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4874 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.

o 183 8 de Agosto de 2001

MINISTRIO DO AMBIENTE E DO ORDENAMENTO de Substncias Perigosas, aprovado pela Portaria


DO TERRITRIO n.o 732-A/96, de 11 de Dezembro, com a redaco dada
pelo Decreto-Lei n.o 330-A/98, de 2 de Novembro, pelo
Decreto-Lei n.o 209/99, de 11 de Junho, e pelo Decre-
Decreto-Lei n.o 222/2001 to-Lei n.o 195-A/2000, de 22 de Agosto, transpondo para
de 8 de Agosto
a ordem jurdica interna a Directiva n.o 2000/21/CE,
da Comisso, de 25 de Abril, que introduz uma iseno
Com a publicao do Decreto-Lei n.o 82/95, de 22 de notificao para os produtos fitofarmacuticos e bio-
de Abril, foram aprovados os princpios gerais do regime cidas, e as Directivas n.os 2000/32/CE e 2000/33/CE,
jurdico da notificao de substncias qumicas e da clas- ambas da Comisso, de 19 de Maio e 25 de Abril, res-
sificao, embalagem e rotulagem de substncias peri- pectivamente, que alteram e adaptam ao progresso tc-
gosas para a sade humana ou para o ambiente. nico, pela 26.a e 27.a vez, a Directiva n.o 67/548/CEE,
A Portaria n.o 732-A/96, de 11 de Dezembro, veio do Conselho, de 27 de Julho, e aplicando a Deciso
regulamentar o citado Decreto-Lei n.o 82/95, tendo da Comisso n.o 2000/368/CE, de 19 de Maio, que cor-
aprovado o Regulamento para a Notificao de Subs- rige o anexo VI do referido Regulamento.
tncias Qumicas e para a Classificao, Embalagem e
Rotulagem de Substncias Perigosas, completando, Artigo 2.o
assim, o processo de transposio para a ordem interna
das directivas aplicveis neste domnio. Alterao ao artigo 16.o do Regulamento para a Notificao de Subs-
A referida portaria foi, depois, alterada pelo Decre- tncias Qumicas e para a Classificao, Embalagem e Rotulagem
de Substncias Perigosas.
to-Lei n.o 330-A/98, de 2 de Novembro, pelo Decreto-Lei
n.o 209/99, de 11 de Junho, e pelo Decreto-Lei O n.o 1 do artigo 16.o do Regulamento para a Noti-
n.o 195-A/2000, de 22 de Agosto, em virtude de novas ficao de Substncias Qumicas e para a Classificao,
exigncias de adaptao ao progresso cientfico e tcnico Embalagem e Rotulagem de Substncias Perigosas,
determinadas pela necessidade de transposio de novo aprovado pela Portaria n.o 732-A/96, de 11 de Dezem-
normativo comunitrio entretanto publicado. bro, com as alteraes introduzidas pelo Decreto-Lei
A este propsito refira-se que para a nossa ordem n.o 330-A/98, de 2 de Novembro, pelo Decreto-Lei
jurdica foram transpostas para o direito interno todas n.o 209/99, de 11 de Junho, e pelo Decreto-Lei
as directivas comunitrias decorrentes da Directiva n.o 195-A/2000, de 22 de Agosto, alterado nos termos
n.o 67/548/CEE, do Conselho, at 25.a adaptao ao seguintes:
progresso tcnico e 8.a emenda referida directiva.
Como facilmente se constata, a legislao comunitria Artigo 16.o
nesta temtica alvo permanente de sucessivas alte- [. . .]
raes, adoptadas luz do progresso dos conhecimentos
cientficos e tcnicos adquiridos, que a legislao interna 1..........................................
tem de acompanhar.
, tambm, este o fundamento da publicao do pre- a) . ........................................
sente diploma, em virtude da recente Directiva b) . ........................................
n.o 2000/21/CE, de 25 de Abril, que introduz uma iseno c) . ........................................
de notificao para os produtos fitofarmacuticos e bio- d) As que sejam usadas exclusivamente como subs-
cidas, e das Directivas n.os 2000/32/CE, de 19 de Maio, tncias activas de produtos fitofarmacuticos;
e 2000/33/CE, de 25 de Abril, ambas da Comisso, que e) As que sejam usadas exclusivamente como subs-
adoptam alteraes aos anexos tcnicos. tncias activas de produtos biocidas;
Acresce que a Deciso da Comisso n.o 2000/368/CE, f) [Corresponde anterior alnea d).]
de 19 de Maio, corrigiu a Directiva n.o 98/98/CE, a qual
adaptava ao progresso tcnico, pela 25.a vez, a Directiva Artigo 3.o
n.o 67/548/CEE e que fora transposta para o direito
interno pelo Decreto-Lei n.o 195-A/2000, de 22 de Alteraes ao anexo I do Regulamento para a Notificao de Subs-
Agosto. Importa igualmente implementar na ordem jur- tncias Qumicas e para a Classificao, Embalagem e Rotulagem
de Substncias Perigosas.
dica interna estas alteraes.
O presente diploma procede transposio das Direc- O anexo I do Regulamento para a Notificao de
tivas n.os 2000/21/CE, 2000/32/CE e 2000/33/CE, da Substncias Qumicas e para a Classificao, Embala-
Comisso, de 25 de Abril, 19 de Maio e 25 de Abril, gem e Rotulagem de Substncias Perigosas alterado
respectivamente, bem como aplicao da Deciso da nos termos seguintes:
Comisso n.o 2000/368/CE, de 19 de Maio.
Assim: a) As entradas dos elementos qumicos constantes
Nos termos da alnea a) do n.o 1 do artigo 198.o da da tabela A do anexo I so substitudas pelas
Constituio, o Governo decreta o seguinte: correspondentes entradas do anexo I ao pre-
sente diploma, do qual faz parte integrante;
b) As entradas constantes do anexo I so substi-
Artigo 1.o tudas pelas correspondentes entradas do
Objecto anexo II ao presente diploma, do qual faz parte
integrante;
O presente diploma tem por objecto a alterao do c) So aditadas, pela primeira vez, as entradas que
Regulamento para a Notificao de Substncias Qu- figuram no anexo III ao presente diploma, do
micas e para a Classificao, Embalagem e Rotulagem qual faz parte integrante.
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4875

Artigo 4.o Artigo 5.o


Alteraes ao anexo V do Regulamento para a Notificao de Subs- Alteraes ao anexo VI do Regulamento para a Notificao de Subs-
tncias Qumicas e para a Classificao, Embalagem e Rotulagem tncias Qumicas e para a Classificao, Embalagem e Rotulagem
de Substncias Perigosas. de Substncias Perigosas.

1 A parte B do anexo V do Regulamento para a O anexo VI do Regulamento para a Notificao de


Notificao de Substncias Qumicas e para a Classi- Substncias Qumicas e para a Classificao, Embala-
ficao, Embalagem e Rotulagem de Substncias Peri- gem e Rotulagem de Substncias Perigosas o constante
gosas alterada da seguinte forma: do anexo XIII ao presente diploma, do qual faz parte
integrante.
a) O texto do captulo B.10 substitudo pelo texto Artigo 6.o
constante do anexo IV ao presente diploma, do
qual faz parte integrante; Alteraes ao anexo IX do Regulamento para a Notificao de Subs-
tncias Qumicas e para a Classificao, Embalagem e Rotulagem
b) O texto do captulo B.11 substitudo pelo texto de Substncias Perigosas.
constante do anexo V ao presente diploma, do
qual faz parte integrante; O anexo IX do Regulamento para a Notificao de
c) O texto do captulo B.12 substitudo pelo texto Substncias Qumicas e para a Classificao, Embala-
constante do anexo VI ao presente diploma, do gem e Rotulagem de Substncias Perigosas alterado
qual faz parte integrante; em conformidade com o anexo XIV ao presente diploma,
d) O texto dos captulos B.13 e B.14 substitudo do qual faz parte integrante.
pelo texto constante ao anexo VII ao presente
Visto e aprovado em Conselho de Ministros de 17
diploma, do qual faz parte integrante;
de Maio de 2001. Antnio Manuel de Oliveira Guter-
e) O texto do captulo B.17 substitudo pelo texto
res Mrio Cristina de Sousa Maria Manuela de Brito
constante do anexo VIII ao presente diploma,
Arcanjo Marques da Costa Jos Scrates Carvalho
do qual faz parte integrante;
Pinto de Sousa.
f) O texto do captulo B.23 substitudo pelo texto
constante do anexo IX ao presente diploma, do
Promulgado em 28 de Junho de 2001.
qual faz parte integrante;
g) aditado o captulo B.39 constante do anexo X Publique-se.
ao presente diploma, do qual faz parte inte-
O Presidente da Repblica, JORGE SAMPAIO.
grante;
h) aditado o captulo B.40 constante do anexo XI
Referendado em 5 de Julho de 2001.
ao presente diploma, do qual faz parte inte-
grante; O Primeiro-Ministro, Antnio Manuel de Oliveira
i) aditado o captulo B.41 constante do anexo XII Guterres.
ao presente diploma, do qual faz parte inte-
grante. ANEXO I

2 eliminado o quarto travesso na introduo Z Smbolo Nome


geral parte C do anexo V do Regulamento para a
Notificao de Substncias Qumicas e para a Classi-
ficao, Embalagem e Rotulagem de Substncias Peri- 18 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ar rgon.
64 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Gd Gadolnio.
gosas.
4876
ANEXO II

Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

006-011-00-7 Carbarilo (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . . 200-555-0 63-25-2 Carc. Cat. 3; R40 Xn; N


Carbaril (DCI) . . . . . . . . . . . . . . . . Xn; R22 R: 22-40-50
Metilcarbamato de 1-naftilo . . . . . N; R50 S: (2-)22-24-36/37-46-61

006-013-00-8 Metame-sdio (ISO) . . . . . . . . . . . 205-293-0 137-42-8 Xn; R22 C; N


N-metilditiocarbamato de sdio . . . . R31 R: 22-31-34-43-50/53
C; R34 S: (1/2-)26-36/37/39-45-60-61

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


R43
N; R50-53

006-015-00-9 Diuron (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206-354-4 330-54-1 Carc. Cat. 3; R40 Xn; N


Muta. Cat. 3; R40 R: 22-40-48/22-50/53
Xn; R22-48/22 S: (2-)13-22-23-37-46-60-61
N; R50-53

006-016-00-4 Propoxur (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . . 204-043-8 114-26-1 T; R25 T; N


Metilcarbamato de 2-isopropoxife- N; R50-53 R: 25-50/53
nilo. S: (1/2-)37-45-60-61

006-017-00-X Aldicarbe (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . 204-123-2 116-06-3 T+; R26/28 T+; N


2-metil-2-(metiltio) propionalde- T; R24 R: 24-26/28-50/53
do-O-(metilcarbamoil) oxima. N; R50-53 S: (1/2-)22-36/37-45-60-61

006-018-00-5 Aminocarbe (ISO) . . . . . . . . . . . . . 217-990-7 2032-59-9 T; R24/25 T; N


Metilcarbamato de 4-dimetila- N; R50-53 R: 24/25-50/53
mino-m-tolilo. S: (1/2-)28-36/37-45-60-61

006-019-00-0 Di-alato (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . . . 218-961-1 2303-16-4 Carc. Cat. 3; R40 Xn; N


Diisopropiltiocarbamato de S-2,3- Xn; R22 R: 22-40-50/53
-dicloroalilo. N; R50-53 S: (2-)25-36/37-60-61

006-020-00-6 Barbane (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . . . 202-930-4 101-27-9 Xn; R22 Xn; N


3-clorofenilcarbamato de 4-cloro- R43 R: 22-43-50/53
-2-butinilo. N; R50-53 S: (2-)24-36/37-60-61

N.o 183 8 de Agosto de 2001


006-023-00-2 Mercaptodimetur (ISO) . . . . . . . . . 217-991-2 2032-65-7 T; R25 T; N
Metiocarbe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N; R50-53 R: 25-50/53
Metilcarbamato de 4-metiltio-3,5- S: (1/2-)22-37-45-60-61
-xililo.

006-024-00-8 Proxana-sdio (ISO) . . . . . . . . . . . . 205-443-5 140-93-2 Xn; R22 Xn; N


Ditiocarbonato de O-isopropilo e Xi; R38 R: 22-38-51/53
de sdio. N; R51-53 S: (2-)13-61
N.o 183 8 de Agosto de 2001
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

006-026-00-9 Carbofuran (ISO) . . . . . . . . . . . . . . 216-353-0 1563-66-2 T+; R26/28 T+; N


Metilcarbamato de 2,3-dihidro- N; R50-53 R: 26/28-50/53
-2,2-dimetilbenzofurane-7-ilo. S: (1/2-)36/37-45-60-61

006-028-00-X Dinobutona (ISO) . . . . . . . . . . . . . . 213-546-1 973-21-7 T; R25 T; N


Carbonato de 2-sec-butil-4,6-dini- N; R50-53 R: 25-50/53
trofenilo e isopropilo. S: (1/2-)37-45-60-61

006-029-00-5 Dioxacarbe (ISO) . . . . . . . . . . . . . . 230-253-4 6988-21-2 T; R25 T; N


Metilcarbamato de 2-(1,3-dioxo- N; R51-53 R: 25-51/53
lano-2-il)fenilo. S: (1/2-)37-45-61

006-033-00-7 Metoxurone (ISO) . . . . . . . . . . . . . 243-433-2 19937-59-8 N; R50-53 N


N-(3-cloro-4-metoxifenil)-N,N-di- R: 50/53
metilureia. S: 60-61

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


006-034-00-2 Pebulato (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . . 214-215-4 1114-71-2 Xn; R22 Xn; N
Butil (etil) tiocarbamato de S-pro- N; R51-53 R: 22-51/53
pilo. S: (2-)23-61

006-035-00-8 Pirimicarbe (ISO) . . . . . . . . . . . . . . 245-430-1 23103-98-2 T; R25 T; N


N,N-dimetilcarbamato de 2-dimeti- N; R50-53 R: 25-50/53
lamino-5,6-dimetil-4-pirimidi- S: (1/2)22-37-45-60-61
nilo.

006-037-00-9 Promecarbe (ISO) . . . . . . . . . . . . . 220-113-0 2631-37-0 T; R25 T; N


Metilcarbamato de 5-isopropil-m- N; R50-53 R: 25-50/53
-tolilo. S: (1/2-)24-37-45-60-61
Metilcarbamato de 5-metil-m-
-cumenilo.

006-038-00-4 Sulfalato (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . . E 202-388-9 95-06-7 Carc. Cat. 2; R45 T; N


Dietilditiocarbamato de 2-cloroa- Xn; R22 R: 45-22-50/53
lilo. N; R50-53 S: 53-45-60-61

006-039-00-X Trialato (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . . . 218-962-7 2303-17-5 Xn; R22-48/22 Xn; N


Diisopropiltiocarbamato de S- R43 R: 22-43-48/22-22-50/53
-2,3,3-tricloroalilo. N; R50-53 S: (2-)24-37-60-61

006-042-00-6 Monurone (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . 205-766-1 150-68-5 Car. Cat. 3; R40 Xn; N

4877
3-(4-clorofenil)-1,1-dimetilureia . . . . Xn; R22 R: 22-40-50/53
N; R50-53 S: (2-)36/37-60-61
4878
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

006-043-00-1 Monuron-TCA . . . . . . . . . . . . . . . . 140-41-0 Xi; R36/38 Xn; N


Tricloroacetato de 3-(4-clorofenil)- Carc. Cat. 3; R40 R: 36/38-40-50/53
-1,1-dimetilurnio. N; R50-53 S: (2-)36/37-60-61

006-045-00-2 Metomil (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . . 240-815-0 16752-77-5 T+; R28 T+; N


Metilcarbamato de metiltio-1-eti- N; R50-53 R: 28-50/53
lidenoamino. S: (1/2-)22-36/37-45-60-61

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


006-046-00-8 Bendiocarbe (ISO) . . . . . . . . . . . . . 245-216-8 22781-23-3 T; R23/25 T; N
Metilcarbamato de 2,2-dimetil-1,3- Xn; R21 R: 21-23/25-50/53
-benzodioxole-4-ilo. N; R50-53 S: (1/2-)22-36/37-45-60-61

006-047-00-3 Bufencarbe (ISO) . . . . . . . . . . . . . . 8065-36-9 T; R24/25 T; N


Metilcarbamato de -3-(pent-2- N; R50-53 R: 24/25-50/53
-il)fenilo-metilcarbamato de 3- S: (1/2-)28-36/37-45-60-61
-(pent-3-il)fenilo (3:1), contendo
35 % de uma mistura de isme-
ros 2 e 4.

