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Ministrio da sade

secretaria de Vigilncia em sade


departamento de Vigilncia epidemiolgica

Raiva
Manual de Diagnstico Laboratorial da

1 edio
1 reimpresso
srie a. normas e Manuais tcnicos
t

Braslia dF
2008
2008 Ministrio da Sade.
Todos os direitos reservados. permitida a reproduo parcial ou total desta obra, desde que citada
a fonte e que no seja para venda ou qualquer fim comercial.
A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens desta obra da rea tcnica.
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http://www.saude.gov.br/editora

Srie A. Normas e Manuais Tcnicos

Tiragem: 1 edio 1 reimpresso 2008 500 exemplares

Elaborao, distribuio e informaes:


MINISTRIO DA SADE
Secretaria de Vigilncia em Sade
Departamento de Vigilncia Epidemiolgica
Coordenao-Geral de Laboratrios de Sade Pblica
Esplanada dos Ministrios, bloco G, Edifcio Sede, 1. andar
CEP: 70058-900 Braslia DF
E-mail: svs@saude.gov.br
Home page: http://www.saude.gov.br/svs

Colaborao:
A redao deste manual, que se iniciou com a participao de diversos profissionais da Rede de
Laboratrios de Diagnstico de Raiva do Brasil, s foi finalizada com a efetiva participao dos
pesquisadores do Laboratrio de Referncia Nacional, Instituto Pasteur. A CGLAB agradece a
colaborao de todos.

EDITORA MS
Documentao e Informao
SIA trecho 4, lotes 540/610 Equipe editorial:
CEP: 71200-040, Braslia DF Normalizao: Cinthia Kikuchi
Tels.: (61) 3233 1774/2020; Reviso: Lilian Alves Assuno e
Fax: (61) 3233 9558 Paulo Henrique de Castro
E-mail: editora.ms@saude.gov.br Capa, projeto grfico e
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Impresso no Brasil / Printed in Brazil

Ficha Catalogrfica
Brasil. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. Departamento de Vigilncia
Epidemiolgica.
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva / Ministrio da Sade, Secretaria de Vigilncia
em Sade, Departamento de Vigilncia Epidemiolgica. Braslia: Editora do Ministrio da Sade,
2008.
108 p. : il. (Srie A. Normas e Manuais Tcnicos).

ISBN 978-85-334-1454-9

1. Raiva/diagnstico. 2. Tcnicas de diagnstico e procedimentos. 3. Vrus da raiva. I. Ttulo. II.


Srie.
NLM WC 550
Catalogao na fonte Coordenao-Geral de Documentao e Informao Editora MS OS 2008/0740
Ttulos para indexao:
Em ingls: Guide of Laboratorial Diagnosis of Rabies
Em espanhol: Manual de Diagnstico en Laboratorio de la Rabia
Sumrio

Apresentao _ ______________________________________________7

Captulo 1 A raiva____________________________________________9
1.1 Distribuio geogrfica_ ______________________11
1.2 Principais caractersticas do vrus da raiva_________12
1.3 Patogenia_ _________________________________16
1.4 Imunidade anti-rbica_ _______________________18
1.5 Epidemiologia_______________________________19
1.6 Anticorpos monoclonais como instrumento de
vigilncia epidemiolgica_____________________21
1.7 Estudos genticos com o vrus rbico_____________24
1.8 Sintomatologia______________________________25
1.8.1 Humanos ______________________________25
1.8.2 Ces___________________________________26
1.8.3 Gatos__________________________________27
1.8.4 Bovinos________________________________27
1.8.5 Outros animais domsticos________________28
1.8.6 Animais silvestres________________________28

Captulo 2 Biossegurana_ ____________________________________29


2.1 Classes de risco biolgico_ _____________________31
2.2 Medidas bsicas de biossegurana_ _____________32

Captulo 3 Colheita e envio das amostras para diagnstico laboratorial_ _35


3.1 Colheita do material_ _________________________37
3.2 Necropsia___________________________________38
3.2.1 Materiais para necropsia_ _________________38
3.2.1.1 Equipamentos de proteo
individual_________________________38
3.2.1.2 Instrumentais______________________38
3.3 Colheita da amostra_ _________________________39
3.4 Acondicionamento e preparo da amostra para
encaminhamento____________________________43
3.5 Sugesto de informaes para a ficha de
remessa de amostras para o laboratrio de
diagnstico de raiva__________________________44
Captulo 4 Diagnstico laboratorial_____________________________45
4.1 Tcnica histolgica (colorao de Sellers)__________47
4.1.1 Materiais necessrios_____________________47
4.1.1.1 Equipamentos_____________________47
4.1.1.2 Reagentes_ _______________________47
4.1.1.3 Materiais diversos_ _________________47
4.1.1.4 Corante_ _________________________48
4.1.2 Colorao______________________________49
4.1.3 Leitura_________________________________51
4.2 Tcnica de imunofluorescncia direta_ ___________52
4.2.1 Materiais necessrios_____________________53
4.2.1.1 Equipamentos_____________________53
4.2.1.2 Reativos__________________________53
4.2.1.3 Materiais diversos_ _________________53
4.2.1.4 Procedimentos_ ___________________54
4.2.2 Leitura das lminas_______________________55
4.2.3 Preparo do CVS (Challenge Virus Standard)____56
4.2.4 Titulao do CVS (trabalho)_______________56
4.2.5 Preparo do CCN (crebros de camundongos
normais)_______________________________57
4.2.6 Titulao do conjugado anti-rbico_ ________57
4.2.7 Avaliao do conjugado_ _________________59
4.3 Prova para isolamento do vrus rbico em
camundongos (prova biolgica)_ _______________60
4.3.1 Materiais necessrios_____________________61
4.3.1.1 Equipamentos_____________________61
4.3.1.2 Reativos__________________________61
4.3.1.3 Materiais diversos_ _________________61
4.3.2 Procedimentos__________________________62
4.3.3 Inoculao em camundongos______________62
4.4 Prova para Isolamento do Vrus Rbico em Cultivo
Celular____________________________________ 65
4.4.1 Materiais necessrios_____________________65
4.4.1.1 Equipamentos_____________________65
4.4.1.2 Reativos__________________________66
4.4.1.3 Materiais diversos_ _________________66
4.4.2 Procedimentos__________________________67
4.5 Tipificao antignica pela tcnica de
imunofluorescncia indireta com anticorpos
monoclonais________________________________69
4.5.1 Materiais necessrios_____________________70
4.5.1.1 Equipamentos_____________________70
4.5.1.2 Reativos__________________________70
4.5.1.3 Materiais diversos_ _________________71
4.5.1.4 Procedimentos_ ___________________71

Captulo 5 Soroneutralizao__________________________________75
5.1 Avaliao sorolgica para raiva__________________79
5.1.1 Colheita do soro_________________________80
5.2 Soroneutralizao em cultura de clulas_ _________80
5.2.1 Materiais necessrios_____________________80
5.2.1.1 Equipamentos_____________________80
5.2.1.2 Materiais diversos_ _________________81
5.2.1.3 Reativos__________________________81
5.2.2 Procedimentos__________________________81
5.2.3 Colorao com conjugado fluorescente______82
5.2.4 Leitura_________________________________82
5.3 Soroneutralizao em camundongos_____________83
5.3.1 Diluio do soro a ser testado e do
soro-padro____________________________83
5.3.2 Diluio do vrus desafio_ _________________84
5.3.3 Inoculao e observao dos camundongos__85
5.3.4 Clculos segundo Reed & Mench_ _________85

Captulo 6 Logaritmos________________________________________87
6.1 Conceitos bsicos______________________________89
6.2 Operaes com logaritmos______________________89
6.3 Cologaritmo__________________________________91
6.4 Estrutura de logaritmo decimal___________________91
6.5 Obteno de antilogaritmos_____________________92

Captulo 7 Mtodo de Reed-Mench (R & M)_______________________93

Captulo 8 Tampes e solues__________________________________97

Referncias ______________________________________________ 101


Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Apresentao

O diagnstico laboratorial da raiva de fundamental importn-


cia para o tratamento profiltico humano ps-exposio, mediante
a aplicao de imunobiolgicos especficos, e para a adoo de me-
didas visando ao controle da doena nas populaes de animais do-
msticos, evitando a ocorrncia de epizootias com a identificao
das reas com circulao viral.
A avaliao sorolgica dos anticorpos anti-rbicos com a so-
roneutralizao permite o acompanhamento da proteo conferida
pela vacina em indivduos expostos ao vrus da raiva, acidentalmen-
te ou por razes de trabalho, evitando riscos da ocorrncia de novos
casos da enfermidade.
Outras contribuies importantes do laboratrio de diagns-
tico so a anlise antignica dos vrus isolados e o estudo genmi-
co. A anlise antignica tem contribudo para o estudo comparativo
das variantes do vrus da raiva, por meio da utilizao de anticorpos
monoclonais. Tal caracterizao tem sido muito til para que se en-
tenda a epidemiologia da raiva humana em situaes em que no h
evidncias de exposio ao vrus, em regies onde a raiva canina est
sob controle, e tambm para integrar a vigilncia epidemiolgica no
mbito dos laboratrios de diagnstico, na compreenso dos novos
ciclos epidemiolgicos da raiva identificados no pas.
A anlise genmica permite que se estabelea a relao evolu-
tiva das variantes e a distribuio espacial e temporal de cada uma
delas. A padronizao dos procedimentos nos laboratrios que rea-
lizam o diagnstico essencial para garantir a qualidade dos resul-
tados obtidos. Este manual tem o objetivo de promover tal padro-
nizao de procedimentos de rotina da rede de laboratrios, com a
atualizao dos profissionais que atuam nas diferentes instituies
da referida rea.
Ministrio da Sade

7
Captulo
1

A raiva
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

A raiva uma antropozoonose transmitida ao homem pela ino-


culao do vrus da raiva, contido na saliva de animais infectados, prin-
cipalmente por meio de mordeduras. Trata-se de uma encefalite aguda,
que leva as vtimas ao bito em praticamente 100% dos casos, sendo
uma das mais antigas doenas conhecidas. Ainda nos dias atuais, a rai-
va representa um srio problema de sade pblica e produz grandes
prejuzos econmicos pecuria.

1.1 Distribuio geogrfica


A distribuio da raiva mundial, com cerca de 40.000 a 70.000
mortes ao ano, quase todas em pases em desenvolvimento. Atualmen-
te, as nicas regies cuja populao animal no est infectada com rai-
va so: Nova Zelndia, Nova Guin, Japo, Hawai, Taiwan, Oceania,
Finlndia, Islndia, a parte continental da Noruega, Sucia, Portugal,
Grcia e algumas ilhas das Antilhas e do Atlntico. Aps mais de 115
anos do desenvolvimento da vacina anti-rbica, por Louis Pasteur, a rai-
va persiste em algumas regies sob a forma epidmica. A razo mais
importante para que tal fato ocorra a multiplicidade de reservatrios
domsticos ou silvestres da raiva.
Na sia, na frica e na Amrica Latina, os ces continuam sen-
do os mais importantes reservatrios, e a raiva humana permanece
como um grave problema de sade pblica.
Nos pases nos quais foi possvel o controle da raiva nos animais
domsticos urbanos, os casos em humanos diminuram; porm, os
animais silvestres representam um srio desafio a ser vencido. Em
raposas, a raiva tem se mostrado endmica, tanto na Europa como
na Amrica do Norte. Outros animais silvestres, como os cangambs,
guaxinins e morcegos, na Amrica do Norte, tm assumido enorme
importncia, porm os dados de ocorrncia refletem principalmente
a ateno que tem sido dada raiva nesses animais, o que no vem
acontecendo no restante do mundo. Algum xito vem sendo obtido,
atualmente, no controle da raiva silvestre, com a utilizao de vaci-
nas de vrus atenuados ou de vacinas recombinantes.
Na Amrica Latina, os morcegos hematfagos, principalmente
o Desmodus rotundus, constituem-se nos principais transmissores

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Secretaria de Vigilncia em Sade

para os animais de interesse econmico, embora os ces tenham sido


os principais transmissores da raiva humana at o ano de 2003. Ou-
tras espcies de morcegos tambm vm desempenhando importante
papel na transmisso da raiva. A partir de 2004, os morcegos he-
matfagos se tornaram o principal transmissor da raiva na Amrica
Latina e, em particular, no Brasil.
Quando se consideram os prejuzos econmicos causados pela
raiva, devem ser computados, alm das mortes dos animais de inte-
resse econmico, os prejuzos indiretos, como a quebra da produ-
o leiteira e da carne, a depreciao do couro dos animais, pelos
freqentes ataques dos morcegos hematfagos, e o dano econmico
pelas horas perdidas por homem nos tratamentos anti-rbicos, bem
como o prprio custo dos tratamentos.

1.2 Principais caractersticas do vrus da raiva


A raiva uma doena que acomete mamferos, em geral, e
causada por um vrus RNA da ordem Mononegavirales, famlia Rhab
doviridae, gnero Lyssavirus e espcie Rabies virus (RABV). Na famlia
Rhabdoviridae, existe um amplo nmero de espcies de vrus que in-
fectam animais vertebrados (mamferos, peixes e rpteis), invertebra-
dos e plantas, o que demonstra a grande diversidade desses vrus.
A famlia Rhabdoviridae possui trs gneros que infectam ma-
mferos:
Vesiculovirus: vrus da estomatite vesicular e vrus relacionados.
Lyssavirus: vrus da raiva e aparentados ao vrus da raiva.
Ephemerovirus: vrus da febre efmera dos bovinos.
Alm desses trs gneros, h outros trs:
Novirhabdovirus (que infecta peixes) e cytorhabdovirus e nucle-
orhabdovirus (que infectam plantas e invertebrados).
O estudo do vrus da raiva, que at a dcada de 70 era consi-
derado uma unidade antignica, teve grandes avanos a partir da
dcada de 80, com a utilizao de anticorpos monoclonais.

