UNIVERSIDAD DE ORIENTE

NCLEO DE ANZOTEGUI
ESCUELA DE INGENIERA Y CIENCIAS APLICADAS
DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA
ANLISIS INSTRUMENTAL

Cromatografa Lquida de Alta Presin

(HPLC)

Profesor: Pea, Luis Integrantes:

- Heneech, Gabriel 26.958.570
- Villavicencio, Andrea 26.385.848

Febrero, 2017
 INTRODUCCIN
La cromatografa lquida (LC) fue definida a principios del siglo XX por el trabajo del
botnico ruso Mikhail S. Tswett. Sus estudios pioneros se enfocaron en la separacin
de compuestos [pigmentos foliares], extrados de plantas usando un disolvente, en una
columna llena de partculas.
Tswett llen una columna de cristal abierta con partculas. Dos materiales especficos
que encontr tiles fueron tiza en polvo [carbonato de calcio] y almina. Verti su
muestra [extracto disolvente de hojas de plantas homogeneizadas] en la columna y le
permiti pasar al lecho de partculas. A esto le sigui un disolvente puro. A medida que
la muestra pasaba a travs de la columna por gravedad, se podan distinguir diferentes
bandas de color porque algunos componentes se movan ms rpido que otros. l
relacion estas bandas separadas, de color diferente a los diferentes compuestos que
originalmente estaban contenidos en la muestra. Haba creado una separacin
analtica de estos compuestos basada en la fuerza diferente de la atraccin qumica
de cada compuesto a las partculas. Los compuestos que se atraen ms fuertemente
a las partculas se ralentizan, mientras que otros compuestos ms fuertemente
atrados al disolvente se mueven ms rpido. Este proceso se puede describir como
sigue: los compuestos contenidos en la muestra se distribuyen, o se dividen de forma
diferente entre el disolvente en movimiento, denominado fase mvil, y las partculas,
denominadas fase estacionaria. Esto hace que cada compuesto se mueva a una
velocidad diferente, creando as una separacin de los compuestos.
Tswett acu la cromatografa conocida (de las palabras griegas chroma, que significa
color y grfico, que significa escritura, literalmente, escritura en color] para describir su
colorido experimento. Hoy en da, la cromatografa lquida, en sus diversas formas, se
ha convertido en una de las herramientas ms poderosas de la qumica analtica.
Especficamente, trataremos en este trabajo la cromatografa lquida de alto
rendimiento (HPLC) que es una forma de cromatografa en columna que bombea una
mezcla de muestras o analito en un disolvente (conocida como fase mvil) a alta
presin a travs de una columna con material de empaque cromatogrfico (fase
estacionaria). La muestra es transportada por una corriente de gas portador mvil de
helio o nitrgeno. La HPLC tiene la capacidad de separar e identificar compuestos que
estn presentes en cualquier muestra que puede disolverse en un lquido en
concentraciones de trazas tan bajas como partes por trilln. Debido a esta versatilidad,
HPLC se utiliza en una variedad de aplicaciones industriales y cientficas, tales como
farmacutica, medioambiental, forense y productos qumicos.

3
 CONTENIDO

Introduccin
pg
I Cromatografa Lquida de Alta Presin (HPLC) 1
II Tipos de cromatografa lquida 2

2.1 Cromatografa de reparto 2

2.1.1 Cromatografa en fase normal 3
2.1.2 Cromatografa en fase reversa 4
2.1.3. ndice de polaridad 6
2.2 Cromatografa de adsorcin 7
2.3 Cromatografa inica 8
2.4 Cromatografa de exclusin 9

III COMPONENTES de un cromatgrafo 10

3.1 Bomba de impulsin 10

3.2 Regulador de impulsos 10
3.3 Sistema de inyeccin 11
3.4 Columnas 12
3.4.1 Columnas analticas 12
3.4.2 Pre columnas 12
3.4.3 Termostatos 13
3.4.4 Tipos de rellenos de la columna
3.5 Detectores 13
3.5.1 Detectores de absorbancia 14
3.5.2 detectores de absorbancia ultravioleta con filtros 14
3.5.3 Detectores de absorbancia ultravioleta con monocromadores 14
3.5.4 Detectores de absorbancia en el infrarrojo 15
3.5.5 Detectores de fluorescencia 15
3.5.6 detectores de ndice de refraccin 16
3.5.7 Detector de dispersin de luz 16
3.5.8 Detectores electroqumicos 16
IV Conclusin 17
V Bibliografa 18