006-048-00-9 Etiofencarbe(ISO) . . . . . . . . . . . . . 249-981-9 29973-13-5 Xn; R22 Xn; N


Metilcarbamato de 2-etiltiometil- N; R50-53 R: 22-50/53
fenilo. S: (2-)60-61

006-050-00-X Fenuro-tricloroacetato . . . . . . . . . 4482-55-7 Xi; R38 Xi; N


Tricloroacetato de 1,1-dimetilfenil- N; R50-53 R: 38-50/53
carbamoilamnio. S: (2-)60-61

006-053-00-6 Isoprocarbe (ISO) . . . . . . . . . . . . . . 220-114-6 2631-40-5 Xn; R22 Xn; N


Metilcarbamato de o-cumenilo . . . N; R50-53 R: 22-50/53
S: (2-)60-61

006-054-00-1 Mexacarbato (ISO) . . . . . . . . . . . . . 206-249-3 315-18-4 T+; R28 T+; N


Metilcarbamato de 4-dimetila- Xn; R21 R: 21-28-50/53

N.o 183 8 de Agosto de 2001


mino-3,5-xililo. N; R50-53 S: (1/2-)36/37-45-60-61

006-057-00-8 Nitrapirina (ISO) . . . . . . . . . . . . . . 217-682-2 1929-82-4 Xn; R22 Xn; N


2-cloro-6-triclorometilpiridina . . . . N; R51-53 R: 22-51/53
S: (2-)24-61

006-060-00-4 Oxicarboxina (ISO) . . . . . . . . . . . . 226-066-2 5259-88-1 Xn; R22 Xn


5,6-diidro-2-metil-1,4-oxatiino-3- R52-53 R: 22-52/53
-carboxanili de 4,4-dixido. S: (2-)61
N.o 183 8 de Agosto de 2001
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

006-069-00-3 Tiofanato-metilo (ISO) . . . . . . . . . 245-740-7 23564-05-8 Muta. Cat. 3; R40 Xn; N


N; R50-53 R: 40-50/53
S: (2-)36/37-60-61

006-070-00-9 Furmecyclox . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262-302-0 60568-05-0 Carc. Cat. 3; R40 Xn; N


N-ciclohexil-2,5-dimetil-N-metoxi- N; R50-53 R: 40-50/53
-3-furamida. S: (2-)36/37-60-61

006-088-00-7 Benfuracarbe (ISO) . . . . . . . . . . . . 82560-54-1 T; R23/25 T; N


N-[2,3-dihidro-2,2-dimetilbenzofu- N; R50-53 R: 23/25-50/53
ran-7-iloxicarbonil(metil)amino- S: (1/2-)36/37-45-60-61
tio]-N-isopropil-b-alalinato de
etilo.

007-012-00-5 N,N-dimetilhidrazina . . . . . . . . . . . E 200-316-0 57-14-17 F; R11 F; T; N


Carc. Cat. 2; R45 R: 45-11-23/25-34-51/53

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


T; R23/25 S: 53-45-61
C; R34
N; R51-53

007-013-00-0 1,2-dimetil-hidrazina . . . . . . . . . . . . E 540-73-8 Carc. Cat. 2; R45 T; N C 25 %: T;


T; R23/24/25 R: 45-23/24/25-51/53 R45-23/24/25
N: R51-53 S: 53-45-61 3 % C 25 %: T;
R45-20/21/22
0,01 % C 3 %: T; R45

009-003-00-1 cido fluordrico em soluo . . . % B 231-634-8 7664-39-3 T+; R26/27/28 T+; C C 7 %: T+; C;
C; R35 R: 26/27/28-35 R26/27/28-35
S: (1/2-)7/9-26-36/37-45 1 % C 7 %: T;
R23/24/25-34
0,1 % C 1 %: Xn;
R20/21/22-36/37/38

015-039-00-9 Azinfos metilo (ISO) . . . . . . . . . . . 201-676-1 86-50-0 T+; R26/28 T+; N


Fosforoditioato de O,O-dimetilo e T; R24 R: 24-26/28-43-50/53
4-oxobenzotriazina-3-ilmetilo. R43 S: (1/2-)28-36/37-45-60-61
N; R50-53

015-048-00-8 Fentione (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . . 200-231-9 55-38-9 Muta. Cat. 3; R40 T; N


Fosforotioato de O,O-dimetilo e T; R23-48/25 R: 21/22-23-40-48/25-50/53
O-(4-metiltio-m-tolido). Xn; R21/22 S: (1/2-)36/37-45-60-61
N; R50-53

015-056-00-1 Azinfos-etilo (ISO) . . . . . . . . . . . . . 220-147-6 2642-71-9 T+; R28 T+; N

4879
Ditiofosfato de O,O-dietilo e T; R24 R: 24-28-50/53
4-oxobenzotriazina-3-ilmetilo. N; R50-53 S: (1/2-)28-36/37-45-60-61
4880
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

015-140-00-8 Triazofos (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . . 245-986-5 24017-47-8 T; R23/25 T; N


Tiofosfato de O,O-dietilo e de Xn; R21 R: 21-23/25-50/53
O-1-fenil-1,2,4-triazol-3-ilo. N; R50-53 S: (1/2-)36/37-45-60-61

016-013-00-X Dicloreto de enxofre . . . . . . . . . . . . 234-129-0 10545-99-0 R14 C; N C 10 %: C: R34


C; R34 R: 14-34-50 5 % C 10 %: Xi;
N; R50 S: (1/2-)26-36/37/39-45-61 R36/37/38

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


016-014-00-5 Tetracloreto de enxofre . . . . . . . . . 13451-08-6 R14 C; N C 10 %: C; R34
C; R34 R: 14-34-50 5 % C 10 %: Xi;
N; R50 S: (1/2-)26-36/37/39-45-61 R36/37/38

016-023-00-4 Sulfato de dimetilo . . . . . . . . . . . . . E 201-058-1 77-78-1 Carc. Cat. 2; R45 T+ C 25 %: T+;


Muta. Cat. 3; R40 R: 45-25-26-34-43 R45-25-26-34-43
T+; R26 S: 53-45 10 % C 25 %: T+;
T; R25 R45-22-26-34-43
C; R34 7 % C 10 %: T+;
R43 R45-22-26-36/37/38-43
5 % C 7 %: T;
R45-22-23-36/37/38-43
3 % C 5 %: T;
R45-22-23-43
1 % C 3 %: T;
R45-23-43
0,1 % C 1 %: T;
R45-20
0,01 % C 0,1 %: T;
R45

016-024-00-X Dimexano (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . 215-993-8 1468-37-7 Xn; R22 Xn; N


Dissulfureto de bis(metoxitiocar- N; R50-53 R: 22-50/53
bonilo). S: (2-)60-61

016-071-00-6 3-amino-6,13-dicloro-10-((3- 410-130-3 136248-03-8 R43 Xi


-((4-cloro-6-(2-sulfofenilami- R: 43
no)-1,3,5-triazina-2-il)amino) S: (2-)22-24-37
propil)amino)-4,11-trifenoxi-
dioxazinodissulfonato de triss-

N.o 183 8 de Agosto de 2001


dio.

022-001-00-5 Tetracloreto de titnio . . . . . . . . . . 231-441-9 7550-45-0 R14 C C 10 %: C; -R34


C; R34 R: 14-34 5 % C 10 %: Xi;
S: (1/2-)7/8-26-36/37/39-45 R36/37/38

030-004-00-8 Dimetilzinco [1] . . . . . . . . . . . . . . . . 208-884-1 [1] 544-97-8 [1] R14 F; C; N


Dimetilzinco [2] . . . . . . . . . . . . . . . . 209-161-3 [2] 557-20-0 [2] F; R17 R: 14-17-34-50/53
C; R34 S: (1/2-)16-43-45-60-61
N; R50-53
N.o 183 8 de Agosto de 2001
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

050-002-00-0 Ciexatine (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . . 236-049-1 13121-70-5 Xn; R20/21/22 Xn; N


Hidrxido de tri(cicloexil)estanho N; R50-53 R: 20/21/22-50/53
S: (2-)13-60-61

050-012-00-5 Tetraciclohexilestanano [1] . . . . . . 215-910-5 [1] 1449-55-4 [1] Xn; R20/21/22 Xn; N C 1 %: Xn; R20/21/22 1
Clorotriciclohexilestanano [2] . . . . 221-437-5 [2] 3091-32-5 [2] N; R50-53 R: 20/21/22-50/53
Butiltriciclohexilestanano [3] . . . . . 230-358-5 [3] 7067-44-9 [3] S: (2-)26-28-60-61

050-017-00-2 ter fenbutatina . . . . . . . . . . . . . . . 236-407-7 13356-08-6 T+; R26 T+; N


ter bis [tris(2-metil-2-fenilpropil) Xi; R36/38 R: 26-36/38-50/53
estanho]. N; R50/53 S: (1/2-)28-36/37-45-60-61

082-009-00-X Amarelo de sulfocromato de 215-693-7 1344-37-2 Carc. Cat. 3; R40 T; N 1


chumbo. (Esta substncia iden- Repr. Cat. 1; R61 R: 61-33-40-50/53-62
tificada no Colour Index pelo Repr. Cat. 3; R62 S: 53-45-60-61

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


Colour Index Constitution Num- R33
ber, C. I. 77603.) N; R50-53

082-010-00-5 Vermelho de cromato molibdato 235-759-9 12656-85-8 Carc. Cat. 3; R40 T; N 1


sulfato de chumbo. (Esta subs- Repr. Cat. 1; R61 R: 61-33-40-50/53-62
tncia identificada no Colour Repr. Cat. 3; R62 S: 53-45-60-61
Index pelo Colour Index Cons- R33
titution Number, C. I. 77605.) N; R50-53

601-024-00-X Cumeno [1] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202-704-5 [1] 98-82-8 [1] R10 Xn; N 4


Propilbenzeno [2] . . . . . . . . . . . . . . 203-132-9 [2] 103-65-1 [2] Xn; R65 R: 10-37-51/53-65
Xi; R37 S:(2-)24-37-61-62
N; R51-53

601-032-00-3 Benzo[a]pireno . . . . . . . . . . . . . . . . 200-028-5 50-32-8 Carc. Cat. 2; R45 T; N


Benzo[def]criseno . . . . . . . . . . . . . . Muta. Cat. 2; R46 R: 45-46-60-61-50/53
Repr. Cat. 2; S: 53-45-60-61
R60-61
N; R50-53

601-034-00-4 Benze[e]acefenantrileno . . . . . . . . . 205-911-9 205-99-2 Carc. Cat. 2; R45 T; N


N; R50-53 R: 45-50/53
S: 53-45-60-61

602-035-00-2 1,4-diclorobenzeno . . . . . . . . . . . . . 203-400-5 106-46-7 Xi; R36 Xi; N

4881
p-diclorobenzeno . . . . . . . . . . . . . . N; R50-53 R: 36-50/53
S: (2-)24/25-46-60-61
4882
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

602-054-00-6 3-iodopropeno . . . . . . . . . . . . . . . . . 209-130-4 556-56-9 R10 C


Iodeto de alilo . . . . . . . . . . . . . . . . . C; R34 R: 10-34
S: (1/2-)7-26-45

603-076-00-9 But-2-ino-1,4-diol . . . . . . . . . . . . . . 203-788-6 110-65-6 T; R23/25 T C 50 %: T;


2-butino-1,4-diol . . . . . . . . . . . . . . . Xn; R21-48/22 R: 21-23/25-34-48/22 R21-23/25-34-48/22
C; R34 S: (1/2-)26-36/37/39-45 25 % C 50 %: T;
R21-23/25-36/38-48/22
10 % C 25 %:Xn;

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


R20/22-48/22
3 % C 10 %: Xn;
R20/22

603-091-00-0 Exo-1-metil-4(1-metiletil)-7-oxa- 402-470-6 87172-89-2 O; R8 O; Xn


biciclo[2.2.1]heptano-2-ol. Xn; R22 R: 8-22-36
Xi; R36 S: (2-)26

603-093-00-1 Exo-(+/-)-1-metil-4(1-metiletil)-2- 402-410-9 87818-31-3 Xn; R20 Xn; N


-[(2-metilfenil)metoxi]-7-oxa- N; R51-53 R: 20-51/53
biciclo[2.2.1]heptano. S: (2-)23-61

603-097-00-3 1,1,1-nitrilotripropano-2-ol . . . . . 204-528-4 122-20-3 Xi; R36 Xi


R52-53 R: 36-52/53
S: (2-)26-61

603-117-00-0 Propano-2-ol . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200-661-7 67-63-0 F; R11 F; Xi 6


lcool isoproplico . . . . . . . . . . . . . Xi; R36 R: 11-36-67
R67 S: (2-)7-16-24/25-26

604-020-00-6 2-bifenilol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201-993-5 90-43-7 Xi; R36/37/38 Xi; N


2-hidroxibifenilo . . . . . . . . . . . . . . . N; R50 R: 36/37/38-50
S: (2-)22-61

604-021-00-1 2-bifenilato de sdio . . . . . . . . . . . . 205-055-6 132-27-4 Xn; R22 Xn; N


Xi; R37/38-41 Xi; 37/38-41-50

N.o 183 8 de Agosto de 2001


N; R50 S: (2-)22-26-61

604-024-00-8 4,4-isobutiletilidenodifenol . . . . . . 401-720-1 6807-17-6 Repr. Cat. 2; R60 T; N


Xi; R36 R: 60-36-50/53
N; R50-53 S: 53-45-60-61

604-041-00-0 cido 5-[2-cloro-4-(trifluorome- 256-634-5 [1] 50594-66-6 [1] Xn; R22 Xn; N
til)fenoxi]-2-nitrobenzico [1]. 263-560-7 [2] 62476-59-9 [2] Xi; R38-41 R: 22-38-41-50/53
5-[2-cloro-4-(trifluorometil)feno- N; R50-53 S: (2-)24-39-60-61
xi]-2-nitrobenzoato de sdio [2].
N.o 183 8 de Agosto de 2001
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

604-043-00-1 Monobenzona . . . . . . . . . . . . . . . . . 203-083-3 103-16-2 Xi; R36 Xi


R43 R: 36-43
S: (2-)24/25-26-37

604-044-00-7 Mequinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205-769-8 150-76-5 Xn; R22 Xn


Xi; R36 R: 22-36-43
R43 S: (2-)24/25-26-37/39-46

605-016-00-7 Glioxal . . . % . . . . . . . . . . . . . . . . . . B 203-474-9 107-22-2 Muta. Cat. 3; R40 Xn C 10 %: Xn;


Etanedial . . . % . . . . . . . . . . . . . . . . Xn; R20 R: 20-36/38-40-43 R20-36/38-40-43
Xi; R36/38 S: (2-)36/37 1 % C 10 %:Xn;
R43 R40-43

606-016-00-X Pindona (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . . . 201-462-8 83-26-1 T; R25-48/25 T; N


Pivaldiona . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N; R50-53 R: 25-48/25-50/53
2-pivaloil-1,3-indanodiona . . . . . . . S: (1/2-)37-45-60-61

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


606-018-00-0 Diclona (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . . . 204-210-5 117-80-6 Xn; R22 Xn; N
2,3-dicloro-1,4-naftoquinona . . . . . Xi; R36/38 R: 22-36/38-50/53
N; R50-53 S: (2-)26-60-61

606-019-00-6 Clordecona (ISO) . . . . . . . . . . . . . . 205-601-3 143-50-0 Carc. Cat. 3; R40 T; N


Decacloropentaciclo[5,2,1,0 2,6 , T; R24/25 R: 24/25-40-50/53
0 3,9,0 5,8]decano-4-ona. N; R50-53 S: (1/2-)22-36/37-45-60-61

606-034-00-8 Metribuzina (ISO) . . . . . . . . . . . . . 244-209-7 21087-64-9 Xn; R22 Xn; N


4-amino-6-terc-butil-3-metiltio- N; R50-53 R: 22-50/53
-1,2,4-triazin-5-ona. S: (2-)60-61

606-035-00-3 Pirazona (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . . 216-920-2 1698-60-8 R43 Xi; N


5-amino-4-cloro-2-fenilpiridazin- N; R50-53 R: 43-50/53
-3-ona. S: (2-)24-37-60-61

606-036-00-9 Chinometionato (ISO) . . . . . . . . . . 219-455-3 2439-01-2 Repr. Cat. 3; R62 Xn; N


6-metil-1,3-ditiolo(4,5-b)quinoxa- Xn; R: 20/21/22-36-43-48/22-50/
lina-2-ona. R20/21/22-48/22 53-62
Xi; R36 S: (2-)24-37-60-61
R43
N; R50-53

606-037-00-4 Triadimefo (ISO) . . . . . . . . . . . . . 256-103-8 43121-43-3 Xn; R22 Xn; N

4883
1-(4-clorofenoxi)-3,3-dimetil-1- N; R51-53 R: 22-51/53
-1,2,4-triazol-1-il)butanona. S: (2-)61
4884
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

606-044-00-2 2,4,6-trimetilbenzofenona . . . . . . . 403-150-9 954-16-5 Xn; R22 Xn; N


Xi; R36 R: 22-36-50/53
N: R50-53 S: (2-)26-60-61

607-043-00-X Dicamba (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . . 217-635-6 1918-00-9 Xn; R22 Xn; N


cido 3,6-dicloro-2-metoxiben- Xi; R41 R: 22-41-52/53
zico. R52-53 S: (2-)26-61

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


607-057-00-6 Cumaclor (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . 201-378-1 81-82-3 Xn; R48/22 Xn
3-[1-(4-clorofenil)-3-oxobutil]- R52-53 R: 48/22-52/53
-4-hidroxicumarino. S: (2-)37-61

607-058-00-1 Cumafuril (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . 204-195-5 117-52-2 T; R25-48/25 T


3-[1-(2-furil)-3-oxobutil]-4-hidroxi- R52-53 R: 25-48/25-52/53
cumarino.