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Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

O gnero Lyssavirus possui, atualmente, sete espcies distintas. Quatro


delas podem ser relacionadas da seguinte forma:
(1) Rabies virus (RABV), o vrus clssico da raiva, que infecta
mamferos terrestres, morcegos hematfagos e morcegos no-hema-
tfagos das Amricas e pertence ao gentipo 1;
(2) Lagos bat virus (LBV) ou gentipo 2, que o vrus isolado
de morcegos frugvoros (Eidolon helvum, Micropterus pusillus e Epo-
morphorus wahlbergi) da Regio dos Lagos (Nigria);
(3) Mokola virus (MOKV) ou gentipo 3, que foi isolado de
mussanharos (Crocidura sp) de humanos, tambm da Nigria, e de
felinos do Zimbabwe e da Etipia; e
(4) Duvenhage virus (DUVV) ou gentipo 4, isolado de mor-
cegos insetvoros (miniopterus schereibersii e nycteris thebaica) e hu-
manos da frica do Sul e Zimbabwe.
A partir da dcada de 80, verificou-se que tais vrus (gentipos
2, 3 e 4), denominados vrus relacionados ou aparentados ao vrus da
raiva, pareciam estar mais difundidos do que se sups inicialmente.
Naquela poca, foram isoladas vrias cepas de vrus do continente eu-
ropeu com caractersticas similares aos vrus relacionados. Mais estu-
dos realizados posteriormente permitiram a classificao de mais dois
gentipos ou duas espcies: o European bat lyssavirus 1 (EBLV1), que
agrupou os isolamentos do gnero Eptesicus; e o European bat lyssa-
virus 2 (EBLV2), que agrupou os isolamentos do gnero Myotis. Esses
foram denominados, respectivamente, gentipos 5 e 6.
Na dcada de 90, foi isolada na Austrlia, de um morcego fru-
gvoro (Pteropus alecto), uma nova cepa, denominada Australian bat
lyssavirus, classificada como gentipo 7.
Mais recentemente, em 2003, foram descritas novas variantes
isoladas de morcegos insetvoros do Kirguisto, do Tadijkisto e da
Rssia, tendo sido apresentada proposta para que eles sejam classi-
ficados como novos gentipos do gnero Lyssavirus. Tais vrus so
denominados Aravan virus, isolado no Kirguisto, em 2003, a par-
tir de morcego insetvoro (Myotis blythi); Khujand virus, isolado no
Tadijkisto, em 2001, tambm de morcego insetvoro; e outras duas

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Secretaria de Vigilncia em Sade

variantes isoladas na Rssia, uma da cidade de Irkutsk, denominada


Irkut virus, a partir de um morcego Murina leucogaster, e a outra ob-
tida na regio das montanhas do Cucaso, denominada West cauca-
sian bat virus (WCBV), isolada a partir de um morcego Miniopterus
schreibersi.
Ressalta-se que, at o presente, o nico Lissavrus no isolado
de quirpteros foi o gentipo 3 (Mokola virus) e somente o gentipo
1 foi encontrado no continente americano e no Caribe.
Todos os Lyssavirus, vrus rbicos ou aparentados, possuem
RNA de fita simples, polaridade negativa, linear, no segmentado,
com 11.932 nucleotdeos e PM = 4,6 x 106 daltons.
O vrus da raiva pode ser dividido em duas pores: o ribonu-
cleocapsdeo e o envelope. O ribonucleocapsdeo possui o RNA e trs
protenas: a nucleoprotena (n), que est associada ao RNA viral; a
protena L, que uma RNA polimerase RNA dependente (respons-
vel pela transcrio e pela replicao do RNA viral), e a protena P (NS
ou M1), que uma fosfoprotena. O envelope constitudo de duas
protenas: a glicoprotena (G) e a protena matrix (M ou M2).
A protena mais importante e mais conhecida a glicoprotena
(G), responsvel pela induo de anticorpos neutralizantes, pela esti-
mulao das clulas T e pela adsoro entre vrus e clula. A resposta
imune especfica ao vrus da raiva possui dois componentes: a me-
diada por anticorpos e a mediada por clulas. Alm da glicoprotena
(G), a nucleoprotena (N) tem importante papel na resposta imune,
visto que, mediante uma interao, age na resposta imune celular.
Destaca-se que uma boa relao N/G, na suspenso antignica
destinada vacina, o ideal para a obteno de uma boa vacina anti-
rbica.
No que diz respeito morfologia, o vrus da raiva apresenta a
forma de um projtil, com uma das extremidades plana e a outra
arredondada. Seu comprimento mdio de 180nm e o dimetro m-
dio de 75nm. As espculas do envelope, de glicoprotena, possuem
9nm. Na sua constituio qumica, a partcula viral completa possui
de 2 a 3% de cido ribonuclico (RNA), 67% de protenas, 26% de
lipdeos e 3% de carboidratos.

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Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

O vrus da raiva sensvel aos solventes de lipdeos (sabo, ter,


clorofrmio e acetona), ao etanol a 45-70%, aos preparados iodados
e aos compostos de amnio quaternrio. Outras relevantes proprie-
dades so a resistncia dessecao, assim como aos congelamentos
e descongelamentos sucessivos, a relativa estabilidade a um pH entre
5-10 e a sensibilidade s temperaturas de pasteurizao e luz ultra-
violeta. inativado a 60oC, em 35 segundos; a 4oC, se mantm infec-
tivo por dias; a -70oC ou liofilizado (4oC), se mantm durante anos.
O vrus da raiva muito sensvel aos agentes fsicos e qumicos,
sendo possvel a sua inativao em poucos minutos pela ao de ci-
dos e bases fortes, luz solar, alteraes de PH e temperatura e raios
ultravioleta.
A adsoro entre vrus e clula feita pela glicoprotena, em
uma ligao especfica (receptor celular anti-receptor viral). O vrus
penetra nas clulas por um processo de endocitose. Uma vez dentro
das clulas, o ribonucleocapsdeo liberado dentro do citoplasma,
onde o RNA negativo se replica, dando origem ao RNA mensageiro
(ciclo de transcrio primria), que codifica as cinco protenas e os
novos genomas, que so encapsidados e, no nvel das membranas
celulares, so liberados por brotamento.
A glicoprotena, como j foi dito, tem papel importante na
penetrao do vrus na clula, tendo tambm importante papel na
imunidade humoral e na celular, pela ativao de linfcitos T (hel-
per) e citocinas.
A fosfoprotena interage com a nucleoprotena no processo de
encapsidao, e a protena matrix muito importante na fase de ma-
turao viral.
A polimerase (protena L) RNA dependente tem mltiplas
atividades enzimticas: na sntese do RNA, na metilao, na fosfori-
lao, etc.
importante tambm fazer distines entre os vrus rbicos cls-
sicos, o vrus de rua e o vrus fixo. A denominao vrus de rua
utilizada para cepas isoladas de animais infectados em ciclos de trans-
misso natural. Tais cepas caracterizam-se por um perodo de incuba-
o varivel, s vezes bastante prolongado, ao contrrio das cepas deno-

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Secretaria de Vigilncia em Sade

minadas vrus fixos, que apresentam um perodo de incubao curto,


geralmente de quatro a sete dias.

1.3 Patogenia
A patogenia da raiva semelhante em todas as espcies de
mamferos. O vrus se replica no local da inoculao, inicialmente
nas clulas musculares ou nas clulas do tecido subepitelial, at que
atinja concentrao suficiente para alcanar as terminaes nervo-
sas, sendo este perodo de replicao extraneural responsvel pelo
perodo de incubao relativamente longo da raiva.
Nas junes neuromusculares, o vrus rbico, por meio da gli-
coprotena, se liga especificamente ao receptor nicotnico da ace-
tilcolina. Aps essa fase, os vrus atingem os nervos perifricos, se-
guindo um trajeto centrpeto, em direo ao sistema nervoso central
(SNC). O vrus segue o fluxo axoplasmtico retrgrado e o transpor-
te clula a clula. Estima-se que o genoma viral tenha um desloca-
mento de 25 a 50mm por dia, at chegar ao sistema nervoso central.
A distribuio do vrus rbico no homognea no SNC e, por tal
razo, a poro de eleio para encaminhamento ao laboratrio de
diagnstico varia de espcie para espcie. As regies mais habitu-
almente atingidas so: o hipocampo, o tronco cerebral e as clulas
de Purkinje, no cerebelo. Muitas vezes, os sintomas esto associados
com a localizao anatmica no crebro.
Nos ruminantes suspeitos de raiva, deve ser feita a colheita de
todo o encfalo ou, de preferncia, de fragmentos do sistema nervo-
so (crtex, cerebelo e hipocampo ou corno de Amon) de ambos os
hemisfrios. Nos eqdeos, deve-se enviar, tambm, o bulbo e frag-
mentos das pores inicial, medial e terminal da medula espinhal.
Nos ces, a poro de eleio o corno de Amon ou o hipocampo.
Ressalta-se que, na coleta de amostras de todas as espcies (domsti-
cas ou silvestres), deve ser encaminhada poro da medula.
A partir da intensa replicao no SNC, o vrus da raiva segue
em direo centrfuga, disseminando-se atravs do sistema nervo-
so perifrico e autnomo para diferentes rgos (pulmes, corao,
rins, bexiga, tero, testculos, folculo piloso, etc.) e glndulas sali-
vares, sendo eliminado pela saliva. A disseminao possibilita que

16
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

o vrus atinja, tambm, terminaes nervosas sensoriais do tecido


cutneo da cabea e do pescoo, onde se pode demonstrar a presen-
a de antgeno viral. Por tal razo, utiliza-se a bipsia de tecido des-
sa regio como mtodo de diagnstico ante-mortem. O vrus rbico
pode localizar-se tambm na retina e no epitlio da crnea.
A viremia tem sido documentada em modelos experimentais,
sendo fugaz e temporria, mas no h evidncias de que tenha im-
portncia significativa durante o processo de disseminao viral.
Em ces e gatos, a saliva pode ter maior concentrao de vrus
do que o prprio SNC. Em herbvoros, no entanto, a concentrao de
vrus eliminado pela saliva baixa.
As leses histopatolgicas so as incluses de Negri, que so
patognomnicas para a raiva. A sua ausncia, porm, no invalida o
diagnstico da raiva, tendo em vista que nos episdios de evoluo
rpida, com perodo de incubao curto e bito precoce, pode no
haver tempo suficiente para o aparecimento das incluses. Tal fato
tem sido observado, com freqncia, no diagnstico laboratorial da
raiva em eqdeos. Outra leso observada deve-se formao de va-
colos, que conferem ao sistema nervoso o aspecto espongiforme.
A via nasal e particularmente as clulas neuroepiteliais olfati-
vas podem ser uma via alternativa de penetrao viral.
Mais recentemente, nos Estados Unidos e na Alemanha, foi
verificada a transmisso entre humanos mediante transplantes de
rgos slidos.
O perodo de incubao da raiva extremamente varivel e depen-
de, fundamentalmente, da concentrao do inculo viral e da distncia
entre o local do ferimento e o crebro. De igual forma, est relacionado
com a extenso, a gravidade e o tamanho da ferida causada pelo animal
agressor. o perodo que vai desde o momento em que o agente penetra
no organismo at o aparecimento da sintomatologia clnica. Pode variar,
em mdia, de 20 a 90 dias, em humanos e animais.
O perodo de transmissibilidade o perodo em que existe a
possibilidade de transmisso do agente infeccioso de um organismo
a outro. Varia de espcie a espcie, mas, em todos os animais, inclu-
sive nos seres humanos, precede ao aparecimento da sintomatologia

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Secretaria de Vigilncia em Sade

e perdura durante o quadro clnico, at a morte. Tal perodo foi bas-


tante estudado em ces e gatos, sendo, na grande maioria das vezes,
de cerca de dois a quatro dias antes do surgimento dos sintomas no
animal, at sua morte, que ocorre geralmente cinco dias aps.

1.4 Imunidade anti-rbica


Ao contrrio de muitos vrus que causam infeco aguda, o
vrus da raiva ultrapassa as defesas imunes do hospedeiro, por um
longo perodo, devido ao seu extremo neurotropismo, isto , a pro-
duo de anticorpos anti-rbicos em indivduos infectados s ocorre
tardiamente, com freqncia apenas quando surgem os primeiros
sintomas.
Ao penetrar nos neurnios, o vrus da raiva torna-se protegido
da ao dos anticorpos, das clulas do sistema imune e da ao dos
interferons, responsveis pela resposta imune inespecfica. Os inter-
ferons so protenas de baixo peso molecular extremamente impor-
tantes no incio da infeco, que podem atuar inibindo diretamente a
replicao viral (e, assim, a sua disseminao) ou induzindo as reaes
das clulas imunes. O vrus da raiva capaz de induzir a produo de
interferons antes de sua migrao para o sistema nervoso central.
As clulas apresentadoras de antgeno (macrfagos, clulas
dendrticas, clulas de Langerhans, etc.), quando entram em contato
com o vrus da raiva, fagocitam-no e o processam para apresenta-
o s clulas imunes. Tal apresentao fundamental ativao dos
linfcitos T auxiliares, que vo produzir diferentes citocinas. Estas
ativam diferentes clulas implicadas na eliminao direta do vrus
ou de clulas infectadas e auxiliam a produo de anticorpos pelos
linfcitos B.
A estimulao dos linfcitos B para a produo de anticorpos,
na infeco natural, s se d aps o aparecimento dos sintomas clni-
cos. A possibilidade de neutralizao da capacidade infecciosa viral
s se d, portanto, aps a invaso do sistema nervoso central e, neste
momento, a doena j adquiriu uma forma irreversvel. O ttulo de
anticorpos neutralizantes permanece baixo at a fase terminal da
doena e atinge seu pico prximo morte da vtima.

18
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

O papel principal dos anticorpos o de bloquear o vrus ex-


tracelular antes que ele encontre o receptor das clulas musculares,
limitando sua propagao no nvel do local de infeco e sua pro-
gresso para o sistema nervoso central.
A resposta imune celular , talvez, o mecanismo mais impor-
tante da resposta imune ao vrus da raiva. Os linfcitos T participam
da proteo de diferentes maneiras: (1) estimulando, por intermdio
dos linfcitos T auxiliares, as clulas B para que produzam anticor-
pos; (2) como efetoras de imunidade, na forma de clulas T citotxi-
cas, lisando clulas infectadas; (3) induzindo a sntese de substncias
mediadoras da estimulao de diferentes clulas; e (4) como clulas
de memria imunolgica.