4
 I CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA PRESIN (HPLC)
La Cromatografa Lquida de Alta Presin (HPLC) o Resolucin es una tcnica de
permite separar, aislar e identificar los analitos de una mezcla de compuestos qumicos
(basada en la transferencia de masa entre la fase estacionaria y la fase mvil), por lo
que es utilizada frecuentemente en Bioqumica y Qumica Analtica para la separacin
de componentes de una sustancia determinada, basndose en diferentes tipos de
interacciones qumicas. Recientemente es una de las tcnicas ms utilizada en la
industria Qumica y de alimentos, ya que ofrece la posibilidad de identificar y cuantificar
sus componentes mediante el uso de sustancias patrn. La cromatografa de lquidos
abarca un grupo muy amplio entre los mtodos cromatogrficos, puesto que el sistema
ternario fase estacionaria/fase mvil/analito ofrece muchas y muy distintas
posibilidades para separar compuestos qumicos muy diferentes.
La cromatografa lquida clsica se lleva a cabo en una columna generalmente de
vidrio, la cual est rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte
superior, se hace fluir la fase mvil a travs de la columna por efecto de la gravedad.
Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamao de las partculas
de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamao delos micrones, lo cual gener la
necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase mvil. De esta
manera, naci la tcnica de cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), que
requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones
requeridas. La descripcin de la HPLC no se puede basar solo en la instrumentacin
sino que tambin hay que ofrecer una aproximacin sistemtica para lograr
separaciones adecuadas.
En la actualidad HPLC ha llegado a ser una de las Tcnicas del laboratorio moderno
ms importantes como herramienta analtica para separar y detectar compuestos
qumicos. Como en todas las tcnicas analticas, los pequeos problemas a la larga
pueden llegar a tener un mayor impacto en la exactitud y durabilidad del sistema. Aun
con la evolucin de los cromatgrafos lquidos en la era de la computadora, hay an
problemas que sta no puede resolver.
Hasta los Solventes para HPLC, todos filtrados cuidadosamente en la fbrica, pueden
acumular partculas en suspensin que pueden ser perjudicial a los componentes del
sistema HPLC. Estas partculas en suspensin pueden venir de varias fuentes, incluso
de la exposicin al polvo en el aire durante el trasegado de solvente en el depsito
para solvente, la exposicin a particulares del aire durante el almacenamiento del
solvente en el depsito del solvente, la degradacin lenta del recipiente solvente, o de
condensacin y polimerizacin del solvente. Las partculas pueden ocasionar costosos
daos a la bomba HPLC, al guarda columnas, y en general causar desgaste del
sistema de HPLC. Los fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta este problema
y recomiendan que se filtre y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos.
La HPLC utiliza una fase mvil lquida para separar los componentes de la muestra.
Los componentes se disuelven en un disolvente y a continuacin se hacen pasar por
la columna a una gran presin. A continuacin, interactan con la fase estacionaria y
salen en momentos distintos, igual que ocurre con la cromatografa de gases. Si una
1
cantidad excesiva de gas permanece disuelta en la fase mvil lquida a la presin de
la columna, el gas puede salir del detector y provocar grandes picos no deseados.
Estos pueden eliminarse mediante el burbujeo de helio de gran pureza a travs del
lquido cuando el sistema HPLC no disponga de un desgasificador integrado. El helio
debe presentar unos niveles bajos de hidrocarburos, ya que estos pueden disolverse
en el disolvente y generar ruido de lnea base.
Cabe destacar que se tienen dos fases cromatografas:
- Fase mvil: que fluye a travs de una fase estacionaria, arrastrando con ella a los
compuestos de la mezcla.
- La fase estacionaria: en la cual estn retenidos los componentes de la muestra, y a
travs de la cual fluye la fase mvil arrastrando a los mismos.

II TIPOS DE CROMATOGRAFA LQUIDA

2.1 Cromatografa de reparto:

Consiste en la separacin de los componentes de una mezcla sobre una fase

estacionaria constituida por un soporte slido inerte cubierto por una pelcula lquida
que es fuertemente retenida por dicha fase. La separacin se efecta por medio de
una fase fluida mvil que es el solvente de desarrollo que es inmiscible con el lquido
del soporte estacionario y que transporta los componentes a lo largo de la F. E. Los
componentes se van separando segn sean sus solubilidades relativas en el lquido
de la fase estacionaria y la fase mvil.
La cromatografa de reparto ha llegado a ser el tipo de cromatografa ms utilizado
de las cuatro modalidades de cromatografa de lquidos. En el pasado la mayora de a
las aplicaciones se han referido a compuestos polares, no inicos, de baja a moderada
masa molecular (habitualmente < 3000). Sin embargo, recientemente se han
desarrollado algunos mtodos (derivitalizacin y formacin de pares inicos) que han
extendido las separaciones de reparto a los compuestos inicos.
La cromatografa de reparto se puede subdividir en cromatografa liquido-lquido y
cromatografa de fase unida qumicamente. La diferencia entre estas tcnicas radica
en la forma que se retiene la fase estacionaria sobre la partcula soporte del relleno.
En liquido-liquido, la fase estacionaria lquida se retiene sobre la superficie del soporte
por adsorcin fsica. En fase unida qumicamente, la fase estacionaria se une
qumicamente a la superficie del soporte. En la actualidad los mtodos de fase unida
qumicamente son los que predominan debido a la desventaja de los sistemas lquido-
lquido. Una de esas desventajas es la perdida de la fase estacionaria por disolucin
en fase mvil, lo que hace necesario un peridico recubrimiento de las partculas del
soporte. Por otra parte, el problema de la solubilidad, de la fase estacionaria impide el
uso de los rellenos de la fase lquida en la elucin con gradiente.