607-079-00-6 Celevano (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . . 4234-79-1 T; R24 T; N


5-(1,2,3,5,6,7,8,9,10,10-de- Xn; R22 R: 22-24-51/53
cacloro-4-hidroxipentaciclo N; R51-53 S: (1/2-)36/37-45-61
(5,2,1,0 2,6 0, 3,9 ,0 5,8 )dec-4-il)-
-4-oxovalerato de etilo.

607-097-00-4 1,2-anidrido de cido benzeno- 209-008-0 552-30-7 Xi; R37-41 Xn


-1,2,4-tricarboxlico. R42/43 R: 37-41-42/43
S: (2-)22-26-36/37/39

607-143-00-3 cido valrico . . . . . . . . . . . . . . . . . 203-677-2 109-52-4 C; R34 C


R52-53 R: 34-52/53
S: (1/2-)26-36-45-61

607-152-00-2 2,3,6-TBA (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . 200-026-4 50-31-7 Xn; R22 Xn; N


cido 2,3,6-triclorobenzico . . . . . N; R51-53 R: 22-51/53
S: (2-)61

607-153-00-8 Benazolina (ISO) . . . . . . . . . . . . . . 223-297-0 3813-05-6 Xi; R36/38 Xi

N.o 183 8 de Agosto de 2001


cido 4-cloro-2,3-dihidro-2-oxo- R52-53 R: 36/38-52/53
-1,3-benzotiazol-3-ilactico. S: (2-)22-61

607-156-00-4 Clorfensone (ISO) . . . . . . . . . . . . . 201-270-4 80-33-1 Xn; R22 Xn; N


4-clorobenzenossulfonato de 4-clo- Xi; R38 R: 22-38-50/53
rofenilo. N; R50-53 S: (2-)37-60-61

607-158-00-5 Sal de sdio do cido cloroactico 223-498-3 3926-62-3 T; R25 T; N


Cloroacetato de sdio . . . . . . . . . . . Xi; R38 R: 25-38-50
N; R50 S: (1/2-)22-37-45-61
N.o 183 8 de Agosto de 2001
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

607-159-00-0 Clorobenzilato (ISO) . . . . . . . . . . . 208-110-2 510-15-6 Xn; R22 Xn; N


4,4-diclorobenzilato de etilo . . . . . N; R50-53 R: 22-50/53
S: (2-)60-61

607-176-00-3 Mistura de: a-3-(3-(2H-benzotri- 400-830-7 R43 Xi; N


azole-2-il)-5-terc-butil-4-hidro- N; R51-53 R: 43-51/53
xifenil)propionil-x-hidroxi- S: (2-)36/37-61
poli(oxietileno);a-3-(3-(2H-ben-
zotriazole-2-il)-5-terc-butil-
-4-hidroxifenil)propionil-x-3-
-(3-(2H-benzotriazole-2-il)-
-5-terc-butil-4-hidroxifenil) pro-
pioniloxipoli(oxietileno).

607-188-00-9 N-carboxilatoetil-N-octadec-9-enil- 402-970-4 R43 Xn; N


maleamato de hidrognio e s- N; R51-53 R: 43-51/53
dio. S: (2-)24/37-61

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


607-209-00-1 Mistura de: O,O-di(1-metiletil)- 403-030-6 Xn; R22 Xn; N
tritio-bis-tioformato;O,O-di- R43 R: 22-43-50/53
(1-metiletil)tetratio-bis-tiofor- N; R50-53 S: (2-)36/37-60-61
mato;O,O-di(1-metiletil)penta-
tio-bis-tioformato.

607-213-00-3 3,3-bis[(1,1-dimetilpropil)peroxi]- 403-320-2 67567-23-1 E; R2 E; N


butirato de etilo. O; R7 R: 2-7-10-51/53
R10 S: (2-)3/7-14-33-36/37/39-61
N; R51-53

607-217-00-5 2-[4-(-7-fenil-2,6-dihidro-2,6- 403-960-2 R43 Xi


-dioxo-1,5-dioxaindaceno- R53 R: 43-53
-3-il)fenoxi]acetato de S: (2-)24-37-61
2-etoxietilo.

607-243-00-7 3,6-dicloro-o-anisato de sdio [1] 217-846-3 [1] 1982-69-0 [1] R52-53 R: 52/53
cido 3,6-dicloro-o-ansico, com- 246-590-5 [2] 25059-78-3 [2] S: 61
posto com 2,2-iminodietanol 258-527-9 [3] 53404-28-7 [3]
(1:1) [2].
cido 3,6-dicloro-o-ansico, com-
posto com 2-aminoetanol (1:1)
[3].

607-248-00-4 Naptalame-sdio . . . . . . . . . . . . . . . 205-073-4 132-67-2 Xn; R22 Xn

4885
R: 22
S: (2)
4886
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

607-249-00-X Diacrilato de (1-metil-1,2-etano- 256-032-2 42978-66-5 Xi; R36/37/38 Xi; N C 10 %: Xi;


diil)bis[oxi(metil-2,1-etanodiilo. R43 R: 36/37/38-43-51/53 R36/37/38-43
N; R51-53 S: (2-)24-37-61 1 % C 10 %: Xi; R43

607-252-00-6 Lamda-cialotrina (ISO) . . . . . . . . . 415-130-7 91465-08-6 T+; R26 T+; N


Mistura 1:1 de (Z)-(1R,3R)-3- T; R25 R: 21-25-26-50/53
-(2-cloro-3,3,3-trifluoropro- Xn; R21 S: (1/2-)28-36/37/39-38-45-60-61
penil)-2,2-dimetilciclopropa- N; R50-53

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


nocarboxilato de (S)-a-ciano-
-3-fenoxibenzilo e do (Z)-
-(1S,3S)-3-(2-cloro-3,3,3-
-trifluoropropenil)-2,2-dime-
tilciclopropanocarboxilato de
(R)-a-ciano-3-fenoxibenzilo.

607-255-00-2 Fluoroxipir (ISO) . . . . . . . . . . . . . . 69377-81-7 R52-53


cido 4-amino-3,5-dicloro-6-flu- R: 52/53
oro-2-piridiloxiactico. S:61

608-003-00-4 Acrilonitrilo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D 203-466-5 107-13-1 F; R11 F; T; N C 20 %: T;


E Carc. Cat. 2; R45 R: 45-11-23/24/25-37/38-41-43- R45-23/24/25-37/38-41-43
T; R23/24/25 -51/53 10 % C 20 %: T;
Xi; R37/38-41 S: 9-16-53-45-61 R45-23/24/25-41-43
R43 5 % C 10 %: T;
N; R51-53 R45-23/24/25-36-43
1 % C 5 %: T;
R45-23/24/25-43
0,2 % C 1 %: T;
R45-20/21/22
0,1 % C 0,2 %: T; R45

608-016-00-5 1,4-diciano-2,3,5,6-tetra-cloro- 401-550-8 1897-41-2 R43 Xi; N


-benzeno. N; R50-53 R: 43-50/53
S: (2-)24-37-60-61

N.o 183 8 de Agosto de 2001


609-030-00-4 Dinoterbe (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . E 215-813-8 1420-07-1 Repr. Cat. 2; R61 T+; N
2-terc-butil-4,6-dinitrofenol . . . . . . T+; R28 R: 61-24-28-44-50/53
T; R24 A: 53-45-60-61
R44
N; R50-53

609-040-00-9 Nitrofene (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . . E 217-406-0 1836-75-5 Carc. Cat. 2; R45 Xn; N


ter 2,4-diclorofenilo-4-nitrofen- Repr. Cat. 2; R61 R: 45-61-22-50/53
lico. Xn; R22 S: 53-45-60-61
N; R50-53
N.o 183 8 de Agosto de 2001
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

609-044-00-0 Tecnazena (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . 204-178-2 117-18-0 Xn; R22 Xn; N


1,2,4,5-tetracloro-3-nitrobenzeno R43 R: 22-43-50/53
N; R50-53 S: (2-)24-37-60-61

611-008-00-4 4-aminoazobenzeno . . . . . . . . . . . . 200-453-6 60-09-3 Carc. Cat. 2; R45 T; N


N; R50-53 R: 45-50/53
S: 53-45-60-61

611-013-00-1 1-hidroxi-7-(3-sulfonatoanilina)-2- 403-650-7 117409-78-6 E; R2 E; N


-[3-metil-4-[2-metoxi-4-(3-sul- N; R51-53 R: 2-51/53
fonatofenilazo)fenilazo]fenila- S: (2-)35-61
zo]naftaleno-3-sulfonato de tri-
litio.

611-031-00-X 4,4-(4-iminociclohexa-2,5-dienili- 209-321-2 569-61-9 Carc. Cat. 2; R45 T

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


denometileno)dianilina, clori- R: 45
drato. S: 53-45

612-035-00-4 2-metoxianilina . . . . . . . . . . . . . . . . E 201-963-1 90-04-0 Carc. Cat. 2; R45 T


o-anisidina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Muta. Cat. 3; R40 R: 45-23/24/25
T; R23/24/25 S: 53-45

612-042-00-2 Benzidina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E 202-199-1 92-87-5 Carc. Cat. 1; R45 T; N C 25 %: T; R45-22


4,4-diaminobifenilo . . . . . . . . . . . . Xn; R22 R: 45-22-50/53 0,01 % C 25 %: T; R45
N; R50-53 S: 53-45-60-61

612-051-00-1 4,4-diaminodifenilmetano . . . . . . . E 2002-974-4 101-77-9 Carc. Cat. 2; R45 T; N


Muta. Cat. 3; R40 R: 45-39/23/24/25-43-48/20/21/-
T; R39/23/24/25 22-51/53
Xn; R48/20/21/22 S: 53-45-61
R43
N; R51-53

612-081-00-5 Sais de 4,4-bi-o-toluidina . . . . . . . A 210-322-5 612-82-8 Carc. Cat. 2; R45 T; N


Sais de 3,3-dimetilbenzidina . . . . . E 265-294-7 64969-36-4 Xn; R22 R: 45-22-51/53
Sais de o-tolidina . . . . . . . . . . . . . . . 277-985-0 74753-18-7 N; R51-53 S: 53-45-61

612-099-00-3 4-metil-m-fenilendiamina . . . . . . . . E 202-453-1 95-80-7 Carc. Cat. 2; R45 T; N


T; R25 R: 45-21-25-36-43-51/53
Xn; R21 A: 53-45-61
Xi; R36

4887
R43
N; R51-53
4888
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

612-105-00-4 2-(1-piperazinil)etilamina . . . . . . . 205-411-0 140-31-8 Xn; R21/22 C


C; R34 R: 21/22-34-43-52/53
R43 S: (1/2-)26-36/37/39-45-61
R52-53

612-111-00-7 2-metil-m-fenilenodiamina . . . . . . 212-513-9 823-40-5 Muta. Cat. 3; R40 Xn; N


Xn; R21/22 R: 21/22-40-43-51/53
R43 S: (2-)24-36/37-61
N; R51-53

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


612-125-00-3 2-metil-p-fenilenodiamina . . . . . . . 202-442-1 95-70-5 T; R25 T; N
Xn;R20/21 R: 20/21-25-43-51/53
R43 S: (1/2-)24-37-45-61
N; R51-53

612-144-00-7 Flumetralina (ISO) . . . . . . . . . . . . . 62924-70-3 Xi; R36/38 Xi; N


N-(2-cloro-6-fluorobenzil)-N-etil- R43 R: 36/38-43-50/53
-a,a,a-trifluoro-2,6-dinitro- N; R50-53 S: (2-)36/37-60-61
-p-toluidina.

612-151-00-5 Diaminotolueno . . . . . . . . . . . . . . . E 246-910-3 25376-45-8 Carc. Cat. 2; R45 T; N


T; R25 R: 45-20/21-25-36-43-51/53
Xn; R20/21 S: 53-45-61
Xi; R36
R43
N; R51-53

613-018-00-4 Morfanquato (ISO) . . . . . . . . . . . . 7411-47-4 Xn; R22 Xn


1,1-bis(3,5-dimetilmorfolinocar- Xi; R36/37/38 R: 22-36/37/38-52/53
bonilmetil)-4,4-dipiridnio. R52-53 S: (2-)22-36-61

613-031-00-5 Sincloseno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201-782-8 87-90-8 O; R8 O; Xn; N


Tricloro-s-triazina-2,4,6-triona . . . Xn; R22 R: 8-22-31-36/37-50/53
cido tricloroisocianrico . . . . . . . R31 S: (2-)8-26-41-60-61
Xi; R36/37
N; R50-53

N.o 183 8 de Agosto de 2001


613-038-00-3 6-fenil-1,3,5-triazina-2,4-diildi- 202-095-6 91-76-9 Xn; R22 Xn
amina. R52-53 R: 22-52/53
6-fenil-1,3,5-triazina-2,4-diamina S: (2-)61
Benzoguanamina . . . . . . . . . . . . . . .

613-042-00-5 1-[2-(aliloxi)-2-(2,4-diclorofenil)- 252-615-0 35554-44-0 Xn; R20/22 Xn; N


etil]-1H-imidazole. N; R41 R: 20/22-41-50/53
N; R50-53 S: (2-)26-39-60-61
N.o 183 8 de Agosto de 2001
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

613-043-00-0 Hidrogenossulfato de 1-[2-(ali 261-351-5 [1] 58594-72-2 [1] Xn; R20/22 Xn; N
-loxi)etil-2-(2,4-diclorofenil)]- 281-291-3 [2] 83918-57-4 [2] Xi; R41 R: 20/22-41-40/53
-1H-imidazlio [1]. N; R50-53 S: (2-)26-39-60-61
Hidrogenossulfato de ()-1-[2-(ali-
loxi)etil-2-(2,4-diclorofenil)]-
-1-H-imidazlio [2].

613-066-00-6 Terbumeton (ISO) . . . . . . . . . . . . . 251-637-8 33693-04-8 Xn; R22 Xn; N


2-terc-butilamino-4-etilamino- N; R50-53 R: 22-50/53
-6-methoxi-1,3,5-triazina. S: (2-)60-61

613-091-00-2 Dicloreto de morfanquato [1] . . . . 225-062-8 [1] 4636-83-3 [1] Xn; R22 Xn
Sulfato de morfanquato [2] . . . . . . 29873-36-7 [2] Xi; R36/37/38 R: 22-36/37/38-52/53
R52-53 S: (2-)22-36-61

613-098-00-0 N-(n-octil)-2-pirrolidinona . . . . . . . 403-700-8 2687-94-7 C; R34 C; N

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


N; R51-53 R: 34-51/53
S: (1/2-)23-26-36/37/39-45-61

613-130-00-3 Hexaconazol (ISO) . . . . . . . . . . . . . 79983-71-4 R43 Xi; N


(RS)-2-(2,4-diclorofenil)-1-(1H-1, N; R51-53 R: 43-51/53
2,4-triazol-il)hexano-2-ol. S: (2-)24-37-61

613-131-00-9 Piroquilona (ISO) . . . . . . . . . . . . . . 57369-32-1 Xn; R22 Xn


1,2,5,6-tetrahidropirrolo[3,2,1-ij]- R52-53 R: 22-52/53
quinolin-4-ona. S: (2-)61

613-134-00-5 Miclobutanil (ISO) . . . . . . . . . . . . . 88671-89-0 Repr. Cat. 3; R63 Xn; N


2-p-clorofenil-2-(1H-1,2,4-triazol- Xn; R22 R: 22-36-51/53-63
-1-il-metil)hexanonitrilo. Xi; R36 S: (2-)36/37-46-61
N; R51-53

613-137-00-1 Metabenzetiazurone (ISO) . . . . . . 242-505-0 18691-97-9 N; R50-53 N


R: 50/53
S: 60-61

613-139-00-2 Metassulfuro-metilo . . . . . . . . . . . 74223-64-6 N; R50-53 N


2-(4-metoxi-6-metil-1,3,5-triazina- R: 50/53
-2-ilcarbamoilsulfonil)benzoato S: 60-61
de metilo.