1.5 Epidemiologia
A raiva uma enfermidade que ocorre de maneira endmica
em diversos pases. Suas formas epidemiolgicas obedecem a uma
diviso didtica, sendo que as mais conhecidas so a raiva urbana e
a raiva rural.
A raiva urbana transmitida principalmente de co para co.
O vrus mantido primariamente na populao canina; porm, ou-
tros animais domsticos urbanos so freqentemente infectados. Os
ces, como j foi dito, so os importantes transmissores da raiva para
o homem. Esta forma um grave problema de sade pblica, devido
ao estreito relacionamento entre as pessoas e seus animais de com-
panhia.
A raiva rural mantida no campo pelo morcego hematfago
(desmodus rotundus), que o reservatrio do vrus rbico no am-
biente rural. Dessa forma, o morcego transmite o vrus para dife-
rentes espcies de animais domsticos, como bovinos, eqinos, ca-
prinos, etc.
O nmero de casos de raiva em herbvoros, confirmados labo-
ratorialmente, tem tido, nos ltimos anos, um acrscimo de maneira
preocupante em algumas regies, devido principalmente intensa
proliferao dos morcegos hematfagos e crescente dificuldade de
controle de suas populaes.

19
Secretaria de Vigilncia em Sade

A transmisso do vrus da raiva feita, geralmente, por meio


da saliva de um animal infectado para outro, embora outras vias se-
jam relatadas (membranas mucosas: olhos, nariz, boca), aerossis e
transplante de crnea. Em quirpteros, as transmisses transplacen-
trias e transmamrias tambm j foram relatadas.
J foi relatada a transmisso da doena em cavernas com gran-
des populaes de morcegos, para humanos e animais, por via aer-
gena, bem como em laboratrios de produo e vacina.
O ciclo areo da raiva tem, atualmente, uma grande importn-
cia para a manuteno do vrus em uma rea geogrfica. As diferen-
tes espcies de morcegos, hematfagos ou no, so susceptveis ao
vrus, com possibilidade de transmiti-lo e de apresentar sintomato-
logia, que sempre evolui para a morte.
O ciclo silvestre representado pela raiva nas espcies de ma-
mferos silvestres terrestres, com nfase nos candeos silvestres. Em
nosso meio, a real importncia desse ciclo no , ainda, bem conhe-
cida, razo pela qual se torna indispensvel a implementao de pro-
gramas de vigilncia epidemiolgica.
Os estudos realizados com amostras isoladas nos ltimos anos,
no Brasil, permitiram a proposio de um ciclo epidemiolgico da
raiva, no qual h uma estreita inter-relao entre os quatro ciclos
clssicos.

20
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Figura 1. Ciclos epidemiolgicos da raiva

Fonte: Instituto Pasteur.

1.6 Anticorpos monoclonais como instrumento de


vigilncia epidemiolgica
Com a finalidade de caracterizar o vrus da raiva, a Organizao
Pan-Americana da Sade (Opas) criou um consrcio de instituies
com reconhecido conhecimento tcnico-cientfico (Consrcio de La-
boratrios de Referncia para a Raiva) com os seguintes objetivos:
fortalecer a vigilncia da raiva nas Amricas; otimizar a capacidade
de diagnstico; harmonizar os mtodos e unificar os critrios de in-
terpretao dos resultados utilizados nos diferentes laboratrios.
Embora os mtodos sorolgicos que utilizam anticorpos poli-
clonais permitam diferenciar o vrus da raiva dos outros Lyssavirus,
eles s conseguem estabelecer ligeiras diferenas entre os subtipos
do vrus clssico da raiva. Os mtodos de caracterizao antignica e
gentica permitem a identificao das variantes responsveis por epi-
sdios e por casos individuais tanto de humanos como de animais.

21
Secretaria de Vigilncia em Sade

Os anticorpos monoclonais permitem anlises antignicas


comparativas das variantes do vrus da raiva. A reatividade deter-
minada com a utilizao de um painel de anticorpos monoclonais
especficos para eptopos da nucleoprotena viral e visualizada pela
colorao fluorescente. O painel de anticorpos monoclonais anti-
nucleoprotena tem se mostrado adequado tanto para possibilitar a
mxima diferenciao entre os vrus da raiva importantes, do ponto
de vista da sade pblica, como para a distribuio e a transmisso
entre as diferentes espcies selvagens.
A caracterizao das variantes tem sido muito til tambm para
que se entenda a epidemiologia da raiva humana, sobretudo nas situa-
es em que no h evidncias de exposio ao vrus, como, por exem-
plo, em regies onde a raiva canina esteja controlada.
O uso exclusivo de anticorpos monoclonais, no entanto, apre-
senta certas limitaes. Por exemplo, a diversidade das variantes pre-
sentes em morcegos no hematfagos no totalmente explicada
com os anticorpos monoclonais existentes. A anlise genmica ,
evidentemente, mais adequada, pois proporciona informaes mais
detalhadas sobre a relao evolutiva dos isolados, as mudanas es-
paciais e temporais que se podem produzir e a semelhana entre os
isolados.
Dependendo dos objetivos da anlise e do grau de relao das
variantes, prefervel a anlise das seqncias totais ou parciais do
gene N, altamente conservado; do gene G, de divergncia interme-
diria; ou do gene P e da regio intergnica G-L, altamente diver-
gentes.
A anlise gentica se realiza mediante a reao de polimeriza-
o em cadeia e a anlise dos produtos da amplificao.
A aplicao da tipificao antignica e gentica na vigilncia
da raiva na Amrica Latina e no Caribe essencial para melhorar os
atuais programas de controle da doena. O conhecimento da fonte
de novos focos de raiva canina e a identificao das espcies silves-
tres que mantm os ciclos silvestres de transmisso da raiva pos-
sibilitam uma melhor utilizao dos recursos de sade pblica.

22
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Na atualidade, o CDC (de Atlanta, USA), como Centro Co-


laborador da Organizao Mundial da Sade para a investigao e
a referncia da raiva, que proporciona aos pases da Amrica Latina
o painel de oito anticorpos monoclonais anti-N. O uso do mesmo
painel tem a vantagem de permitir a comparao dos resultados ob-
tidos por diferentes grupos de pesquisa.
No Brasil, o Instituto Pasteur de So Paulo vem utilizando tal
tcnica, que tem permitido determinar a distribuio geogrfica das
variantes antignicas do vrus da raiva, descrever novas variantes e
identificar variantes conhecidas em novos hospedeiros, informaes
muito teis para a vigilncia epidemiolgica da raiva no Brasil.
Tm sido demonstradas algumas limitaes da anlise antig-
nica com um pequeno nmero de anticorpos monoclonais, visto que
pequenos erros na interpretao de uma reao positiva ou negati-
va com um dos anticorpos monoclonais podem proporcionar um
padro antignico diferente, o que poderia conduzir identificao
incorreta de um reservatrio ou de um novo padro de reao. Por
tal razo, a tipificao antignica, quando fornece resultados inespe-
rados, deve ser complementada com o seqenciamento gentico.
No Brasil, foram encontradas quatro variantes: variante 2, pr-
pria dos ces; variante 3, prpria do morcego hematfago Desmodus
rotundus; variante 4, prpria do morcego insetvoro Tadarida brasi-
liensis; e variante 6, prpria do morcego insetvoro Lasiurus cinereus.
Foram encontradas tambm diversas outras variantes, que foram
denominadas no compatveis com o painel de monoclonais estabe-
lecido para estudos das cepas isoladas nas Amricas, com especial
destaque para uma nova variante isolada em sagis do tufo branco
(Callithrix jacchus) e em humanos, nos estados do Cear e do Piau,
bem como outras isoladas em morcegos insetvoros.

23
Secretaria de Vigilncia em Sade

1.7 Estudos genticos com o vrus rbico


A tipificao gentica de uma determinada amostra de vrus
rbico pode ser feita com a determinao da seqncia de um pe-
queno segmento de seu genoma e a comparao da seqncia com
outras derivadas de diversas amostras de vrus rbico, disponveis
em bancos de dados internacionais, como, por exemplo, o GenBank.
Para tanto, o primeiro passo a ser cumprido amplificar, em uma
escala de bilhes de vezes, o segmento de eleio e isol-lo do material
gentico pertencente a outros microorganismos presentes na amostra ou
mesmo ao prprio hospedeiro do qual se colheu a amostra. A amplifica-
o conseguida por meio de uma reao desenvolvida no incio dos anos
80 e que ficou conhecida como reao em cadeia pela polimerase (PCR),
na qual uma enzima que sintetiza cadeias de DNA (DNA-polimerase), a
partir de um DNA molde, presente na amostra, faz cpias de um deter-
minado segmento de DNA, cujas localizao e extenso so determina-
das por um par de cadeias curtas de DNA sintetizadas artificialmente em
laboratrio, par denominado primers, que ir reagir de modo especfico,
nica e exclusivamente com o gene ou o agente de interesse.
Ciclos de temperaturas permitem que o DNA-polimerase
monte cpias do segmento delimitado pelos primers por meio da
insero das bases nitrogrenadas A, G, T, C. Ao final da reao, o
fragmento de DNA amplificado pode ser observado por eletroforese
em gel de agarose, quando aparece como uma banda de precipitao
de DNA de um tamanho esperado.
Tal resultado , por si s, suficiente para que se determine a pre-
sena de vrus rbico, mas no permite que se observe a composio
do DNA amplificado em termos de seqncias de nucleotdeos. As-
sim, para que se atinja esse nvel de disseco, o material amplificado
submetido a uma segunda reao bioqumica, a reao de seqencia-
mento de DNA, mediante a adio de bases A, T, G e C modificadas
e marcadas com cores. Uma vez terminada a reao, o equipamen-
to conhecido como seqenciador de DNA capaz de ler as cores
e apresent-las, finalmente, sob a forma de uma seqncia de DNA
que pode, agora, ser utilizada para a tipificao molecular por meio da
construo de uma rvore filogentica, uma representao grfica das
relaes existentes entre diversas amostras de vrus rbico.

24
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Uma questo fundamental na tipificao molecular reside na


escolha do segmento ou do gene a ser focalizado. No vrus rbico,
so encontrados cinco genes, um para cada uma das protenas: N
para a nucleoprotena, P para a fosfoprotena, M para a protena de
matriz, G para a glicoprotena e L para a RNA-polimerase. Desses
genes, a menor variabilidade encontrada no N: por exemplo, sabe-
se que a similaridade dos aminocidos codificados por tal gene de
98 a 99,6% em amostras fixas. Isso torna o gene N o alvo de eleio
para a tipificao molecular de uma dada amostra de vrus rbico: o
gene N to conservado e estvel que pequenas variaes encontra-
das em sua seqncia sero compartilhadas por variantes que tm
caractersticas em comum, como, por exemplo, o hospedeiro (mor-
cego, co, etc.), o ciclo de transmisso (silvestre, areo, rural ou urba-
no), a regio de onde provm a amostra ou mesmo a poca em que
a amostra foi detectada.
A tipificao antignica, por meio da imunofluorescncia in-
direta, com utilizao de anticorpos monoclonais, uma tcnica
especfica, sensvel e extremamente rpida, mas impossvel de ser
realizada em amostras com volume muito pequeno, autolisadas ou
em decomposio avanada, alm de ter um poder discriminatrio
limitado, desvantagens que podem, seguramente, ser contornadas
com a tipificao molecular.

1.8 Sintomatologia
A sintomatologia varia conforme o animal infectado. Assim,
sero apresentadas consideraes sobre a sintomatologia em huma-
nos, ces, gatos, outros animais domsticos e animais silvestres.

1.8.1 Humanos
O perodo de incubao, na maioria dos casos, de 2 a 12 se-
manas, podendo variar de 10 dias at 4 a 6 anos. Durante o perodo
de incubao, o paciente apresenta-se absolutamente assintomtico.
A maior ou menor durao do perodo pode depender da dose de
vrus injetada pela mordedura, do lugar desta e da gravidade da le-
so, sendo mais longo o perodo quanto mais distante do sistema
nervoso central localizar-se a leso.

25
Secretaria de Vigilncia em Sade

A doena inicia-se com alteraes de comportamento, sensao


de angstia, cefalia, pequena elevao de temperatura, mal-estar e alte-
raes sensoriais imprevistas, com freqncia relacionadas ao local da
mordedura. O paciente costuma sentir dor e irritao na regio lesio-
nada. Na fase seguinte, de excitao, surge hiperestesia de uma extrema
sensibilidade luz e ao som, dilatao das pupilas e aumento da saliva-
o. Conforme a doena progride, surgem espasmos nos msculos da
deglutio e a bebida recusada por contraes musculares. A disfun-
o de deglutio observa-se na maioria dos doentes, muitos dos quais
apresentam contraes espasmdicas laringofarngeas simples viso
de um lquido e se abstm de deglutir a sua prpria saliva (hidrofobia).
Tambm podem ser observados espasmos dos msculos respiratrios
e convulses generalizadas. A fase de excitao pode ser predominante
at a morte ou ser substituda por uma fase de paralisia generalizada.
Em alguns casos, a fase de excitao muito curta e, em quase todo o
curso da doena, predomina a sintomatologia paraltica. Tal fato ocorre,
principalmente, quando a espcie transmissora o morcego. A doena
dura de dois a seis dias ou mais e quase sempre termina com a morte,
que atribuda falncia das funes vegetativas centrais bsicas e, mui-
tas vezes, ocorre em funo da miocardite rbica concomitante.
A raiva em animais manifesta-se de duas formas: a raiva furiosa
e a raiva paraltica ou muda, de acordo com a sintomatologia nervo-
sa apresentada.

1.8.2 Ces
O perodo de incubao , em geral, de 15 dias a 2 meses. Na
fase prodrmica, os animais apresentam mudana de comportamen-
to, escondem-se em locais escuros ou mostram uma agitao inusi-
tada. A excitabilidade reflexa fica exaltada e o animal se sobressalta
ao menor estmulo. Observa-se a ocorrncia de anorexia, irritao
ou prurido na regio de penetrao do vrus e uma ligeira elevao
da temperatura. Aps um a trs dias, ficam acentuados os sintomas
de excitao. O co se torna agressivo, com tendncia a morder obje-
tos, outros animais, o homem (inclusive o seu proprietrio) e morder
a si mesmo, muitas vezes provocando graves ferimentos. A salivao
torna-se abundante, uma vez que o animal incapaz de deglutir sua
saliva, em virtude da paralisia dos msculos da deglutio. H alte-

26
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

rao do seu latido, que se torna rouco ou bitonal, devido paralisia


parcial das cordas vocais. Os ces infectados pelo vrus rbico tm
propenso de abandonar suas casas e percorrer grandes distncias,
durante a qual podem atacar outros animais, disseminando, dessa
maneira, a raiva. Na fase final da doena, freqente observar con-
vulses generalizadas, que so seguidas de incoordenao motora e
paralisia do tronco e dos membros.
A forma muda se caracteriza por predomnio de sintomas do
tipo paralticos, sendo a fase de excitao extremamente curta ou
imperceptvel. A paralisia comea pela musculatura da cabea e do
pescoo; o animal apresenta dificuldade de deglutio e suspeita-se
de engasgo, quando ento seu proprietrio tenta ajud-lo, expondo-
se infeco. A seguir, vm a paralisia e a morte.

