Aptmeros y Chips de

Protenas
Biotecnologa
Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo

Los aptmeros son cidos nucleicos de cadena sencilla, ADN o ARN, que reconocen
una gran variedad de molculas. Cada aptmero posee una estructura tridimensional
particular que le permite unirse con afinidad y especificidad altas a la molcula diana.
Los aptmeros tienen propiedades de reconocimiento equiparables a las de los
anticuerpos; sin embargo, por la naturaleza de su composicin tienen ventajas
significativas en cuanto a su tamao, produccin y modificacin. Estas caractersticas
los hacen excelentes candidatos para el desarrollo de nuevas plataformas
biotecnolgicas. Todos estos avances ocurridos durante las dos ltimas dcadas
permiten anticipar el protagonismo que tendrn los aptmeros como agentes
diagnsticos y teraputicos en un futuro cercano. Los aptameros y los chips de
protenas se utilizan en el diagnostico y tratamiento de enfermedades.
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Aptmeros y
Chips de
Protenas
Biotecnologa

APTAMEROS
DIFINICION

Los aptmeros son cidos nucleicos de cadena sencilla, ADN o

ARN, que reconocen una gran variedad de molculas.
Cada aptmero posee una estructura tridimensional particular
que le permite unirse con afinidad y especificidad altas a la
molcula diana. Los aptmeros tienen propiedades de
reconocimiento equiparables a las de los anticuerpos; sin
embargo, por la naturaleza de su composicin tienen ventajas
significativas en cuanto a su tamao, produccin y
modificacin. Estas caractersticas los hacen excelentes
candidatos para el desarrollo de nuevas plataformas
biotecnolgicas. Se han identificado aptmeros con
propiedades teraputicas que han sido evaluados
exitosamente en modelos animales; entre ellos, algunos se
encuentran en fase clnica y uno ya fue aprobado para
tratamiento por la FDA (Food and Drug Administration). Todos
estos avances ocurridos durante las dos ltimas dcadas
permiten anticipar el protagonismo que tendrn los
aptmeros como agentes diagnsticos y teraputicos en
un futuro cercano.

CARACTERISTICAS DE LOS APTAMEROS

La posibilidad de obtener aptmeros bajo condiciones

diferentes a las fisiolgicas abre la puerta para la seleccin de

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elementos de reconocimiento en condiciones no convencionales. Un ejemplo de la versatilidad en

este aspecto es la toxicidad de una molcula diana. La seleccin de aptmeros no se ve limitada en
ningn caso por la toxicidad u otras condiciones diferentes a las fisiolgicas, dado que el proceso se
lleva a cabo in vitro. Esta es una ventaja de los aptmeros con respecto a los anticuerpos, que
generalmente solo pueden ser generados en condiciones fisiolgicas, en las que la toxicidad es un
factor determinante. Por lo anterior, es poco probable o no viable el desarrollo de anticuerpos para
un gran nmero de toxinas. En la actualidad se ha seleccionado un buen nmero de aptmeros que
reconocen una gran variedad de molculas diana , entre las cuales se encuentran: toxinas,
compuestos inorgnicos y orgnicos, nucletidos y sus derivados, cofactores, aminocidos,
carbohidratos, antibiticos, pptidos y protenas, al igual que estructuras complejas como clulas.
Esta diversidad de aptmeros, aunada al hecho de que su seleccin se hace sin importar el pH o la
toxicidad de la molcula diana, lleva a considerar el SELEX como un mtodo genrico que
tericamente permitira seleccionar aptmeros para cualquier molcula bajo las condiciones elegidas.
La afinidad de los aptmeros se encuentra muy frecuentemente en un rango bajo de nanomolaridad,
similar a la reportada para los anticuerpos.