614-001-00-4 Nicotina (ISO) . . . . . . . . . . . . . . . . . 200-193-3 54-11-5 T+; R27 T+; N

4889
T; R25 R: 25-27-51/53
N; R51-53 S: (1/2-)36/37-45-61
4890
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

614-006-00-1 Brucina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206-614-7 357-57-3 T+; R26/28 T+


R52-53 R: 26/28-52/53
S: (1/2-)13-45-61

614-007-00-7 Sulfato de brucina [1] . . . . . . . . . . . 225-432-9 [1] 4845-99-2 [1] T+; R26/28 T+
Nitrato de brucina [2] . . . . . . . . . . . 227-317-9 [2] 5786-97-0 [2] R52-53 R: 26/28-52/53
Estricnidin-10-ona, 2,3-dimetoxi-, 269-439-5 [3] 68239-26-9 [3] S: (1/2-)13-45-61
mono [1,2-benzenodicarboxilato 269-710-8 [4] 68310-42-9 [4]

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


de(R)-1-metilheptilo [3].
Estricnidin-10-ona, 2,3-dimetoxi-,
composto com (S)-mono-(1-me-
tilheptil)-1,2-benzenodicar-
boxilato(1:1) [4].

615-006-00-4 Diisocianato de 2-metil-m-fenile- C 202-039-0 [1] 91-08-7 [1] Carc. Cat. 3; R40 T+ C 20 %:T+; 2
no [1]. 209-544-5 [2] 584-84-9 [2] T+; R26 R: 26-36/37/38-40-42/43-52-53 R26-36/37/38-40-42/43
Diisocianato de 4-metil-m-fenile- 247-722-4 [3] 26471-62-5 [3] Xi; R36/37/38 S: (1/2-)23-36/37-45-61 7 % C 20 %: T+;
no [2]. R42/43 R26-40-42/43
Diisocianato de m-tolilideno [3] . . . . R52-53 1 % C 7 %: T;
2,6-diisocianato de toluileno [1] . . . . R23-40-42/43
2,4-diisocianato de toluileno [2] . . . . 0,1 % C 1 %: Xn;
R20-42

616-010-00-9 Sdio tosilcloramida . . . . . . . . . . . . 204-854-7 127-65-1 Xn; R22 C


R31 R: 22-31-34-42
C; R34 S: (1/2-)7-22-26-36/37/39-45
R42

616-034-00-X Piracarbolida (ISO) . . . . . . . . . . . . 246-419-4 24691-76-7 R52-53 R: 52/53


S: 61

616-035-00-5 2-ciano-N-[(etilamino)carbonil]-2- 261-043-0 57966-95-7 Xn; R22 Xn; N


-(metoxiimino)acetamida. R43 R: 22-43-50/53
N; R50-53 S: (2-)36/37-60-61

N.o 183 8 de Agosto de 2001


617-004-00-9 Hidroperxido de 1,2,3,4-tetrahi- 212-230-0 771-29-9 O; R7 O; C; N C 25 %: C; R22-34
dro-1-naftilo. Xn; R22 R: 7-22-34-50/53 10 % C 25 %: C; R34
C; R34 S: (1/2-)3/7-14-26-36/37/39-45- 5 % C 10 %: Xi;
N; R50-53 -60-61 R36/37/38

617-006-00-X Perxido de bis(a,a-dimetilben- 201-279-3 80-43-3 O; R7 O; Xi; N


zilo). Xi; R36/38 R: 7-36/38-51/53
N; R51-53 S: (2-)3/7-14-36/37/39-61
N.o 183 8 de Agosto de 2001
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

617-008-00-0 Perxido de dibenzoilo . . . . . . . . . . 202-327-6 94 36-0 E; R2 E; Xi;


Xi; R36 R: 2-36-43
R43 S: (2-)3/7-14-36/37/39

650-007-00-3 Clordimeforme (ISO) . . . . . . . . . . . 228-200-5 6164-98-3 Carc. Cat. 3; R40 Xn; N


N 1 -(4-cloro-o-tolil)-N 1 ,N 2 -dime- Xn; R21/22 R: 21/22-40-50/53
tilformamidina. N; R50-53 S: (2-)22-36/37-60-61

650--008-00-9 Drazoxolon (ISO) . . . . . . . . . . . . . . 227-197-8 5707-69-7 T; R25 T; N


4-(2-clorofenilidrazono)-3-metil- N; R50-53 R: 25-50/53
-5-isoxazolona. S: (1/2-)22-24-36/37-45-60-61

650-009-00-4 Clordimeforme, cloridrato . . . . . . . 243-269-1 19750-95-9 Carc. Cat. 3; R40 Xn; N


N-(4-cloro-o-tolil)-N,N-dimetil- Xn; R22 R: 22-40-50/53
formamidina, monocloridrato. N; R50-53 S: (2-)22-36/37-60-61

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


650-033-00-5 Esfenvalerato (ISO) . . . . . . . . . . . . 66230-04-4 T; R23/25 T; N
(S)-2-(4-clorofenil)-3-metilbuti- R43 R: 23/25-43-50/53
rato de (S)-a-ciano-3-fenoxiben- N; R50-53 S: (1/2-)24-36/37/39-45-60-61
zilo.

650-041-00-9 Triassulfuro (ISO) . . . . . . . . . . . . 82097-50-5 N; R50-53 N


3-(4-metoxi-6-metil-1,3,5-triazina- R: 50/53
-2-il)-1-[2-(2-cloroetoxi)fenil- S: 60-61
sulfonil]-ureia.

ANEXO III

Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

006-090-00-8 Fenilcarbamato de 2-(3-iodoprop- 408-010-0 88558-41-2 Xn; R20 Xn


-2-in-1-iloxi)etilo. Xi; R41 R: 20-41-52/53
R52-53 S: (2-)22-26-39-61

014-016-00-0 Mistura de: 1,3-dihex-5-eno-1-il- 406-490-6 N; R51-53 N


-1,1,3,3-tetrametildissiloxano; R: 51/53
1,3-dihex-n-eno-1-il-1,1,3,3-te- S: 61
trametildissiloxano.

015-164-00-9 Dihidrato do P,Pb-(1-hidroxieti- 400-480-5 36669-85-9 R52-53 R: 52/53

4891
leno)bis(hidrogeniofosfonato) S: 61
de clcio.
4892
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

015-165-00-4 Mistura de: bishexafluorofosfato de 404-986-7 Xi; R41 Xi; N


tiobis (4,1-fenileno)-S,S,Sb,Sb- N; R50-53 R: 41-50/53
-tetrafenildissulfonio; hexafluo- S: (2-)15-26-39-60-61
rofosfato de difeni (4-feniltiofe-
nil) sulfonio.

015-166-00-X 3,9-bis(2,6-di-terc-butil-4-metilfe- 410-290-4 80693-00-1 R53 R: 53


noxi)-2,4,8,10-tetraoxi-3,9-difos- S: 61
faespiro[5.5] undecano.

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


015-167-00-5 cido 3-(hidroxifenilfosfinil)pro- 411-200-6 14657-64-8 Xi; R41 Xi
panico. R: 41
S: (2-)26-39

601-050-00-1 Benzeno, derivados C10-C13-al- 267-051-0 67774-74-7 N; R50 N


quilo. R: 50
S: 61

601-051-00-7 4-fenilbut-1-eno . . . . . . . . . . . . . . . . 405-980-7 768-56-9 Xi; R38 Xi; N


N; R51-53 R: 38-51/53
S: (2-)37-61

602-083-00-4 ter difenlico, derivado pentabro- 251-084-2 32534-81-9 Xn; R48/21/22 Xn; N
mado. R64 R: 48/21/22-50/53-64
N; R50-53 S: (1/2-)36/37-45-60-61

602-084-00-X 1,1-dicloro-1-fluoretano . . . . . . . . . 404-080-1 1717-00-6 N; R52-53-59 N


R: 52/53-59
S: 59-61

603-128-00-0 2-(fenilmetoxi)naftaleno . . . . . . . . 405-490-3 613-62-7 R53 R: 53


S: 61

603-129-00-6 1-terc-butoxipropano-2-ol . . . . . . . . 406-180-0 57018-52-7 R10 Xi


Xi; R41 R: 10-41

N.o 183 8 de Agosto de 2001


S: (2-)26-39

603-130-00-1 Mistura de ismeros de: a-[(dime- 406-325-8 Xn; R22 Xn


til)bifenil]-x-hidroxipoli(oxieti- R52-53 R: 22-52/53
leno). S: (2-)39-61

603-131-00-7 Mistura (3:1) de: 1-deoxi-1-[me- 407-290-1 Xi; R41 Xi


til-(1-oxododecil)amino]-D-glu- R: 41
citol; 1-deoxi-1-[metil-(1-oxote- S: (2-)26-39
tradecil)amino]-D-Glucitol.
N.o 183 8 de Agosto de 2001
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

603-132-00-2 2-hidroximetil-9-metil-6-(1-metile- 408-200-3 63187-91-7 Xi; R38-41 Xi


til)-1,4-dioxaspiro[4,5]decano. R52-53 R: 38-41-52/53
S: (2-)26-37/39-61

603-133-00-8 Mistura de: 3-[(4-amino-2-cloro-5- 408-240-1 Xn; R22 Xn


-nitrofenil)amino]propano-1,2- R52-53 R: 22-52/53
-diol; 3,3b-(cloro-5-nitro-1,4-fe- S: (2-)22-36-61
nilenodiimino)bis(propan-1,2-
-diol).

603-134-00-3 Mistura de dodecil e ou tetradecil 410-450-3 R53 R: 53


defenil teres substitudos. A S: 61
substncia produzida com a
reaco de Friedel Craft. O cata-
lizador eliminado do produto
de reaco. O defenilter subs-
titudo com grupos alqulicos

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


C1-C10. Os grupos alqulicos so
ligados casualmente entre C1 e
C6. So usadas cadeias lineares
de C12 e C14 em proporo
50/50.

603-135-00-9 bis[(2,2b,2n-nitrilotris[etanolato)]- 410-500-4 Xi; R41 Xi; N


-1-N,O]-bis [2-(2-metoxieto- N; R51-53 R: 41-51/53
xi)etoxi]-titnio. S: (2-)26-39-61

603-136-00-4 3-((4-(bis(2-hidroxietil)amino)-2- 410-910-3 104226-19-9 R43 Xi


-nitrofeni)amino)-1-propanol. R52-53 R: 43-52/53
S: (2-)24-37-61

603-137-00-X Mistura de: 1-deoxi-1-[metil-(1- 411-130-6 Xi; R41 Xi


-oxohexadecil)amino]-D-gluci- R: 41
tol; 1-deoxi-1-[metil-(1-oxooc- S: (2-)26-39
tadecil)amino]-D-glucitol.

603-138-00-5 3-(2,2-dimetil-3-hidroxipropil)to- 403-140-4 103694-68-4 R52-53 R: 52/53


lueno. S: 61

604-050-00-X 4-cloro-o-cresol . . . . . . . . . . . . . . . . 216-381-3 1570-64-5 T; R23 T; C; N C 25 %: T; C; R23-35


C; R35 R: 23-35-50 10 % C 25 %; C;
N; R50 S: 1/2-)26-36/37/39-45-61 R20-35
5 % C 10 %: C;
R20-34
3 % C 5 %; Xn;
R20-36/37/38

4893
1 % C 3 %: Xi;
R36/37/38
4894
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

604-051-00-5 3,5-bis[(3,5-di-terc-butil-4-hidro- 401-110-5 87113-78-8 R52-53 R: 52/53


xi)benzil]-2,4,6-trimetilfenol. S: 61

604-052-00-0 2,2b-metilenobis[6-(2H-benzotria- 403-800-1 103597-45-1 R53 R: 53


zole-2-il)-4-(1,1,3,3-tetrametil- S: 61
butil)fenol].

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


604-053-00-6 2-metil-4-(1,1-dimetiletil)-6-(1-me- 410-760-9 157661-93-3 Xi; R38 Xi; N
til-pentadecil)-fenol. R34 R: 38-43-50/53
N; R50-53 S: (2-)24-37-60-61

604-054-00-1 Mistura de: 2-metoxi-4-(tetrahi- 412-020-0 R43 Xi


dro-4-metileno-2H-pirano-2-il)- R52-53 R: 43-52/53
-fenol; 4-(3,6-dihidro-4-metil- S: (2-)24-37-61
-2H-pirano-2-il)-2-metoxifenol.

604-055-00-7 2,2b-((3,3b,5,5b-tetrametil-(1,1b- 413-900-7 85954-11-6 Muta. Cat. 3; R40 Xn


-bifenil)-4,4b-diil)-bis(oximeti- R: 40
leno))-bis-oxirano. S: (2-)22-36-37

605-027-00-7 Mistura de: 3a,4,5,6,7,7a-hexa- 410-480-7 R43 Xi, N


hidro-4,7-metano-1H-indeno-6- N; R51-53 R: 43-51/53
-carboxaldedo; 3a,4,5,6,7,7a- S: (2-)24-37-61
-hexahidro-4,7-metano-1H-in-
deno-5-carboxaldedo.

606-051-00-0 4-pentilciclohexanona . . . . . . . . . . . 406-670-4 61203-83-6 N; R51/53 N


R: 51/53
S: 61

606-052-00-6 4-(N,N-dibutilamino)-2-hidroxi- 410-410-5 54574-82-2 R52-53 R: 52/53


-2b-carboxibenzofenona. S: 61

N.o 183 8 de Agosto de 2001


607-272-00-5 Fluoroxipir-meptil (ISO) [1] . . . . . 279-752-9 [1] 81406-37-3 [1] N; R50-53 N
Fluroxipir-butometil (ISO) [2] . . . . 154486-27-8 [2] R: 50/53
S:60-61

607-273-00-0 7-(2,6-dimetil-8-(2,2-dimetilbutiri- 404-520-2 R52-53 R: 52/53


loxi)-1,2,6,7,8,8a-hexahidro-1- S: 61
-naftil)-3,5-dihidroxiheptanoato
de amnio.
N.o 183 8 de Agosto de 2001
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

607-274-00-6 3-amino-2-butenoato de 2-(N-ben- 405-350-1 54527-73-0 R43 Xi; N


zil-N-metilamino)etilo. N; R51-53 R: 43-51/53
S: (2-)24-37-61

607-275-00-1 Benzoiloxibenzeno-4-sulfonato de 405-450-5 66531-87-1 R43 Xi


sdio. R: 43
S: (2-)24-37

607-276-00-7 Complexo de zinco de bis[(1-meti- 405-635-0 Xi; R38-41 Xi; N


limidazole)-(2-etil-hexanoato)]. N; R50-53 R: 38-41-50/53
S: (2-)26-37/39-60-61

607-277-00-2 Mistura de: 2-(hexiltio)etilamina, 405-720-2 Xn; R22 Xn; N


clorhidrato; propionato de s- Xi; R41 R: 22-41-43-51/53
dio. R43 S: (2-)24-26-37/39-61
N; R51-53

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


607-278-00-8 Mistura de ismero de: fenetilnaf- 405-760-0 Xi; R41 Xi
talenossulfonato de sdio; nafti- R43 R: 41-43-52/53
letilbenzenossulfonato de sdio. R52-53 S: (2-)24-26-37/39-61

607-279-00-3 Mistura de: bis(hidrogeniomalea- 405-960-8 R43 Xi; N


to) de n-octadecilaminodietilo; N; R51-53 R: 43-51/53
hidrogeniomaleato-hidrogeniof- S: (2-)24-37-61
talato de n-octadecilaminodie-
tilo.