1.8.3 Gatos
Na maioria das vezes, a doena do tipo furioso, com sintoma-
tologia semelhante raiva canina.
Observao: especial ateno se deve dar a outras sintomato-
logias que podem ocorrer quando a raiva em ces e gatos for trans-
mitida por morcegos, fato que vem ocorrendo em algumas regies
do pas.

1.8.4 Bovinos
Na raiva transmitida por morcegos hematfagos (Desmodus
rotundus), o perodo de incubao geralmente mais longo, com va-
riao de 30 a 90 dias ou at mais. A sintomatologia predominante
da forma paraltica. Os animais infectados se afastam do rebanho,
apresentam as pupilas dilatadas e os plos eriados. possvel obser-
var, tambm, lacrimejamento, catarro nasal e movimentos anormais
das extremidades posteriores. Os acessos de fria so raros, poden-
do se observar, no entanto, inquietao, tremores musculares e hi-
persensibilidade no local da mordedura, de modo que os animais
podem at provocar autodilaceraes. Com a evoluo da doena,
observam-se contraes tnico-clnicas e incoordenao motora; os
animais apresentam dificuldade de deglutio e param de ruminar.
Os sinais de paralisia aparecem entre o segundo e terceiro dia aps o

27
Secretaria de Vigilncia em Sade

incio dos sintomas, sendo a durao da doena, geralmente, de dois


a cinco dias.
1.8.5 Outros animais domsticos
A sintomatologia da raiva em eqdeos, ovinos e caprinos bas-
tante semelhante dos bovinos. Depois de um perodo de excitao
com durao e intensidade variveis, apresentam sintomas paralticos,
que dificultam a deglutio e provocam incoordenao das extremi-
dades. Muitos animais apresentam alterao de comportamento e
realizam a ingesto de objetos estranhos. Em sunos, a enfermidade
inicia-se, geralmente, com sintomas de excitabilidade. Os animais se
apresentam agressivos, semelhana do que ocorre nos ces.

1.8.6 Animais silvestres


A raiva ocorre naturalmente em muitas espcies de candeos
e outros mamferos. Com base em estudos epidemiolgicos, consi-
dera-se que os lobos, as raposas, os coiotes e os chacais so os mais
susceptveis. Os morcegos (hematfagos ou no hematfagos), os
mapaches e as mangostas apresentam um grau menor de suscep-
tibilidade. A sintomatologia dos candeos silvestres , na maioria das
vezes, do tipo furiosa, semelhante dos ces.
Nos morcegos pode ocorrer uma fase de excitabilidade seguida
de paralisia, principalmente das asas, o que faz que esses animais dei-
xem de voar. Deve-se suspeitar, portanto, de morcegos (hematfagos
ou no) encontrados em locais e horas no habituais e que no sejam
capazes de se desviar de obstculos interpostos sua trajetria.

28
Captulo
2

Biossegurana
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

2.1 Classes de risco biolgico


Consideram-se agentes de risco biolgico as bactrias, os fungos,
os parasitas e os vrus, entre outros. Tais agentes podem ser distribu-
dos em quatro classes de risco, segundo alguns critrios:
patogenicidade do microorganismo infectante;
concentrao;
volume;
virulncia;
formao de aerossis;
modos de transmisso;
disponibilidade de medidas profilticas e de tratamentos efi-
cazes;
endemicidade.
Para a manipulao dos microorganismos pertencentes a cada
uma das quatro classes de risco, devem ser atendidos alguns requisitos
de segurana, conforme o nvel de conteno necessrio.
O nvel de biossegurana 1 adequado aos laboratrios que
efetuam tcnicas bsicas e envolvam agentes bem caracterizados, ou
seja, que apresentam escasso risco individual e comunitrio, com
pouca probabilidade de provocar enfermidades humanas ou enfer-
midades de importncia veterinria nos animais.
O nvel de biossegurana 2 destinado ao trabalho com mi-
croorganismos que apresentam risco individual moderado e risco
comunitrio limitado. Nos laboratrios so manipulados agentes pa-
tognicos que podem provocar enfermidades humanas ou enfermi-
dades animais, mas que tm poucas probabilidades de acarretar um
risco grave para o pessoal de laboratrio, a comunidade, os animais
e o meio ambiente.
O nvel de biossegurana 3 o que tem risco individual elevado
e baixo risco comunitrio. Manipulam-se neste nvel agentes patog-
nicos que podem provocar enfermidades humanas ou animais graves,
podendo se propagar de uma pessoa infectada a outra.

31
Secretaria de Vigilncia em Sade

O nvel de biossegurana 4 aplicvel para laboratrios onde


so manipulados microorganismos que apresentam elevado risco
individual e comunitrio: trata-se de agentes patognicos que po-
dem provocar enfermidades graves nas pessoas, nos animais e ainda
podem se propagar facilmente de um indivduo a outro, direta ou
indiretamente, sem que haja profilaxia ou tratamento.

2.2 Medidas bsicas de biossegurana


Em consonncia com a classe de risco dos microorganismos
manipulados, os laboratrios devem estabelecer um programa de
biossegurana que ter por finalidade aperfeioar e disciplinar os
trabalhos, objetivando minimizar os riscos mediante a execuo de
efetiva preveno de acidentes. De acordo com as Diretrizes Gerais
para o Trabalho em Conteno com Material Biolgico do Minist-
rio da Sade, os Rhabdovirus, incluindo o vrus da raiva (amostras de
vrus fixo), esto classificados como classe de risco 2, e os Rhabdovi-
rus vrus da raiva (amostras de rua) esto classificados como classe
de risco 3.
Algumas prticas tipo padro e especiais so aplicveis aos
agentes designados para o nvel de biossegurana 2:
Nunca pipetar com a boca; devem ser utilizados dispositivos
mecnicos.
No comer, beber ou fumar na rea de trabalho do laboratrio.
No armazenar alimentos nem bebidas nas reas de trabalho.
No aplicar maquiagem, nem usar adereos.
Usar os equipamentos de proteo individual, como aventais
ou jalecos, protetores faciais, mscaras, culos de proteo,
luvas, sapatilhas descartveis, entre outros.
Limitar ou restringir o acesso ao laboratrio.
Proibir a entrada de crianas na rea de trabalho do laboratrio.
No permitir a entrada de animais que no tenham relao
com os trabalhos que estejam sendo realizados.

32
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Realizar cuidadosamente todos os procedimentos, a fim de


minimizar a criao de borrifos ou aerossis.
Descontaminar as superfcies de trabalho com agentes de-
sinfetantes adequados ao final do trabalho e aps qualquer
vazamento ou borrifada de material vivel.
Lavar as mos aps a manipulao de materiais viveis, aps
a remoo das luvas e antes de sair do laboratrio.
Colocar, na entrada do laboratrio, o smbolo de risco biolgico.
Descontaminar os resduos produzidos antes que sejam des-
cartados. Os materiais que devem ser descontaminados fora
do prprio laboratrio devero ser colocados em recipientes
prova de vazamentos e hermeticamente fechados, para que
sejam transportados.
Utilizar cabines de segurana biolgica, mantidas de manei-
ra adequada, sempre que sejam realizados procedimentos
com elevado potencial de criao de aerossis ou quando al-
tas concentraes ou grandes volumes do agente infeccioso
forem manipulados.
Descartar os materiais perfurocortantes (tais como agulhas,
lminas, lamnulas, tubos quebrados e outros materiais utili-
zados) em recipientes de paredes rgidas, devidamente iden-
tificados.
Assegurar-se de que as sadas de emergncia se encontrem
livres de obstculos.
Manter extintores para diferentes tipos de fogo, com seu cor-
respondente controle peridico, assim como ter o nmero
de telefone dos bombeiros em lugar visvel.
Manter a obrigatoriedade da vacinao anti-rbica preventi-
va para todo o pessoal de laboratrio e controlar periodica-
mente o ttulo de anticorpos neutralizantes.

33
Captulo
3

Colheita e envio das amostras para


diagnstico laboratorial
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

3.1 Colheita do material


A raiva uma doena que se apresenta de forma varivel nas
diferentes espcies de mamferos, razo pela qual todo animal sus-
peito deve ter o sistema nervoso central coletado e enviado, em con-
dies adequadas, ao laboratrio de diagnstico, para a confirmao
de uma suspeita clnica. O laboratrio de diagnstico dever receber
amostras em bom estado de conservao, devidamente identificadas
e com ficha de remessa de material suficientemente elucidadora.
O material para diagnstico laboratorial dever ser encami-
nhado da seguinte maneira:
A) material de animais silvestres: os animais devero ser enca-
minhados inteiros, de forma a permitir sua perfeita identi-
ficao;
B) material de ces e gatos: dever ser encaminhado com a cabe-
a inteira ou com o sistema nervoso central coletado;
C) material de bovinos, eqdeos e outros: dever ser encami-
nhado com o sistema nervoso central coletado.
importante, em ces e carnvoros silvestres, a realizao do
diagnstico diferencial da raiva e da cinomose. Entre bovinos, a ne-
cessidade do estabelecimento de um sistema de vigilncia epidemio-
lgica da encefalopatia espongiforme dos bovinos (EEB) possibilita
que as amostras negativas para raiva, em especial o tronco enceflico,
sejam encaminhadas para os laboratrios credenciados pelo Minist-
rio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento.
semelhana do que ocorre com a espcie bovina, um diagns-
tico negativo para raiva em eqinos que apresentaram sintomas de en-
cefalites, de igual forma, exige o direcionamento dessas amostras para
o diagnstico diferencial da encefalomielite eqina tipos leste, oeste e
venezuelana e, mais recentemente, para febre do Nilo Ocidental.

37
Secretaria de Vigilncia em Sade

3.2 Necropsia
A sala de necropsia deve ser localizada em rea de circulao res-
trita e, se possvel, prxima rea de acondicionamento dos resduos
slidos de sade. necessrio que as carcaas ou as cabeas dos ani-
mais sejam colocadas em sacos apropriados para resduos infectantes
e colocadas em cmara fria (-20oC) at o seu recolhimento para a inci-
nerao, quando no for possvel sua descontaminao no local.
O necropsista dever ser imunizado e devidamente treinado,
para a perfeita coleta do sistema nervoso central ou de seus fragmen-
tos, e dever embalar corretamente o material, para que este chegue
ao laboratrio em condies de ser processado e no apresente, du-
rante o transporte, risco s pessoas que o manipulem.

3.2.1 Materiais para necropsia:

3.2.1.1 Equipamentos de proteo individual:


toucas/gorros;
protetor facial;
mscara;
culos de proteo;
batas cirrgicas;
avental longo oleado, de borracha ou material similar;
luvas de borracha com punho longo;
botas de borracha.

3.2.1.2 Instrumentais:
morsa para conteno adequada da cabea do animal;
bisturi;
faca de dissecao;
serra de arco e lminas para substituio;
cinzel;

38
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

tesouras cirrgicas de ponta reta e curva;


pinas de dissecao (dente de rato);
pedra de afiar.
Observao: as serras eltricas so desaconselhadas, pois pro-
duzem aerossis.

3.3 Colheita da amostra


Para a adequada colheita do material para o diagnstico da rai-
va, a cabea do animal deve ser fixada e os passos ilustrados a seguir
devem ser obedecidos.

Figura 2. Fixao da cabea do animal para colheita do SNC

Fonte: Instituto Pasteur

39
Secretaria de Vigilncia em Sade

Figura 3. Corte da linha mediana da caixa craniana: ao


longo da linha mdia do crnio, faz-se um corte, dos olhos
at a base do crnio, que atravesse a pele e as fscias

Fonte: Instituto Pasteur

Figura 4. Dissecao dos msculos da cabea: rebatem-se os


msculos e tecidos at que se exponha a calota craniana

Fonte: Instituto Pasteur

40
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Figura 5. Cortes da caixa craniana: com a serra, fazem-


se dois cortes, do formen occipital ao osso frontal

Fonte: Instituto Pasteur

Figura 6. Com a serra, fazem-se cortes longitudinais,


rebatendo o osso com o cinzel e deixando o encfalo exposto

Fonte: Instituto Pasteur

41
Secretaria de Vigilncia em Sade

Figura 7. Com a pina de dissecao e a


tesoura se extrai o encfalo inteiro

Fonte: Instituto Pasteur

Figura 8. Extrao completa do encfalo

Fonte: Instituto Pasteur

42
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

3.4 Acondicionamento e preparo da amostra para


encaminhamento
A amostra deve ser encaminhada ao laboratrio em condies
de refrigerao, se a previso de envio for de at 24 horas. O material
deve ser colocado em um frasco com tampa de rosca, de boca larga e
de capacidade maior do que o tamanho da amostra. O recipiente deve
ser hermeticamente fechado, de maneira a no haver vazamento de
fluidos e contaminao dos manipuladores. O frasco deve ser iden-
tificado de maneira clara e visvel e ser colocado em isopor com gelo
suficiente para manter a amostra refrigerada durante o transporte.
Nos casos em que a previso de envio situar-se entre 24 a 48 horas,
a amostra deve ser congelada e embalada da mesma forma j relatada.
Em regies onde houver dificuldades para manter as amostras
congeladas ou sob refrigerao, estas devem ser colocadas em uma
mistura de glicerina a 50%, com salina estril tamponada, observan-
do-se os procedimentos j citados em relao ao vazamento e ve-
dao do frasco.
Na embalagem externa, deve constar o nome do laboratrio de
destino, com seu endereo completo, bem como o rgo remetente
e seu endereo.
A amostra deve ser acompanhada de uma ficha de remessa
com os dados epidemiolgicos.
Observao: para que o resultado laboratorial permita a r-
pida adoo de aes de controle, as amostras coletadas de animais
suspeitos devem ser rapidamente encaminhadas ao laboratrio de
diagnstico.