2
En relacin con las polaridades relativas de las fases mvil y estacionaria, se
distinguen dos tipos de cromatografa de reparto. Inicialmente, la cromatografa de
lquidos usaba fases estacionarias de elevada polaridad tales como el agua o el
trietilenglicol soportadas sobre partculas de slice o almina; y como fase mvil se
empleaba un disolvente relativamente apolar como el hexano o el iso-propileter. Por
razones histricas, a este tipo de cromatografa se le conoce ahora como
cromatografa en fase normal. En la cromatografa en fase inversa, l fase estacionaria
es no polar, con frecuencia se trata de un hidrocarburo, y la fase mvil es relativamente
polar (como el agua, el metanol o el acetonitrilo).
2.1.1 Cromatografa en fase Normal
La cromatografa de fase normal o "Normal phase HPLC" (NP-HPLC) fue el primer tipo
de sistema HPLC utilizado en el campo de la qumica, y se caracteriza por separar los
compuestos en base a su polaridad. Esta tcnica utiliza una fase estacionaria polar y
una fase mvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de inters es bastante polar.
El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de
absorcin aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interaccin
entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparacin a la fase mvil)
aumenta el tiempo de retencin. La fuerza de interaccin no slo depende de los
grupos funcionales del compuesto de inters, sino tambin en factores estricos de
forma que los ismeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro.
La utilizacin de disolventes ms polares en la fase mvil disminuye el tiempo de
retencin de los compuestos mientras que los disolventes ms hidrofbicos tienden a
aumentar el tiempo de retencin.
En cromatografa en fase normal el componente menos polar se eluye primero, debido
a que relativamente es el ms soluble en la fase mvil y un aumento de la polaridad
de la fase mvil provoca una disminucin del timo de elucin.
En la Tabla N1 se muestran los compuestos ordenados segn su polaridad y su
elucin:

3
 Solvente Polaridad
n-Hexano
Menos
Isoctano polar o no
2,2,4- polar
Trimetilpentano
Tetraclorometano
o tetracloruro de
carbono
Triclorometano o
cloroformo
Diclorometano,
Cloruro de metilen
Tetrahidrofurano*
Acetona
cido actico
Metanol
Sulfuro di metlico Polar
Forma mida
agua

Tabla 1. Orden de polaridad y de elucin

en la cromatografa en fase normal.

2.1.2 Cromatografa en fase inversa

El sistema cromatogrfico de fase reversa fue inducido por Howard y Marln en 1950.
Hasta el momento, la cromatografa de lquidos se utilizaba bsicamente para separar
compuestos polares, siendo la fase estacionaria de un carcter altamente polar y la
fase mvil poco polar. Estos cientficos revirtieron la polaridad de las fases con el
objetivo de separar cidos grasos. As fue cmo surgi la fase reversa.
La tcnica de fase reversa, RPC (del ingls Reverse Phase Chromatography), se ha
convertido en el tipo de cromatografa ms ampliamente utilizada en HPLC e incluye
cerca de la mitad de los mtodos de la cromatografa de lquidos descritos en la
literatura. Esta tcnica proporciona retencin y selectividad ptimas cuando las
muestras tienen un carcter predominantemente aliftico o aromtico.
La RPC es un proceso de particin en donde los solutos estn distribuidos entre una
fase estacionaria no polar y una fase mvil polar. Los solutos no polares tienden a
adsorberse en la fase estacionaria y se mueven a travs del sistema ms lentamente
que los solutos polares.

4
Una de las fases estacionarias ms comunes de este tipo de cromatografa es la slica
tratada con RMe 2 SiCl, dnde la R es una cadena alquil tal como C18H37OC8H17.
El tiempo de retencin es mayor para las molculas de naturaleza apolar, mientras que
las molculas de carcter polar eluyen ms rpidamente.
Como fase mvil se emplean mezclas de disolventes apolares (hexano, pentano), con
disolventes polares (cloroformo, Diclorometano, T.H.F, Etanol, metanol o acetonitrilo).
Se utiliza para la separacin de compuestos muy polares que quedaran demasiado
retenidos en una cromatografa slido lquido. En este tipo de cromatografa el orden
de elucin est gobernado por interacciones de tipo polar: Los solutos ms polares
quedan ms retenidos, igual que en la cromatografa de adsorcin.
El mecanismo que se ha propuesto para explicar el mecanismo por el cual estas
superficies retienen a los solutos es el siguiente: Cuando un soluto se disuelve en
agua, las fuerzas de atraccin entre las molculas de agua se distorsionan o se
rompen. nicamente los solutos altamente polares o inicos pueden interaccionar con
la estructura del agua. Los solutos no polares casi no interactan con estas estructuras
y como consecuencia abandonan la fase mvil para adsorberse al hidrocarburo de la
fase estacionaria. La fuerza motriz de la retencin no es la interaccin favorable del
soluto con la fase estacionaria, sino el efecto de repulsin del disolvente por el soluto.

