a la plantas mayores tales como papa, arroz, trigo, tomate, etc.
protena viral y al eptopo inmunognico aadido. Como los La expresin de la protena recombinante en la planta
virus normalmente infectan clulas, este sistema es bastante transformada puede confirmarse preparando extractos de
eficiente y resulta en la produccin de altas cantidades de los tejidos y haciendo un inmunoblot (eg, Western blot), en
inmungeno. La desventaja es que el virus puede daar la el que con el uso de antisuero especfico se visualiza la
clula receptora (an cuando se trate de usar mutantes de banda de protena del tamao esperado. Luego puede
baja virulencia). purificarse el antgeno por medios fsicos o por inmuno-
afinidad, o puede usarse el extracto proteico crudo
Tambin puede usarse plsmidos u otras formas de ADN directamente para inmunizar animales por via oral, otras
transferible; colectivamente se les llama vectores. mucosas, o va parenteral. Para mejorar la respuesta
Plsmidos naturales han sido modificados en el laboratorio inmune al antgeno puede usarse un adyuvante; el
quitndoles pedazos de ADN intiles y aadindoles adyuvante oral ms eficiente es toxina colrica, pero como
pedazos que confieren caractersticas tiles. Estos es txico a veces se prefiere otro (subunidad B de toxina
plsmidos comerciales tienen un promotor que es el colrica o toxina lbil de E. coli, u oligonucletidos CpG);
segmento reconocido por la clula receptora para iniciar va parenteral puede usarse adyuvante de Freund o
transcripcin del ADN; vectores que transportan ADN entre hidrxido de aluminio. Sangre o secreciones intestinales
diferentes lneas celulares usualmente tienen ms de un puede obtenerse de los animales inmunizados para detectar
3
la presencia de anticuerpos (IgG o IgA) contra la protena simulacro de IgA, los autores reemplazaron la regin
usando el mtodo de ELISA. Puede hacerse estudios de constante de la cadena pesada con la contraparte de
neutralizacin in vitro para confirmar que los anticuerpos la cadena produciendo una quimera IgA/G. El
producidos son capaces de neutralizar la citotoxicidad del anticuerpo producido por la planta era capaz de
patgeno o interferir con la habilidad de infectar clulas. reconocer el antgeno original en la superficie de la bacteria
Finalmente, los sujetos inmunizados pueden ser inoculados aglutinando S. mutans en cultivo. Zeitlin y col 6 en los EE.UU.
con el patgeno para determinar si estn protegidos por la sintetiz un anticuerpo IgG contra el virus herpes simplex
vacuna. Estos estudios se hacen en animales primero 2 (VHS-2) en planta de soya. El anticuerpo producido en
(ratones, conejos, primates, etc) y luego en humanos. planta era idntico al producido en clulas mamferas, tanto
en sus propiedades fsicas y qumicas como en su
PRODUCCION DE INMUNOLOGICOS capacidad de neutralizar la actividad citoptica de VHS-2
en clulas humanas. Ms an, cuando se evaluaron en un
EN PLANTAS modelo experimental de infeccin de ratones con VHS-2,
ambos anticuerpos (el producido en plantas o en clulas
I. Inmunoglobulinas (Ig) mamferas) protegieron a 50-100% de los animales.
Los primeros esfuerzos en el uso de plantas se dedicaron
a la produccin de protenas humanas de probable Fragmentos de anticuerpos que no tienen el segmento
aplicacin mdica. Entre ellas, las ms complejas y tiles efector Fc no pueden proteger contra infecciones, pero son
son los anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig). Anticuerpos ms fciles de manipular en el laboratorio que el anticuerpo
para uso mdico pueden purificarse del plasma de personas completo y conservan alta afinidad por su antgeno. Por lo
inmunizadas o naturalmente infectadas. Esta fuente es tanto pueden ser tiles como inmuno-reactivos para terapia
limitada, sin embargo, dada la escasez crnica de donantes, o diagnstico. Benvenuto y col 7 en Italia transformaron N.
la preocupacin de transmisin de infecciones por el uso benthamiana con Agrobacterium para que exprese el
de productos sanguneos y el hecho de que el proceso de segmento variable de la cadena pesada (VH), y Owen y col
purificacin del anticuerpo es costoso. Algunos de estos 8
en Inglaterra transformaron N. tabacum para que exprese
problemas pueden solucionarse con el uso de sistemas una cadena nica del fragmento variable scFv (cadena
recombinantes en bacterias o levaduras. El uso de plantas pesada + cadena ligera: VH + V L) de una Ig. Finalmente,
ha sido evaluado como un sistema alternativo. De Neve y col 9 in Blgica transformaron N. tabacum y
A. thaliana usando vectores T-ADN y obtuvieron
1. Immunoglobulina G (IgG) expresin y ensamblaje del anticuerpo IgG1 MAK33 y
Las Ig son glicoprotenas complejas con 2 cadenas pesadas su fragmento fijador de antgeno F(ac).
idnticas (, , para IgA, IgD, IgE e IgG,
respectivamente) y 2 cadenas ligeras idnticas ( ). En 2. Immunoglobulin A (IgA)
1989 Hiatt y col 3 en los Estados Unidos de Norte-Amrica IgG es el principal anticuerpo en sangre pero IgA es el
(EE.UU.) purificaron ARN mensajero de un hibridoma y encargado de proteccin a nivel de mucosas. Esta Ig
sintetizaron ADNc de las cadenas y del anticuerpo est formada por 2 cadenas pesadas y 2 cadenas
monoclonal (Ac-m) presente; estas cadenas fueron ligeras ( ). La forma activa de IgA en mucosas es
entonces insertadas en el vector de plantas pMON, usadas sIgA que est formada por 2 molculas de IgA unidas
para infectar Agrobacterium y luego transformar clulas de por un pequeo polipptido (cadena J) ms un
la planta del tabaco; las clulas eventualmente regeneraron polipptido denominado componente secretorio (CS).
plantas maduras que expresaban cadenas o . Al cruzar Como se describi previamente, en 1994 Ma y col 5
estas plantas los investigadores obtuvieron una progenie prepararon molculas de IgA a partir de la modificacin
capaz de expresar ambas cadenas simultneamente y que de IgG. Para sintetizar sIgA los investigadores 10
al expresar simultneamente se agregaban transformaron N. tabacum para expresar cada una de
espontneamente en complejos - indistinguibles de la las 4 molculas (quimera /, , J y CS), cruzaron las
IgG original. Los autores demostraron in vitro que el plantas y obtuvieron una progenie que expresaba las 4
anticuerpo derivado de la planta fijaba el antgeno molculas simultneamente. La planta que expresaba
correspondiente con la misma avidez que el anticuerpo las 4 cadenas era capaz de ensamblarlas correctamente
derivado del hibridoma original. Dring y col 4 en Alemania y producir sIgA funcional (hbrido sIgA/G) demostrado
tomaron un camino diferente: los autores construyeron por inmunoblot y ELISA; 57% de IgA estaba en la forma
genes mixtos conteniendo la cadena ligera y pesada de sIgA. Los anticuerpos as producidos reconocan SA
derivados de ADNc s del anticuerpo B 1-8 y transformaron I/II y se unan a S. mutans, la causa de caries dental en
tabaco. Tejidos de la planta transgnica sintetizaban ambas humanos. Finalmente, los autores procedieron a evaluar
cadenas simultneamente y stas se agregaban para formar la eficacia de su producto. 11 Voluntarios humanos
un anticuerpo funcionalmente activo con interaccin colonizados con S. mutans recibieron clorexidina para
especfica al antgeno original. Por microscopia electrnica erradicar la bacteria y luego 2 veces por semana por 3
el anticuerpo poda detectarse en el retculo endoplsmico semanas se les aplic a los dientes sIgA/G derivado de
y los cloroplastos. plantas, el Ac-m original IgG Guys 13 placebo (un Ac-
m contra otro antgeno). Los sujetos que recibieron sIgA/
Ma y col 5 en el Reino Unido (R.U.) us Agrobacterium para G IgG Guys 13 permanecieron libres de re-colonizacin
transformar Nicotiana tabacum para que exprese Guys13, con S. mutans por 4 meses mientras que los sujetos
un Ac-m IgG1 de ratones que reconoce la protena SA I/II que recibieron placebo se re-colonizaron a partir del da
de la superficie de Streptococcus mutans. Para crear un 21.