43
Secretaria de Vigilncia em Sade

3.5 Sugesto de informaes para a ficha de remessa de


amostras para o laboratrio de diagnstico de raiva

Modelo de ficha de remessa de amostras

Solicitao de exame laboratorial para diagnstico de raiva

Remetente:________________________________________________________
Endereo:_________________________________________________________
Cidade:__________________________________Estado:___________________
Telefone: ( )_____________________________Ramal:___________________
Fax: ( )__________________________________________________________
E-mail:____________________________________________________________

Identificao do animal:

Data da coleta:____________________________________________________
Espcie: ( ) co ( ) gato ( ) bovino ( ) eqino ( ) outra__________________
Raa:_____________________Sexo:_______ Cor:__________ Idade:_________
( ) Morcego (espcie)___________________Hora da coleta:________________
Local da coleta:__________________________________( ) Vivo ( ) Morto
Procedncia do animal:______________________________________________
Proprietrio ou responsvel:__________________________________________
Endereo: _________________________________________________________
Bairro:__________________________________Telefone: ( )________________
Cidade:_____________________________Estado:________________________
Vacinao anti-rbica: ( ) sim ( ) no n. de doses___________
H pessoas agredidas ou que tiveram contato: ( ) sim ( ) no quantas:____
Sacrificado: ( ) sim ( ) no
Sinais anteriores:____________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________

__________________________________
Responsvel pela solicitao

Observao: por favor, preencha a ficha com letra de forma e coloque a identificao
nas amostras.

Endereo para o envio da amostra: Alameda Rodrigues, 416 Cerqueira Csar, So


Paulo (SP) CEP: 01418-000.

44
Captulo
4

Diagnstico laboratorial
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Quando a amostra chegar ao laboratrio, esta deve ser registrada de


acordo com os critrios do setor de recepo de cada laboratrio.

4.1 Tcnica histolgica (colorao de Sellers)


Consiste na colorao de impresses de diferentes pores do
sistema nervoso central com o corante de Sellers e na pesquisa (por
meio de microscopia tica comum) da presena de incluses patog-
nomnicas da infeco rbica denominadas corpsculos de Negri,
que so concentraes de protenas virais que se localizam no cito-
plasma da clula infectada.
As impresses de fragmentos do tecido nervoso devem ser fei-
tas levemente em uma rea de 3cm2. As mesmas pores utilizadas
para a impresso devem ser reservadas para a prova biolgica (em
camundongos ou clulas). Tal tcnica, quando realizada por profis-
sional experiente, proporciona uma sensibilidade de at 90%.

4.1.1 Materiais necessrios


4.1.1.1 Equipamentos:
microscpio ptico comum.

4.1.1.2 Reagentes:
lcool metlico absoluto;
azul de metileno;
fucsina bsica;
leo de imerso.

4.1.1.3 Materiais diversos:


lminas de vidro para microscopia;
placas de Petri;
esptulas de madeira;
papis de filtro;

47
Secretaria de Vigilncia em Sade

tesouras e pinas;
suportes para colorao.

4.1.1.4 Corante:
Soluo-me:
Azul de metileno: 10g de azul de metileno + 1.000ml de lcool
metlico.
Fucsina bsica: 5g de fucsina bsica + 500ml de lcool metlico.
Preparo do corante de Sellers:
2 partes da soluo de azul de metileno + 1 parte da soluo de
fucsina bsica.
Aps a mistura das duas solues, o corante deve ser envasado
em frasco mbar com tampa esmerilhada. Deixe-o maturar por 48
horas.
Ajustes do corante de Sellers:
A) Aps a maturao, convm realizar uma colorao de prova.
B) Se a impresso ficar avermelhada, devem ser adicionadas
gotas da soluo de azul de metileno.
C) Se os corpsculos de Negri aparecerem com uma cor casta-
nha e as clulas com um azul muito intenso, deve-se fazer o
ajuste com gotas da soluo de fucsina bsica.

48
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

4.1.2 Colorao
Quando a amostra for conservada em glicerina, os decalques
produzidos sero insatisfatrios, por causa das dificuldades na ade-
rncia. Para se retirar a glicerina do tecido nervoso, necessria sua
lavagem com salina, agitando-se suavemente o preparo com movi-
mentos rotatrios. A lavagem dever ser repetida sucessivas vezes.
A) Prepare lminas com impresses de fragmentos de hipo-
campo, cerebelo, crtex e medula (figura 9). As impresses
devem ser extremamente finas e, quando houver necessida-
de, o excesso pode ser retirado com papel filtro.
B) Submerja as lminas no corante de Sellers por aproximada-
mente cinco segundos (figura 10).
C) Lave as lminas, rapidamente, em gua corrente e seque-as
temperatura ambiente (figura 11).

Figura 9. Preparo de impresses do sistema


nervoso central em lminas

Fonte: Instituto Pasteur

49
Secretaria de Vigilncia em Sade

Figura 10. Imerso da lmina no corante de Sellers

Fonte: Instituto Pasteur

Figura 11. Lavagem da lmina em gua corrente

Fonte: Instituto Pasteur

50
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

4.1.3 Leitura
Os corpsculos de Negri (figura 12) so encontrados princi-
palmente no corno de Amon (hipocampo), nas clulas de Purkinje
do cerebelo e na medula. Eles podem estar presentes, tambm, em
um grande nmero de rgos, porm nestas estruturas geralmen-
te apresentam pequeno tamanho. Tais incluses so acidfilas, com
granulaes basfilas.
O corante de Sellers demonstra os corpsculos de Negri dife-
renciados com colorao arroxeada e estrutura interna azul-escura
no citoplasma celular, que corado em rosa.
Quando o tecido cerebral est em decomposio, geralmente a
impresso torna-se avermelhada ou azulada; porm, os corpsculos
de Negri mantm sua colorao.
A utilizao da colorao de Sellers permite a realizao de um
diagnstico diferencial entre raiva e cinomose, visto que a infeco
pelo vrus da cinomose determina a formao de incluses de Lentz
(figura 13), que so intracitoplasmticas ou intranucleares e basfilas
e possuem estrutura homognea. Ressalta-se que o vrus que causa a
cinomose pertence famlia Paramyxoviridae, gnero Morbillivirus.

Figura 12. Incluses de Negri no citoplasma de neurnios


infectados pelo vrus da raiva e no meio extracelular

Fonte: Instituto Pasteur

51
Secretaria de Vigilncia em Sade

Figura 13. Incluses de Lentz no neurnio


infectado pelo vrus da cinomose

Fonte: Instituto Pasteur

4.2 Tcnica de imunofluorescncia direta


A tcnica de imunofluorescncia direta com utilizao de an-
ticorpos fluorescentes (imunoglobulinas anti-rbicas marcadas com
isotiocianato de fluorescena = conjugado anti-rbico) se constitui
em um mtodo rpido, sensvel e especfico de diagnosticar a infec-
o rbica em susceptveis. A prova se baseia no exame microscpico
de impresses de fragmentos de tecido nervoso tratados com con-
jugado especfico e submetidos luz ultravioleta. O antgeno rbico,
reagindo com o conjugado e iluminado com luz ultravioleta (com-
primento de onda de 260 nanmetros), emite uma luz esverdeada
fluorescente.
A sensibilidade da imunofluorescncia depende do espcime
(espcie animal e grau de autlise) e da experincia do profissional
de diagnstico.

52
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

4.2.1 Materiais necessrios


4.2.1.1 Equipamentos:
microscpio de imunofluorescncia;
estufa bacteriolgica;
centrfuga refrigerada;
geladeira;
freezer a -200C;
balana;
destilador;
timer.

4.2.1.2 Reativos:
conjugado anti-rbico;
CVS (challenge virus standard);
crebro de camundongo normal (sadio);
acetona PA;
glicerina PA;
cloreto de sdio (NaCL);
fosfato de potssio monobsico (KH2PO4);
fosfato de potssio dibsico (K2HPO4);
penicilina e estreptomicina ou gentamicina;
soro normal de coelho ou de eqino no imunizados contra
a raiva.

4.2.1.3 Materiais diversos:


pinas pequenas;
tesouras pequenas;
lminas de vidro com extremidades foscas;

53
Secretaria de Vigilncia em Sade

lamnulas;
pipetas diversas;
tubos diversos;
estantes para tubos;
papel de filtro;
esptulas de madeira;
cmara mida;
coplin (suporte para lminas).

4.2.1.4 Procedimentos:
Identifique as lminas.
Corte fragmentos das diferentes pores do sistema nervoso
central (SNC).
Toque ligeiramente o fragmento na lmina, fazendo dois es-
paos de aproximadamente 1,5cm2 cada, com impresses na
mesma lmina.
Observaes:
A) Para ces e gatos, recomenda-se fazer impresses do corno
de Amon (hipocampo). Para herbvoros e animais silvestres,
utilize fragmentos da medula, do cerebelo e do corno de
Amon para as impresses.
B) Utilize os fragmentos para o preparo do inculo destinado
prova biolgica.
Deixe secar a lmina por aproximadamente 15 a 30 minutos.
Fixe a lmina, no mnimo durante 30 minutos, em acetona a
-20C contida em coplin (este e a acetona devem ser manti-
dos permanentemente em congelador).
Retire a lmina da acetona e deixe-a escorrer e secar.

54
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Aps a secagem, caso no utilize as lminas prprias para IF,


faa um crculo em torno das impresses com esmalte, para
reter o conjugado.
Cubra a impresso mais prxima da identificao com a di-
luio A (crebro de camundongo normal + conjugado pre-
viamente titulado) e a impresso mais distante com a dilui-
o B (CVS + conjugado previamente titulado).
Incube as lminas por 30 minutos a 37C em cmara mida.
Enxge as lminas com soluo salina tamponada (pH en-
tre 7,2 a 7,5), deixando-as por duas vezes submersas em sali-
na durante dez minutos.
Enxge as lminas com gua destilada, para evitar a forma-
o de cristais durante a secagem.
Seque as lminas.
Adicione uma gota de glicerina tamponada (pH em 8,5).
Coloque lamnulas nas duas impresses, A e B.
Este mesmo procedimento deve ser feito com as lminas de
controle (material positivo e negativo para raiva). O mate-
rial utilizado para controle positivo deve ser o crebro de
camundongos infectados com material de rua ou a prpria
amostra original positiva.

4.2.2 Leitura das lminas


Nas lminas com a presena do antgeno podero ser obser-
vadas estruturas de cor verde-ma dotadas de brilho intenso. Os
tamanhos destas incluses podem ser variados: algumas so peque-
nas (chamadas de areia ou poeira antignica) e outras apresentam o
tamanho comparvel ao dos corpsculos de Negri.
Observao: no devero ser observadas incluses fluorescen-
tes nas impresses com a diluio B (CVS + conjugado). Tal proce-
dimento importante para determinar a especificidade do teste e
evitar o falso-positivo.

55
Secretaria de Vigilncia em Sade

4.2.3 Preparo do CVS (Challenge Virus Standard)


Prepare uma diluio que contenha 1.000 DL50/mL do vrus-
semente.
Inocule 0,03mL, via intracerebral, em camundongos de 21
dias com peso de 11 a 14 gramas.
Colete o sistema nervoso central dos camundongos quando
a maioria deles estiver em fase final de paralisia (de cinco a
seis dias).
Prepare uma suspenso a 20% com o diluente de vrus.
Centrifugue o preparo, em condies de refrigerao, a
2.500g durante dez minutos.
Coloque alquotas em frascos apropriados, de acordo com a
rotina laboratorial.
Mantenha o preparo em condies de congelamento, de prefe-
rncia a -70oC.
Observao: o ttulo do CVS produzido no dever ser infe-
rior a 105,0 DL50 / 0,03mL, lembrando-se que o ttulo de um 105,0
DL50/0,03mL significa que nesta diluio (1:100.000) temos 1DL50.

4.2.4 Titulao do CVS (trabalho)


Todo lote de CVS trabalho produzido dever ser titulado, para
que se verifique a viabilidade do produto.
Exemplo:
A partir da suspenso 1:5 (20%) do lote de CVS trabalho
produzido, faa uma diluio 1:2 e depois diluies suces
sivas de 1:10.
Inocule dez camundongos por diluio (de 11 a 14 gramas
ou recm-nascidos) a partir da diluio 10-5,0 a 10-8,0.
Observe os animais inoculados por 15 dias, anotando o n-
mero de animais mortos.

56
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Calcule o ttulo do vrus por meio do mtodo de Reed &


Mench.
4.2.5 Preparo do CCN (crebros de camundongos normais)
Colete o sistema nervoso central de camundongos sadios.
Prepare uma suspenso a 20% com o diluente de vrus.
Centrifugue o preparo, em condies de refrigerao, a 2.500g,
durante dez minutos.
Coloque alquotas em frascos apropriados, de acordo com a
rotina laboratorial.
Mantenha o preparo em condies de congelamento, de prefe-
rncia a -70oC.

4.2.6 Titulao do conjugado anti-rbico


Dilua o conjugado, conforme o recomendado pelo laborat-
rio produtor.
Prepare lminas com material positivo com as identificaes
das diluies que devem ser testadas.
Prepare separadamente diluies duplas do conjugado com
CVS e CCN.
Deixe o preparo reagir, temperatura ambiente, por aproxi-
madamente 15 minutos.
Core as lminas, conforme descrito na tcnica de imunofluo-
rescncia direta.
Para melhor avaliao, utilize em cada diluio uma lmina
preparada com material negativo, alm das positivas.
Quando o ttulo do conjugado anti-rbico, sugerido pelo labo-
ratrio produtor, for maior ou igual a 1:100, sugere-se que seja rea-
lizada uma diluio inicial de 1:10 com soluo salina tamponada
para iniciar a titulao (tal diluio poder ser aproveitada depois de
estabelecido o ttulo ideal).

