Instituto Politcnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias

Biolgicas

Laboratorio Mtodos de Anlisis

Prctica:
Verificacin del funcionamiento de un
espectrofotmetro.

29/Agosto/2016
 Objetivos
Evaluar el rendimiento instrumental de un espectrofotmetro
Verificar la exactitud de la escala de la longitud de onda, la presencia
de radiacin dispersa, en ancho de banda, la exactitud fotomtrica, la
proporcionalidad de respuesta y el rendimiento global del
instrumento.
Fundamento.

El espectrofotmetro es un instrumento usado en la fsica ptica que sirve para

medir, en funcin de la longitud de onda, la relacin entre valores de una misma
magnitud fotomtrica relativos a dos haces de radiaciones. Tambin es utilizado en
los laboratorios de qumica para la cuantificacin de sustancias y
microorganismos. Constituido de:

Fuente de luz: debe cumplir con estabilidad, direccionalidad, distribucin de

energa espectral continua y larga vida.
Monocromador: asla las radiaciones de longitud de onda deseada que
inciden o se reflejan desde el conjunto, se usa para obtener luz
monocromtica. Est constituido por las rendijas de entrada y salida,
colimadores y el elemento de dispersin.
Compartimiento de Muestra: Es donde tiene lugar la interaccin, R.E.M con
la materia (debe producirse donde no haya absorcin ni dispersin de las
longitudes de onda). Es importante destacar, que durante este proceso, se
aplica la ley de Lambert-Beer en su mxima expresin.
Detector: es quien detecta una radiacin y a su vez lo deja en evidencia,
para posterior estudio. Hay de dos tipos:
o a) los que responden a fotones;
o b) los que responden al calor
Registrador: Convierte el fenmeno fsico, en nmeros proporcionales al
analito en cuestin.

Para asegurar un funcionamiento ptimo se evalan los siguientes criterios:

1. Exactitud de la escala de longitud de onda: La adecuada seleccin de

esta exista que se produzcan desviaciones importantes en la exactitud
fotomtrica. Se recurre a un patrn que tenga espectros de absorcin o
transmisin con picos y valles bien definidos, distribuidos a lo largo de la
escala de revisin. Se acostumbra el empleo de filtros o soluciones de
tierras raras cuyos espectros se obtuvieron con el mismo ancho de banda
que trabaja el instrumento que se est evaluando.
2. Luz dispersa: Para medir esta, se emplean filtros o soluciones de
estndares que absorben la mayor parte de la radiacin en un intervalo de
longitudes de onda determinados. Si incrementa ms del 3% se considera
la presencia de esta.
 3. Exactitud fotomtrica: Se evala empleando
Longitud de onda %T
estndares con espectros de absorcin o
(nm)
transmisin que tienen picos o valles definidos a
380
longitudes de onda especficas y con valores de
390
absorbancia o transmitancia documentados.
400
Tambin se 39.4 puede usar un filtro de vidrio neutro.
410
4. Ancho de 51.2 banda: Se recurre a un estndar
con
420 un ancho 55.2 de banda natural que no sea mayor
a
43010 veces el 50.8 ancho de banda del instrumento
5. 440 45.2 Proporcionalidad o linealidad
fotomtrica:
450 45.8 Un intervalo de longitudes de onda o
de
460 45.8 concentraciones en las que exista
una
470 relacin 43.8 lineal entre a vs. o entre A vs. C
480
permite 48 evaluar el intervalo dinmico lineal,
490este se ve
si 56.4 reducido podra indicar una falla en
500 fuente de
la 52.6 radiacin, monocromador, el
detector
510 o 40.2 presencia de luz dispersa.
520 28.8
Datos
530 31.4 experimentales e Informe
540 46.8
A) EXACTITUD
550 65 DE LA ESCALA DE LONGITUD DE
ONDA
560 56
A.1)
570 Mtodo 32.8 del filtro de tierras raras
A.1)
580 Mtodo 9.2 de la solucin de estndar de
590 6.2 NISO 4 6 H 2 O al 20%
%T

5.6
4.2
4.2
5.2
10.4
22
37
50.8
61.4
72.6
81.8
86.6
94.4
92.8
91
88
83
80
74.4
69
61.6
52.4
 Tabla 1.Datos experimentales del espectro de transmisin del
filtro de Didimio y solucin estndar.

Espectros de transmisin:
Filtro de didimio y solucin estndar.
100
80
60 Espectro solucin estndar
40 Espectro filtro de Didimio
%T
20
0
370 410 450 490 530 570 610
350 390 430 470 510 550 590

Longitud de onda (nm)

Grfica 1. Espectros de transmisin del filtro de didimio y solucin de

NISO 4 6 H 2 O al 20%

A.1) Mtodo del filtro de tierras raras

 Observar el espectro obtenido y sealar aquellas longitudes en donde
se muestran picos y valles:
Coincidieron los mximos y/o mnimos con las longitudes de onda
informadas por el fabricante? En qu longitudes de onda no fue as?