607-280-00-9 4-cloro-1-hidroxibutano-1-sulfo- 406-190-5 54322-20-2 Xn; R22 XN


nato de sdio. Xi; R36 R: 22-36-43
R43 S: (2-)22-26-36/37

607-281-00-4 Mistura de 3-[3-(2H-benzotriazole- 407-000-3 127519-17-9 N; R51-53 N


-2-il)-5-(1,1-dimetiletil)-4-hidro- R: 51/53
xifenil]propionatos de C7-C9 S: 61
alquilo ramificados e lineares.

607-282-00-X Acetato de 2-acetoximetil-4-benzi- 407-140-5 131266-10-9 R52-53 R: 52/53


loxibut-1-ilo. S: 61

607-283-00-5 E-etil-4-oxo-4-fenilcrotonato . . . . . 408-040-4 15121-89-4 Xn; R21/22 Xn; N


Xi; R38-41 R: 21/22-38-41-43-50/53

4895
R43 S: (2-)26-36/37/39-60-61
N; R50-53
4896
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

607-284-00-0 Mistura (9:1) de: 3,3b-(1,4-feni- 410-040-4 136213-76-8 N; R51-53 N


lenobis(carbonilimino-3,1-pro- R: 51/53
pandiilimino))bis(10-amino- S: 61
-6,13-dicloro)-4,11-trifenodioxa-
zinodissulfonato) de sdio; 3,3b-
-(1,4-fenilenobis(carbonilimino-
-3,1-propanodiilimino))bis)10-
-amino-6,13-dicloro)-4,11-trife-
nodioxazinodissulfonato) de

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


ltio.

607-285-00-6 Mistura de: cido 7-{[(3-ami- 410-065-0 R43 Xi


nofenil)sulfoni]amino}-nafta- R: 43
leno-1,3-dissulfnico; 7-{[(3- S: (2-)22-24-37
-aminofenil)sulfonil]amino}-
-naftaleno-1,3-dissulfonato de
sdio: 7-{[(3-aminofenil)sulfo-
nil]amino}-naftaleno-1,3-dissul-
fonato de potssio.

607-286-00-1 Mistura de: 7-[[[(3-[[4-((2-hidroxi- 410-070-8 141880-36-6 R43 Xi


-naftil)azo)fenil]azo]fenil]sulfo- R52-53 R: 43-52/53
nil]amino]naftaleno-1,3-dissul- S: (2-)22-24-37-61
fonato de sdio e de potssio.

607-287-00-7 O-(1-metil-2-metacriloiloxi-etil)- 410-140-8 R52-53 R: 52/53


-1,2,3,6-tetrahidroftalato de Ob- S: 61
-metilo.

607-288-00-2 (c-(3-(1-(3-(e-6-dicloro-5-cianopi- 410-160-7 148732-74-5 Xi; R36 Xi


rimidina-f-il (metil)amino)pro- R43 R: 36-43-52/53
pil)-1,6-dihidro-2-hidroxi-4- R52-53 S: (2-)22-26-36/37-61
-metil-6-oxo-3-piridilazo)-4-sul-
fonatofenilsulfamoil)ftalocia-
nina-a,b,d-trissulfonato(6-))ni-
quetato II de tetrassdio, em que

N.o 183 8 de Agosto de 2001


a 1 ou 2 ou 3 ou 4, b 8 ou
9 ou 10 ou 11, c 15 ou 16 ou
17 ou 18, d 22 ou 23 ou 24
ou 25 e em que e e f juntos so
2 e 4 ou 4 e 2, respectivamente.

607-289-00-8 cido 3-(3-(4-(2,4-bis(1,1-dimetilpro- 410-370-9 105488-33-3 R53 R: 53


pil)fenoxi)butilaminocarbonil- S: 61
-4-hidroxi-1-naftalenil)tio)pro-
panico.
N.o 183 8 de Agosto de 2001
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

607-290-00-3 Mistura (em relao desconhecida 410-540-2 Xi; R38 Xi; N


de: amnio 1-C14-C18-alquiloxi- R43 R: 38-43-50/53
carbonil-2-(3-aliloxi-2-hidroxi- N; R50-53 S: (2-)24-37-60-61
propoxicarbonil)etano-1-sulfo-
nato; amnio 2-C14-C18-alqui-
loxicarbonil-1-(3-aliloxi-2-hi-
droxipropoxicarbonil)etano-1-
-sulfonato.

607-291-00-9 Carboxilato de dodecil-x-(C5/C6- 410-630-1 104051-92-5 R53 R: 53


-cicloalquil)alquilo. S: 61

607-292-00-4 Mistura de: cido [1-(metoxime- 410-640-6 Xi; R38-41 Xi; N


til)-2-(C12-alcoxi)-etoxi]actico; N; R50-53 R: 38-41-50/53
cido [1-(metoximetil)-2-(C14- S: (2-)26-37/39-60-61
-alcoxi)-etoxi]actico.

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


607-293-00-X Mistura de: ter mono-2,4,6-trime- 410-650-0 Xi; R41 Xi; N
tilnonildifenlico de dissulfonato R43 R: 41-43-51/53
de N-aminoetilpiperaznio; ter N; R51-53 S: (2-)26-36/37/39-61
di-2,4,6-trimetilnonildifenlico
de dissulfonato de N-aminoetil-
piperaznio.

607-294-00-5 2-benzoiloxi-1-hidroxietanossulfo- 410-680-4 R43 Xi


nato de sdio. R: 43
S: (2-)24-37

607-295-00-0 Mistura de: fosfonoetano-1,2-di- 410-800-5 R43 Xi; N


carboxilato de tetrassdio; fos- N; R51-53 R: 43-51/53
fonobutano-1,2,3,4-tetracarboxi- S: (2-)24-37-61
lato de hexassdio.

607-296-00-6 Mistura de: tetrasteres de pentae- 410-830-9 R53 R:53


ritriol com cido heptanico e S: 61
cido 2-etilhexanico.

607-297-00-1 cido (E-E)-3,3b-(1,4-fenilendi- 410-960-6 92761-26-7 Xi; R41 Xi


metiliden)bis (2-oxobornano-10- R:41
-sulfnico). S: (2-)26-39

607-298-00-7 2-(trimetilamnio)etoxicarboxi- 411-010-3 R43 Xi

4897
benzeno-4-sulfonato. R: 43
S: (2-)22-36/37
4898
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

607-299-00-2 3-(acetiltio)-2-metil-propanato de 411-040-7 97101-46-7 Xn; R22 Xn; N


metilo. R43 R: 22-43-50/53
N; R50-53 S: (2-)24-37-60-61

607-300-00-6 [2-(5-cloro-2,6-difluoropirimidi- 411-430-7 R43 Xi


na-4-ilamino)-5-(b-sulfamoil- R: 43
-c,d-sulfonatoftalocianina-a-il- S: (2-)22-24-37
-K4,N29,N30,N31,N32-sulfoni-
lamino)benzoato(5-)]cuprato(II)

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


de trissdio em que a=1, 2, 3,
4b=8, 9, 10, 11c=15, 16, 17,
18d=22, 23, 24, 25.

607-301-00-1 Mistura de: cido dodecanico; 411-860-5 Xi; R38-41 Xi; N


steres de poli(1-7)lactato do R43 R: 38-41-43-51/53
cido dodecanico. N; R51-53 S: (2-)24-26-37/39-61

607-302-00-7 Mistura de: cido tetradecanico; 411-910-6 Xi; R38-41 Xi; N


estres de poli(1-7)lactato do R43 R: 38-41-43-51/53
cido tetradecanico. N; R51-53 S: (2-)24-26-37/39-61

607-303-00-2 cido 1-ciclopropil-6,7-diflor-1,4- 413-760-7 93107-30-3 Repr. Cat. 3; R62 Xn


-dihidro-4-oxoquinolina-3-car- R52-53 R: 62-52/53
boxlico. S: (2-)22-36/37-61

608-023-00-3 4-(4-clorofenil)-2-fenil-2-[(1H- 406-140-2 114369-43-6 N; R50-53 N


-1,2,4-triazole-1-il)metil]butano- R: 50/53
nitrilo. S: 60-61

608-024-00-9 2-(4-(N-butil-N-fenetilamino)fe- 407-650-8 97460-76-9 R53 R: 53


nil)etileno-1,1,2-tricarbonitrilo. S: 61

608-025-00-4 2-nitro-4,5-bis(benziloxi)fenilace- 410-970-0 117568-27-1 R53 R: 53


tonitrilo. S: 61

N.o 183 8 de Agosto de 2001


609-053-00-X Hidrazina-tri-nitrometano . . . . . . . 414-850-9 E; R3 E; T
O; R8 R: 45-3-8-23/25-43
Carc. Cat. 2; R45 S: 53-45
T; R23/25
R43

610-010-00-2 2-bromo-1-(2-furil)-2-nitroetileno 406-110-9 35950-52-8 Xn; R22-48/22 C; N


C; R34 R: 22-34-43-48/22-50/53
R43 S: (1/2-)22-26-36/37/39-45-60-61
N; R50-53
N.o 183 8 de Agosto de 2001
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

611-043-00-5 Mistura (2:1:1) de: N(1b)- 402-850-1 Xi; R41 Xi


-N(2):N(1m)-N(2n)-g-6-[2- 52-53 R: 41-52/53
-amino-4-(ou 6]-hidroxi-(ou 4- S: (2-)26-39-61
-amino-2-hidroxi)fenilazo]-6n-
-(1-carbaniloil-2-hidroxiprop-1-
-enilazo)-5b,5m-dissulfamoil-
-3-3n- -dissulfonato-bis(nafta-
leno-2,1b- -azobenzeno-1,2b-dio-
lato-O(1),O(2b))-cromato de tris-
sdio; N(1b)-N(2):N(1m)-N(2n)-
-g-6,6n-bis(1-carbaniloil-2-hidro-
xiprop-1-enilazo)-5b,5m-dissul-
famoil-3,3n-dissulfonatobis(na-
ftaleno-2,1bazobenzeno-1,2b-dio-
lato-O(1),O(2b))-cromato de tris-
sdio: N(1b)-N(2):N(1m)-
-N(2n)-g-6,6n-bis[2-amino-4-
-(ou 6)-hidroxi-(ou 4-amino-2-
-hidroxi)fenilazo]5b,5m-dis-

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


sulfamoil-3,3n-dissulfonato-
bis(naftaleno-2,1bazoben-
zeno-1,2b-diolato-O(1), O(2b))-
-cromato de trissdio.

611-044-00-0 Mistura de: bis[1-[(2-hidroxi-5-ni- 403-720-7 117527-94-3 N; R51-53 N


trofenil)azo]-2-naftaleno- R: 51/53
lato(2-)]-cromato(1-) de terc-al- S: 61
quil (C12-C14)amnio; bis[1-
-[(-hidroxi-4-nitrofenil)azo]-2-
-naftalenolato(2-)]-cromato(1-)
de terc-alquil(C12-C14)amnio;
bis[1-[[5-(1,1-dimetilpropil)-2-
-hidroxi-3-nitrofenil]azo]-2-
-naftalenolato(2-)]-cromato(1-)
de terc-alquil(C1-C14) amnio;
[[1-[(2-hidroxi-5-nitrofenil)azo]-
-2-naftalenolato(2-)]-[1-[(2-hi-
droxi-5-nitrofenil)azo]2-nafta-
lenolato(2-)]]cromato(1-)de
terc-aluil(C12-C14) amnio; [(1-
-[(5-[(1,1-dimetilpropil)-2-
-hidroxi-3-nitrofenil]azo]-2-
-naftalenolato(2-)]-[1-[(2-hi-
droxi-5-nitrofenil]azo]-2-nafta-
lenolato(2-)]]-cromato(1-) de
terc-alquil(C12-C14)amnio;
((1-(4(ou 5)-nitro-2-oxidofeni-
lazo)-2-naftolato)(1-(3-nitro-2-
-oxido-5-pentilfenilazo)-2-nafto-

4899
lato))cromato(1-) de C12-C14-
-terc-alquilamnio.
4900
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

611-045-00-6 2-[4-[N-(4-acetoxibutil)-N-etil] 404-830-8 R53 R: 53


amino-2-metilfenilazo]-3-acetil- S: 61
-5-nitrotiofeno.

611-046-00-1 4,4b-diamino-2-metilazobenzeno 407-590-2 43151-99-1 T; R25 T; N


Xn; R48/22 R: 25-43-48/22-50/53
R43 S: (1/2-)-22-28-36/37-45-60-61
N; R50-53

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


611-047-00-7 Mistura (1:1) de: 2-[[4-[N-etil-N- 407-890-3 111381-11-4 R53 R: 53
-(2-acetoxietil)amino]fenil]azo]- S: 61
-5,6-diclorobenzotiazol; 2-[[4-N-
-etil-N-(2-acetoxietil)amino]fe-
nil]azo]-6,7-diclorobenzotiazol.

611-048-00-2 Mistura (1:1) de: 2-[[4-[bis(2-ace- 407-900-6 111381-12-5 R53 R: 53


toxietil)amino] fenil]azo]-5,6- S: 61
-diclorobenzotiazol; 2-[[4-[bis
(2-acetoxietil)amino]fenil]azo]-
-6,7-diclorobenzotiazol.

611-049-00-8 7-[4-(3-dietilaminopropilamino)-6- 408-000-6 118658-98-3 Xn; R48/22 Xn


-(3-dietilamoniopropilamino)- R43 R: 43-48/22-52/53
-1,3,5-triazin-2-ilamino]-4- R52-53 S: (2-)22-36/37-61
-hidroxi-3-(4-fenilazofenilazo)-
-naftaleno-2-sulfonato, cido
actico, cido lctico (2:1:1).

611-051-00-9 Cloreto de 2-(4-(N-etil-N-(2-hidro- 411-110-7 136213-74-6 N; R50-53 N


xi)etil)amino-2-metilfenil)azo- R: 50/53
-6-metroxi-3-metil-benzotia- S: 60-61
zolio.

611-052-00-4 Complexo de ferro de aqua-[5- 400-720-9 R52-53 R: 52/53


-[[2,4-dihidroxi-5-[(2-hidroxi- S: 61
-3,5-dinitrofenil)azo]fenil]azo]-
-2-naftalenosulfonato] de mo-

N.o 183 8 de Agosto de 2001


nossdio.

612-156-00-2 Mistura de: cloreto de trihexadecil- 405-620-9 Xi; Xi; N


metilamnio; cloreto de dihexa- N; R50-53 R: 41-50/53
decilmetilamnio. S: (2-)26-39-60-61

612-157-00-8 (Z)-1-benzo[b]tieno-2-iletanono- 410-780-8 Xn; R22-48/22 Xn; N


xima cloridrato. Xi; R41 R: 22-41-43-48/22-51/53
R43 S: (2-)22-26-36/37/39-61
N; R51-53
N.o 183 8 de Agosto de 2001
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

612-158-00-3 Mistura de: bis(5-dodecil-2-hidro- 410-820-4 R53 R: 53


xibenzald-oximato) de cobre (II) S: 61
o grupo alqulico C12 ramifi-
cado; 4-dodecilsalicilaldoxima.

612-159-00-9 Produtos de reaco de: trimetilhe- 410-880-1 Xn; R22 C; N


xametilene diamina (mistura de C; R34 R: 22-34-50/53
2,2,4-trimetil-1,6-hexanodiamina e N; R50-53 S: (1/2-)23-26-36/37/39-45-60-61
2,4,4-trimetil-1,6-hexanodiamina,
catalogada no EINECS). Epxi-
do 8 (derivados de mono[(C10-
-C16-alquiloxi)metil]oxirane) e
cido p-tolueno-sulfnico.

613-149-00-7 2-terc-butil-5-(4-terc-butilbenzil- 405-700-3 96489-71-3 T; R23/25 T; N


tio)-4-cloropiridazina-3(2H)- N; R50-53 R: 23/25-50/53
-ona. S: (1/2-)36/37-45-60-61

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


613-150-00-2 2,2b-[3,3b-(piperazina-1,4-diil)di- 406-295-6 R53 R: 53
propil]bis (1H-benzimidazo S: 61
[2,1-b]benzo[l,m,n][3,8]fenan-
trolina-1,3,6-triona.