En los aptmeros la afinidad est ligada al nmero de ciclos de SELEX que se lleven a cabo y a la
efectividad del proceso de separacin de secuencias que se unen con alta o baja afinidad a la
molcula diana. En algunos casos ha sido posible obtener aptmeros con afinidades destacadas que
evidentemente superan a los anticuerpos y para las que se reportan valores de un dgito picomolar.
La especificidad mostrada por los aptmeros es otra caracterstica interesante de estos elementos de
biorreconocimiento, que se evidencia en su capacidad para diferenciar cambios estructurales
mnimos entre la molcula diana y molculas inespecficas. Un ejemplo claro de esta caracterstica es
el aptmero antiteofilina, que distingue especficamente la teofilina de la cafena, a pesar de que solo
un grupo metilo diferencia estas dos molculas. En la mayora de las aplicaciones mdicas, se logran
altos niveles de afinidad y especificidad utilizando anticuerpos, pero existen limitaciones en el uso
de estos en diversas pruebas clnicas. Algunas de estas limitaciones estn relacionadas
principalmente con su produccin (se requieren animales o clulas), variabilidad de cada lote de
anticuerpos, frecuente inmunogenicidad, su tamao que dificulta el acceso a compartimentos
biolgicos pequeos y su susceptibilidad en procesos de desnaturalizacin. En contraste, los
aptmeros se seleccionan in vitro y se generan de forma reproducible utilizando procedimientos
convencionales de sntesis en fase slida con el mtodo de la fsforo-amidita. De igual forma, se los
puede modificar fcilmente en el proceso de sntesis para mejorar su estabilidad frente a nucleasas o
adicionarles grupos funcionales (ejemplo: grupos fluorescentes) para incrementar su aplicabilidad.
La tabla 1 muestra las principales ventajas y desventajas en el uso de aptmeros y anticuerpos.

Se ha explorado la utilizacin de aptmeros como elementos de biorreconocimiento en el desarrollo

de numerosos tipos de biosensores, integrndolos de forma eficiente a distintos sistemas
transductivos. Una ventaja de los aptmeros en el desarrollo de biosensores es la estabilidad durante
su vida til, que es generada por su naturaleza qumica. Los aptmeros pueden ser desnaturalizados

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mediante aumento de la temperatura o del pH, pero luego pueden retornar a su estado activo
utilizando las condiciones ptimas de reconocimiento (buffer, temperatura, etc.). Todo lo anterior
contrasta con los anticuerpos en los que cualquier episodio de desnaturalizacin generalmente les
produce una prdida en la capacidad de reconocimiento y por lo tanto en su funcin en un sensor.

METODO PARA LA GENERACION DE APTAMEROS

La qumica combinatoria consiste en la sntesis de un nmero significativo de molculas de

estructura similar que forman colecciones (bibliotecas) consiguiendo una gran diversidad qumica, y
en la cual se puede tamizar una molcula diana para encontrar miembros (es decir, secuencias) de
dicha biblioteca que presenten afinidad. En SELEX, estas secuencias individuales se han
denominado aptmeros. El mtodo SELEX (figura 1) consiste en la seleccin de los miembros de una
biblioteca (aproximadamente 1015 secuencias diferentes) que se unen a la molcula diana. Se puede
dividir este mtodo en tres pasos principales: 1) la interaccin entre los miembros de la biblioteca y
la molcula diana; 2) la seleccin de los miembros que poseen afinidad por la molcula diana y 3) el
enriquecimiento de la biblioteca mediante amplificacin usando PCR (por la sigla en ingls de
polymerase chain reaction). La composicin natural de los aptmeros incluye ADN y ARN. Sin
embargo, se han incorporado satisfactoriamente al proceso enzimtico o de sntesis secuencias con
cidos nucleicos modificados. Estos ltimos han sido evaluados exitosamente mediante ensayos in
vitro o modelos in vivo. En el caso de ADN-SELEX, la doble cadena se separa y una de sus cadenas
sencillas es la forma funcional de la biblioteca. En ARN-SELEX se requieren la transcripcin para

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hacer funcional la biblioteca partiendo de ADN y la transcripcin reversa para enriquecerla

posteriormente mediante PCR.

APLICACIONES DE LOS APTAMEROS

1. Aptmeros en el diagnstico clnico

A pesar de los grandes avances en la identificacin de aptmeros y la utilidad demostrada como

molculas de biorreconocimiento, solo en algunos casos se los ha utilizado en el diagnstico en
muestras clnicas. Por esa razn, se puede decir que an falta un paso definitivo que genere
evidencia sobre su aplicabilidad en dicho diagnstico. Sin embargo, un gran avance en esta direccin
lo estn llevando a cabo Gold y colaboradores. Recientemente han descrito un sensor protemico
basado en aptmeros que mide simultneamente 813 protenas diferentes provenientes de una
pequea muestra de sangre. La efectividad clnica de este multisensor se demostr mediante la
identificacin del perfil de protenas de enfermedades como la falla renal crnica y el cncer de
pulmn. Es, sin duda, un buen comienzo para la entrada definitiva de los aptmeros en el campo del
diagnstico clnico. Otro buen ejemplo en este sentido es el aptmero anti-IgE que se utiliz en la
identificacin de IgE presente en el suero sanguneo de 50 muestras clnicas. Utilizaremos este

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aptmero como modelo ilustrativo de la aplicabilidad de estos elementos de biorreconocimiento en

muestras clnicas.