4
Estos experimentos prueban que las clulas de humanos y papas naturales o transformadas. Ningn sujeto desarroll
plantas comparten vas biosintticas bsicas y que, dada la anticuerpos contra potatina (la proteina de la papa). En este
informacin gentica pertinente, plantas pueden sintetizar estudio no se evalu la eficacia del producto para proteger
protenas humanas. El desarrollo de lneas de plantas contra infeccin por el VN.
capaces de producir inmunoglobulinas funcionales puede
tener aplicaciones importantes en inmunoterapia pasiva. b) Rotavirus (RV)
Rotavirus (RV) es la causa ms frecuente de diarrea
II. Vacunas infantil en el mundo con 140 millones de casos y 1 milln
Otra aplicacin importante de la tecnologa de plantas es de muertes anuales. Los RV humanos pertenecen al
en el desarrollo de vacunas que puedan utilizarse para grupo A, determinado por la protena viral 6 (VP6). Anti-
proteger a la poblacin general contra una enfermedad VP6 aparece con frecuencia luego de infeccin por RV,
comn. En este caso el objetivo es expresar no el anticuerpo pero estos anticuerpos no son neutralizantes y su rol en
sino el antgeno y dejar al sistema inmune de la persona inmunidad es cuestionable. Los RV humanos pertenecen
que genere los Ac correspondientes. Esto resultara en a varios serotipos, determinados por la protenas de la
proteccin activa de larga duracin. La comunidad cientfica cpsida VP7 y VP4. Anti-VP7 y anti-VP4 son anticuerpos
ha hecho progresos en la expresin de diferentes antgenos. neutralizantes y participan en proteccin. Una vacuna
contra RV, basada en virus recombinantes humano-
1. Patgenos Virales resus, representativos de los 4 serotipos ms frecuentes,
fue aprobada para uso universal pero se cancel cuando
se evidenci que provocaba intususcepcin.
A. Virus Entricos
Recientemente han aparecido 2 nuevas vacunas contra
a) Virus Norwalk (VN) RV que no parecen causar esa complicacin.
Los calicivirus son una extensa familia de virus que causan
enfermedad intestinal en humanos y animales. Los En 2000, OBrien y col 14 en Nueva Zelanda expresaron
calicivirus humanos (CaHu) son la causa principal de brotes VP6 en N. bethiana y notaron que las molculas se
de diarrea (a diferencia de diarrea endmica) en pases agregaban en PVAs. En forma similar, Yu y Langridge 15
desarrollados (y quizs tambin en pases en desarrollo). en los EE.UU. insertaron VP6 de un RV de ratn en papa
Los CaHu se agrupan en 2 gneros: los similares al virus (Solanum tuberosum) por transformacin con A.
Norwalk (VN) y los similares al virus Saporo. No hay tumefaciens. La inmunizacin oral (da 0, 7, 17 y 24) de
vacunas contra estos virus, en parte porque no se entiende ratones CD-1 con papa transgnica (5 g conteniendo
bien la inmunologa contra estos virus y porque hay aproximadamente 15 g de VP6) ms TC result en la
marcada variabilidad antignica con poca reaccin cruzada. aparicin de anti-VP6 IgG en suero (ttulos: 1:80-1:1280)
Los esfuerzos por hacer una vacuna se han centrado en la e IgA en intestino (ttulos: 1:8-1:32). Wu y col 16 en China
protena de la cpsida del virus Norwalk (PCVN) y han insertaron VP7 de RV humano (serotipo G1) en S.
encontrado que PCVN sintetizado artificialmente en clulas tuberosum y administraron el tubrculo transgnico (42
de insecto se agregan en partculas virales artificiales g VP7) ms TC (10 g) oralmente a ratones (da 0, 7,
(PVAs) que pueden usarse como vacunas. 14 y 42). Los animales inmunizados desarrollaron IgG
en suero e IgA (niveles ms altos) en el intestino; los
Mason y col 12 en los EE.UU. transformaron hojas de tabaco anticuerpos en suero no eran neutralizantes pero los
y tubrculo de papa para que expresen PCVN. El producto anticuerpos en intestino s lo eran. Dong y col 17 tambin
extrado del tabaco (t-rPCVN) era idntico en sus en China transformaron alfalfa con VP6 de RV humano
propiedades fsicas y qumicas al producto derivado de e inmunizaron ratones hembras BALB/c con 10 mg alfalfa
clulas de insecto (i-rPCVN) y ambos se agregaban en transformada (24 g VP6) ms oligonucletidos ricos en
PVAs de 38 nm. A continuacin, ratones CD1 recibieron CpG (10 g) como adyuvante. Los cachorros nacidos
extractos de hoja de tabaco (que contenan 50 mg t-rPCVN) de las hembras inmunizadas estuvieron parcialmente
va intragstrica (i.g.) 4 g de papa transformada (~ 60 mg protegidos contra diarrea al ser inoculados con el RV
p-rPCVN) va oral en das 1, 2, 11 y 28. Al da 40 casi todos simio SA-11. Finalmente, Saldaa y col 18 en Mxico
los animales haban desarrollado en suero y heces anti- transformaron plantas de tomate (Lycopersicon
VN, determinado por ELISA. Los niveles de IgA anti-VN esculentum) doblemente para que expresen VP2 y VP6.
variaron entre 0.33-4.12 ng/mg cuando se administr toxina La co-expresin de las protenas result en su
colrica (TC) 10 mg como adyuvante al rgimen anterior, y ensamblaje en PVAs. Un extracto de protena (100 g,
0.08-4.21 sin TC; la TC indujo mayores Ac al principio pero equivalente a 1 g protena de RV) ms adyuvante de
al final los niveles fueron similares con o sin TC. El mismo Freund se administr va intraperitoneal (i.p.) 3 veces a
grupo entonces procedi con experimentacin en humanos. ratones BALB/c y result en un aumento significativo 9-
13
Veinte voluntarios adultos recibieron 150 g de papa cruda, veces de anticuerpos anti-RV.
pelada (dosis estimada: 215-715 mg p-rPCVN) 2 dosis (das
0, 21) o 3 dosis (das 0, 7 y 21); 19 (95%) de los sujetos
c) Poliovirus
desarroll un aumento en el nmero de clulas secretoras
En los 1980s poliovirus causaban por lo menos 350,000
de anticuerpos (CSA) especficos para IgA; 4 (20%)
casos de parlisis flcida aguda en el mundo. En contraste,
desarrollaron IgG en suero y 6 (30%) IgA en heces. Las
gracias a la campaa de erradicacin de polio, en 2004 se
respuestas fueron estadsticamente significativas pero
reporten slo 1,252 casos. Hay 2 vacunas contra polio: la
modestas. Los efectos adversos (nausea y retortijones)
vacuna oral atenuada Sabin y la vacuna inyectable
ocurrieron con igual frecuencia en sujetos que consumieron
inactivada Salk.