613-151-00-8 1-(3-mesiloxi-5-tritiloxi-2-D-treo- 406-360-9 104218-44-2 R53 R: 53


furil)timina. S: 61

613-152-00-3 N-(4,6-dimetoxipirimidina-2-il)car- 406-600-2 89392-03-0 R43 Xi; N


bamato de fenilo. N; R51-53 R: 43-51/53
S: (2-)24-37-61

613-153-00-9 2,3,5-tricloropiridina . . . . . . . . . . . . 407-270-2 16063-70-0 R52-52 R: 52/53


S: 61

613-154-00-4 2-amino-4-cloro-6-metoxipirimi- 410-050-9 5734-65-5 Xn; R22 Xn


dina. R: 22
S: (2-)22

613-155-00-X 5-cloro-2,3-difluorpiridina . . . . . . . 410-090-7 89402-43-7 R10 Xn


Xn; R22 R: 10-22-52/53
R52-53 S: (2-)23-36-61

613-156-00-5 2-butil-4-cloro-5-formilimidazole 410-260-0 83857-96-9 R43 Xi; N

4901
N; R51-53 R: 43-51/53
S: (2-)24-37-61
4902
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

613-157-00-0 2,4-diamino-5-metoximetilpirimi- 410-330-0 54236-98-5 Xn; R22-48/22 Xn


dina. Xi; R36 R: 22-36-48/22
S: (2-)22-26-36

613-158-00-6 2,3-dicloro-5-trifluorometil-piri- 410-340-5 69045-84-7 Xn; R20/22 Xn; N


dina. Xi; R41 R: 20/22-41-43-51/53
R43 S: (2-)24-26-37/39-61
N: R51-53

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


613-159-00-1 4-[2-[4-(1,1-dimetiletil)fenil]eto- 410-580-0 120928-09-8 T; R25 T; N
xi]quinazolina. Xn; R20 R: 20-25-50/53
N; R50-53 S: (1/2-)37-45-60-61

613-160-00-7 (IS)-2-metil-2,5-diazobiciclo[2,2,1] 411-000-9 125224-62-6 R43 Xi


heptano dibromoidrato. R: 43
S: (2-)24-37

615-022-00-1 3-isocianatossulfonil-2-tiofeno-car- 410-550-7 79277-18-2 E; R2 E; Xn


boxilato de metilo. R14 R: 2-14-42/43-48/22
Xn; R48/22 S: (2-)22-30-35-36/37
R42/43

615-023-00-7 Metil ster do cido 2-(isocianatos- 410-900-9 83056-32-0 R10 Xn


sulfonilmetil)benzico. R14 R: 10-14-20-40-41-42-48/22
Muta. Cat. 3; R40 S: (2-)23-26-36/37/39
Xn; R20-48/22
Xi; R41
R42

616-044-00-4 N-(3,5-dicloro-4-etil-2-hidroxife- 402-510-2 N; R51-53 N


nil)-2-(3-pentadecilfenoxi)-buta- R: 51/53
namida. S: 61

616-045-00-X 2b-(4-cloro-3-ciano-5-formil-2-tie- 405-190-2 122371-93-1 R43 Xi


nilazo)-5b-dietilamino-2-meto- R53 R: 43-53
xiacetanilida. S: (2-)22-24-37-61

N.o 183 8 de Agosto de 2001


616-046-00-5 N-(2-(6-cloro-7-metilpirazolo(1,5- 406-390-2 N; R50-53 N
-b)-1,2,4-triazolo-4-il)propil)- R: 50/53
-2-(2,4-di-terc-pentilfenoxi)octa- S: 60-61
namida.

616-047-00-0 Mistura de: 2,2b,2n,2m-etilenodi- 406-640-0 R43 Xi


nitrilotetraquis-N,N-di(C16)al- R: 43
quiloacetamida; 2,2b,2n,2m- S: (2-)24-37
-(etilenodinitrilotetraquis-N,N-
-di(C18)alquiloacetamida.
N.o 183 8 de Agosto de 2001
Notas Notas
Nmero
explicativas explicativas
de Designao qumica Nmero CE Nmero CAS Classificao Rotulagem Limites de concentrao
sobre as sobre as
ndice
substncias preparaes

616-048-00-6 3b-trifluorometilisobutiranilida . . . 406-740-4 1939-27-1 Xn; R48/22 Xn; N


N; R51-53 R: 48/22-51/53
S: (2-)22-36-61

616-049-00-1 2-(2,4-bis(1,1-dimetiletil)fenoxi)- 408-150-2 99141-89-6 R53 R: 53


-N-(3,5-dicloro-4-etil-2-hidroxi- S: 61
fenil)-hexanamida.

616-050-00-7 N-[2,5-dicloro-4-(1,1,2,3,3,3-hexa- 410-690-9 103055-07-8 R43 Xi; N


fluoro-propoxi)-fenil-aminocar- N; R50-53 R: 43-50/53
bonil]-2,6-difluorbenzamida. S: (2-)24-37-60-61

616-051-00-2 Mistura de: 2,4-bis(Nb-(4-metilfe- 411-070-0 R53 R: 53


nil)-ureido)-tolueno; 2,6-bis(Nb- S: 61
-(4-metilfenil)-ureido)-tolueno.

DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A


617-015-00-9 bis(4-metilbenzoil)perxido . . . . . . 407-950-9 895-85-2 E; R2 E; N
O; R7 R: 2-7-50/53
N; R50-53 S: (2-)7-14-36/37/39-47-60-61

650-032-00-X Ciproconazole (ISO) . . . . . . . . . . . 94361-06-5 Repr. Cat. 3; R63 Xn; N


(2RS,3RS; 2RS,3RS)-2-(4-cloro- Xn; R22 R: 22-50/53-63
fenil)-3-ciclopropil-1-(1H-1,2,4- N; R50-53 S: (2-)36/37-60-61
-triazol-1-il)butano-2-ol.

4903
4904 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

ANEXO IV
B.10 Mutagenicidade Ensaio in vitro de aberraes cromossmicas em mamferos
1 Mtodo
O presente mtodo idntico ao mtodo OCDE TG 473 Ensaio in vitro de aberraes cromossmicas
em mamferos (1997).

1.1 Introduo
O objectivo do ensaio in vitro de aberraes cromossmicas identificar os agentes que causam aber-
raes estruturais dos cromossomas em culturas de clulas de mamferos (1) (2) (3). As aberraes
estruturais podem ser de dois tipos, afectando os cromossomas ou os cromatdeos. A maior parte
dos mutagneos qumicos induzem aberraes cromatdicas, mas tambm podem ocorrer aberraes
cromossmicas. Um aumento da taxa de poliploidia pode indicar que um determinado produto qumico
tem potencial para induzir aberraes numricas. Contudo, este mtodo no foi concebido para medir
as aberraes numricas nem normalmente utilizado com esse objectivo. As mutaes nos cromossomas
e eventos relacionados causam diversas doenas genticas humanas, existindo provas substanciais de
que as alteraes que causam nos oncogenes e nos genes supressores de tumores das clulas somticas
esto envolvidas na induo de cancro nos seres humanos e em animais utilizados em experincias.
O ensaio in vitro de aberraes cromossmicas pode envolver culturas de linhas celulares bem esta-
belecidas, de uma determinada estirpe ou ainda culturas de clulas primrias. As clulas utilizadas
so seleccionadas com base na sua capacidade de crescimento em cultura, na estabilidade do caritipo,
no nmero e diversidade dos seus cromossomas e na frequncia das aberraes cromossmicas
espontneas.
Os ensaios in vitro exigem geralmente a utilizao de uma fonte exgena de activao metablica,
que no consegue imitar inteiramente as condies in vivo nos mamferos. Deve ter-se o cuidado
de evitar condies que conduzam a resultados positivos que no sejam reflexo de uma mutagenicidade
intrnseca mas que possam resultar, por exemplo, de mudanas do pH, da presso osmtica ou ainda
de nveis elevados de citotoxicidade (4) (5).
O presente ensaio utilizado para a anlise de agentes eventualmente mutagneos ou carcinogneos
para os mamferos. Muitos dos compostos que do um resultado positivo no presente ensaio so
carcinogneos nos mamferos, no existindo, contudo, uma correlao perfeita entre o ensaio e a
carcinogenicidade. A correlao depende da classe qumica e existem cada vez mais provas de que
alguns agentes carcinogneos no so detectados por este ensaio, por os seus mecanismos de actuao
no passarem directamente pela danificao do ADN.
V., tambm, a parte B da introduo geral.

1.2 Definies
Aberrao cromatdica: leso estrutural de um cromossoma expressa na ruptura, ou na ruptura seguida
de unio, de cromatdeos simples.
Aberrao cromossmica: leso estrutural de um cromossoma expressa na ruptura, ou na ruptura seguida
de unio, de ambos os cromatdeos no mesmo local.
Endoreduplicao: processo mediante o qual, na sequncia de um perodo S de replicao do ADN,
o ncleo no sofre mitose, iniciando-se um novo perodo S, que resulta em cromossomas com 4,
8, 16, . . . cromatdeos.
Lacuna: leso acromtica de extenso inferior largura de um cromatdeo e que determine um ligeiro
desalinhamento do mesmo.
ndice mittico: relao entre o nmero de clulas em metafase e o nmero total de clulas observadas
numa populao de clulas, que fornece uma indicao do grau de proliferao da populao em
causa.
Aberrao numrica: alterao do nmero de cromossomas relativamente ao nmero de cromossomas
caracterstico das clulas utilizadas.
Poliploidia: nmero de cromossomas mltiplo do nmero haplide (n), mas diferente do nmero diplide
(ou seja, 3n, 4n, etc.).
Aberrao estrutural: alterao da estrutura dos cromossomas detectvel por exame microscpico das
clulas em metafase, na forma de supresso de segmentos, de alteraes de partes da sequncia ou
da troca de segmentos num cromatdeo ou entre cromatdeos.

1.3 Princpio do mtodo de ensaio


As culturas celulares so expostas substncia em estudo tanto na presena como na ausncia de
um sistema de activao metablica. Aps um perodo determinado, adiciona-se um produto fixador
da metafase (por exemplo Colcemidd ou colchicina); as clulas so colhidas, coradas e analisadas
microscopicamente para detectar a presena de aberraes cromossmicas nas clulas em metafase.
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4905

1.4 Descrio do mtodo de ensaio


1.4.1 Preparao

1.4.1.1 Clulas
Podem utilizar-se diversas linhas celulares, estirpes ou culturas celulares primrias, incluindo clulas
humanas (por exemplo: fibroblastos do hamster da China ou linfcitos da circulao perifrica do
ser humano ou de outros mamferos).

1.4.1.2 Meios e condies de cultura


As culturas devem ser mantidas em meios de cultura e condies de incubao adequados (tipo de
recipiente, concentrao de CO2, temperatura e humidade). As linhas celulares e estirpes devem ser
periodiamente controladas no que respeita estabilidade do nmero modal de cromossomas e
ausncia de contaminao por micoplasma, no devendo ser utilizadas se se verificar que foram con-
taminadas. Deve ser conhecida a durao do ciclo celular normal para as clulas e condies de
cultura utilizadas.

1.4.1.3 Preparao das culturas


Linhas e estirpes de clulas definidas: multiplicam-se as clulas provenientes de culturas de arranque
por incubao a 37oC num meio cuja densidade no permita a confluncia das culturas antes da
colheita.
Linfcitos: adiciona-se sangue total tratado com anticoagulante (por exemplo: heparina) ou linfticos
provenientes de indivduos saudveis a um meio de cultura contendo um agente mitognico (por
exemplo: fito-hemoglutinina), incubando a 37oC.

1.4.1.4 Activao metablica


As clulas devem ser expostas substncia em estudo tanto na presena como na ausncia de um
sistema adequado de activao metablica. O sistema mais frequentemente utilizado consiste numa
fraco ps-mitocondrial reforada com co-factor (S9) preparada a partir de fgados de roedores tratados
com agentes de induo enzimtica, como por exemplo Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9) ou uma mistura
de fenobarbitona e b-naftoflavona (10) (11) (12).
A fraco ps-mitocondrial geralmente utilizada em concentraes na gama dos 1 %-10 % v/v no
meio de ensaio final. O estado do sistema de activao metablica pode depender da classe dos
produtos qumicos em estudo. Em alguns casos pode revelar-se adequado utilizar vrias concentraes
diferentes de fraco ps-mitocondrial.
Progressos tais como a elaborao por engenharia gentica de linhas celulares que exprimam enzimas
de activao especficos oferecem possibilidades de activao endgena. A escolha das linhas celulares
a utilizar ter de ser cientificamente justificada (por exemplo: pela relevncia do isoenzima de citocromo
P450 para o metabolismo da substncia em estudo).

1.4.1.5 Substncia em estudo/preparao


As substncias slidas devem ser dissolvidas ou suspensas em solventes ou veculos adequados e,
se necessrio, diludas antes de serem adicionadas s clulas. As substncias lquidas podem ser adi-
cionadas directamente aos sistemas em estudo e ou diludas antes de serem adicionadas s clulas.
Devem ser utilizadas preparaes frescas da substncia em estudo, a menos que os dados de estabilidade
demonstrem que o respectivo armazenamento no coloca problemas para o ensaio.

1.4.2 Condies de ensaio

1.4.2.1 Solvente/veculo
O solvente/veculo no deve reagir com a substncia em estudo, devendo ser compatvel com a sobre-
vivncia das clulas e com a actividade da mistura S9. Caso se utilizem solventes/veculos cujas pro-
priedades no se encontrem totalmente elucidadas, devem fornecer-se dados que justifiquem a sua
compatibilidade. Sempre que possvel, recomenda-se a utilizao de solventes/veculos aquosos. Quando
forem realizados ensaios de substncias instveis na presena de gua, os solventes orgnicos utilizados
devem ser anidros. A gua poder ser removida atravs de um filtro molecular.

1.4.2.2 Concentraes de exposio


A citotoxidade, a solubilidade no sistema de ensaio e as alteraes do pH ou da presso osmtica
constituem alguns dos critrios a ter em conta na determinao da concentrao mxima.
A citotoxidade deve ser determinada na experincia principal tanto na presena como na ausncia
de um sistema de activao metablica, por recurso a um indicador adequado da integridade e do
crescimento celulares, nomeadamente o grau de confluncia, as contagens de clulas viveis ou o
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ndice mittico. Poder ser til determinar previamente a citotoxicidade e solubilidade atravs de
uma experincia preliminar.
Devem utilizar-se pelo menos trs concentraes analisveis. No caso de substncias que sejam cito-
txicas, as concentraes utilizadas devem abranger uma gama compreendida entre a toxicidade mxima
e uma toxicidade reduzida ou nula; o que significa geralmente que as concentraes devem variar
num factor de 2 a kl 10. No momento da colheita, a concentrao mxima deve determinar uma
reduo significativa (superior a 50 %) do grau de confluncia, da contagem de clulas viveis e do
ndice mittico. O ndice mittico constitui uma medida indirecta dos efeitos citotxicos/citostticos,
dependendo do tempo decorrido aps a exposio. Todavia, a sua utilizao aceitvel no caso de
culturas em suspenso, em que os restantes mtodos de determinao da toxicidade podem revelar-se
fastidiosos ou impraticveis. Os dados relativos cintica do ciclo celular, nomeadamente o tempo
mdio de gerao (TMG), podem ser utilizados como informao suplementar. O TMG constitui,
no entanto, uma mdia global, que nem sempre permite identificar a existncia de subpopulaes
com um crescimento menos rpido, podendo acontecer em alguns casos que ligeiros aumentos do
TMG possam resultar em atrasos muito substanciais no que respeita ao surgimento de aberraes.
No caso de substncias sem efeitos citotxicos considerveis, a concentrao mxima do ensaio deve
ser a mais baixa de 5 ml/ml, 5 mg/ml ou 0,01 M.
Para substncias relativamente insolveis que no sejam txicas em concentraes inferiores con-
centrao insolvel, a dose mxima a utilizar deve corresponder a uma concentrao acima do limite
de solubilidade no meio de cultura final aps o perodo de exposio. Em alguns casos (por exemplo:
quando a toxicidade apenas ocorre em concentraes superiores menor concentrao insolvel)
conveniente ensaiar mais de uma concentrao com precipitao visvel. Poder ser til avaliar
a solubilidade no incio e no fim da exposio, uma vez que a mesma se pode alterar durante a
exposio no sistema de ensaio devido presena de clulas, de S9, de soro, etc. A insolubilidade
pode ser detectada vista desarmada. O precipitado no deve interferir com as contagens necessrias.