Aptmero anti-IgE: Las personas que sufren cuadros alrgicos presentan con frecuencia niveles
elevados de IgE comparadas con las no alrgicas. Por lo tanto, se puede deducir la importancia de
cuantificar los niveles de IgE en el tratamiento de un episodio alrgico. La determinacin de IgE se
hace generalmente mediante ELISA o radioinmunoanlisis (RIA). Sin embargo, estos mtodos son
costosos y consumen mucho tiempo. Partiendo de la necesidad de una deteccin de IgE mucho ms
rpida y confiable, Yao y colaboradores desarrollaron un sensor basado en aptmeros que mide en
15 minutos los niveles de IgE, de forma especfica y reproducible. Este sensor utiliza una
microbalanza de cristal de cuarzo en la que previamente se ha inmovilizado el aptmero anti-IgE.
Una vez que dicho aptmero reconoce la IgE en solucin (suero), el biosensor traduce su nivel que es
directamente proporcional a la masa depositada en l (figura 3). Este tipo de dispositivos abre una
puerta hacia la utilizacin generalizada de aptmeros en muestras clnicas, campo en el que an
predominan los anticuerpos como molculas de biorreconocimiento. Es posible entonces, que la
tecnologa basada en aptmeros sea una alternativa futura para el diagnstico clnico, cuando se
generen sensores eficientes y de bajo costo que puedan competir con los mtodos convencionales.

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2. Aptmeros como agentes teraputicos

Los aptmeros han tenido un gran impacto en el desarrollo de nuevas terapias; se destacan las
orientadas a las enfermedades hematolgicas, el cncer y la infeccin por VIH. En la revisin llevada
a cabo por Keefe y colaboradores, se recopilaron los aptmeros ms destacados en modelos
teraputicos. Los aptmeros se pueden usar en dos formas diferentes en el desarrollo de procesos
teraputicos: 1. Como molculas efectoras para reconocer un receptor y ejercer directamente la
funcin teraputica; 2. Como vehculos para la entrega de una molcula secundaria. En este caso, se
utiliza el aptmero nicamente como elemento

de biorreconocimiento, que es modificado con la molcula secundaria encargada de la accin

teraputica. Dada la facilidad de modificacin de los aptmeros, incluso en el proceso de sntesis,
actualmente estn compitiendo con pptidos y anticuerpos en el desarrollo de nuevos enfoques
teraputicos, lo que evidencia el notorio avance logrado durante los ltimos aos en este campo. En
la actualidad ocho aptmeros se encuentran en fase clnica y uno ya fue aprobado para uso clnico
(tabla 2). Este ltimo es el aptmero anti-VEGF (por la sigla en ingls de vascular endothelial growth
factor) y lo analizaremos ms detenidamente a manera de ejemplo.

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Aptmero anti-VEGF El anti-VEGF (pegaptanib - Macugen) es el primer aptmero aprobado por

la FDA y se lo utiliza en el tratamiento de la degeneracin macular asociada a la edad (DMAE). Esta
enfermedad oftalmolgica se caracteriza por el deterioro de la mcula, tejido de color amarillento
sensible a la luz, localizado en el centro de la retina, cuya funcin est ligada a la nitidez visual; por
lo tanto, est encargado de las percepciones visuales finas. El proceso patolgico consiste en la
prdida de nitidez y agudeza visuales. De hecho, la DMAE es la principal causa mundial de ceguera.
Por esta razn, se han hecho esfuerzos significativos para el desarrollo de nuevas terapias para esta
enfermedad. Una de las estrategias se basa en utilizar el aptmero anti-VEGF inyectado intravtreo
que reconoce la molcula VEGF165, lo que inhibe la unin a su receptor natural y es as como se
genera el proceso teraputico, porque se evita la proliferacin y migracin de vasos sanguneos hacia
el humor vtreo . Los reportes de la utilizacin de este aptmero son promisorios: ha generado una
inhibicin de 65% y 80% en modelos animales y 80% de los pacientes que participaron en las
pruebas clnicas se estabilizaron o mejoraron despus de tres meses de tratamiento. En la actualidad
ms de 50.000 pacientes han sido tratados con pegaptanib con resultados satisfactorios. Con base en
aptmeros hay, sin lugar a dudas, una posibilidad real de desarrollar nuevos enfoques teraputicos y
cabe destacar que se estn adelantando pruebas clnicas para otros aptmeros de los que se tendrn
noticias en los prximos aos. Esperamos entonces que el aptmero anti-VEGF sea solo el inicio de
una generacin de nuevos agentes teraputicos.