57
Secretaria de Vigilncia em Sade

Sugestes de diluies para titulao:


1.) Inicie a diluio em 1:2 (conjugado anti-rbico 1:10 e CN/
CVS) e continue com diluies seriadas em 1:2.
1:2 1:2 1:2

Conjugado 1:10 100l 100l 100l 100l
+ + + + +
CN 100l 100l 100l 100l
1:2 1:2 1:2

Conjugado 1:10 100l 100l 100l 100l

+ + + + +
CVS 100l 100l 100l 100l
Diluies 20 40 80 160

2.) Inicie a diluio em 1:3 (conjugado anti-rbico 1:10 e CN/


CVS) e continue com diluies seriadas em 1:2.
1:2 1:2 1:2

Conjugado 1:10 100l 100l 100l 100l

+ + + + +
CN 200l 100l 100l 100l
1:2 1:2 1:2

Conjugado 1:10 100l 100l 100l 100l

+ + + + +
CVS 200l 100l 100l 100l
Diluies 30 60 120 240

3.) Inicie a diluio em 1:5 (conjugado anti-rbico 1:10 e CN/


CVS) e continue com diluies seriadas em 1:2.
1:2 1:2

Conjugado 1:10 50l 100l 100l
+ + + +
CN 100l 100l 100l
1:2 1:2

Conjugado 1:10 50l 100l 100l

+ + + +
CVS 100l 100l 100l
Diluies 50 100 200

58
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

4.2.7 Avaliao do conjugado


Observe as lminas microscopia de fluorescncia.
Determine a diluio ideal, observando a presena de incluses,
sua intensidade de colorao e a inexistncia de colorao ines-
pecfica (no campo com CCN + conjugado) e a total ausncia
de incluses (no campo com CVS + conjugado).
A diluio determinada ser o ttulo de uso do conjugado. Man-
tenha o estoque do conjugado anti-rbico acondicionado de acordo
com as recomendaes do laboratrio produtor.

Figura 14. Lmina com impresso de corno de Amon


de animal infectado pelo vrus da raiva corado
com conjugado anti-rbico fluorescente

Fonte: Instituto Pasteur

59
Secretaria de Vigilncia em Sade

Figura 15. Lmina com impresso de cerebelo de


animal infectado com o vrus da raiva corado
com conjugado anti-rbico fluorescente

Fonte: Instituto Pasteur

4.3 Prova para isolamento do vrus rbico em


camundongos (prova biolgica)
Os animais de laboratrio tm sido utilizados ao longo dos anos
nos estudos de anatomia, fisiologia, imunologia, virologia e outros,
procedimento que tem permitido importantes avanos no desenvol-
vimento da cincia e da tecnologia. A definio mais simplificada de
um biotrio a de uma instalao que atenda s exigncias do bem-
estar e da sade dos animais que sero criados ou mantidos. Tais
exigncias, alm do aspecto fsico, se devem aos procedimentos e ao
manejo dos animais. Atualmente, os animais utilizados em experi-
mentos ou para fins de diagnstico devem atender a parmetros de
qualidade gentica e sanitria, uma vez que podem ser considerados
reagentes biolgicos e, como tal, os resultados dos experimentos
so afetados em razo da qualidade de cada espcie animal utiliza-
da. Existe em mbito mundial toda uma legislao especfica para o
uso de animais em experimentao. Entretanto, o Brasil no possui
uma legislao que efetivamente regule a criao e o uso de animais

60
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

para a pesquisa e o ensino em mbito nacional.Apesar disso, na


conduta de cada indivduo que trabalha com animais que deve haver
a conscientizao de minimizar a utilizao, a dor, o sofrimento e o
estresse dos animais.
O animal de eleio para o isolamento o camundongo albino
suo, por ser um dos mais sensveis ao vrus rbico. O animal utili-
zado deve ser de boa procedncia e apresentar bom estado sanitrio,
com idade e peso adequados.

4.3.1 Materiais necessrios


4.3.1.1 Equipamentos:
cabine de segurana biolgica;
centrfuga refrigerada com caapas de segurana;
geladeira;
freezer (-20oC);
balana;
destilador ou sistema de purificao de gua;
timer.
4.3.1.2 Reativos:
gua destilada;
cloreto de sdio (NaCl);
fosfato de potssio monobsico (KH2PO4);
fosfato de potssio dibsico (K2HPO4);
penicilina e estreptomicina ou gentamicina;
soro normal de coelho ou de eqino, no imunizados
contra a raiva, ou soro fetal bovino.
4.3.1.3 Materiais diversos:
gral e pistilo;
tubos para centrfuga;

61
Secretaria de Vigilncia em Sade

suportes para tubos;


tesouras e pinas cirrgicas;
micropipetas e ponteiras para volumes de 200 a
5000uL;
gaiolas para manuteno de camundongos;
bebedouros para camundongos;
rao peletizada, prpria para camundongos;
maravalha.

4.3.2 Procedimentos

Preparo da suspenso a 20% para inoculao


Pese 1 grama dos diferentes fragmentos do SNC, macere-o em
gral estril e adicione ao preparo 4mL de diluente de vrus.
Centrifugue o preparo de 2.000 a 3.000g durante 15 minutos.
Retire o sobrenadante.
Mantenha o preparo em refrigerao (de 2 a 8C) para inocul-
lo em camundongos, no mesmo dia, por via intracerebral (IC).

4.3.3 Inoculao em camundongos


Realize as inoculaes IC em camundongos lactentes de at
5 dias (0,01mL por animal) ou em camundongos de 21 dias
de idade com 11 a 14 gramas de peso (0,03mL por animal).
Prepare fichas de identificao e de leitura das amostras que
devem ser inoculadas.
Inocule de 8 a 10 camundongos por amostra.
Realize a leitura dos camundongos inoculados diariamente
por 21 dias, no caso de amostras de ces e gatos, e no mnimo
30 dias, no caso de amostras de herbvoros e animais silves-
tres.

62
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Anote, nas fichas de leitura, a relao dos animais mortos, do-


entes e sacrificados. Colete todos os animais mortos a partir
do quinto dia da inoculao e os submeta prova de IFD.
Para a inoculao, devero ser utilizadas, preferencialmente,
seringas descartveis de 1mL que permitam a dosagem de
0,03mL e agulhas de calibre 13x4,5, no mximo.
Ao final da prova, os animais devero ser sacrificados com
a utilizao de equipamentos adequados eutansia de ani-
mais ou mediante a inalao de ter etlico ou clorofrmio,
observando-se as boas prticas laboratoriais.
Observao:
1. As amostras originais recebidas para o diagnstico labora-
torial devero ser guardadas em congelador (freezer) at o trmino
das provas.
2. Os animais inoculados devem ser mantidos em observao
em rea ou local prprio (biotrio de experimentao ou infectrio)
separado das demais dependncias do laboratrio. No devem ser
mantidos na rea de criao animal.
Inicialmente, em 1975, as clulas BHK-21 foram utilizadas em
muitos laboratrios na rotina de diagnstico, porm no apresenta-
ram a mesma sensibilidade dos camundongos para a prova de isola-
mento do vrus da raiva. As clulas de neuroblastoma, identificadas
na American Type Culture Collection (ATCC) como CCL 131, so
utilizadas, atualmente, em muitos pases para o diagnstico da raiva.
Tal linhagem celular sensvel ao vrus de rua, sem nenhum grau de
adaptao. A replicao do vrus da raiva nestas clulas revelada
pela tcnica de anticorpos fluorescentes. O resultado do teste pode
ser obtido a partir de 18 horas de incubao da mistura clulas +
vrus (um ciclo de replicao do vrus nas clulas); porm, a leitura
realizada, geralmente, aps 48 horas.
Este teste to sensvel como a inoculao em camundongos
e, uma vez existindo a unidade de cultivo celular no laboratrio,
um teste mais econmico do que o realizado em camundongos, pois
fornece resultados com maior rapidez.

63
Secretaria de Vigilncia em Sade

Figura 16. Camundongo inoculado com amostra


positiva para raiva apresentando aerofobia

Fonte: Instituto Pasteur

Figura 17. Camundongo inoculado com amostra


positiva para a raiva apresentando paralisia

Fonte: Instituto Pasteur

64
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

4.4 Prova para Isolamento do Vrus Rbico em Cultivo


Celular
Utilizado no diagnstico laboratorial da raiva como um se-
gundo teste para confirmao dos resultados obtidos pela tcnica
de imunofluorescncia direta, em casos de suspeita de raiva em ani-
mais, a tcnica de isolamento e identificao viral com utilizao
de clulas de neuroblastoma de camundongo (N2A) e anticorpos
fluorescentes (imunoglobulinas anti-rbicas marcadas com isotio-
cianato de fluorescena = conjugado anti-rbico) um mtodo mais
rpido, simples e de custo menos elevado de isolamento do vrus da
raiva. A tcnica se baseia na inoculao de suspenses de sistema
nervoso central (SNC) em placas utilizando clulas, seguida pelo
exame microscpico da clula tratada com conjugado especfico
e submetida luz ultravioleta. O antgeno rbico, reagindo com o
conjugado e iluminado com luz ultra (comprimento de onda de 260
nanmetros), emite uma luz esverdeada fluorescente.
A sensibilidade da tcnica depende do uso de clula com boa
morfologia, da experincia do profissional na realizao da tcnica e,
principalmente, da leitura das placas.

4.4.1 Materiais necessrios


4.4.1.1 Equipamentos:
cabine de segurana biolgica classe A, II tipo;
incubadora de CO2 a 37C;
microscpio de fluorescncia invertido;
microscpio tico invertido;
pipetador automtico para pipetas de vidro;
bomba de vcuo;
banho maria para 56C;
geladeira;
freezer a -20C;

65
Secretaria de Vigilncia em Sade

agitador magntico;
sistema de purificao de gua (Milli-Q);
balana analtica.
4.4.1.2 Reativos:
gua destilada;
tripsina a 0,2% e versene a 0,02% (ATV);
aminocidos no essenciais;
antibitico (sulfato de gentamicina);
dimethiyl sulfoxide (DMSO);
conjugado anti-rbico;
acetona a 80%;
glicerina tamponada;
reagente para preparo da soluo salina tamponada;
dihidrogenofosfato de sdio (NaH2PO4.H2O);
di-sdio hidrognio fosfato dodecahidrato
(Na2HPO4.12H20);
cloreto de sdio (NaCl).
4.4.1.3 Materiais diversos:
garrafas de plstico;
microplacas de 96 wells;
micropipetadores multicanais (8) de 20-200l;
pipetas de vidro ponteiras;
tubos de 1,5mL para alicotar aminocidos e gentamicina;
tubos cnicos de plstico de 50mL para alicotar soro fe-
tal bovino e ATV;
becker.

66
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

4.4.2 Procedimentos
Preparo das suspenses do SNC
Prepare uma suspenso de tecido cerebral a 20% - 0,6g de
tecido + 2,4mL de diluente (1ml de gentamicina e 20ml de
soro fetal bovino, completando o preparo com quantidade
suficiente para 1000ml de soluo fisiolgica a 0,85%).
Deixe o antibitico agir por 1 hora.
Centrifugue o preparo por 30 minutos em 3000rpm (1400g)
a 4C.
Separe o sobrenadante como suspenso para a inoculao
em clula.
Preparo da suspenso celular
Clulas N2A mantidas no laboratrio so resuspensas em
10mL de meio (5x105 clulas/mL) contendo 10% de soro
fetal bovino, 30L de antibitico (gentamicina) acrescido de
30L de aminocido.
Preparo da placa
Em cada 3 orifcios da placa, inocule 1 suspenso de amostra
de quirptero, adicionando 40L por orifcio (para a suspen-
so ficar na concentrao de 4%). Juntamente com as amos-
tras de rotina, tambm sero aplicados na placa um controle
positivo (amostra fixa CVS) e controles negativos (somente
clula e outro com crebro normal de camundongo CN).
Em seguida, adicione 160L de meio de cultura contendo
30L de antibitico [3X] e 30L de aminocido para cada
10ml de meio preparado.
Deve-se homogeneizar o material adicionado na placa.
Em cada orifcio da placa, adicione 100L da suspenso ce-
lular (com meio preparado igual etapa citada), na qual a
clula mantida com repiques sucessivos no laboratrio.
Incube a placa a 37C em cmara mida com CO2 a 5% por
96 horas.

67
Secretaria de Vigilncia em Sade

Aps esse tempo, remova o material da placa utilizando uma


bomba de suco.
Fixe as clulas em acetona gelada a 80% (200uL por orifcio)
e incube o preparo por 15 minutos em banho de gelo (a ace-
tona deve ser mantida permanentemente em congelador).
Despreze a acetona.
Seque os orifcios da placa.
Acrescente 40L do conjugado anti-rbico (previamente titu-
lado) por orifcio e incube o preparo a 37C por 60 minutos.
Despreze o conjugado.
Enxge a placa por submerso, 3 vezes, em soluo salina
tamponada pH 7,4.
Enxge a placa por submerso, 3 vezes, em gua destilada.
Seque a placa.
Adicione 50L de glicerina tamponada (pH 8,5) em cada
orifcio.

Leitura das placas

Examine as placas em microscpio invertido de luz ultravio-


leta.
Nos orifcios com presena de antgeno podero ser observa-
das estruturas de cor verde-ma, dotadas de brilho intenso. O
tamanho das incluses pode ser variado: algumas so peque-
nas, chamadas de areia ou poeira antignica, e outras apresen-
tam o tamanho comparvel ao dos corpsculos de Negri.

Observaes
No devero ser observadas incluses fluorescentes nos ori-
fcios contendo os controles negativos (CN e somente clula); este
procedimento importante para determinar a especificidade do
teste e evitar o falso positivo. No controle positivo (CVS), devero

68
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

ser observadas incluses fluorescentes, sendo este procedimento im-


portante para determinar tambm a especificidade do teste e evitar
falso negativo.
Todo o procedimento de repique celular e inoculao das sus-
penses em clula deve ser realizado dentro de cabine de segurana
biolgica classe A II, exclusiva para cada um desses procedimentos.
Todos os materiais utilizados devem ser estreis.