Figura 1. Relacin entre la polaridad y los tiempos de elucin en cromatografa

en fase normal y fase inversa.

5
2.1.3 ndice de polaridad
Los disolventes que interaccionan fuertemente con los solutos a menudo se les
denomina disolventes fuertes o disolventes polares. El ndice de polaridad,
desarrollado por Synder, es aquel que describe cuantitativamente la polaridad de los
disolventes. Este se basa en las medidas de solubilidad para la sustancia en cuestin
en tres disolventes: dioxano (un aceptor de protones de dipolo dbil), nitrometano ( un
aceptor de protones de dipolo intenso) y el etanol ( un dador de protones de dipolo
intenso). El ndice de polaridad es una medida numrica de la polaridad relativa de los
disolventes. En la tabla 2 da una relacin de los ndices de polaridad para varios
disolventes que se usan en la cromatografa de reparto.

Disolvente ndice de polaridad

Tabla 2. ndices de polaridad de algunos

compuestos usados en la cromatografa de
reparticin

6
2.2 Cromatografa de adsorcin:
Es la propiedad que tienen ciertos solidos de aumentar la concentracin en su
superficie de otras sustancias. La separacin se debe a las diferencias de adsorcin
de los componentes de una mezcla sobre la fase estacionaria. Esta fase estacionaria
ha de ser un slido polar de gran superficie (adsorbente). En este mtodo la fase mvil
puede ser un gas o un lquido dando lugar a la cromatografa gas-solido o liquido-
solido.
El grado de adsorcin va a variar segn la naturaleza y superficie especifica de los
adsorbentes y naturaleza de los solutos.
Para que la separacin de los componentes de la mezcla sea efectiva, su velocidad
de migracin a lo largo de la columna debe ser suficientemente diferente y la longitud
de la columna adecuada.
Algunos adsorbentes comnmente utilizados son: gel de slice, almina, sacarosa y
almidn.
La fase mvil consiste en un disolvente o mezcla de disolventes, seleccionado en
base a su polaridad con el fin de optimizar la separacin de los componentes de la
muestra en la columna. La fase mvil se desplaza a lo largo de la fase estacionaria
debido a la fuerza de la gravedad.
Con respecto a la forma en que sucede el fenmeno; bsicamente se llena la columna
hasta un tercio de su altura con eluyente. A continuacin, se prepara una suspensin
del adsorbente (fase estacionaria) en el eluyente (fase mvil) y se vierte lentamente
(para evitar la formacin de burbujas) en el interior de la columna. Esta operacin se
puede realizar en varias adiciones, aadiendo ms eluyente a la suspensin a medida
que sea necesario. Con el fin de favorecer una distribucin ms uniforme del
adsorbente en la columna, as como eliminar las pequeas burbujas que se puedan
haber formado, se puede golpear suavemente la pared externa de la columna comn
tubo de goma. La columna se llena hasta aproximadamente la mitad de su altura,
reservndose la parte superior para la fase mvil. Se abre la llave de la columna y se
deja fluir el eluyente hasta que la altura de ste en la columna quede aproximadamente
un milmetro por encima del adsorbente. La superficie de la fase estacionaria debe
presentar un aspecto uniforme, liso y perpendicular al eje longitudinal de la columna.
A lo largo del proceso cromatogrfico la columna nunca debe secarse, esto es,la fase
estacionaria debe encontrarse en todo momento cubierta por la fase mvil, yaque de
lo contrario la fase estacionaria se contraera y agrietara.
La muestra se deposita (siembra) en la superficie superior del adsorbente contenido
en la columna con la ayuda de una pipeta. Si la muestra es lquida se puede sembrar
directamente, si es slida se siembra una solucin concentrada de la misma en un
disolvente adecuado (de baja polaridad). Para evitar que se deforme la superficie del
adsorbente durante la adicin, se puede depositar la muestra en la pared interior de la
columna permitiendo que resbale hasta la superficie del adsorbente. Finalizada la
adicin de la muestra se abre la llave de la columna y se eluye hasta que la muestra

7
sea adsorbida y el nivel del lquido quede aproximadamente 1 mmpor encima de la
superficie del adsorbente. Se lavan las paredes internas de la columna (por las que se
ha dejado resbalar la muestra) con un poco de eluyente y se eluye de nuevo hasta que
el nivel del lquido vuelva a quedar 1 mm por encima de la superficie del adsorbente.
2.3 Cromatografa inica:

La cromatografa de intercambio inico es un mtodo que permite la separacin de

molculas basada en sus propiedades de carga elctrica. Se compone de dos fases:
la fase estacionaria o intercambiador inico, y la fase mvil. La fase estacionaria
insoluble lleva en la superficie cargas electrostticas fijas, que retienen contra iones
mviles que pueden intercambiarse por iones de la fase mvil, la cual suele ser una
disolucin acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgnico
miscible con agua que contiene especies inicas generalmente en forma de buffer. Los
iones de sta compiten con los analitos por los sitios activos de la fase estacionaria.
El principio bsico de la cromatografa de intercambio inico es que las molculas
cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas
molculas pueden ser asociadas o disociadas cambiando el ambiente inico. La
separacin mediante intercambiadores inicos se realiza por lo general, en dos fases:
en la primera las sustancias a separar se unen al intercambiador utilizando condiciones
que originan una unin fuerte y estable; a continuacin, se eluye de la columna con
buffers de diferentes pH o diferente fuerza inica, compitiendo los componentes del
buffer con el material por los sitios de unin.
Cuando una muestra inica atraviesa estas columnas, los iones presentes sufren una
separacin debido a las diferentes reacciones que sufren al interactuar con la fase
estacionaria de las columnas analticas: aquellos componentes que son retenidos con
ms fuerza por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase mvil;
por el contrario, los componentes que se unen ms dbilmente a la fase estacionaria,
se mueven con ms rapidez. Al salir de la columna, la muestra pasa a travs de un
detector (conductimtrico, amperomtrico, etc.) donde se registra la seal obtenida
respecto al tiempo de retencin. El resultado son unos cromatogramas donde la
posicin de los mximos nos indica el in presente y su rea nos indican la cantidad
existente de dicho in.

Las muestras pueden entregarse en la Unidad de Cromatografa de los SCI, entre las
8-15h, una vez registrada la solicitud en la Administracin.
Las muestras lquidas deben estar preparadas (filtradas a travs de un filtro de
0,45m), transportadas en viales adecuados, segn los requisitos de la muestra, y
conservadas a 4C.
Las muestras deben estar perfectamente identificadas, tanto en los viales como en la
solicitud de ensayo. Si el nmero de muestras es elevado, para evitar problemas de
almacenamiento, es posible entregar la orden de solicitud y no entregar las muestras
hasta el da en que los tcnicos comuniquen al usuario que van a comenzar el anlisis.

8
 El volumen mnimo de muestra depender del nmero y tipo de anlisis solicitados.
Consultar al coordinador tcnico antes de la entrega de muestras.
En el caso de muestras que se analizan por primera vez, es conveniente proporcionar
al coordinador de la unidad toda la informacin posible acerca de las mismas para la
optimizacin del mtodo (ej.: conductividad, pH, rango de concentracin aproximado
de analito si se conoce, etc.)

2.4 Cromatografa de Exclusin:

Es un mtodo de cromatografa en columna por el cual los tomos se separan en

solucin segn su peso molecular. En este mtodo se separan las protenas segn
su tamao. La fase solida consiste en pequeas perlas que contienen unos poros o
cavidades de tamao calibrado.
Algunas de sus ventajas es que trabaja con un peso molecular alto y tiene tiempos
de corrida cortos; se tienen tiempos de separacin y de orden de elucin fciles de
predecir. Adems, no existen prdidas o reacciones en las columnas y posee un
desarrollo del mtodo relativamente simple, sin gradientes.
En su contra se tiene que este proceso es limitado en cuanto a capacidad de pico
(baja resolucin); no puede resolver compuestos de tamao similar (ismeros); se
requieren diferentes estrategias para la optimizacin y este debe tener la capacidad
de poder disolver al polmero.
En este mtodo las protenas de mayor tamao no pueden entrar en las cavidades,
por ende, las de menor tamao si poseen esa capacidad de penetrar dichas
cavidades.

9
 III COMPONENTES DE UN CROMATGRAFO

1 2

Figura 2. Esquema de un aparato de HPLC

3.1 Bomba de impulsin:

sta bomba impulsa la sustancia a travs de conductos. stas no tienen lmite de

presin mxima de impulsin, esta presin de salida puede llegar a valores que ponen
en peligro la integridad de la bomba si el conducto de escape se cierra completamente.
Para garantizar el funcionamiento seguro de ella, es necesario la utilizacin de alguna
vlvula de seguridad que derive la salida en caso de obstruccin del conducto.

3.2 Regulador de impulsos

Muchos de los detectores utilizados en HPLC son sensibles a variaciones de flujo. Un

mtodo sencillo de amortiguacin contiene un fuelle flexible o un gas compresible en
la porcin superior cerrada de un tubo en T para absorber parte de la energa de
pulsacin. Cuando la bomba se rellena esta energa se libera para ayudar a suavizar
la pulsacin de presin. Los amortiguadores electrnicos de pulsos proporcionan una
carrera hacia delante corta y rpida del pistn, y enseguida la carrera rpida de recarga

10
de la bomba. El pequeo impulso hacia delante amortigua el pulso de flujo llevando
disolvente a la presin del sistema.
3.3 Sistema de inyeccin
A menudo, el factor limitante en la precisin de las medidas en cromatografa de
lquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna.
El problema se agrava por el ensanchamiento de banda que acompaa a la
sobrecarga de las columnas. Por ello, los volmenes que se emplean han de ser muy
pequeos, de unas pocas dcimas de microlitro a tal vez 500 L. Adems, se ha de
poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema.