1.4.2.3 Controlos negativos e positivos


Cada experincia deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente/veculo), tanto
na presena como na ausncia de um sistema de activao metablica. Quando for utilizada activao
metablica, o produto qumico de controlo positivo deve ser o mesmo que exige a activao para
dar uma resposta mutagnica.
Para os controlos positivos deve ser utilizado um agente clastognico conhecido aos nveis de exposio
esperados, de forma a obter um aumento detectvel e reprodutvel ao longo do tempo que permita
demonstrar a sensibilidade do sistema de ensaio.
As concentraes do controlo positivo devem ser escolhidas de modo que os seus efeitos sejam claros,
devendo ser utilizadas lminas codificadas de forma que no sejam imediatamente identificveis pela
pessoa que procede leitura. As substncias de controlo positivo podem ser, por exemplo:

Condio de activao metablica Substncia Nmero CAS Nmero EINECS

Ausncia de activao metablica exgena . . . . . Metanossulfonato de metilo . . . 66-27-3 200-625-0


Metanossulfonato de etilo . . . . . 62-50-0 200-536-7
Etil nitrosureia . . . . . . . . . . . . . . 759-73-9 212-072-2
Mitomicina C . . . . . . . . . . . . . . . 50-07-7 200-008-6
N-xido de 4-nitroquinolina . . . 56-57-5 200-281-1

Presena de activao metablica exgena . . . . . Benzo[a]pireno . . . . . . . . . . . . . . 50-32-8 200-028-5


Ciclofosfamida . . . . . . . . . . . . . . 50-18-0 200-015-4
Ciclofosfamida monohidrato . . . 6055-19-2

Podem utilizar-se no controlo positivo outras substncias adequadas. A possibilidade de utilizao


de produtos qumicos de uma classe afim para o controlo positivo deve ser considerada, quando existam.
Para cada colheita devem tambm realizar-se controlos negativos, em que as clulas so expostas
apenas ao solvente ou veculo e ao meio de tratamento, procedendo-se do mesmo modo que num
ensaio normal. Alm disso, devem igualmente ser utilizados controlos no expostos substncia em
estudo, a menos que j existam dados de controlo que demonstrem que o solvente escolhido no
induz nenhum efeito deletrio ou mutagnico.

1.4.3 Procedimento
1.4.3.1 Exposio substncia em estudo
As clulas em crescimento so expostas substncia em estudo na presena e na ausncia de um
sistema de activao metablica. Os linfcitos devem ser expostos substncia em estudo cerca de
48 horas aps o estmulo mitognico.
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1.4.3.2 Normalmente, devem ser utilizadas culturas em duplicado para cada concentrao, sendo fortemente
recomendada a utilizao de culturas em duplicado tambm para os controlos negativos/solventes.
Quando puder ser demonstrado, a partir dos dados de experincias anteriores, que a diferena entre
as culturas duplicadas mnima (13) (14), pode aceitar-se a utilizao de uma nica cultura para
cada concentrao.
As substncias gasosas ou volteis devem ser ensaiadas por mtodos apropriados, por exemplo em
recipientes selados (15) (16).

1.4.3.3 Intervalo de amostragem das culturas


No primeiro ensaio, as clulas so expostas substncia em estudo, na presena e na ausncia de
um sistema de activao metablica, durante 3-6 horas, sendo colhidas a intervalos equivalentes a
cerca de 1,5 ciclos celulares normais, a partir do incio da exposio (12). Se este protocolo der resultados
negativos tanto na presena como na ausncia de um sistema de activao, deve ser realizada uma
experincia adicional sem activao, com exposio em contnuo at colheita, passado um tempo
equivalente a 1,5 ciclos celulares normais. Certos produtos qumicos podem ser detectados mais facil-
mente com tempos de exposio/colheita superiores a 1,5 ciclos celulares. Os resultados negativos
com activao metablica tero de ser confirmados caso a caso. Nos casos em que a confirmao
dos resultados negativos no seja considerada necessria, deve ser apresentada uma justificao.

1.4.3.4 Preparao dos cromossomas


As culturas de clula so tratadas com Colcemidd ou colchicina, geralmente durante 1-3 horas antes
da colheita. Procede-se colheita individual das culturas e ao respectivo processamento, com vista
preparao dos cromossomas, que inclui o tratamento hipotnico das clulas, seguido de fixao
e colorao.

1.4.3.5 Anlise
Todas as lminas, incluindo as provenientes dos lotes de controlo positivo e negativo, devem ser
independentemente codificadas antes da anlise microscpica. Uma vez que os processos de fixao
do frequentemente lugar ruptura de uma determinada proporo das clulas em metafase, com
perda dos cromossomas, as clulas contabilizadas devem apresentar, para todos os tipos de clula,
um nmero de centrmeros igual ao nmero modal 2. Devem ser contabilizadas pelo menos 200 meta-
fases com uma boa distribuio para cada concentrao e para o controlo, com boa concordncia
entre os replicados, quando existam. Esse nmero pode ser inferior caso se observe um nmero elevado
de aberraes.
Embora o objectivo do ensaio consista na deteco de aberraes cromossmicas estruturais, devem
registar-se os casos de poliploidia e de endoreduplicao, quando ocorram.

2 Dados
2.1 Tratamento dos resultados
A unidade experimental a clula, pelo que se deve avaliar a percentagem de clulas que apresentam
uma aberrao cromossmica estrutural. Os diferentes tipos de aberrao cromossmica estrutural
devem ser enumerados e discriminados pelo seu nmero e frequncia nas culturas experimentais e
de controlo. A ocorrncia de lacunas registada em separado e includa no relatrio, mas no
geralmente contabilizada para o clculo da frequncia total das aberraes.
Durante a experincia principal para a deteco de aberraes devem ser igualmente registadas as
medies da citotoxicidade realizadas em paralelo com os ensaios, para todas as culturas de controlo
e para os casos de resposta negativa.
Devem ser fornecidos dados individuais para cada cultura, para alm de um quadro com o resumo
dos dados globais.
No necessrio comprovar uma reaco positiva inequvoca. Os resultados ambguos devem ser
esclarecidos atravs de experincias adicionais, de preferncia com modificao das condies expe-
rimentais. A necessidade de confirmar os resultados negativos j foi discutida no ponto 1.4.3.3. As
experincias subsequentes devem contemplar a modificao dos parmetros de estudo, por forma
a alargar a gama de condies avaliadas. Os parmetros de estudo que podem ser alterados incluem
a gama e os intervalos entre as diferentes concentraes e as condies da activao metablica.

2.2 Avaliao e interpretao dos resultados


Existem vrios critrios para determinar um resultado positivo, nomeadamente o aumento do nmero
de clulas com aberraes cromossmicas relacionado com a concentrao ou que seja reprodutvel.
Deve atender-se, antes de mais, importncia biolgica dos resultados. Como auxlio para a avaliao
dos resultados dos ensaios, podero ser utilizados mtodos estatsticos (3) (13), embora a significncia
estatstica no deva ser o nico elemento para a determinao de uma resposta positiva.
Um aumento do nmero de clulas poliplides pode indicar que a substncia em estudo apresenta
o potencial de inibir a mitose e de induzir aberraes cromossmicas numricas. Um aumento do
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nmero de clulas com cromossomas endoreduplicados pode indicar que a substncia em estudo apre-
senta o potencial de inibir a progresso do ciclo celular (17) (18).
Uma substncia cujos resultados no cumpram os critrios supra considerada no mutagnica para
o sistema em causa.
Embora a maioria de experincias tenha resultados claramente positivos ou negativos, em casos raros
o conjunto dos dados no permitir que se obtenha uma opinio inequvoca sobre a actividade da
substncia em estudo, podendo acontecer que os resultados continuem a ser ambguos ou duvidosos,
independentemente do nmero de vezes que a experincia seja repetida.
Um resultado positivo no ensaio in vitro de aberraes cromossmicas indica que a substncia em
estudo induz aberraes cromossmicas estruturais nas clulas somticas de mamferos em cultura.
Um resultado negativo indica que, nas condies do ensaio, a substncia em estudo no induz aberraes
cromossmicas estruturais nas clulas somticas de mamferos em cultura.

3 Apresentao de relatrios
Relatrio de ensaio
O relatrio de ensaio deve incluir a seguinte informao:
Solvente/veculo:
justificao para a escolha do veculo;
solubilidade e estabilidade da substncia em estudo no solvente/veculo, se conhecida.

Clulas:
tipo e origem das clulas;
caractersticas do caritipo e adequao do tipo de clulas utilizado;
ausncia de micoplasma, quando aplicvel;
informao sobre a durao do ciclo celular;
sexo dos dadores de sangue, sangue completo ou linfcitos, agente mitognico utilizado;
nmero de passagens, quando aplicvel;
mtodos de manuteno da cultura celular, quando aplicvel;
nmero modal de cromossomas.

Condies de ensaio:
identificao e concentrao da substncia que pra a metafase, durao da exposio da clula;
justificao para a seleco das concentraes e do nmero de culturas, incluindo, por exemplo,
dados sobre a citotoxicidade e sobre as limitaes de solubilidade, quando disponveis;
concentrao da substncia em estudo;
volumes adicionados do veculo e da substncia em estudo;
temperatura de incubao;
tempo de incubao;
durao da exposio;
densidade celular da cultura de arranque, quando aplicvel;
tipo e composio do sistema de activao metablica, incluindo critrios de aceitabilidade;
controlos positivos e negativos;
mtodos de preparao das lminas;
critrios de contabilizao das aberraes;
nmero de clulas em metafase analisadas;
mtodos de determinao da toxicidade;
critrios definidos para que o estudo seja considerado positivo, negativo ou no conclusivo.

Resultados:
sinais de toxicidade, ou seja, grau de confluncia, dados relativos ao ciclo celular, contagens de
clulas, ndice mittico;
sinais de precipitao;
dados sobre o pH e a presso osmtica do meio de tratamento, caso tenham sido determinados;
definio das aberraes observadas, incluindo as lacunas;
nmero de clulas em que se observa uma aberrao cromossmica e tipo dessas aberraes,
discriminados para cada cultura exposta e de controlo;
alteraes da ploidia, quando observadas;
relao dose-resposta, quando seja possvel de determinar;
anlise estatstica, quando tenha sido realizada;
dados relativos ao controlo negativo (solvente/veculo) e positivo realizados em paralelo com o
ensaio;
dados histricos sobre o controlo negativo (solvente/veculo) e positivo, com as respectivas gamas,
valores mdios e desvios-padro.

Discusso dos resultados.


Concluses.
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4 Bibliografia
(1) Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens, in Chemical mutagens,
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(10) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M.,
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(11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K., and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polych-
lorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J., Fouts,
J. R., Berid., J. R., and Philpot, R. M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing,
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(12) Galloway, S. M., Aardema, M. J., lshidate, M. Jr., Iven, J. L., Kirkland, D. J., Morita, T., Mosesso,
P., Sofuni, T. (1994), Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aber-
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(13) Richardson, C., Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., Chanter, D. O., and Phillips, B. (1989),
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(15) Krahn, D. F., Barsky, F. C., and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation
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(16) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P., and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure
System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the
CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801.
(17) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced
G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403-413.
(18) Huang, Y., Change, C., and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese
hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.

ANEXO V
B.11 Mutagenicidade Ensaio in vivo de aberraes cromossmicas em clulas da medula de mamferos
1 Mtodo
O presente mtodo idntico ao mtodo OCDE TG 475 Ensaio de aberraes cromossmicas
em clulas da medula de mamferos (1977).

1.1 Introduo
O ensaio de aberraes cromossmicas em clulas da medula de mamferos utilizado para a deteco
de aberraes cromossmicas estruturais induzidas pela substncia em estudo em clulas da medula
de animais geralmente roedores (1) (2) (3) (4). As aberraes estruturais podem ser de dois tipos,
afectando os cromossomas ou os cromatdeos. A maior parte dos mutagneos qumicos induzem aber-
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raes cromatdicas, mas tambm podem ocorrer aberraes cromossmicas. Um aumento da taxa
de poliploidia pode indicar que um determinado produto qumico tem potencial para induzir aberraes
numricas. As mutaes cromossmicas e eventos relacionados causam diversas doenas genticas
humanas, existindo provas substanciais de que as alteraes que causam nos oncogenes e nos genes
supressores de tumores das clulas somticas esto envolvidas na induo de cancro nos seres humanos
e em animais utilizados em experincias.
Os animais utilizados no presente ensaio so geralmente roedores. A medula o tecido objectivo
do ensaio, por se tratar de um tecido altamente vascularizado e que contm uma populao de clulas
com grande ritmo de duplicao e que podem ser facilmente isoladas e processadas. O presente mtodo
no se destina aplicao noutras espcies animais ou tecidos objectivo.
O presente ensaio de aberraes cromossmicas particularmente relevante para a avaliao dos
riscos mutagnicos, uma vez que permite tomar em considerao os factores do metabolismo in vivo,
da farmacocintica e dos processos de reparao do ADN, embora estes possam variar de espcie
para espcie e de tecido para tecido. Os ensaios in vivo so igualmente teis para a investigao
complementar de efeitos mutagnicos detectados atravs de ensaios in vitro.
Se existirem provas de que nem a substncia em estudo nem nenhum dos seus metabolitos reactivos
entram em contacto com o tecido objectivo, o presente ensaio no apropriado.
V. tambm a parte B da introduo geral.

1.2 Definies

Aberrao cromatdica: leso estrutural de um cromossoma expressa na ruptura, ou na ruptura seguida


de unio, de cromatdeos simples.
Aberrao cromossmica: leso estrutural de um cromossoma expressa na ruptura, ou na ruptura seguida
de unio, de ambos os cromatdeos no mesmo local.
Endoreduplicao: processo no qual, aps um perodo S de replicao do ADN, o ncleo no entra
em mitose iniciando um novo perodo S. O resultado so cromossomas com 4, 8, 16, . . . cromatdeos.
Lacuna: leso acromtica de extenso inferior largura de um cromatdeo e que determine um ligeiro
desalinhamento do mesmo.
Aberrao numrica: alterao do nmero de cromossomas relativamente ao nmero de cromossomas
caracterstico das clulas utilizadas.
Poliploidia: nmero de cromossomas mltiplo do nmero haplide (n), mas diferente do nmero diplide
(ou seja, 3n, 4n, etc.).
Aberrao estrutural: alterao da estrutura dos cromossomas detectvel por exame microscpico das
clulas em metafase, na forma de supresso de segmentos, de alteraes de partes da sequncia ou
da troca de segmentos num cromatdeo ou entre cromatdeos.

1.3 Princpio do mtodo de ensaio

Os animais so expostos substncia em estudo atravs de um modo de exposio apropriado, sendo


sacrificados passado o tempo necessrio aps a exposio. Antes do sacrifcio, os animais so tratados
com um produto fixador da metafase (por exemplo: colchicina ou Colcemidd). Seguidamente, so
feitas preparaes de cromossomas a partir das clulas de medula onde, aps colorao, as clulas
em metafase so analisadas para deteco de aberraes cromossmicas.

1.4 Descrio do mtodo de ensaio

1.4.1 Preparao

1.4.1.1 Seleco das espcies animais


Geralmente, so utilizados ratos, ratazanas ou hamsters chineses, embora possa ser utilizada qualquer
outra espcie de mamfero apropriada. Devem ser utilizados animais adultos saudveis jovens das
raas de laboratrio mais comuns. No incio do estudo, a variao de peso entre os animais deve
ser mnima, no devendo exceder 20 % do peso mdio de cada sexo.

1.4.1.2 Condies de acomodao e alimentao


Devem ser aplicadas as condies gerais referidas na introduo geral, parte B, embora o objectivo
para a humidade deva ser de 50 %-60 %.

1.4.1.3 Preparao dos animais


Os animais adultos saudveis jovens so distribudos aleatoriamente pelos grupos de controlo e pelos
grupos expostos. As gaiolas devem ser dispostas de modo que eventuais, efeitos devidos respectiva
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colocao sejam minimizados. Os animais so identificados de forma inequvoca, devendo ser acli-
matados s condies de laboratrio durante pelo menos cinco dias.

1.4.1.4 Preparao das doses


As substncias slidas devem ser dissolvidas ou suspensas em solventes ou veculos adequados e,
se necessrio, diludas antes de serem adicionadas s clulas. As substncias lquidas podem ser adi-
cionadas directamente aos sistemas em estudo e ou diludas antes de serem adicionadas s clulas.
Devem ser utilizadas preparaes frescas da substncia em estudo, a menos que os dados de estabilidade
demonstrem que o respectivo armazenamento no coloca problemas para o ensaio.

1.4.2 Condies do ensaio

1.4.2.1 Solvente/veculo
O solvente/veculo no deve reagir com a substncia em estudo nem produzir efeitos txicos nas
doses utilizadas. Caso se utilizem solventes/veculos cujas propriedades no se encontrem totalmente
elucidadas, devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que possvel,
recomenda-se a utilizao de solventes/veculos aquosos.