4.5 Tipificao antignica pela tcnica de imunofluorescncia


indireta com anticorpos monoclonais
Os centros colaboradores da OMS, da Opas e de instituies
privadas disponibilizam, para a tipificao antignica, vrios painis
de anticorpos monoclonais. Cada um dos painis tem poder de re-
soluo diferente e, em funo disso, h a necessidade de adoo de
um nico painel para uma regio.
O Centro Pan-Americano de Zoonoses (Cepanzo)/Opas e o
Centers of Disease Control and Prevention (CDC), em Atlanta (EUA),
realizaram estudos com amostras virais isoladas nos diferentes pases
das Amricas durante o perodo de 1987 a 1992. Com tais dados, os
referidos rgos selecionaram um painel reduzido, composto de oito
anticorpos monoclonais, que permite detectar as cepas mais comuns
de raiva da Amrica Latina.
Todos os anticorpos monoclonais foram preparados pela imu-
nizao de camundongos com amostras vacinais ERA/SAD e devem
ser titulados com esses vrus ou com vrus CVS. Para os laborat-
rios de diagnstico encaminhado 1mL da diluio 1:10 de cada
um dos oito anticorpos monoclonais, sendo que o ttulo de trabalho
dos anticorpos , aproximadamente, 1:1000. Cada um deles deve ser
diludo a 1:100 em emem, com 10% de soro fetal bovino, 25mm de
tampo hepes e 1mm de azida sdica. Essas diluies so estveis
por um ano a 4oC.
A partir dessa soluo estoque, devem ser testadas diluies se-
riadas de cada um dos anticorpos monoclonais (por exemplo: 1:500;
1:1000; 1:1500) para determinar, de acordo com cada laboratrio, a
diluio de trabalho. Esta diluio ideal de trabalho ser estabelecida

69
Secretaria de Vigilncia em Sade

como a diluio na qual a intensidade de brilho seja de 3+ a 4+ para


cada anticorpo monoclonal.
As lminas preparadas para o estudo das amostras devem ser
providenciadas a partir do cultivo de clulas de neuroblastoma mu-
rino ou de decalques a partir de crebros de camundongos infecta-
dos com a amostra em teste.
Decalques em lminas de amostras originais de SNC podero
ser utilizados desde que apresentem distribuio de antgeno rbico
em 75% a 100% dos campos pesquisados por meio da IFD. Ressalta-
se que alguns anticorpos monoclonais podem produzir resultados
variveis em decalques preparados com amostras originais de SNC.

4.5.1 Materiais necessrios


4.5.1.1 Equipamentos:
microscpio de imunofluorescncia;
estufa bacteriolgica;
geladeira;
freezer (a -200C);
timer.
4.5.1.2 Reativos:
painel de oito anticorpos monoclonais (Mcl);
conjugado anti-camundongo;
acetona PA;
glicerina PA;
cloreto de sdio (NaCL);
fosfato de potssio monobsico (KH2PO4);
fosfato de potssio dibsico (K2HPO4);
meio de cultura (MEM).

70
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

4.5.1.3 Materiais diversos:


pinas pequenas;
tesouras pequenas;
lminas de vidro marcadas com extremidades foscas;
lamnulas;
pipetas diversas;
estantes para tubos;
papel de filtro;
cmara mida;
coplin (suporte para lminas).
4.5.1.4 Procedimentos:
Prepare quatro lminas com dois campos de leitura ou oito
lminas com um s campo.
Mantenha-as temperatura ambiente por 30 minutos.
Fixe as lminas em acetona PA a -20oC por quatro horas ou
durante toda a noite (recomenda-se a utilizao de lminas
j demarcadas para IF).
Retire-as da acetona e deixe-as secar por 15 minutos.
1. etapa
Coloque 15l da diluio de trabalho de cada um dos oito
anticorpos monoclonais em cada decalque.
Identifique as lminas com o nmero de cada anticorpo mo-
noclonal (1, 4, 9, 10, 12, 15, 18 e 19).
Incube as lminas a 37oC, por 30 minutos, em cmara mida.
Retire-as da estufa e lave cada lmina utilizando pisseta com
PBS 0,01M, pH 7,6. Esta fase deve ser realizada com o m-

71
Secretaria de Vigilncia em Sade

ximo cuidado, para que no haja transferncia de um an-


ticorpo monoclonal de um decalque para outro, quando se
utilizar dois ou mais por lmina.
Lave cada decalque duas vezes.
Deixe as lminas submersas em PBS (0,01M, pH 7,6) por dez
minutos.
Seque-as para a prxima etapa.
2. etapa
Coloque em cada decalque cerca de 25 a 30l de conjugado
anti-camundongo diludo de acordo com ttulo j estabele-
cido pelo laboratrio.
Incube os decalques a 37oC por 30 minutos.
Retire e lave os decalques conforme o procedimento ante-
rior.
Retire as lminas do PBS e passe-as em gua destilada.
Seque e monte as lminas com glicerina tamponada (pH 8,5)
e lamnulas.
Realize sua leitura em microscpio de IF, estabelendo os pa-
dres de acordo com o quadro apresentado a seguir (MAT-
TOS, C.; MATTOS, C., 1998).

72
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Padres de reao das diferentes variantes


antignicas com os anticorpos monoclonais

Anticorpos
C1 C4 C9 C10 C12 C15 C18 C19 AgV
monoclonais
CVS/ERA SAD/
+ + + + + + + + Lab.
Past
Perro/mangosta + + + + + + - + 1
Perro + + - + + + - + 2
Vampiro - + + + + - - + 3
Tadarida
- + + + + - - - 4
brasiliensis
Vampiro - + + + + v - v 5
Lasiurus cinereus v + + + + - - - 6
Zorro de Arizona + + + - + + - + 7
Zorrillo centro/sur? - + + + + + + + 8
Tadarida Br. mex. + + + + + - - - 9
Baja SC zorrillo + + + + - + - + 10
Vampiro - + + + - - - + 11
Fonte: Mattos, C.; Mattos, C. (1998).

73
Captulo
5

Soroneutralizao
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

A neutralizao viral definida como a perda da capacidade


infectante da partcula viral pela reao com um anticorpo especfico.
O soro de animais que se recuperam de uma infeco viral ge-
ralmente contm imunoglobulinas, que so capazes de diminuir ou
inibir a capacidade infecciosa do agente causal. Esses anticorpos neu-
tralizantes so altamente especficos e responsveis pelo efeito prote-
tor do soro imune e esto dirigidos contra determinantes antignicos
da superfcie do vrus, que intervm no processo de adsoro clula.
Pode-se concluir que a soroneutralizao a tcnica mais sensvel e
especfica para a caracterizao viral por mtodos sorolgicos.
O princpio bsico consiste em misturar diluies apropriadas
de soro e vrus, incub-los sob determinadas condies e inocular
a mistura em um sistema sensvel (ovos embrionados, animais de
laboratrio ou cultivos celulares). O vrus no neutralizado pode
produzir um efeito como morte, leso especfica (pocks) em ovos
embrionados, efeito citoptico, etc.
As condies de incubao como o tempo, a temperatura, o
pH, a presena de complemento podem interferir no processo de
neutralizao.
O teste de neutralizao freqentemente usado para:
identificao de cepas isoladas mediante a utilizao de anti-
soros especficos fornecidos por rgos de referncia;
diagnstico de infeces virais mediante a demonstrao do
aumento de ttulo de anticorpos especficos na evoluo de
uma doena (sorologia pareada);
determinao do nvel de proteo individual ou populacional.
H dois mtodos para se realizar uma prova de soroneutra-
lizao.

Mtodo : vrus constante/soro diludo:


Este mtodo apresenta a vantagem de requerer pequena quan-
tidade de soro. bastante til para demonstrar diferentes nveis de
anticorpos neutralizantes em soros coletados na fase aguda da doen-
a e durante o perodo de convalescena.

77
Secretaria de Vigilncia em Sade

Para a padronizao deste teste, necessrio determinar o t-


tulo infeccioso do antgeno viral no sistema no qual se realizar o
teste. O ttulo ser determinado pela utilizao da frmula de Reed
& Mench.

DP = % infectado > 50% 50% x FD


% infectado > 50% % infectado < 50%

Onde: DP = distncia proporcional;


FD = fator de diluio.

Aps a determinao do ttulo infeccioso, dever ser calculada


a diluio que possui o nmero fixo de DL50 ou DICT50. Geralmente
so utilizados testes que usam 100 DL50 ou 100 DICT50.
Neste mtodo, portanto, adiciona-se uma quantidade fixa de
vrus (medida por titulaes anteriores) a diluies variveis de um
soro-problema e inoculam-se sistemas sensveis. A mais alta diluio
do soro que protege o sistema sensvel da infeco denominada
ttulo soroneutralizante.

Mtodo : soro constante/vrus diludo:


Diferentes concentraes (diluies) de vrus so misturadas a
uma concentrao fixa de soro que, aps a incubao, so inoculadas
em sistemas sensveis. O ndice de soroneutralizao (IN) a dife-
rena entre o ttulo do vrus na presena de soro-controle negativo e
o ttulo do vrus na presena do soro-problema.
O teste de soroneutralizao pode ser utilizado, tambm, para
identificao de cepas isoladas, desde que sejam realizadas provas
com anti-soros de referncia.
O vrus em estudo, usado na diluio que contm 100 DICT50,
deve ser misturado a quatro unidades neutralizantes dos soros de
referncia. Estas misturas, por sua vez, devem ser inoculadas (aps
a incubao) em um sistema adequado. A sobrevivncia deste sis-
tema implica a proteo e, conseqentemente, a identidade com o
respectivo soro de referncia. A atividade neutralizante de um soro

78
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

tambm pode ser determinada pelo teste de reduo de placas, com


certos vrus que produzem um rpido efeito citoptico.
importante lembrar que qualquer teste de neutralizao s
poder ser considerado se todos os controles de prova forem execu-
tados. Assim, por exemplo, no teste de soroneutralizao em clulas,
que o mais utilizado, dever haver soro positivo e soro negativo,
controle de clulas e controle de diluio de vrus.

5.1 Avaliao sorolgica para raiva


A determinao dos anticorpos neutralizantes (AcN) deve ser
realizada em amostras de soros coletados dez dias aps a ltima dose
de vacina (ou a qualquer momento) de indivduos previamente imu-
nizados e expostos ao risco de contrair a raiva. Todos os indivdu-
os pertencentes aos grupos de risco que freqentemente esto em
contato com o vrus rbico devem ser avaliados a cada seis meses.
De igual forma, uma dose de reforo vacinal deve ser administra-
da sempre que o ttulo de anticorpos estiver abaixo de 0,5UI/mL. A
Organizao Mundial da Sade considera que um ttulo igual ou su-
perior a 0,5UI/mL representa um estado imunitrio suficiente para
proteger indivduos expostos ao risco de contaminao pelo vrus
rbico. Ressalta-se, no entanto, que os anticorpos no so elementos
exclusivos de proteo (resposta imune humoral), visto que agem
simultaneamente na presena da imunidade celular. Um ttulo ele-
vado de anticorpos significa proteo, porm um ttulo baixo no
significa que o indivduo esteja necessariamente desprotegido, tendo
em vista a atuao da imunidade celular.
O primeiro teste para titulao de anticorpos foi desenvolvido
por Webster & Dawson, em 1935, sendo realizado em camundongos
e considerado um bom parmetro para avaliao de imunidade anti-
rbica. Face necessidade de um grande nmero de animais, ao alto
custo e demora na obteno dos resultados (15 dias), vrios outros
mtodos foram desenvolvidos, tais como: a reao de imunofluores-
cncia indireta (Rifi) e contraimunoeletroforese (Ciep), bem como o
teste rpido de inibio de focos fluorescentes (RFFIT).
Por meio de testes comparativos, verificou-se que o RFFIT pos-
sui uma boa correlao com a prova de soroneutralizao em ca-

79
Secretaria de Vigilncia em Sade

mundongos, possuindo a vantagem de ser mais rpido e apresentar


maior reprodutibilidade.
Mais recentemente, o Instituto Pasteur de So Paulo desenvol-
veu um teste simplificado de inibio de focos fluorescentes (SFI-
MT), que vem sendo utilizado rotineiramente na avaliao de anti-
corpos de humanos vacinados contra a raiva.

5.1.1 Colheita do soro


Deve-se coletar uma amostra de sangue de, no mnimo,
5mL.
Preferencialmente, deve-se enviar o soro j separado (no m-
nimo 2mL), sendo que ele deve permanecer em condies
de refrigerao at o seu encaminhamento ao laboratrio,
em frasco hermeticamente fechado.
O sangue total pode ser encaminhado temperatura ambien-
te, tambm em frasco hermeticamente fechado, o mais rapi-
damente possvel (no mximo em 24 horas), evitando-se a
hemlise, que apresenta toxicidade para as clulas.
Os frascos contendo soro ou sangue devem ser perfeitamen-
te identificados com o nome completo do paciente.

5.2 Soroneutralizao em cultura de clulas


O mtodo descrito a seguir o teste simplificado de inibio de
focos fluorescentes (SFIMT), utilizado no Instituto Pasteur.

5.2.1 Materiais necessrios


5.2.1.1 Equipamentos:
microscpio ptico invertido;
microscpio de imunofluorescncia invertido;
centrfuga;
estufa de CO2;
cabine de segurana biolgica;

80
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

continer de nitrognio lquido;


banho-maria a 56C.

5.2.1.2 Materiais diversos:


frascos para cultura celular (corning ou similar);
microplacas para cultura celular de 96 orifcios (corning ou
similar);
pipetas multicanal.

5.2.1.3 Reativos:
vrus PV;
conjugado anti-rbico;
clulas BHK 21 clone 13;
soro hiperimune padro;
meio essencial mnimo de Eagle (MEM);
soluo de tripsina a 0,05% de EDTA;
acetona a 80% em H2O destilada;
tampo de carbonato/bicarbonato (0,05M, pH 8,5);
salina fosfato tamponada (pH 7,3);
glicerina tamponada (pH 8,5);
soro fetal bovino.

5.2.2 Procedimentos
Inative o soro a 56C , em banho-maria, durante 30 minutos.
Faa duas sries de quatro diluies (razo 2) do soro hiperi-
mune padro (por exemplo: 200UI/mL) com diluies iniciais
de 1:2000 e 1:3000, respectivamente, em volumes de 100L.

81
Secretaria de Vigilncia em Sade

Faa seis diluies dos soros que devem ser testados (razo
2), a partir da diluio de 1:5, em volumes de 100L.
Adicione 50L de vrus em diluio pr-determinada sufi-
ciente para infectar, no mnimo, 80% das clulas.
Incube o preparo a 37C, durante uma hora, em atmosfera
contendo 5% de CO2.
Adicione 50L de suspenso de clulas BHK-21 (10.000 c-
lulas/poo).
Faa uma diluio de vrus (razo 2) de 1:1 a 1:8 a partir da
diluio utilizada na placa.
Incube as placas a 37C, com 5% de CO2, durante 24 horas.