Experimentales Referencia
Mximos 420, 490 y 550nm 420, 450, 490 y 550nm.
Mnimos 470, 520nm 440, 470 y 520nm

Coincidieron a las longitudes de onda, teniendo como mximos valores

experimentales y de referencia iguales en 420, 490 y 550nm. La nica longitud de
onda que no se aprecia como mximo en los valores que obtuvimos es 450nm. En
valores mnimos coincidieron los valores de 470 y 520nm, no coincidiendo con la
informada la longitud de 440nm.

NISO 4 6 H 2 O
A.1) Mtodo de la solucin de estndar de al 20%

Verificar la longitud de onda en la que se obtuvo el valor mximo de

%T: 500 nm, mnimos: 400 nm.
Cmo es la exactitud de la escala de longitud de onda del
espectrofotmetro a esta longitud de onda?

Es exacta, ya que el valor en mximo que obtuvimos fue de 500nm y el valor

informado es el mismo.

Describa ventajas y desventajas de los mtodos empleados en la

prctica para estimar la exactitud de la escala de longitud de onda.

Ventajas:

Las lecturas realizadas en poco tiempo, gracias a la eficacia de los equipos.

El filtro de Didimio y la solucin estndar NISO 4 6 H 2 O al 20% pueden ser
usados ms de una vez, lo que hace que se puedan realizar lecturas
seguidas en diferentes equipos.
Al aprender a usar los equipos, es sencillo manejarlos.
Los resultados obtenidos son muy exactos respecto a los informados por el
fabricante.
Desventajas:

El filtro es sensible, adems de costoso. Este puede rayarse y as afectar

nuestras lecturas.
 Como cualquier solucin, el NISO 4 6 H 2 O al 20% se puede contaminar y
afectar las lecturas.

B) PROPORCIONALIDAD FOTOMTRICA

Longitud de onda (nm) Absorbancia

530 0.0555
540 0.0809
550 0.0969
560 0.1284
570 0.1611

Tabla 2.Datos proporcionalidad entre A y para el

NISO 4 6 H 2 O al
20%
Ejemplo de clculo de Absorbancia:

A=2log ( %T )

A=2log ( 88 )=0.0555

A vs.
0.2

0.15
f(x) = 0x - 1.32
R = 0.99
0.1
Absorbancia

0.05

0
525 530 535 540 545 550 555 560 565 570 575

Longitud de onda (nm)

 Grfica 2. Espectro de proporcionalidad entre A y para el
NISO 4 6 H 2 O al 20%

Informe los valores de la ordenada al origen, la pendiente y el

coeficiente de correlacin de la grfica.

B= -1.3183
A= 0.0026
R= 0.9856
Qu se puede concluir respecto a la proporcionalidad fotomtrica en
este intervalo de longitudes de onda?

Al disminuir la transmitancia, la absorbancia aumenta y con esta su longitud de

onda.

Qu relacin existe entre la absorbancia y la longitud de onda en este

intervalo de longitudes de onda?

La relacin es proporcional, ya que al aumentar la longitud de onda, aumenta la

absorbancia.

C) LUZ DISPERSA

Los resultados se encuentran en la tabla 5

Se considera que la luz dispersa rebasa los lmites permitidos cuando

se presentan incrementos del 3% T con respecto a los valores de
referencia Qu puede concluir a ese respecto al instrumento que
evalu?

Que al incrementar el 3% a nuestros resultados, estos no rebasan el lmite

permitido, por lo tanto el instrumentos evaluado es aceptado.

D) ANCHO DE BANDA
Resultados en taba 5.

Considerando que la variacin en el ancho de banda se presenta

cuando hay disminuciones o incrementos en el %T de ms de 3%T, en
relacin a los valores de referencia Qu se puede concluir con
respecto al ancho de banda del instrumento?

Existe variacin en el ancho de banda, ya que existe una disminucin del

3.879%T, y al suceder esto, el ancho de banda instrumental va a aumentar.

Si el porcentaje de %T se increment Qu ocurri con el ancho de

banda? Qu ocurre si l %T disminuye?

Al ser inversamente proporcionales, si el %T aumenta, el ancho de banda

disminuye y viceversa.

E) EXACTITUD FOTOMTRICA
E.1) Mtodo del filtro de transmisin.
No se realizo debido a que el filtro no se encontraba .