En cromatografa de lquidos el mtodo ms ampliamente utilizado para la introduccin

de la muestra utiliza bucles de muestra, como el que se muestra en la Figura 4.4. Estos
dispositivos estn normalmente integrados en el equipo cromatogrfico y hay bucles
intercambiables que permiten la eleccin de tamaos de muestra desde 5 a 500 L.
Con bucles de este tipo se puede introducir la muestra a presiones de hasta 500
kg/cm2 con una precisin relativa de unas dcimas por ciento. Tambin existen
vlvulas de inyeccin de micromuestras, con bucles con volmenes de 0,5 a 5 L.

Figura 3. Bucle de muestra para cromatografa de lquidos

11
 3.4 Columnas

Las columnas para cromatografa de lquidos se construyen de ordinario con tubo de

acero inoxidable de dimetro interno uniforme. Cientos de columnas empaquetadas
que difieren en tamao y relleno se comercializan por distintos fabricantes y su coste
oscila, por lo general, de 30 000 a 100 000 pesetas.
3.4.1 Columnas analticas
La mayora de las columnas para cromatografa de lquidos tienen una longitud entre
5 y 30 cm. Por lo comn, las columnas son rectas y se pueden alargar, si es necesario,
acoplando dos o ms columnas. El dimetro interno de las columnas es a menudo de
4 a 10 mm y los tamaos de las partculas de los rellenos ms comunes son 3, 5 y 10
4 m.
Tal vez la columna ms frecuentemente utilizada es la de 25 cm de longitud y 4.6 mm
de dimetro interno, y empaquetada con partculas de 5 m. Estas columnas tienen
5 de 40 000 a 60 000 platos/metro.
Tambin, se han empezado a fabricar columnas de alta resolucin ms rpidas, las
cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente descritas. Estas columnas
pueden tener dimetros internos que oscilan entre 1 y 4.6 mm y se rellenan con
partculas de 3 o 5 m. A menudo su longitud es de 3 a 7.5 cm. Estas columnas tienen
hasta 100 000 platos/metro y presentan la ventaja de la rapidez y del mnimo consumo
de disolvente. La ltima propiedad es de considerable importancia, puesto que los di-
solventes de alta pureza que se requieren en cromatografa de lquidos son muy caros.

3.4.2 Precolumnas

En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna analtica, se coloca delante

una precolumna que elimina la materia en suspensin y los contaminantes de los
disolventes. Adems, en cromatografa lquido-lquido, la precolumna sirve para
saturar la fase mvil con la fase estacionaria y as minimizar las prdidas de sta en la
columna analtica. La composicin del relleno de la precolumna debe ser semejante al
de la columna analtica; sin embargo, el tamao de partcula es por lo comn mayor
para minimizar la cada de presin.

3.4.3 Termostatos

En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura, y las

columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces si se controla
la temperatura de la columna en unas pocas dcimas de grado centgrado, se obtienen
mejores cromatogramas. La mayora de los instrumentos comerciales llevan
actualmente hornos para las columnas que controlan la temperatura de la columna a
las dcimas de grado, desde la temperatura ambiente hasta 150 C. Para poder
controlar con precisin la temperatura, las columnas tambin se pueden colocar en
camisas con agua que provenga de un bao a temperatura constante.

12
3.4.4 Tipos de rellenos de la columna

En cromatografa de lquidos se han utilizado dos tipos bsicos de rellenos, pelicular y

de partcula porosa. El primero consiste en bolas de vidrio o de polmero, no porosas
y esfricas con unos dimetros caractersticos de 30 a 40 m. En la superficie de estas
bolas se deposita una capa delgada y porosa de slice, almina o de una resina de
intercambio inico. Para algunas aplicaciones se aplica un recubrimiento adicional,
constituido por una fase estacionaria lquida que se mantiene fija por adsorcin. Las
bolas tambin se pueden tratar qumicamente para obtener una capa superficial
orgnica. Por lo general, los rellenos peliculares se utilizan ampliamente en las
precolumnas y no en las columnas analticas.

Los tpicos rellenos de partculas porosas de cromatografa de lquidos estn

formados por micropartculas porosas con dimetros entre 3 y 10 m y con la menor
dispersin posible para un tamao determinado. Las partculas son de slice, almina
o resinas de intercambio inico, aunque la slice es el material ms comn. Las
partculas de slice se sintetizan aglomerando partculas de slice de tamaos inferiores
al micrn en unas condiciones tales que se forman partculas mayores con dimetros
muy unifor-mes. Las partculas que resultan se recubren muchas veces con pelculas
orgnicas, que se unen qumica o fsicamente a la superficie.

3.5 Detectores

Un detector ideal para cromatografa de lquidos debera poseer todas las propiedades
listadas en relacin con la cromatografa de gases, con la excepcin de que un detector
para cromatografa de lquidos no es necesario que sea sensible en un intervalo tan
grande de temperaturas. Adems, un detector de HPLC debe tener un volumen interno
mnimo a fin de reducir el ensanchamiento de banda.