5
Fujiyama y col 19 en Japn modificaron genticamente el En 2001, Huang y col en Australia 23 transformaron plantas
virus mosaico del tabaco (VMT) insertando fragmentos de de tabaco para que expresen la hemaglutinina (H) del virus
ADN codificando una secuencia de 15 aa derivados de las del sarampin, una glicoprotena expuesta en la superficie
protenas VP3 y VP1 de la cpsida de poliovirus tipo 1 Sabin del virus. Ratones adultos BALB/c fueron inoculados i.p.
y transformaron plantas de N. tabacum. Cuando se inyect con protena H derivada de plantas o recibieron i.g. extractos
a ratones, las partculas virales quimricas indujeron de hojas transformadas en das 0, 4, 14, 21, 35, 49 y 63
anticuerpos contra ambos: protenas de poliovirus y del VMT. (cada dosis de 0.3-0.4 g de extracto de hojas ms TC-B) y
desarrollaron IgG anti-sarampin en suero con actividad
B. Virus Respiratorios neutralizante in vitro. En un siguiente reporte, el mismo grupo
a) Rinovirus mostr que la inmunogenicidad de la vacuna oral poda
Rinovirus son la causa principal del resfriado comn, una aumentarse con la administracin previa de 1 dosis de
enfermedad raramente severa pero de gran morbilidad. vacuna a ADN. 24 Ms recientemente, los investigadores
En 1994 Porta y col 20 en R.U. infectaron plantas de replicaron los experimentos de transformacin usando
alberja con un virus mosaico de la alberja (VMA) lechuga, una planta comestible. 25 Extractos de lechuga
genticamente modificado para contener sitios conteniendo protena H indujeron anticuerpos neutralizantes
antignicos del rinovirus humano 14 (residuos 85-98 de luego de su administracin i.p intranasal (i.n.).
VP1). La partcula quimrica resultante fue administrada Nuevamente, animales pre-inmunizados con vacuna a ADN
intramuscularmente (i.m.) a conejos (100 g primero y que luego recibieron lechuga transformada oralmente
seguido de 50 g de refuerzo en das 21 y 24 ms mostraron un aumento de 10 veces en su ttulo de
adjuvante de Freund) con la consecuente aparicin de anticuerpos anti-sarampin. El producto era ltamente
anticuerpos que reaccionaron con VP1 de rinovirus en estable: extractos desecados de lechuga permanecieron
Western blot. estables a temperatura ambiente por lo menos por 13 meses
y por 1 semana a temperaturas de 50 oC.
b) Virus del Sincicio Respiratorio (VSR)
VSR es uno de los patgenos respiratorios ms Otro grupo en Francia 26 sigui la misma estrategia y
importantes en nios y una causa frecuente de transform plantas de zanahoria para expresar protena H.
bronquiolitis y neumona. Los esfuerzos iniciales para La inmunizacin de ratones con extractos de hoja o raz
desarrollar una vacuna inactivada en formalina resultaron result en ttulos elevados de IgG1 e IgG2a. Los
en una respuesta paradjica con exacerbacin de los investigadores luego cambiaron de estrategia: 27 en vez de
sntomas cuando el sujeto se expona a VSR natural. transferir toda la protena H, se concentraron en un eptopo
Recientemente los esfuerzos se han centrado en el conformacional de la proteina (H381-400). Como los
desarrollo de una vacuna utilizando subunidades del pptidos de pequeo tamao son poco inmunognicos,
virus, principalmente la glicoprotena F de la cubierta viral introdujeron copias repetidas del eptopo y lo fusionaron a
que es responsable de la fusin del virus con la clula un eptopo de toxoide tetnico (tt830-840) para crear un
infectada, o la protena G que interacta con el receptor polieptopo de mayor inmunogenicidad (la secuencia total
de membrana. Sandhu y col 2 1 en los EE.UU. era de 1.1 kpb). El gen as creado se introdujo en T-ADN
transformaron plantas de tomate para expresar VSR-F del vector binario pBIN19, bajo el control del promotor del
y administraron oralmente 3-4 g de tomate a ratones virus mosaico de la coliflor (VMCo), luego en A. tumefaciens
BALB/c en das 0, 4, 14, 18 y 28. De los ratones LBA4404 y se us para transformar plantas de zanahoria
inmunizados, 88% mostr un aumento significativo de anti- (Daucus carota L.). Protena purificada y extractos de
VSR-F IgG e IgA en suero. Una dosis subsecuente de protena se usaron para inmunizar ratones BALB/c i.p. (500
refuerzo consistente en antgeno inactivado de VSR produjo g extracto ms adyuvante de Freund en 4 dosis). Los
un aumento en el nivel de anticuerpos de 1.6 -1.8 veces. animales inmunizados desarrollaron altos ttulos de
Adems, con la dosis de refuerzo 72% de los ratones anticuerpos anti-sarampin capaces de neutralizar virus
desarroll anticuerpos intestinales IgA contra RSV-F. Yusibov clnicos de diferentes regiones geogrficas y genotipos.
y col 22 prepararon un polipptido de 21 aa correspondiente
a VSR-G, lo insertaron en el virus mosaico de alfalfa (VMAl) d) Virus del Sindrome Respiratorio Severo
y usaron la quimera para infectar plantas de N. tabacum. Agudo (SARS)
Los investigadores purificaron el virus recombinante de la En 2003-2004 el mundo fue testigo de la diseminacin global
planta transformada y usaron 500 g para inmunizar (da 0, de un virus previamente desconocido, denominado SARS
12 y 21) i.m. macaques resus y cinomolgus quienes que caus por lo menos 8,400 casos y 800 muertes. El
desarrollaron un aumento significativo de anticuerpos en el agente causante es un coronavirus (Co-SARS). La
da 28 del experimento. No se evalu proteccin. glicoprotena S de la superficie del virus induce anticuerpos
neutralizantes que son protectivos contra la enfermedad.
c) Virus del Sarampin Estos anticuerpos se fijan al extremo amino (NH3+) de la
Infeccin por el virus del sarampin conlleva alta morbilidad protena (denominado S1), el cual es responsable de la
y mortalidad, especialmente en nios pequeos. La vacuna fijacin del virus a la clula infectada. Pogrebnyak y col 28
basada en una cepa atenuada ha sido utilizada desde los en los EE.UU. transformaron tomate y tabaco de baja
1960s resultando en una reduccin marcada de esta nicotina para que expresen S1. Luego usaron extractos de
enfermedad a nivel mundial. El virus del sarampin es plantas para inmunizar ratones BALB/c por va oral (sin
relativamente estable, a menos desde el punto de vista de adyuvante) o va subcutanea (s.c.) con adyuvante de
inmunolgico, de modo que la vacuna protege contra todas Freund. Tomate administrado va oral produjo anticuerpos
las cepas. anti-S1 IgA en el intestino. Tabaco administrado va
6
parenteral no result en la aparicin de anticuerpos pero el inicialmente inmunizados con 1 dosis parenteral de vacuna
nivel aument marcadamente al dar 1 dosis de refuerzo de comercial. Adems los investigadores reportaron que
protena S viral, sugiriendo que el sistema inmune haba inmunizacin con la planta conteniendo el antgeno pero
sido pre-estimulado. No se evalu proteccin. sin TC como adyuvante result en falta de respuesta
primaria y una respuesta mnima al refuerzo con vacuna
C. Otros Virus comercial (pico 48 mUI/ml). Si los tubrculos se hervan
a) Virus de la Hepatitis B (VHB) por 10 minutos para cocinarlos, la inmunogenicidad
En el mundo ms de 300 millones de personas viven disminua significativamente: no respuesta primaria y
crnicamente infectadas por el VHB. Desde 1982 se ha mnima respuesta secundaria (135 mUI/ml). Microscopa
tenido una vacuna basada en el antgeno de superficie del electrnica mostr PVAs de 17 nm dentro de vesculas
virus (AgsHB) y que induce los correspondientes anticuerpos intracelulares. Los investigadores especularon que estas
(anti-AgsHB) los cuales protegen contra la infeccin. vesculas podran proteger el antgeno de las barreras
Inicialmente el AgsHB a ser usado en la vacuna se purificaba intestinales naturales y favorecer su interaccin con el
de la sangre de personas crnicamente infectadas. sistema inmune.