NISO 4 6 H 2 O
E.1) Mtodo de la solucin estndar de al 20%

Parmetro/Longitud de 400nm 500nm

Onda
Absorbancia Esperada 1.4 - 1.6 0.043 0.05
Tolerancia Aceptada 1.447-1.599 0.044-0.048
Absorbancia Medida 1.380 0.039
Tabla 3. Datos exactitud fotomtrica. Mtodo de la solucin estndar
NISO
Respecto
de
6 H 2absorbancias
a4 las O al 20% medidas, se encuentran un poco por debajo de la
absorbancia esperada, por lo que se puede considerar que existe exactitud
fotomtrica al aproximarse al valor pero no es aceptada por estar debajo de esta.

F) INTERVALO DINAMICO LINEAL DE CONCENTRACIN

 Tubo Concentracin de A395
a a NiSO4*6H2O Seria a Serie b
1 1 0 0 0
2 2 0.0095 0.06 0.063
3 3 0.0285 0.149 0.149
4 4 0.0665 0.328 0.322
5 5 0.1045 0.496 0.488
6 6 0.1425 0.648 0.648
7 7 0.1520 0.688 0.688
8 8 0.1710 0.756 0.756
9 9 0.1805 0.788 0.788
10 10 0.1900 0.815 0.820

Tabla 4. Datos intervalo dinmico lineal de la concentracin.

Ejemplo de clculo de concentracin:

(C 1 V 1)
C1V1=C2V2 C 2=
V2

Curva de Calibracin del Intervalo Dinmico Lineal de Concentracin

1

0.8
f(x) = 4.29x + 0.02
R = 1
0.6
0.19 M
Absorbancia 0.4
0.2mL
0.2 ()

0 C 2=
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2

Concentracin (M)
 Grfica 3. Curva de calibracin del intervalo dinmico lineal de
concentracin

El intervalo dinmico lineal de la concentracin es el intervalo de

concentraciones en el que se observa una respuesta lineal entre la
absorbancia y la concentracin. Cmo es este intervalo con respecto
al sealado por el profesor?

El intervalo lineal es de 0.9972, que se aproxima bastante al sealado por el

profesor, el cual es de 1, por lo tanto presenta una tendencia lineal casi exacta.

Qu puede indicar que el intervalo sea menor al esperado?

Que la correlacin no sea lineal y el comportamiento no sea directamente

proporcional, es decir que la absorbancia no aumente conforme aumenta su
concentracin. Esto se podra deber a un mal manejo del aparato o a un error
experimental.

Parmetro Estudiado Valores de Referencia Valores Observados Conclusione

Exactitud de la escala de longitud de onda

1. Filtro de Didimio
Mximo(nm) 420, 450, 490, 550 420, 490, 450 Los valores se encuent
de los valores de refere
Prueba Aprobada

Mnimo(nm) 440, 470, 520 470, 520 Los valores se encuent

de los valores de refere
Prueba Aprobada
2. Solucin de NISO4*6H2O al 20%
Mximo (nm) 500 500 Los valores coinci
exactitud a los de refere
Prueba Aprobada
Mnimo (nm) 400 400 Los valores coinci
exactitud a los de refere
Prueba Aprobada
 Proporcionalidad Fotomtrica
Datos de Regresin de R=1 0.9856 El valor observado pre
530 a 570nm relacin cercana al
referencia dado, por l
aprobado.
Luz Dispersa
%T a 400nm (Solucin de 3%T(3%T) 4.4% El resultado obte
NISO4*6H2O al 20%) encuentra dentro d
permitido, por lo
aprobada.
%T a 450nm 1%T(3%T) 0.2% Prueba Aprobada

%T a 500nm 1%T((3%T) 0.4% Prueba Aprobada

Ancho de Banda
%T a 520nm 92.8%(3%) 89.2% Existe un error de
debajo del esperado p
es rechazada.
Exactitud Fotomtrica

1. Mtodo de filtro de vidrio neutro

%T a 530nm - - No se realiz
2. Mtodo de la solucin de NISO4*6H2O al 20%
Absorbancia a 400nm 1.4 1.6 1.380 Se encuentra por deb
permitido por lo que se
Absorbancia a 500nm 0.043 0.05 0.039 Se encuentra por deb
permitido por lo que se

Intervalo dinmico lineal de la concentracin

Datos de la regresin R= 1 R=0.9972 Prueba Aprobada, ya
lineal intervalo es aproxi
referido, con una c
lineal, lo cual se espera
Intervalo de la 0 0.19 0.0242 Parmetro dentro de lo
concentracin por lo cual la pr
aprobada.
Tabla 5. Resumen de resultados de evaluacin del funcionamiento del
espectrofotmetro
PREGUNTA EXTRA.