5.2.3 Colorao com conjugado fluorescente


Retire o meio de cultura da placa por aspirao cuidadosa
com bomba de vcuo ou seringa.
Adicione 300L de acetona gelada (80% em H2O) em cada
orifcio da placa e fixe as clulas durante 15 minutos em ba-
nho de gelo.
Despreze a acetona (por inverso da placa) e a seque em es-
tufa (37C).
Adicione ao preparo 40L de conjugado anti-rbico em di-
luio tima estabelecida previamente (em PBS).
Incube o preparo por 1 hora, a 37C, em cmara mida.
Lave as placas (trs vezes) por imerso em PBS durante cin-
co minutos e, em seguida, trs vezes em gua destilada, por
imerso.
Aps a secagem das placas, adicione ao preparo 40L de gli-
cerina tamponada (pH 8,5).

5.2.4 Leitura
As placas so lidas em microscpio de fluorescncia sem char-
riot (com objetiva de 10x) ou diretamente em microscpio de fluo-
rescncia invertido.

82
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Os resultados correspondem diluio onde ocorrer decrsci-


mo de 50% de infeco. Com treinamento adequado, leituras inter-
medirias podem ser feitas com bastante segurana.
Por meio de uma regra de trs, comparam-se os resultados ob-
tidos com o soro-padro e o soro-teste, para verificao do resultado
do soro, expresso em unidades internacionais (UI/mL).
Exemplo:
Um soro que tenha ttulo por diluio de 1:40, em uma prova
na qual o soro-padro ofereceu resultado 1:16.000, tem ttulo de 0,50
UI/mL, calculado da seguinte maneira:

16.000 __________________ 200UI/mL


40 __________________ X
X = 0,50 UI/mL

5.3 Soroneutralizao em camundongos


Como j foi dito, o teste de soroneutralizao em camundongos
uma tcnica altamente sensvel e especfica para dosagem de anti-
corpos rbicos neutralizantes. Como toda prova biolgica apresenta
os inconvenientes prprios desta tcnica, os camundongos devem
estar dentro das especificaes de peso, idade e condies sanitrias.
Alm disso, seu principal fator limitante o tempo necessrio ob-
teno do resultado (15 dias).
O vrus CVS deve ser conservado em freezer (-70oC), em nitro-
gnio lquido ou liofilizado, para evitar variaes no ttulo e nas DL50
utilizadas. Embora a tcnica de soroneutralizao seja padronizada
para 32 DL50, aceitvel uma variao de 20 a 70 DL50.

5.3.1 Diluio do soro a ser testado e do soro-padro


Inative o soro a 56C durante 30 minutos.
Faa uma diluio seriada do soro na base 5, iniciando com
1:2,5 at 1:312,5.

83
Secretaria de Vigilncia em Sade

Exemplo:
Distribua o diluente em tubos de 12 x 75mm, colocando
150L no primeiro tubo e 200L nos demais.
Coloque 100L do soro no primeiro tubo, homogeneize o
preparo e transfira 50L para o segundo tubo e assim suces-
sivamente, desprezando 50L do ltimo tubo.
Dilua o soro-padro, seriadamente, na base 2, iniciando com
a diluio 1:1.000 at 1:32.000, deixando um volume final,
em cada tubo, igual ao da diluio dos soros.

5.3.2 Diluio do vrus desafio


Dilua o CVS (base), de ttulo conhecido, iniciando com a di-
luio 10-1,7 (1:50).
As diluies 10-1,7 e 10-2,7 sero desprezadas e as diluies 10-
3,7
at 10-7,7 sero usadas como controle, objetivando conferir
se as DL50 obtidas correspondem s DL50 teoricamente espe-
radas a partir da titulao prvia.
Prepare uma diluio do vrus que contenha 64 DL50 tericas
em 0,03mL, como exemplificado.
Supondo-se que o vrus utilizado tenha um ttulo de 107,1/0,03
mL, deve-se proceder ao seguinte clculo para se obter uma diluio
com 64 DL50 (10-5,3), porque o log de 64 aproximadamente 1,8.
Exemplo: 107,1 101,8 = 105,3 = 1:200.000.
Portanto, a diluio do vrus 105,3 possui 64 DL50, sendo esta
diluio igual 1:200.000.
Observao: a quantidade a ser utilizada deve ser suficiente para
acrescentar 200L (0,2mL) em todos os tubos do soro a ser testado
e no soro-padro. Dessa forma, as DL50 sero diludas metade (32
DL50) e as diluies do soro sero dobradas (1:5; 1:25; 1:125 e 1:625).
Incube o preparo em banho-maria a 37oC durante 90 minutos.
Deixe-o por dez minutos em banho de gelo e o inocule imediatamente.

84
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

5.3.3 Inoculao e observao dos camundongos


Inocule oito camundongos por diluio (0,03mL/IC). Inicie
o procedimento com o vrus desafio pela maior diluio. Em
seguida, inocule o soro-padro e os soros que devem ser testa-
dos, iniciando o procedimento pela menor diluio.
Observe diariamente os camundongos, fazendo anotaes
em fichas.

5.3.4 Clculos segundo Reed & Mench


Clculo do vrus
Supondo que os resultados da observao dos camundongos
tenham sido os seguintes:
acumulados)

acumulados)
Mac (mortos

Mortalidade
Diluio do

Vac (vivos
Animais

Animais
mortos

vivos
vrus

(%)
10-3,7 8 0 29 0 100
10-4,7 8 0 21 0 100
10-5,7 7 1 13 1 92,8
10-6,7 6 2 6 3 66,6
10-7,7 0 8 0 11 0

Frmula:
Ttulo do vrus
= log de diluio _____% de mortalidade > 50% 50%__________ x log do fator
> 50% de % de mortalidade > 50% % de sobrevivncia < 50% de diluio
mortalidade

Ttulo do
Vrus = log 10-6,7 66,6 50 x 1
66,6 0
Ttulo do vrus = 6,7 0,25 = -6,95

85
Secretaria de Vigilncia em Sade

Ttulo do vrus = 106,95 DL50/0,03 mL


Subtraia, do ttulo terico utilizado, o ttulo do vrus obtido:
10-6,95 10-5,3 = 10-1,65, cujo antilog representa as doses letais uti-
lizadas (45 DL50).
Clculo do soro em teste e padro (exemplo):

Sobreviventes
acumulados)

acumulados)
Mac (mortos
Diluio do

Vac (vivos
Animais

Animais
mortos

vivos
soro

(%)
1:5 0 8 0 20 100
1:25 0 8 0 12 100
1:125 5 3 5 4 44,4
Frmula:
Ttulo do soro =
Log de diluio _____% de sobrevivncia > 50% 50%__________ x log do fator
> 50% de % de sobrevivncia > 50% % de sobrevivncia < 50% de diluio
sobrevivncia

Ttulo do soro = log (1:25) 100 50 x 0,7


10 44,4

Ttulo do soro = 1,4 0,89 x 0,7.


Ttulo do soro = 0,77,
cujo antilogaritmo representa a diluio que protege 50% dos
camundongos = 1:59 frente a 45 DL50.
Interpretao do resultado:
Segundo a OMS, sero considerados protegidos os indivduos
com ttulos > ou = 1:25.

86
Captulo
6

Logaritmos
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

6.1 Conceitos bsicos


D-se o nome de logaritmo de um nmero positivo N, em uma
base B, ao expoente X, que se deve elevar sobre B para se obter N.
Se N = Bx
Ento, o logaritmo, base B, de N, X.
X = logBN
Onde:
B = base;
N = nmero;
X = logaritmo.
X = logBN = N = antilogBX
Observao: os nmeros negativos e o zero no possuem lo-
garitmo.
Exemplos:
Log39 = 2 ou 9 = 32.
Log10 1000 = 3 ou 103 = 1000.
Entre todos os possveis sistemas de logaritmos existem alguns
utilizados. Estes so:
A) Os logaritmos decimais, comuns ou de Briggs: so os de
base 10 e so simbolizados por log, entendendo-se que a
base 10.
B) Os logaritmos naturais ou niperianos: nestes, a base um n-
mero irracional (e = 2,712828). So simbolizados por ln.

6.2 Operaes com logaritmos


A) logaritmo de um produto
O logaritmo de um produto igual soma dos logaritmos dos
fatores.
Se (A x B), ento: log (A x B) = log A + log B;

89
Secretaria de Vigilncia em Sade

Log (10) (100) = log 10 + log 100;


Log 1000 = 1 + 2;
Log 1000 = 3.
B) Logaritmo de um quociente
O logaritmo de um quociente igual diferena entre o loga-
ritmo do numerador e o logaritmo do denominador.
Log A/B = log A log B;
Log 100/10 = log 100 log 10;
Log 10 = 2 1;
Log 10 = 1.
C) Logaritmo de uma potncia
O logaritmo de uma potncia igual ao expoente multiplicado
pelo logaritmo da base da potncia.
Se A = Bx , ento:
Log A = log Bx = X log B.
Dado que 100 = 102;
Log 100 = 2 log 10;
Log 100 = 2 x 1;
Log 100 = 2.
D) Logaritmo de uma raiz
O logaritmo de uma raiz igual ao logaritmo da quantidade
sub-radical dividido pelo ndice.
Se A = x
b,
ento: log A = log B/X;
10 = 2
100;
Log 10 = log 100/2;

90
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Log 10 = 2/2;
Log 10 = 1.

6.3 Cologaritmo
Cologb N = log 1/N = logB N = 0 - logB N = 0 - logB N = - logB N.
Exemplo: colog10 10.000 = log10 1/10.000 = -4.

6.4 Estrutura de logaritmo decimal


Log N = um inteiro + (frao decimal < 1);
Log N = caracterstica + mantissa;
Log N = C + (m) e 0 < (m) < 1.
A parte inteira de um logaritmo chama-se caracterstica e deve
ser calculada pelo operador.
A parte decimal de um logaritmo chama-se mantissa e se l na
tbua de logaritmos; portanto, a tbua s proporciona mantissas, que
so nmeros positivos e menores do que um.
As seguintes regras devem ser seguidas para que se obtenha a
caracterstica:
A) Se o nmero N > 1, a caracterstica tem uma unidade a me-
nos que os algarismos de N.
B) Se 0 < N < 1 , a caracterstica igual ao nmero de zeros
esquerda que tenha N.
0,01 = -2
0,001 = -3

91
Secretaria de Vigilncia em Sade

Caractersticas de alguns nmeros:


N caracterstica

2962,35 3
26386,35 4
35,20 1
2,24 0
0,0092 -3
0,01 -1
Visto que a mantissa de um logaritmo sempre positiva, quando
a caracterstica for negativa, o sinal negativo deve ser escrito sobre o
valor da caracterstica, indicando que s ela negativa.

6.5 Obteno de antilogaritmos


O antilogaritmo (antilog) de um logaritmo o nmero (N), a
que corresponde este ltimo. O seu clculo deve sempre seguir as
regras estabelecidas pelas operaes com logaritmos.

92
Captulo
7

Mtodo de Reed-Mench (R & M)


Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Princpio bsico: o mtodo de R & M admite que qualquer in-


divduo que tenha reagido a uma dose de determinado estmulo re-
agir a doses mais elevadas e que qualquer indivduo que no tenha
reagido a determinada dose no reagir s doses mais baixas.
Com base neste princpio, procura-se determinar um valor da
dose (X), tal que seja igual tanto para a soma acumulada dos indi-
vduos que reagiram quanto para a soma acumulada dos indivduos
que no reagiram.

DP = % acima de 50% 50% x log FD


% acima de 50% % abaixo de 50%

DP = distncia proporcional;
FD = fator de diluio.
Ttulo: recproca da diluio do vrus que afeta 50% das unida-
des-teste; equivale ao nmero de unidades infecciosas/unidades de
volume.
Dose: diluio do vrus/unidade de volume.
Exemplo: Dict50 = 10-6/0,1mL.
Dados teis:
Log2 0,30 log7 0,85
Log3 0,40 log8 0,90
Log4 0,60 log9 0,95
Log5 0,70 log10 1
Log6 0,80

95
Captulo
8

Tampes e solues
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Todos os reagentes e as solues devero ser preparados em


recepientes adequados, estreis, utilizando-se gua destilada ou
deionizada. Os sais devem ser muito bem dissolvidos para se obter
uma soluo homognea. Dever sempre ser conferido o pH,
mediante a utilizao de pHmetros ou papel indicador.

Soluo salina a 0,85%:


A) cloreto de sdio ______________________________
8,5g
B) gua destilada ou deionizada _______________
1000mL
Soluo salina tamponada com fosfato de sdio
A) Na2HPO4. 12H2O _______________________________ 2,65g
B) NaH2PO4. H2O __________________________________ 0,36g
C) NaCl ______________________________________________ 8,17g
D) gua destilada _______________________________
1.000mL
Soluo salina tamponada com fosfato de potssio:
A) K2HPO4. __________________________________________ 1,45g
B) KH2PO4 __________________________________________ 0,22g
C) NaCl ______________________________________________ 8,50g
D) gua destilada _______________________________
1.000mL
Soluo tampo de carbonato/bicarbonato (pH 9,5):
A) soluo de carbonato de sdio a 0,5M _______________ 10mL
B) soluo de bicarbonato de sdio a 0,5M _____________ 13mL
Soluo de carbonato de sdio a 0,5M:
Na2CO3 anidro _______________ 5,3g
gua destilada ________________ 100mL

99
Secretaria de Vigilncia em Sade

Soluo de bicarbonato de sdio a 0,5M:


Na2HCO3 _____________________ 4,2g
gua destilada _______________ 100mL
Glicerina tamponada:
A) glicerina PA ________________ 9mL
B) tampo de carbonato/bicarbonato de
sdio a 0,5M______________ 1mL
Acetona a 80%:
A) acetona PA _________________ 80mL
B) gua destilada _____________ 20ml
Diluente de vrus:
A) soro normal de coelho ou de
eqino ____________________ 2mL
B) sulfato de gentamicina _ (4mg por
100mL)
C) soluo salina ______________ 97mL
ou
D) soro normal de coelho ou de
eqino _______________________ 2mL
E) penicilina ______________ 50.000UI
F) estreptomicina ___________ 200mg
G) soluo salina _____________ 97mL

100
Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

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