Posteriormente se desarroll sistemas recombinantes en
levaduras que sintetizan el AgsHB. Con el objeto de abaratar Experimentos pre-clnicos con hallazgos similares a los
los costos de fermentacin y purificacin y producir vacunas descritos han sido reportados por otros grupos en China 33
de bajo costo, recientemente se ha explorado el uso de transformando tomatillo para expresar AgsHB, Corea del
plantas para expresar el AgsHB. Sur 34 transformando papa para expresar AgsHB y el
antgeno pre S2, y en Rusia transformando papa para
En 1992 Mason y col 29 en EE.UU. usaron Agrobacterium expresar AgsHB 35 AgcHB. 36
para transformar plantas de tabaco que expresen AgsHB.
El antgeno producido por las plantas era fsica, qumica y Dos grupos han procedido con experimentos clnicos de
morfolgicamente idntico a AgsHB purificado de suero pequea escala. Thanavala y col 37 en los EE.UU. administr
humano e igualmente se agregaba en partculas esfricas 100 g de papa transformada (aproximadamente 850 g
de 22 nm. En un siguiente estudio 30 los investigadores AgsHB) oralmente a 16 voluntarios (da 0, 14 y 28) y 10 (62%)
extrajeron AgsHB de las plantas de tabaco transgnicas, lo desarroll anti-AgsHB (aumento de 1.9-30.4 veces con
purificaron parcialmente y lo administraron i.p. a ratones respecto al basal). En busca de una preparacin comestible
BALB/c en dosis de 0.5 g AgsHB en das 0, 7 y 14 con de la vacuna, Kapusta y col 38 en Polonia transformaron
adyuvante de Freund. La inmunizacin estimul linfocitos lechuga para que exprese AgsHB. Ratones que recibieron
B y T, evidenciado en anticuerpos anti-AgsHB en suero y este producto mostraron una buena respuesta inmune. Luego,
proliferacin in vitro de clulas T de ganglio linftico. La los investigadores dieron de comer a 3 voluntarios humanos
respuesta inmune fue algo menor - pero todava significativa 200 g de lechuga transformada, seguido de 150 g dos meses
en comparacin con inmunizacin con una vacuna despus. Dos semanas luego de la segunda dosis tres
comercial (tambin administrada 0.5 g i.p., mismo voluntarios tuvieron una respuesta adecuada (>10 mUI/ml)
rgimen). El mismo grupo luego evalu el efecto de pero que decay posteriormente. En un siguiente reporte 39 el
inmunizacin oral. 31 Prepararon tubrculos de papa con mismo grupo inmuniz 7 voluntarios ms 3 veces en semana
AgsHB y administraron oralmente 5 g (5.5 g AgsHB) ms 0, 1 y 5 (AgsHB 0.5, 0.8 y 0.9 g, respectivamente). Todos
10 g TC como adyuvante a ratones BALB/c en das 0, 7 y los sujetos desarrollaron anti-HBsAg pero el nivel ms alto
14. La respuesta inmune primaria (medida como anti-AgsHB fue de slo 6.3 mUI/ml. De modo que hubo respuestas
totales en suero) fue mxima en la semana 3 (73 mUI/ml) inmunes pero pobres. En estos experimentos humanos no
pero desapareci en la semana 6. Una dosis subsecuente se us adyuvantes.
de refuerzo i.p. con vacuna comercial (0.5 g rAgsHB)
produjo niveles altos (1,680 mUI/ml) y sostenidos de Ramirez y col en Cuba 40 usaron una estrategia diferente:
anticuerpos. Como referencia, un nivel de AgsHB >10 mUI/ en vez de AgsHB prepararon anti-AgsHB. Empezaron con
ml es considerado protectivo en humanos. un Ac-m IgG1 de ratn utilizado para la purificacin comercial
de AgsHB, amplificaron las cadenas pesada y ligera del
Los investigadores luego 32 compararon la inmunogenicidad gen y los insertaron en tandem en el vector, precedido de
como vacuna oral de AgsHB presentado en plantas vs una secuencia (KDEL) que dirige la protena al retculo
AgsHB preparado en levadura (vacuna comercial, rAgsHB). endoplsmico, y transformaron clulas de tabaco (N.
Transformaron papa e inmunizaron oralmente ratones tabacum). El anticuerpo se expres a niveles 0.5% de la
BALB/c con 5 g de tubrculo (~42 g AgsHB por dosis) protena total de la planta y fue tan efectivo como el Ac-m
ms 10 g TC en das 0, 7 y 14. Para determinar si se original para la purificacin de AgsHB. 41
haba generado clulas inmunes de memoria, administraron
una dosis adicional de rAgsHB en la semana 6. Los ratones b) Otros Virus de la Hepatitis
que recibieron rAgsHB derivado de levadura no mostraron En cuanto al virus de la hepatitis A (VHA), Hu y col 42 en
una respuesta primaria, y tuvieron una respuesta secundaria China construyeron el vector pBI121-A que contiene el gen
dbil (pico ~ 180 mUI/ml). Por otro lado, los ratones que de la protena de la cpsida del VHA fusionado a los flancos
recibieron papa con AgsHB tuvieron una buena respuesta de insercin del plsmido Ti, bajo el control del promotor
primaria (pico 103 mUI/ml) y una respuesta secundaria VMCo35S. Introdujeron el vector en A. tumefaciens
fuerte (pico 3,300 mUI/ml) y sostenida (700 mUI/ml 5 meses LBA4404 y transformaron exitosamente plantas de Citrus.
despus). El experimento inverso mostr que la planta El reporte no incluy experimentos adicionales con el
transformada poda tambin servir de refuerzo en animales producto de la planta.
7
En cuanto al virus de la hepatitis E (VHE), Maloney y col 43 no desarrollaron anticuerpos; sin embargo una dosis
en los EE.UU. transformaron plantas de papa para que adicional de vacuna ADN Tat indujo la aparicin de
expresen protena de la cpsida de VHE a niveles de 5-30 anticuerpos, lo que sugiere un fenmeno de pre-
g/g tubrculo fresco. Sin embargo, la protena expresada estimulacin inmune por el Tat de la planta.
en planta no se agregaba en PVAs (como normalmente
ocurre cuando la protena se expresa en clulas de insecto) d) Citomegalovirus (CMV)
y ratones inmunizados con el producto va oral no CMV es una causa frecuente de infecciones en la poblacin
desarrollaron anticuerpos. Por otro lado Ma y col 44 en China, general. Estas infecciones son usualmente benignas y
usando suero de un paciente infectado, amplificaron una asintomticas, excepto en el neonato o el paciente inmmuno
porcin de ADN de 810 pb (denominada E2) comprometido en los que la infeccin puede ser sistmica
correspondiente a la regin 394-604 aa del ORF2 del VHE, y potencialmente letal. No existe una vacuna y los antivirales
lo insertaron en el vector pCAMBIA1301, luego en A. tienen poca eficacia clnica. Anticuerpos neutralizantes
tumefaciens y transformaron plantas de tomate. Los niveles contra CMV son estimulados principalmente por la
de expresin de la protena recombinante fueron 61.22 ng/ glicoproteina B (gB) de la cubierta viral. Tackaberry y col 50
g tejido fresco en la fruta y 6.37-47.9 ng/g en las hojas. No en Canada expresaron gB de CMV humano en plantas de
se hizo experimentos con animales. Similarmente, otro tabaco y mostraron que el antgeno derivado de plantas
grupo en China 45 insert el fragmento E2 en el vector neutralizaba la infeccin de fibroblastos por CMV. El estudio
pRB94, especfico para plstidos, y transformaron plantas no report inmunogenicidad o proteccin del producto.
del tabaco (N. tabacum). La protena se expres a niveles
tan altos como 13.27 g/g de hojas frescas y fue capaz de e) Papilomavirus Humano (PVH)
inducir la aparicin de anticuerpos cuando se utiliz para Setenta por ciento de mujeres sexualmente activas se
inmunizar ratones infectan con PVH en algn momento. Hay ms de 100 tipos
. de PVH; de ellos PVH tipos 16 y 18 son la causa de 70% de
c) Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) casos de cncer cervical y PVH 6 y 11 causan 90% de casos
Desde el inicio de la pandemia de VIH en los 1980s, ms de verrugas genitales. Los tipos se determinan por la
de 50 millones de personas han sido infectadas y 16 millones protena viral L1. Cuando se expresa en altas cantidades
han fallecido, la mayora en pases en desarrollo. Cada da L1 se agrega para formar PVAs, lo cual aumenta su
15,000 personas se infectan y 7,000 personas mueren en inmunogenicidad. Recientemente, en EE.UU. se ha
el mundo debido al VIH. El tratamiento con anti-retrovirales aprobado el uso de una vacuna contra PVH, de
no cura la infeccin y no est al alcance de muchos de los administracin i.m. en 3 dosis, la vacuna es producida en la
infectados. Hasta el momento no se conoce que haya levadura Saccharomyces cerevisiae y contiene L1 de los
inmunidad contra el VIH. VPH tipos 6, 11, 16 y 18.