1. Seale dos causas que originen:

a. Luz extraa
i. Que al usar nuestro espectrofotmetro no cerremos bien la
tapa y permitamos el paso de diferentes longitudes de onda
que afecten nuestra lectura.
ii. Luz parasita, es decir luz que no paso por la muestra pero
lleg al detector.
 b. Cambio en el ancho de banda
i. Que en el equipo haya presencia de polvo
ii. Mover el aparato.
c. Alteracin de la respuesta relativa o rendimiento instrumental
i. El aparato no ha sido cambiado y presenta fallas en su ajuste
o en la fuente de radiacin
ii. Mover el equipo mientras se est trabajando, as como mover
la perilla de %T
Discusin.

En esta prctica se realizaron distintas pruebas para determinar si el

funcionamiento del espectrofotmetro utilizado era adecuado y se encontraba en
ptimas condiciones para trabajar con l. El espectrofotmetro utilizado fue uno
digital, el cual es un poco ms difcil de manejar por la exactitud que se debe tener
en el ajuste para no obtener falsos positivos o errores de medicin, contrario al
analgico el cual nos puede dar mediciones de absorbancia y transmitancia al
mismo tiempo. Al verificar la exactitud de la longitud de onda, se trabajaron dos
mtodos. El primer mtodo (filtro de tierras raras) arroj los resultados esperados,
ya que se esperaban encontrar mximos en 420, 450, 490, 550nm, de los cuales
se encontraron 3 con exactitud. Respecto a mnimos se obtuvieron tambin los
resultados deseados. Para el caso de la solucin estndar, los resultados
obtenidos fueron exactos al registrar dos valores de los tres esperados, con esto
se puede decir que el monocromador funciona de manera correcta, y se hace con
el fin de que se seleccione la adecuada longitud de onda para evitar que se
produzcan desviaciones importantes en la exactitud fotomtrica.

En proporcionalidad fotomtrica al haber usado un equipo digital, se obtuvo la

transmitancia, para lo cual se determin la absorbancia a ciertas longitudes de
onda mediante una formula, al realizar la grfica obtuvimos una lnea casi recta
con valor de r= 0.9856, cercano al valor esperado (r=1), esto quiere decir que se
obtuvo una relacin lineal en la que la longitud de onda aumenta conforme
aumenta la absorbancia.

Respecto a la prueba realizada en luz dispersa obtuvimos una variacin mnima

del resultado esperado, sin embargo, se encuentra dentro de los lmites permitidos
para aprobar esta prueba ya que el filtro seleccionado y la solucin estndar
absorben la mayor parte de la radiacin en el intervalo seleccionado, por lo que no
hay presencia de luz dispersa.

En ancho de banda se obtuvo un error del 3.879% por debajo del valor de
referencia, por lo que la prueba fue rechazada, esto se podra deber a que la
ranura de salida del monocromador esta obstruida por polvo haciendo que no
pasen las longitudes de onda seleccionadas.
En exactitud fotomtrica se evalu el detector y el registrador el cual nos va indicar
que tan verdadero es nuestro resultado; el mtodo del filtro de vidrio neutro no se
realiz, debido a que este no se encontraba disponible para usarse. El mtodo de
la solucin estndar, nos dio resultados por debajo de los permitidos a las dos
longitudes de onda seleccionadas, un error de este tipo podra deberse al analista.

Finalmente se realiz el intervalo dinmico lineal de concentracin para el cual se

calcularon las concentraciones y realizo una curva de calibracin, obteniendo as
los valores de pendiente, ordenada al origen y r= 0.9972 para la regresin lineal,
siendo aceptada y de 0.242 que se encuentra dentro del valor aceptado para el
intervalo de concentracin, esto nos indica que tanto el detector est funcionando
correctamente y las lecturas son certeras.

Conclusiones
Mediante diversas pruebas, se comprob el rendimiento
instrumental, as como el correcto uso y funcionamiento de las partes
esenciales de un espectrofotmetro.
Se comprob que: el equipo tiene una escala de longitud de onda
exacta, no detecta la presencia de radiacin dispersa, presenta un
mnimo error en ancho de banda, conserva la proporcionalidad de
respuesta y tiene un buen rendimiento global.

Bibliografa
Skoog, W., Holler, C., Qumica Analtica., 9 Edicin. Ed
Cengage. (Pg. 440)
Harris, D., Anlisis Qumico Cuantitativo, 3 Edicin, Ed.
Revert, (Pgs. 471-479)
Dahran, M., Control de Calidad en los laboratorios Clnicos, 2
Edicin, Ed. Revert, (Pg. 146)