Los detectores en cromatografia de lquidos son de dos tipos bsicos. Los detectores
basados en una propiedad de la disolucin responden a una propiedad de la fase
mvil, tal como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, o la densidad, que se
modifica por la presencia de los analitos. Por contraste, los detectores basados en una
propiedad del soluto responden a alguna de las propiedades del soluto, como la
absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de difusin, que no son propias de la fase
mvil.

3.5.1 Detectores de absorbancia

La Figura 4.5 muestra el esquema de una cubeta de flujo en forma de Z para la medida
de la absorbancia de los efluentes de una columna cromatogrfica. A fin de minimizar
el ensanchamiento de banda extracolumna, el volumen de estas cubetas ha de ser lo

13
menor posible, de modo que los volmenes se limitan por lo comn de 1 a 10 L y las
longitudes de la cubeta de 2 a 10 mm. La utilizacin de cubetas de este tipo est
restringida a presiones no mayores de unos 50 kg/cm2.

Figura 4. Celda de detector ultravioleta en HPLC

3.5.2 Detectores de absorbancia ultravioleta con filtros.

Los detectores de absorcin UV ms simples son los fotmetros de filtros con una
lmpara de mercurio como fuente. Lo ms comn en estos casos es aislar la lnea
intensa a 254 nm por medio de filtros; en algunos equipos tambin se pueden utilizar
las lneas a 250, 313, 334 y 365 nm empleando otros filtros. Resulta obvio que este
tipo de detector se utiliza de forma restringida para aquellos solutos que absorben a
alguna de estas longitudes de onda. Algunos grupos funcionales orgnicos y diversas
especies inorgnicas exhiben una banda ancha de absorcin a una o ms de esas
longitudes de onda.

3.5.3 Detectores de absorbancia ultravioleta con monocrornadores.

La mayora de los fabricantes de instrumentos de HPLC ofrecen detectores que

consisten en un espectrofotmetro de barrido con ptica de red. Algunos se limitan a
la radiacin ultravioleta; mientras que otros abarcan la radiacin ultravioleta y la visible.
Se pueden elegir varios modos operacionales. Por ejemplo, se puede obtener el
cromatograma completo a una sola longitud de onda o alternativamente, cuando los
picos que eluyen estn suficientemente separados, se puede elegir distinta longitud de
onda para cada pico. En este caso, debe emplearse el control por ordenador para
elegir la mejor longitud de onda en cada caso. Cuando se desean los espectros

14
completos con fines de identificacin, se puede parar el flujo del eluyente durante un
tiempo suficiente que permita el barrido de la regin de longitud de onda que interesa.

Los detectores espectrofotomtricos de ultravioleta ms potentes son los instrumentos

de series de diodos. Algunos fabricantes ofrecen este tipo de instrumentos, que
permiten recoger los datos de un espectro completo en aproximadamente un segundo.
De esta forma, los datos espectrales para cada pico cromatogrfico se pueden recoger
y almacenar a medida que van saliendo de la columna.

3.5.4 Detectores de absorbancia en el infrarrojo.

Comercialmente se ofrecen dos tipos de detectores de infrarrojo. El primero con

barrido de longitud de onda que proporcionan tres segmentos de filtro semicirculares.
El segundo, mucho ms sofisticado, es un tipo de detector infrarrojo que se basa en
los instrumentos de transformada de Fourier.
Las cubetas de los detectores de infrarrojo son semejantes a las de radiacin
ultravioleta excepto en que las ventanas se construyen de cloruro de sodio o de
fluoruro de calcio. Las longitudes de la cubeta oscilan de 0.2 a 1.0 mm, y los volmenes
de 1.5 a 10 L. Los instrumentos de infrarrojo ms sencillos pueden trabajar a una o
ms longitudes de onda; alternativamente, se pueden obtener los espectros de los
picos parando el flujo en su tiempo de elucin. Los instrumentos con transformada de
Fourier se utilizan de manera anloga a los instrumentos de series de diodos para las
medidas de absorbancia ultravioleta que se han descrito en la seccin anterior.

Una de las mayores limitaciones al uso de los detectores de infrarrojo se debe a la baja
transparencia de muchos de los disolventes que se utilizan. Por ejemplo, las bandas
anchas de absorcin infrarroja del agua y de los alcoholes impiden prcticamente el
uso de este detector para muchas aplicaciones.

3.5.5 Detectores de fluorescencia

Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseo a los

fluormetros y espectrofluormetros. En la mayora de ellos, la fluorescencia se detecta
por medio de un detector fotoelctrico colocado perpendicularmente respecto al haz
de excitacin. Los detectores ms sencillos utilizan una fuente de excitacin de
mercurio, y uno o ms filtros para aislar la radiacin fluorescente. Los futuros
desarrollos en los detectores de fluorescencia probablemente se basarn en el uso de
fuentes de lser sintonizables, las cuales permiten una mayor sensibilidad y
selectividad.