En 1994 Porta y col 20 en el R.U. infectaron alberjas con una Versani y col 51 en Sud-Africa transformaron N. tabacum
quimera del VMA que contena residuos antignicos de la para expresar L1 de VPH-16. La protena se concentraba
cepa IIIB de VIH-1 (correspondiente a los residuos 731- en extractos de hojas (2-4 g/g tejido fresco) y agregaba
752 de gp41). La quimera extrada de la planta en Western en VPAs. Cunado se inmuniz conejos con las partculas
blot reaccionaba con antisuero especfico para VIH-1. Ms producidas en planta se obtuvo una respuesta inmune leve.
an, ratones C57BL/6 fueron inmunizados s.c. con la Biemelt y col 52 en Alemania reportaron hallazgos similares
quimera ms adyuvante de hidrxido de aluminio y al transformar plantas de tabaco y papa. La administracin
desarrollaron anticuerpos capaces de neutralizar cepas de oral de tubrculos de papas transformadas indujo anti-L1
VIH-1. 46 Los anticuerpos desaparecieron luego de 7 en slo 3 de 24 ratones; pero an as, 11 de los 21 restantes
semanas pero reaparecieron luego de una dosis de refuerzo. tuvieron una respuesta anamnstica luego de una dosis
Los investigadores entonces evaluaron la inmunogenicidad adicional subinmunognica de L1. Warzecha y col 53 en los
del producto administrado i.n. u oralmente. 47 Todos los EE.UU. prepararon L1 de PVH-11 (con codones optimizados
ratones inmunizados i.n. (10 g VMA-VIH equivalente a para expresin en plantas) y transformaron tabaco y papa.
~0.17 g VIH-1 gp41 ms 1 g TC) en das 0 y 28 La expresin de L1 mejor cuando removieron el extremo
desarrollaron anti-VIH IgA en intestino e IgG en suero. carboxilo (COO-) de la protena (que media localizacin
Inmunizacin oral (a dosis hasta de 500 g VMA-VIH) en en el ncleo); la protena se agregaba en PVAs.
das 0, 7, 14, 21 y 35 fue menos inmunognico induciendo Nuevamente, la administracin oral de L1 derivado de
un nivel bajo de anticuerpos IgG en slo 40% de los animales papa no result en anticuerpos pero hubo una respuesta
y no IgA. Yusibov y col 48 en los EE.UU. fusionaron la protena anamnstica luego de una dosis adicional de PVH-PVAs
de cubierta del VMAl con pptidos del espiral V3 de VIH-1. preparado en clulas de insecto.
Los antgenos sintetizados en la planta estimularon
anticuerpos neutralizantes de VIH en ratones inmunizados f) Virus de la Rabia
i.p. (7 dosis a intervalo de 2 semanas, 10 g por inyeccin, Rabia es una enfermedad ltamente mortal que afecta
con adyuvante de Freund). No se hizo estudios de proteccin mamferos principalmente salvajes pero tambin
pero estos resultados muestran que es posible expresar animales domsticos (perros) en pases en desarrollo.
protenas de VIH en plantas. El mismo grupo 49 insert el Cada ao, por lo menos 55,000 casos de rabia humana
gen correspondiente a la protena Tat de VIH (con codones ocurren en el mundo. El control de la enfermedad se
optimizados para expresin en plantas) en el VMT y us el basa en inmunizacin regular de animales, con
vector para infectar plantas de espinaca. Ratones que inmunizacin de humanos cuando ocurren casos de
comieron espinaca infectada con VMT-Tat en das 0, 7 y 14 exposicin de riesgo.
8
McGarvey y col 54 en los EE.UU. transformaron plantas comparacin a controles). Luego los investigadores
de tomate, va infeccin con A. tumefaciens para procedieron a usar tubrculos de papa transformados bajo
expresar la protena G de la superficie del virus de la el mismo protocolo 59 para expresar TL-B y los dieron a 14
rabia. Microscopa electrnica mostr que las partculas voluntarios adultos sanos quienes ingirieron 50g 100 g
antignicas se acumulaban en el aparato de Golgi, (3.7-15.7 mg TL-B por g de papa); los sujetos control
vesculas intracelulares y la pared celular. Yusibov y col recibieron 50 g de papa sin transformar. Los sujetos
48
en los EE.UU. fusionaron la protena de cubierta del vacunados desarrollaron en suero CSA anti-TL IgG e IgA
VMAl con pptidos del virus de la rabia (Drg24) e 14-28 das luego de la inmunizacin. Niveles sricos de
infectaron plantas de tabaco. La quimera producida en anti-TL IgG e IgA se detect en 91% y 55% de voluntarios,
la planta (VMAl-Drg24) indujo anticuerpos neutralizantes respectivamente, as como IgA intestinal en 50%. Ninguno
contra virus de la rabia en ratones Swiss-Webster de los sujetos desarroll anticuerpos contra potatina.
inmunizados i.p. Luego los investigadores 55 usaron el mismo Otro grupo report una experiencia similar. Streatfield y col
60
sistema para infectar hojas de espinaca e inocularon ratones en EE.UU. transform maz para expresar TL-B. Ratones
i.p. con 50 g de VMAl-Drg24 derivado de la planta en 3 BALB/c que fueron alimentados con maz transgnico (con
dosis en intervalos de 2 semanas. Los animales 5 50 g TL-B) en das 0, 7 y 21 tuvieron una buena
inmunizados mostraron proteccin parcial (40% respuesta de IgG en suero e IgA en intestino. En este
supervivencia) luego de una dosis letal de virus de rabia. experimento, la respuesta de IgA intestinal fue mejor en los
La administracin oral del antgeno purificado (250 g ratones inmunizados con TL-B expresado en maz que con
por dosis, 4 dosis en intervalos de 2 semanas) estimul TL-B purificado. Ms an, los ratones inmunizados estaban
la aparicin de anticuerpos IgG e IgA especficos en protegidos contra TL. Luego, los investigadores dieron de
suero. Animales alimentados con hojas de espinaca (7 comer maz transgnico a voluntarios adultos (1 mg TL-B,
dosis diarias de 25 g seguido de 7 das de dieta normal, 3 dosis). 61 Siete de los 9 voluntarios desarrollaron anti-TL
por 4 ciclos) desarrollaron IgA en heces a niveles mayor IgG y CSA en suero y 4 de 9 IgA en heces.
que los que recibieron antgeno purificado. La
administracin i.n. de una cepa atenuada de virus de la Laustergar y col 62 en Holanda transformaron tubrculos de
rabia (que enferma pero no mata a los animales) result en papa para expresar TL-B (17 g TL-B por g de tejido). TL-
sntomas ms leves en los animales inmunizados B expresada en papa se agregaba en pentmeros y fijaba
comparado a los controles, lo que sugera un proteccin ganglisidos GM1, que son los receptores naturales de TL-
parcial. En estos experimentos no se us un adyuvante. B. Inyeccin s.c. de TL-B purificada de plantas indujo
Ashraf y col 56 en India transformaron N. tabacum para anticuerpos sricos a nivel similar a los inducidos por rTL-B
expresar proteina G del virus de la rabia (a 0.38% del total derivado de E. coli. La administracin oral de 5 g de tubrculo
de protena soluble de la hoja). La administracin i.p. de de papa (~ 65 mg de TL-B) en 3 dosis interdiarias result
protena G purificada de la planta a ratones result en la en anti-TL-B IgG en suero e IgA intestinal. Sin embargo, la
aparicin de anticuerpos anti-rabia que protegi a los repuesta inmune era evidente slo en los animales
animales contra una dosis letal intracerebral de virus de la previamente vacunados parenteralmente con LT-B y no en
rabia vivo. los que recibieron slo la dosis oral derivada de la planta.