CHIPS DE PROTEINAS

Para la deteccin de pptidos y protenas, adems de las tcnicas de electroforesis bidimensional y la

cromatografa lquida con espectrometra de masas.

Recientemente han aparecido al menos dos sistemas de biochips adaptados a la identificacin de

estas molculas, cuyo desarrollo promete abaratar y agilizar los procesos de caracterizacin de estos
biocompuestos.

Ambos sistemas se fundamentan en la especificidad de la unin entre protenas.

DEFENICION

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Los arrays de protenas son una plataforma que permite el anlisis masivo, en paralelo y simultneo
de interacciones proteicas.

Hasta la fecha, se han desarrollado y empleado diferentes formatos de arrays de protenas en

distintas aplicaciones, donde se incluyen la identificacin de biomarcadores o el desarrollo de
vacunas. Los microarrays de ADN, que se han convertido en los ms utilizados microarrays.

CONSTITUCIN

El chip consta de una superficie de soporte tal como un portaobjetos de vidrio, membrana de
nitrocelulosa, perla o placa de microtitulacin, a la que una serie de protenas de captura es obligada.
de la sonda molculas, normalmente marcados con un colorante fluorescente, se aaden a la matriz.
Cualquier reaccin entre la sonda y la protena inmovilizada emite una seal fluorescente que es
ledo por un escner lser.

IMPORTANCIA DE LOS CHIPS DE PROTEINAS

Microarrays de protenas se desarrollaron debido a las limitaciones del uso de microarrays de

ADN para determinar los niveles de expresin gnica en protemico.
Es un sistema rpido, no costoso.
Microarrays de protenas reemplaza las tcnicas tradicionales tales como la protemico
electroforesis 2D en gel o cromatografa, que se consume mucho tiempo, mano de obra y tratos
adecuado para el anlisis de protenas de baja abundancia.

TIPOS DE MATRICES

1. Microarrays analticos conocidos como matrices de captura:

En esta tcnica, una biblioteca de anticuerpos, aptmeros o aficuerpos se visti sobre la superficie de
apoyo. Estos se utilizan como molculas de captura ya que cada une especficamente a una protena
particular.

2. Microarrays de protenas funcionales (matrices de protena diana):

Se construyen mediante la inmovilizacin de grandes cantidades de protenas purificadas y se

utilizan para identificar protena-protena, protena-DNA, en protenas de ARN, en protenas
fosfolpido, y las interacciones de molculas de protena pequeas, para ensayar actividad
enzimtica y para detectar anticuerpos.

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3. Microarrays de protenas de fase inversa (RPPA)

implican muestras complejas, tales como lisados de tejidos. Se aslan las clulas de diversos tejidos
de inters y se lisan. El lisado se visti sobre el microarrays y se sonde con anticuerpos contra la
protena diana de inters.

APLICACIONES DE LOS CHIPS DE PROTEINAS

Hay cinco reas principales en las que se estn aplicando arrays de protenas: diagnstico, la
protemico, anlisis funcional de protenas, caracterizacin de anticuerpos y desarrollo del
tratamiento

Diagnstico

implica la deteccin de antgenos y anticuerpos en muestras de sangre; la elaboracin de perfiles de

los sueros para descubrir nuevas enfermedades biomarcadores; la vigilancia de las enfermedades y
las respuestas a la terapia en la medicina personalizada; la vigilancia del medio ambiente y la
comida.

Caracterizacin de anticuerpos

est caracterizando reactividad cruzada, especificidad y cartografa eptopos.

La protemico

se refiere a la expresin de protenas de perfiles, es decir, que las protenas se expresan en el lisado
de una clula particular.

Anlisis funcional

La protena es la identificacin de las interacciones protena-protena (por ejemplo, identificacin de

los miembros de un complejo de protenas), las interacciones protena-fosfolpido, blancos pequeos
de molculas, enzimticos sustratos (en particular los sustratos de quinasas) y los ligandos del
receptor.

El tratamiento

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implica el desarrollo el desarrollo de terapias especficas de antgeno para la autoinmunidad, el

cncer y las alergias; la identificacin de objetivos pequeos molcula que potencialmente podra ser
utilizado como nuevos medicamentos.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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1990 Aug 30;346(6287):81822.

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Apr;3(6):75166.

4. Wang RE, Wu H, Niu Y, Cai J. Improving the stability of aptamers by chemical modification. Curr
Med Chem. 2011 Jan;18(27):412638.

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