Una ventaja inherente a los mtodos de fluorescencia es su alta sensibilidad, que

resulta ser ms de un orden de magnitud mayor que la de los sistemas de absorbancia.
En cromatografa de lquidos se ha aprovechado esta ventaja para la separacin y
determinacin de los componentes fluorescentes de las muestras.

15
3.5.6 Detectores de ndice de refraccin

Estos detectores miden la diferencia de ndice de refraccin, entre el disolvente que

en su camino hacia la columna pasa a travs de una mitad de la cubeta y el efluente
de la columna que pasa por la otra mitad. Los dos compartimentos estn separados
por una placa de vidrio montada a un ngulo de modo que si las dos disoluciones
difieren en el ndice de refraccin se produce una desviacin de un haz de luz
incidente. El des-plazamiento del haz con respecto a la superficie fotosensible del
detector provoca una variacin de la seal de salida, la cual, una vez amplificada y
registrada, proporciona el cromatograma.

Los detectores de ndice de refraccin tienen la ventaja de que responden a casi todos
los solutos. Es decir, son detectores universales anlogos a los detectores de llama en
cromatografa de gases. Adems, son fiables y no dependen del caudal. Sin embargo,
son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una
temperatura constante en unas pocas milsimas de grado centgrado. Por otra parte,
no son tan sensibles como la mayora de los otros detectores, y por lo general no se
pueden utilizar en la elucin con gradiente.

3.5.7 Detector de dispersin de luz

Recientemente, se ha comercializado un nuevo tipo de detector general para la HPLC,

el detector de dispersin de luz (ELSD). En este detector, el efluente de la columna se
pasa a un nebulizador donde se convierte en una fina niebla mediante un flujo de
nitrgeno o aire. Las finas gotitas se llevan a travs de un tubo de conduccin a
temperatura controlada donde tiene lugar la evaporacin de la fase mvil, lo que
origina unas finas partculas de analito. La nube de partculas de analito pasa a travs
de un haz lser. Mediante un fotodiodo de silicio se detecta la radiacin dispersada
perpendicularmente al flujo.

Una de las mayores ventajas de este tipo de detector es que su respuesta resulta ser
aproximadamente la misma para todos los solutos no voltiles. Adems, es
notablemente ms sensible que el detector de ndice de refraccin.

3.5.8 Detectores electroqumicos

Los fabricantes de instrumentos proporcionan en la actualidad varios tipos de

detectores electroqumicos. Estos dispositivos se basan en cuatro mtodos
electroanalticos que incluyen la amperometra, la voltamperometra, la coulombimetra
y la conductimetra.

16
 IV CONCLUSIN
La cromatografa de lquidos de alta eficacia es la tcnica analtica de separacin ms
ampliamente utilizada, con unas ventas anuales de equipos de HPLC que se
aproximan a la cifra de mil millones de dlares. Las razones de la popularidad de esta
tcnica son su sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas
exactas, su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y,
sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial inters en la
industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos
ejemplos de los materiales incluyen aminocidos, protenas, frmacos, terpenoides,
plaguicidas, antibiticos, esteroides, especies rgano metlicas y una variedad de
sustancias inorgnicas.

Los distintos procedimientos que se utilizan en la HPLC tienden a ser complementarios

porque a su aplicacin se refiere. As, para solutos con masas moleculares superiores
a 10.000, a menudo se utiliza la cromatografa de exclusin por tamao, aunque ahora
tambin es posible tratar estos compuestos con cromatografa de reparto en fase
inversa. Para especies inicas de masa molecular ms pequea, se utiliza con
frecuencia la cromatografa de intercambio inico. Los mtodos de reparto se aplican
a especies poco polares, pero no inicas. Adems, este procedimiento se utiliza
muchas veces para la separacin de los integrantes de una serie homloga. La
cromatografa de adsorcin se elige con frecuencia para separar especies no polares,
ismeros estructurales y grupos de compuestos como, por ejemplo, los hidrocarburos
alifticos de los alcoholes alifticos.

17
 V BIBLIOGRAFA

- Skoog D. Holler J. Nieman T. (2001). Principios de Anlisis Instrumental Quita

edicin. Avaraca, Madrid. Editorial Mc Graw Hill.

- Waters, the science oh whats possible. (2014). HPLC - High Performance Liquid
Chromatography. Recuperado de: http://www.waters.com/waters/es_VE/HPLC---
High-Performance-Liquid-Chromatography-
explained/nav.htm?cid=10048919&locale=es_VE.

- Open Course Ware (2011). Cromatografa. Recuperado de:

http://unefavirtual.unefa.edu.ve/file.php/281/INTRODUCCION_A_LA_CROMATOGR
AFIA.pdf

- Richard Henry and Carmen T. Santasania. (2016). Efficient Conversion of HPLC

Instruments between Normal-Phase and Reversed-Phase Solvents. Recuperado de
(traducido al espaol):
http://ccc.chem.pitt.edu/wipf/Web/HPLC_Info_SolventSwitch.pdf

18