Chikwamba y col 63 en EE.UU. expresaron TL-B en maz y
2. Patgenos Bacterianos encontraron que la inmunizacin oral de ratones BALB/c
indujo anticuerpos anti-TL-B; la respuesta fue mejor en
A. Bacterias Entricas animales que recibieron maz transformado con TL-B que
a) Escherichia coli Enterotoxignica (ECET) los que recibieron maz natural con TL-B aadido. Los
ECET es un agente causal importante de diarrea a nivel animales inmunizados tuvieron menos acumulacin de
mundial. Entre otros, la bacteria produce una toxina lbil fluido en asa intestinal cuando se les administr TL TC.
(TL) compuesta de 1 subunidad A y 5 subunidades B. Finalmente otros grupos han explorado otras estrategias.
Diferentes fuentes de evidencia sugieren que los anticuerpos Kang y col 64 en Corea del Sur us TLK63 (un mutante no-
contra la subunidad B de TL (TL-B) pueden ser protectivos. txico de TL) y transform cloroplastos de planta de tabaco
Haq y col 57 en los EE.UU. transformaron plantas de tabaco usando una tcnica de bombardeo por partculas lo cual
y papa para expresar TL-B. Luego procedieron a inmunizar aument la cantidad de protena recombinante producida a
ratones BALB/c oralmente en das 0, 4, 14 y 18; un grupo 3.7% del total de protena soluble; la inmunogenicidad o
recibi 5 g de tubrculo transformado (15-20 mg TL-B) y un eficacia protectiva del producto no fueron investigados. Y
segundo grupo recibi 20 mg de TL-B recombinante (rTL- Piller y col 65 en EE.UU. transformaron planta de soya con
B) expresado en E.coli. Ambos grupos desarrollaron niveles la subunidad C de la fimbria de E. coli K99 (FanC). Los
similares de IgG en suero e IgA en intestino. Un siguiente ratones inmunizados i.p. con extracto de protenas de las
estudio por el mismo grupo 58 nuevamente mostr que hojas de plantas transgnicas desarrollaron anticuerpos anti-
ratones alimentados con tubrculos transformados en 3 FanC y linfocitos T CD4+ especficos para el antgeno.
dosis semanales de 5 g cada una (20-50 mg TL-B)
desarrollaron anti-TL-B IgG en suero e IgA en heces a b) Otras cepas de E coli
niveles comparables a los de ratones que recibieron rTL-B E. coli enteropatognica (ECEP) son causa importante de
(3 dosis semanales de 5 mg TL-B cada una). Ms an, diarrea. Proteccin contra ECEP depende de anticuerpos
cuando se les administr dosis txicas de TL (25 g) ambos contra factores de virulencia secretorios tales como BfpA y
grupos mostraron una proteccin parcial contra diarrea otros. Da Silva y col 66 en Brasil amplificaron el gen
(reduccin de 15% y 22% en fluido intestinal para los que correspondiente a BfpA, lo insertaron en el vector pIBT11,
recibieron TL-B de tubrculo o rTL-B, respectivamente, en transformaron A. tumefaciens y luego N. tabacum. La
9
protena recombinante se expres a niveles de 7.7% de la En 1997 Arakawa y col 70 en EE.UU. expresaron TC-B en
cantidad total de protena soluble. Ratones BALB/c fueron plantas de papa y mostraron que la toxina resultante era
inmunizados oralmente 3 veces (da 0, 15 y 30) con 20 g mayormente oligomrica (algunas posiblemente
de extracto de protena. Usando anlisis por inmunoblot pentamricas), que en inmunoblot reaccinaba igual que TC-
los investigadores demostraron la presencia cualitativa de B bacteriana y fijaba a GM1, los receptores naturales de
anticuerpos anti-BfpA en suero y heces; los ttulos no fueron TC. La coccin de los tubrculos redujo la cantidad de TC-
precisados y no se hizo estudios de proteccin. B pentamrica a la mitad. Los investigadores 71 procedieron
a inmunizar ratones CD-1 alimentndolos con 3 g de papa
E. coli enterohemorrgica (ECEH) causa colitis hemorrgica transgnica (~90 mg TC-B cada vez) en das 0, 6, 17 y 24 y
y sindrome urmico hemoltico; la enfermedad es mediada un refuerzo el da 65. Los ratones desarrollaron anti-TC-B
por la secrecin de toxinas Shiglicas (Stx). El serotipo ms IgG, IgM e IgA en suero as como IgA e IgG en heces; los
representativo es E. coli O157:H7, que primariamente infecta ttulos declinaron luego de la ltima dosis pero reaparecieron
al ganado pero que puede afectar a humanos que consumen con la administracin de la dosis de refuerzo. El suero de
carne poco cocida u otros productos. El control de la los animales inmunizados neutralizaba la toxicidad de TC
infeccin incluye principalmente vacunacin de los animales. en clulas Vero; y al recibir TC los ratones inmunizados
Judge y col 67 en EE.UU. prepararon plantas transgnicas presentaron 62% menos acumulacin de fluido en el asa
de tabaco que expresan el extremo carboxilo (COO-) de la intestinal. La accin protectiva de sIgA era mediada por
protena intimina de E. coli O157:H7 que sirve para unirse inhibicin de la unin de TC a GM1. A modo de comparacin,
a la clula receptora. Luego inmunizaron ratones (oralmente, ratones que recibieron una dosis menor de papas
i.p. o ambos) con intimina derivada de plantas y encontraron transgnicas (1 g conteniendo 30 mg TC-B) desarrollaron
que slo los animales que recibieron inmunizacin primaria anticuerpos pero menor capacidad de neutralizacin y
parenteral seguida de refuerzo oral desarrollaron menor reduccin (42%) de fluido en el asa intestinal; y
anticuerpos especficos en mucosa; adems encontraron ratones que recibieron TC-B de origen bacteriano (30 mg
que los animales inmunizados con este rgimen tuvieron cada vez) desarrollaron niveles de anticuerpos 2 veces ms
excrecin reducida de E. coli O157:H7 cuando se les inocul altos, capacidad de neutralizacin 4 veces mayor y una
con la bacteria. En un siguiente estudio, 68 el mismo grupo reduccin similar (55%) de fluido en el asa intestinal. Estos
transform tabaco para expresar una forma detoxificada resultados sugirieron que TC-B bacteriana (sea el producto
(toxoide) de Stx2. La inmunizacin i.p. de ratones con Stx2 en s o la manera de administracin) era ms inmunognica
detoxificado derivado de plantas result en niveles sricos que el producto transgnico obtenido de plantas; pero
elevados de anticuerpos y todos los ratones sobrevivieron tambin ilustran la discrepancia entre niveles de anticuerpos
a una dosis letal de toxina Stx2 natural (a una dosis 10 veces y proteccin. Jani y col 72 en India transformaron N. tabacum
la dosis letal 50%). Ratones alimentados con clulas de la con el gen de TC-B aadiendo una secuencia de retencin
planta conteniendo toxoide Stx2 (5 g en das 0, 7, 14, 21 y para el retculo endoplsmico (SEKDEL) y bajo el control
28) desarrollaron anticuerpos IgG en suero e IgA intestinal del promotor VMCo 35S. Prepararon extractos de plantas
capaces de neutralizar la actividad txica de Stx2 natural (5 g TC-B) y al inyectar va intradrmica (i.d.) a ratones
en clulas Vero. BALB/c, stos desarrollaron anticuerpos en suero y
activacin de clulas T del bazo.
c) Shigella flexneri
Shigella flexneri causa disentera bacteriana. El antgeno e) Helicobacter pylori
del plsmido de invasin (IpaC) cumple una funcin esencial H. pylori es la infeccin bacteriana crnica ms frecuente y
en la entrada de la bacteria a las clulas epiteliales. MacRae causa gastritis, enfermedad lcero-pptica y cncer gstrico.
y col 69 en EE.UU. insert el gen ipaC en el vector pBI121, La infeccin no induce una inmunidad protectiva lo que ha
lo introdujo en A. tumefaciens y transform plantas de A. dificultado el desarrollo de una vacuna. Entre los diferentes
thaliana. La protena recombinante IpaC se expres a antgenos investigados como probables vacunas, el ms
niveles de 1.9-2.3 g/mg protena total. El estudio no report prometedor es la subunidad B de la protena ureasa (ureasa
la inmunogenicidad o valor protectivo del producto. B). Usando transformacin con Agrobacterium, Brodzik y
col en Polonia 73 expresaron ureasa B en tabaco (N.
d) Vibrio cholerae tabacum) y zanahorias (Daucus carota), y Gu y col en China
Cepas de Vibrio cholerae 01 que producen toxina colrica hicieron lo mismo en tabaco 74 y arroz. 75 Estos estudios no
(TC) pueden causar clera en humanos. An cuando la evaluaron la inmunogenicidad o eficacia protectiva del
mayora de individuos experimentan infeccin asintomtica producto. Zhang y col, 76 por su lado transformaron tabaco
o con sntomas leves, algunos pueden presentar con otra protena (HspA) de H. pylori, y describieron que la
deshidratacin severa. El potencial epidmico del clera inmunizacin de ratones va mucosas con extractos de
an no bien explicado ha causado gran morbilidad y tabaco transgnico indujo anticuerpos especficos. La
mortalidad a travs de la historia. Actualmente existe una proteccin por estos anticuerpos no fue estudiada.
vacuna parenteral contra clera pero es de valor limitado.
Vacunas orales estn en desarrollo y por lo menos una ellas B. Otras Bacterias
se usa en Europa (cepa atenuada Vibrio cholerae CVD103- a) Bacillus anthracis
HgR). Similar a lo que ocurre con la toxina lbil de E. coli La causa de ntrax, una enfermedad que normalmente
(TL), TC tambin tiene 1 subunidad A toxignica y 5 afecta animales herbvoros pero que ocasionalmente puede
subunidades B (TC-B) no-toxignicas. Los datos sugieren infectar humanos, o incluso ser usado como agente de
que anticuerpos contra TC-B pueden ser protectivos contra guerra biolgica. La molcula ms importante, en cuanto a
clera. inmunizacin contra ntrax, es el denominado Antgeno
10
Protectivo (AP). Aziz y col 77 en India transformaron plantas mejores alternativas. Rigano y col 83 en EE.UU.
de tabaco con el gen del AP (pag) y demostraron transformaron Arabidopsis thaliana para expresar el
expresin de AP en la planta por anlisis de Western antgeno ESAT-6 de M. tuberculosis fusionado a TL-B de
blot usando antisuero contra AP natural. El AP derivado E. coli. La protena fusionada ESAT-6-TLB derivada de la
de plantas (junto con otra protena de B. anthracis planta fue administrada oralmente a ratones e indujo
denominada Factor Letal) mostraron citotoxicidad en activacin de clulas especficas CD4+ y un aumento en la
lneas celulares de macrfagos. En busca de una produccin de Interfern-, lo cual indica una respuesta
alternativa comestible, el mismo grupo 78 luego primordialmente tipo Th1; en las placas intestinales de Peyer
transform tomate con el gen pagA e inmunizaron los investigadores encontraron una respuesta tipo Th2.
ratones i.p. con 4 dosis semanales crecientes de hasta
300 g de extracto proteico, y describieron que los e) Borrelia burgdorferi
animales desarrollaron anticuerpos anti-AP. Estudios in Infeccin por B. burgdorferi causa la enfermedad de Lyme.
vitro mostraron que estos anticuerpos podan neutralizar La inmunidad contra esta infeccin es mediada por la
la actividad citotxica en macrfagos de AP y Factor liporotena bacteriana OspA, la cual debe ser lipidada para
Letal. Por ltimo, Koya y col 79 en EE.UU. tansformaron tener inmunogenicidad; este requisito de lipidacin limita
cloroplastos de la planta de tabaco con pagA. Las hojas los sistemas en los que puede expresarse este antgeno.
de las plantas transformadas expresaban AP en Glenz y col 84 en EE.UU. transformaron cloroplastos de
cantidades de 14.2% del total de protena soluble. tabaco para expresar OspA. La protena se expres en
Nuevamente, estudios de toxicidad mostraron que el AP cantidades de 1-10% de protena total soluble y ms
derivado de la planta tena la misma potencia que el AP importante estaba adecuadamente lapidada. Ratones
derivado de B. anthracis. La inmunizacin de ratones BALB/c que se inmunizaron s.c. (das 0, 14 y 32) con OspA
s.c. con AP parcialmente purificado de los cloroplastos purificado de la planta desarrollaron anticuerpos, a niveles
o AP derivado de B. anthracis indujo altos niveles de considerados protectivos.
anticuerpos IgG en suero (1:320,000) y ambos grupos
sobrevivieron a una dosis letal de toxina. 3. Parsitos
a) Malaria
b) Yersinia pestis Malaria causa aproximadamente 1.5-2.7 millones de
El agente causante de la plaga, una enfermedad de muertes en el mundo cada ao, la mayora en pases en
animales pero que puede ser transmitida a humanos por desarrollo. De las cuatro especies de Plasmodium de
la picadura de pulgas infectadas o inhalacin de material importancia clnica, P. falciparum es el ms severo. No hay
infectado. Los dos antgenos principales en inmunidad una vacuna contra este parsito y el tratamiento se ha
contra este agente son las protenas F1 y V. Alvarez y dificultado debido a la aparicin de resistencia antibitica.
col 80 en EE.UU. transformaron tomate para expresar F1 En 1995, Turpen y col 85 en EE.UU. modificaron
y V simultneamente como una protena fusionada. genticamente la superficie del VMT para expresar el
Luego inmunizaron ratones BALB/c s.c. con 2 dosis (10 eptopo AGDR de la protena del circumsporozoito de P.
g en das 0 y 11) de F1-V purificada y mezclada con vivax e infectaron plantas de tabaco. Las plantas infectadas
hidrxido de aluminio como adyuvante, seguido de 4 dosis contenan alta cantidad de virus recombinante que
orales (300 g en das 21, 28 y 35, y 1200 g en da 42) de reaccionaba con Ac-m especficos en Western blot.
F1-V con TC (10 g). Todos los animales inmunizados Yasawardene y col 86 en Sri Lanka insertaron un eptopo
desarrollaron anticuerpos IgG en suero e IgA en heces. En (P109) del antgeno de superficie-1 del merozoito de P.
un experimento similar, 81 el mismo grupo transform N. falciparum (PfMSP1) en VMA e infectaron plantas de alberja.
benthamiana, extrajo F1-V e inmuniz cuyes (25 g en das El eptopo P109 poda detectarse fcilmente en tejidos de
0, 30 y 60). Los animales desarrollaron niveles altos de la planta transformada, e inmunizacin de conejos con la
anticuerpos (17,000-20,000) que los protegieron contra una protena quimrica indujo anticuerpos dirigidos
dosis letal de Y. pestis. principalmente contra el virus (VMA) y en menor grado
contra el eptopo P109.
c) Clostridium tetani
TetC es un polipptido (47 kDa), fragmento no-txico de la 4. Vacunas con Mltiples Componentes
toxina tetnica, que puede usarse como una probable Los avances en tecnologa moderna han permitido el
vacuna contra el ttano. Tregoning y col 82 en EE.UU. desarrollo de varias vacunas. Sin embargo, como la mayora
transformaron cloroplastos de tabaco con el gen tetC. La de stas son parenterales, el nmero de inyecciones que
inmunizacin i.n. (da 0, 28 y 35) de ratones con TetC debe recibir un nio ha aumentado marcadamente; como
derivado de la planta indujo IgG en suero e IgA en solucin a este problema, es importante desarrollar
secreciones nasales e intestinales. Los animales productos que contengan varias vacunas simultneamente.
inmunizados mostraron proteccin y no desarrollaron Yu y col 87 en EE.UU. prepararon papas transgnicas que
parlisis luego de una dosis de toxina tetnica (50 veces la expresaban una protena fusionada conteniendo TC-B de
dosis paraltica 50%). Vibrio cholerae, factor de colonizacin I (CFA/I) de E. coli
enterotoxignica y la protena no-estructural 4 (NSP4) de
d) Mycobacterium tuberculosis rotavirus. Inmunizacin oral de ratones CD-1 (10 g de
Tuberculosis causa por lo menos 8.9 millones de infecciones protena recombinante) en das 0, 5, 15, 23 y 56 indujo
y 1.7 millones de muertes en el mundo cada ao. Existe respuesta humoral e intestinal, clulas de memoria CD4+ y
una vacuna (BCG) ampliamente utilizada pero de eficacia proteccin contra diarrea por rotavirus. Shchelkunov y col
modesta, por lo que diversos grupos estn buscando 88
en Rusia prepararon un gen quimrico conteniendo
11
eptopos ENV y GAC de VIH-1 y AgsHB y transformaron son ms inmunognicas que molculas solubles. La
plantas de tomate. Luego usaron las frutas de estos tomates mayora de productos transgnicos retienen su identidad
transgnicos para alimentar ratones (da 0 y 7) quienes antignica y son reconocidos por anticuerpos comerciales
desarrollaron anticuerpos contra ambos VIH-1 y VHB. in vitro. Algunos antgenos han sido evaluados in vivo
Finalmente, como tericamente - y apoyado por evidencia (especialmente en ratones) y han mostrado capacidad para
experimental - la fusin de un antgeno con su anticuerpo inducir anticuerpos especficos, algunos con actividad
debe ser ms inmunognico que el antgeno solo, neutralizante. Unos pocos estudios han evaluado y
Chargelegue y col 89 en R.U. prepararon un complejo inmune demostrado que, al ser usado como vacuna, el antgeno
recombinante consistente en el fragmento C de la toxina puede proteger (en diferentes grados) contra exposicin al
tetnica fusionado a su Ac-m correspondiente. El complejo patgeno o toxina. Finalmente, slo 3 productos han sido
inmune fijaba con avidez C1q y el receptor FcRIIa, lo cual estudiados en humanos (fase I): AgsHB para hepatitis B,
diriga a la molcula especficamente a clulas TL-B para ECET y PCNV para virus Norwalk, y mostraron
presentadoras de antgeno. Como resultado, el complejo repuestas inmunes leves o modestas; en ninguno de ellos
inmune era ltamente inmunognico cuando se administr se intent medir proteccin a la exposicin del patgeno.
s.c. a ratones (10,000 ms inmunognico que el antgeno Finalmente, como es usualmente el caso con tecnologas
solo) sin requerir el uso de adyuvantes, y los animales nuevas, existe la posibilidad de usar estos sistemas para
estuvieron completamente protegidos cuando se les aplicaciones novedosas, tales como la produccin
administr una dosis letal de toxina tetnica. Estos reportes econmica de reactivos diagnsticos, y el uso de plantas
confirman la posibilidad de sintetizar protenas de patgenos para inducir tolerancia contra antgenos dainos (como los
humanos en plantas y de expresar varios componentes que producen enfermedades autoinmunes o alergias) o para
simultneamente. tratar neoplasias.
Pero todava hay barreras importantes que vencer antes
III. OTROS USOS de que los antgenos derivados de plantas alcancen uso
Similarmente a lo que hemos descrito para vacunas rutinario en medicina. Tenemos que entender mejor la
humanas, el sistema de plantas ha sido utilizado naturaleza del antgeno que se puede usar (protena vs
extensamente para la produccin de vacunas de uso otros), los mecanismos de procesamiento y sntesis, el
veterinario. 90 Tambin se ha usado para producir reactivos trfico intracelular (especialmente por el retculo
de bajo costo con fines diagnsticos, tales como AgcHB, 91 endoplsmico y vesculas intracelulares), mejorar el nivel
VP6 de rotavirus 92 y p24 de VIH-1. 93, 94 Ninguno de estos de antgeno producido, la mejor ruta de administracin (oral
antgenos induce anticuerpos neutralizantes de modo que vs otras mucosas), y qu tan seguro es el producto. An
no tienen utilidad como vacunas. Otros usos importantes cuando la ingestin de plantas es por naturaleza seguro,
incluye la sntesis de antgenos para prevenir o modificar existe la posibilidad terica de que la presentacin de un
enfermedades mediadas por el sistema inmune tales como antgeno forneo en la planta lleve a una respuesta no
diabetes tipo 1, 95, 96 alergias, 97, 98 Azheimer 99 y terapia contra natural, sea a la planta o al antgeno forneo. Tericamente
cncer. 100, 101 pudiera ocurrir tolerancia (en vez de respuesta inmune) al
antgeno forneo o alergia (en vez de tolerancia) al antgeno
de la planta. Ninguna de estas dos circunstancias se han
CONCLUSION detectado hasta el momento (cierto que hay muy poca
Por siglos plantas han provedo a los seres humanos con experimentacin humana). Las plantas transformadas son
productos de valor teraputico; estos productos en su mayor organismos genticamente modificados y como tales
parte han sido descubiertos en forma fortuita o por un largo requieren de un control riguroso. Cuando llegue el momento
proceso de prueba emprica. La era de manipulacin y si es que la tecnologa prueba ser exitosa los productos
gentica intencional de plantas para producir productos sern considerados medicamentos bajo las
mdicos es reciente; los resultados son preliminares pero correspondientes regulaciones. Contrario a lo que algunos
de gran esperanza y posibilidades. creen, estos productos no van a ser vacunas comestibles;
En conjunto los estudios muestran - como prueba de no sern frutas o vegetales de distribucin y consumo libre
concepto - que los genes de patgenos humanos, tales sino medicamentos que se deben administrar en dosis y
como virus o bacteria (y tericamente otros), pueden esquemas fijos y regulados. An as, dada su versatilidad,
insertarse al cromosoma de plantas y que estas plantas bajo precio y conveniencia, la produccin de
(dado el promotor y seales de trfico intracelular adecuado) inmunobiolgicos en plantas es una tecnologa que debe
pueden sintetizar la protena y ensamblarla con la continuarse explorando.
configuracin espacial correcta. Ms an, protenas
humanas (tales como inmunoglobulinas, albmina, insulina)
pueden sintetizarse en plantas. Se ha sintetizado protenas
de diferentes tamaos, desde pequeos pptidos hasta REFERENCIAS
protenas grandes. Se puede sintetizar molculas que de
acuerdo a sus caractersticas fsicas y qumicas pueden 1. Hausdorff WP. Prospects for the use of new vaccines
permanecer como partculas solubles, agregarse en in developing countries: cost is not the o n l y
oligomeros (como pentmeros de TC-B o TL-B), complejos impediment. Vaccine 1996;14:1179-1186.
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