1.4.2.2 Controlos
Cada experincia deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente/veculo) para cada
sexo. Com excepo da exposio substncia em estudo, todos os animais, incluindo os dos grupos
de controlo, devem ser manuseados de forma idntica.
Os controlos positivos devem produzir aberraes estruturais in vivo aos nveis a que se espera o
surgimento de um aumento detectvel em relao linha de base. A dose a administrar para o controlo
positivo deve ser escolhida de modo que os seus efeitos sejam claros mas tambm a que as lminas
codificadas no sejam imediatamente identificadas pela pessoa que procede s leituras. aceitvel
que o controlo positivo seja administrado por uma via diferente da substncia em estudo e que s
seja realizada uma amostra. A possibilidade de utilizao de produtos qumicos de uma classe relacionada
para o controlo positivo deve ser considerada, quando existam. As substncias de controlo positivo
podem incluir, por exemplo:

Substncia Nmero CAS Nmero EINECS

Metanossulfonato de etilo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62-50-0 200-536-7


Etilnitrosureia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 759-73-9 212-072-2
Mitomicina C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50-07-7 200-008-6
Ciclofosfamida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50-18-0 200-015-4
Ciclofosfamida monohidrato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6055-19-2
Trietilenomelamina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51-18-3 200-083-5

Para cada colheita devem tambm realizar-se controlos negativos, em que os animais so expostos
apenas ao solvente ou veculo, procedendo-se do mesmo modo que num ensaio normal, a menos
que existam dados histricos de controlo aceitveis em relao variabilidade de animal para animal
e frequncia da ocorrncia de clulas com aberraes cromossmicas. Se s estiver prevista uma
amostra dos controlos negativos, a altura mais apropriada a primeira amostra. Alm disso, devem
igualmente ser utilizados controlos no expostos substncia em estudo, a menos que j existam
dados de estudos anteriores ou publicados que mostrem que o solvente/veculo escolhido no induz
nenhum efeito deletrio ou mutagnico.

1.5 Procedimento

1.5.1 Nmero e sexo dos animais

Cada grupo de estudo e de controlo deve incluir pelo menos cinco animais analisveis por sexo.
Se no momento do estudo existirem dados disponveis de estudos com as mesmas espcies e com
utilizao da mesma via de administrao que demonstrem que no h qualquer diferena substancial
da toxicidade entre os sexos, ser suficiente testar um nico sexo. Nos casos em que a exposio
humana aos produtos qumicos possa ser especfica a cada sexo, como acontece com alguns produtos
farmacuticos, o ensaio deve ser executado com animais do sexo em causa.

1.5.2 Programao do tratamento

As substncias de ensaio so preferivelmente administradas numa nica exposio, podendo igualmente


ser administradas numa dose dividida, ou seja, duas exposies no mesmo dia. Separadas por apenas
algumas horas, para facilitar a administrao de grandes volumes. Qualquer outro regime de admi-
nistrao ter de ser cientificamente justificado.
4912 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

Devem ser colhidas duas amostras separadas, aps exposio durante um dia. Para os roedores, a
primeira amostra deve ser colhida 1,5 ciclos celulares normais (que normalmente de 12-18 horas)
aps a exposio. Dado que o tempo necessrio para a absoro e metabolismo da substncia em
estudo, bem como o seu efeito sobre a cintica do ciclo celular, podem afectar o momento ptimo
para a deteco de uma eventual aberrao cromossmica, recomenda-se a recolha de uma segunda
amostra 24 horas aps a primeira. Se forem utilizados regimes de administrao ao longo de mais
de um dia, deve ser colhida uma amostra, 1,5 ciclos celulares normais aps a exposio final.
Antes do sacrifcio, os animais so injectados intraperitonealmente com uma dose apropriada de um
agente de fixao da metafase (por exemplo: Colcemidd ou colchicina). As amostras sero colhidas
a intervalos regulares, correspondentes a aproximadamente 3-5 horas para os ratos e a 4-5 horas
para os hamsters chineses, a partir desse momento. As clulas da medula so colhidas e analisadas
para deteco de aberraes cromossmicas.

1.5.3 Doses

Se for realizado um estudo para avaliao da gama de doses a administrar, por no estarem disponveis
dados apropriados, esse estudo deve ser executado no mesmo laboratrio, utilizando as mesmas espcies,
linha celular, sexo e regime de exposio a utilizar no estudo principal (5). Se a substncia for txica,
devero ser utilizadas trs doses diferentes para a primeira amostragem, abrangendo uma gama com-
preendida entre a toxicidade mxima e uma toxicidade reduzida ou quase nula. Na segunda amostragem
s ser necessrio avaliar a dose mxima, que definida como a dose que produz sinais de toxicidade
tais que indiquem que a utilizao de doses superiores, com o mesmo regime de administrao, produzir
mortalidade. As substncias com actividade biolgica especfica em doses baixas e no txicas (como
acontece com as hormonas e agentes mitognicos) podero constituir uma excepo aos critrios de
fixao da dose, devendo ser avaliadas caso a caso. A dose mxima pode igualmente ser definida
como a dose que produz algumas indicaes de toxicidade na medula (por exemplo: uma reduo
superior a 50 % do ndice mittico).

1.5.4 Ensaio limite

Se um ensaio com uma dose de pelo menos 2000 mg/kg de peso corporal numa nica exposio
ou em duas exposies no mesmo dia no produzir nenhum efeito txico perceptvel e se, com base
nos dados respeitantes a substncias estruturalmente relacionadas, no for previsvel a existncia de
toxicidade gentica, poder no ser considerado necessrio um estudo completo com utilizao de
trs doses diferentes. Para os estudos de maior durao, a dose limite de 2000 mg/kg de peso
corporal/dia para as exposies at 14 dias e de 1000 mg/kg de peso corporal/dia para as exposies
de durao superior a 14 dias. A exposio prevista para o ser humano pode indicar a necessidade
de se utilizarem doses mais elevadas nos ensaios limite.

1.5.5 Administrao das doses

A substncia em estudo geralmente administrada por sonda esofgica, utilizando um tubo estomacal
ou cnula de intubao apropriada, ou por injeco intraperitoneal. Podero ser aceites, mediante
justificao, outras vias de administrao. O volume mximo de lquido que pode ser administrado
de cada vez por sonda esofgica ou por injeco depende tambm do tamanho do animal de ensaio,
no devendo exceder 2ml/100 g de peso corporal. A utilizao de volumes mais elevados deve ser
justificada. Com excepo das substncias que causem irritao ou que sejam corrosivas, cujos efeitos
sero normalmente agravados em concentraes mais altas, a variabilidade do volume de ensaio deve
ser minimizada atravs do ajustamento das concentraes, por forma a garantir um volume constante
e independente da dose a administrar.

1.5.6 Preparao dos cromossomas

Imediatamente aps o sacrifcio, a medula colhida, exposta a uma soluo hipotnica e fixada.
As clulas so depois esfregadas em lminas e coradas.

1.5.7 Anlise

O ndice mittico deve ser determinado como medio da citotoxicidade em pelos menos 1000 clulas
por animal para todos os animais expostos substncia em estudo (incluindo os controlos positivos)
e para os animais no expostos do controlo negativo.

Devem ser analisadas pelo menos 100 clulas de cada animal. Este nmero poder ser menor quando
se verificarem taxas elevadas de aberraes. Todas as lminas, incluindo as provenientes dos lotes
de controlo positivo e negativo, devem ser independentemente codificadas antes da anlise microscpica.
Uma vez que os processos de fixao do frequentemente lugar ruptura de uma determinada proporo
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4913

das clulas em metafase, com perda dos cromossomas, as clulas contabilizadas devem apresentar,
para todos os tipos de clula, um nmero de centrmeros igual ao nmero modal 2.

2 Dados
2.1 Tratamento dos resultados
Os dados respeitantes a cada animal devem ser apresentados num quadro. A unidade experimental
o animal. Para cada animal devem ser apresentados o nmero de clulas contabilizadas, o nmero
de aberraes por clula e a percentagem de clulas com aberraes cromossmicas estruturais. Os
diferentes tipos de aberrao cromossmica estrutural devem ser enumerados, com os respectivos
nmeros e frequncias, para os grupos expostos substncia em estudo e para os grupos de controlo.
A ocorrncia de lacunas registada em separado e includa no relatrio, mas no geralmente con-
tabilizada para o clculo da frequncia total das aberraes. Se no houver qualquer evidncia de
uma diferena na resposta entre os sexos, os dados de ambos os sexos podero ser combinados para
fins estatsticos.

2.2 Avaliao e interpretao dos resultados


Existem vrios critrios para determinar um resultado positivo, nomeadamente o aumento do nmero
de clulas com aberraes cromossmicas relacionado com a concentrao ou um claro aumento do
nmero de clulas com aberraes num determinado grupo, ou numa determinada amostra. Deve
atender-se, antes de mais, importncia biolgica dos resultados. Como auxlio para a avaliao dos
resultados dos ensaios podero ser utilizados mtodos estatsticos (6), embora a significncia estatstica
no deva ser o nico elemento para a determinao de uma resposta positiva. Os resultados ambguos
devem ser esclarecidos atravs de estudos adicionais, de preferncia com modificao das condies
experimentais.
Um aumento do nmero de clulas poliplides pode indicar que a substncia em estudo apresenta
o potencial de inibir a mitose e de induzir aberraes cromossmicas numricas. Um aumento do
nmero de clulas com cromossomas endoreduplicados pode indicar que a substncia em estudo apre-
senta o potencial de inibir a progresso do ciclo celular (7) (8).
Uma substncia cujos resultados no cumpram os critrios supra no presente ensaio considerada
no mutagnica.
Embora a maioria das experincias tenha resultados claramente positivos ou negativos, em casos raros
o conjunto dos dados no permitir que se obtenha uma opinio inequvoca sobre a actividade da
substncia em estudo, podendo acontecer que os resultados continuem a ser ambguos ou duvidosos,
independentemente do nmero de vezes que a experincia seja repetida.
Um resultado positivo no ensaio in vitro de aberraes cromossmicas indica que a substncia em
estudo induz aberraes cromossmicas estruturais nas clulas da medula das espcies testadas. Um
resultado negativo indica que, nas condies do ensaio, a substncia em estudo no induz aberraes
cromossmicas estruturais nas clulas da medula das espcies testadas.
Deve ser discutida a probabilidade de a substncia em estudo ou os seus metabolitos alcanarem
o sistema circulatrio geral ou especificamente o tecido objectivo (ou seja, a toxicidade sistmica).

3 Apresentao de relatrios
Relatrio de ensaio
O relatrio de ensaio deve incluir a seguinte informao:
Solvente/veculo:
justificao para a escolha do veculo;
solubilidade e estabilidade da substncia em estudo no solvente/veculo, se conhecida.

Animais de ensaio:
espcie/linha celular utilizada;
nmero, idade e sexo dos animais;
origem, condies de acomodao, alimentao, etc.;
peso de cada animal no incio do ensaio, incluindo a gama de pesos, a respectiva mdia e o
desvio padro para cada grupo.

Condies de ensaio:
controlos positivos e negativos (veculo/solvente);
resultados do estudo para definio da gama de doses, quando tenha sido realizado;
justificao para a seleco das doses;
preparao da substncia em estudo;
modo de administrao da substncia em estudo;
4914 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

justificao da via de administrao escolhida;


mtodo para a verificao de que a substncia em estudo atingiu a circulao geral ou o tecido
objectivo, quando aplicvel;
converso da concentrao da substncia em estudo (ppm) na alimentao/abeberao para a dose
real (mg/kg peso corporal/dia), quando aplicvel;
qualidade dos alimentos e da gua;
descrio pormenorizada dos calendrios de exposio e amostragem;
mtodos de medio da toxicidade;
substncia utilizada para fixar a metafase, respectiva concentrao e durao de exposio;
mtodos de preparao das lminas;
critrios de contabilizao das aberraes;
nmero de clulas analisadas por animal;
critrios definidos para que o estudo seja considerado positivo, negativo ou no conclusivo.

Resultados:
sinais de toxicidade;
ndice mittico;
tipo e nmero de aberraes observadas em cada animal;
nmero total de aberraes em cada grupo, com as respectivas mdias e desvios padro;
nmero de clulas aberrantes em cada grupo, com as respectivas mdias e desvios padro;
alteraes da ploidia, quando observadas;
relao dose-resposta, quando seja possvel de determinar;
anlise estatstica, quando tenha sido realizada;
dados relativos ao controlo negativo realizado em paralelo com o ensaio;
dados histricos sobre o controlo negativo com as respectivas gamas, valores mdios e desvios
padro;
dados relativos ao controlo positivo realizado em paralelo com o ensaio.

Discusso dos resultados.


Concluses.

4 Bibliografia

(1) Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach,
S. Venitt and J. M. Parry (eds.), IRL Press, Oxford, Washington D. C., 275-306.
(2) Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. F., and Shelby, M. (1987), Mam-
malian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells,
Mutation Res., 189, 157-165.
(3) Richold, M., Chandly, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., Bootman, J., and Henderson, L. (1990),
In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended
Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing Report, part I, revised,
Cambridge University Press, Cambridge, New Cork, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
(4) Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirch-
-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Paccierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou,
S., and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the In Vivo Mammalian Bone
Marrow Chromosomal Aberration Test, Mutation Res., 312, pp. 305-312.
(5) Fielder, R. J., Alleen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse,
D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J., and Richold, M. (1992), Report of
British Toxicology Society/UK, Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in
In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.
(6) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold,
M., Papworth, D. G., and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic
Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing Report, part III, Statistical
Evaluation of Mutagenicity Test Data, D. J., Kirkland (ed.), Cambridge University Press, Cambridge,
pp. 184-232.
(7) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation-induced
G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403-413.
(8) Huang, Y., Change, C., and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese
hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.

ANEXO VI

B.12 Mutagenicidade Ensaio in vivo dos microncleos em eritrcitos de mamferos

1 Mtodo

O presente mtodo idntico ao mtodo OCDE TG 474 Ensaio dos microncleos em eritrcitos
de mamferos (1997).
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4915

1.1 Introduo
O ensaio in vivo dos microncleos de mamferos utilizado para a deteco de danos induzidos
pela substncia em estudo nos cromossomas ou no aparelho mittico dos eritroblastos, atravs da
anlise dos eritrcitos retirados da medula e ou de clulas de sangue perifrico de animais, geralmente
roedores.
O objectivo do ensaio do microncleo identificar substncias que causam danos citognicos, dando
lugar formao de microncleos com fragmentos de cromossoma ou com cromossomas inteiros.
Quando um eritroblasto da medula se desenvolve para dar um eritrcito policromtico, o ncleo
principal expulso: qualquer microncleo que tenha sido formado pode ficar para atrs (lagging),
no citoplasma, onde no deveria existir qualquer material nuclear. A visualizao dos microncleos
facilitada nestas clulas, uma vez que no existe um ncleo principal. Um aumento de frequncia
de eritrcitos policromticos, micronucleados, nos animais expostos substncia em estudo representa
uma indicao de danos cromossmicos induzidos.
Para o presente ensaio utiliza-se normalmente a medula de roedores, uma vez que os eritrcitos
policromticos so produzidos nesse tecido. A medio dos eritrcitos (policromticos) imaturos micro-
nucleados no sangue perifrico igualmente aceitvel para qualquer outra espcie em que tenha
sido demonstrado que o bao no tem a capacidade de eliminar os eritrcitos micronucleados ou
que apresente uma sensibilidade adequada para a deteco de agentes que causam aberraes cro-
mossmicas estruturais ou numricas. Os microncleos podem ser distinguidos por alguns critrios,
que incluem a identificao da presena ou ausncia de um centrmero ou de ADN centromrico
nos microncleos. A frequncia dos eritrcitos (policromticos) imaturos micronucleados o principal
ponto final utilizado. A proporo de eritrcitos (normocromticos) maturos com microncleos no
sangue perifrico pode igualmente ser utilizada como ponto final do ensaio, quando os animais forem
expostos substncia em estudo de forma contnua durante quatro semanas ou mais.
O ensaio in vivo do microncleo de mamferos particularmente relevante para a avaliao dos perigos
mutagnicos, uma vez que permite a avaliao dos elementos metablicos, da farmacocintica e dos
processos de reparao do ADN in vivo, embora estes possam variar de espcie para espcie, de
tecido para tecido e em termos do ponto final gentico. Os ensaios in vivo so igualmente teis
para a investigao suplementar de um efeito mutagnico detectado in vitro.
Se existirem provas de que nem a substncia em estudo nem nenhum dos seus metabolitos reactivos
entram em contacto com o tecido objectivo, o presente ensaio no apropriado.
V. tambm a parte B da introduo geral.

1.2 Definies
Centrmero: regio(es) de um cromossoma a que esto associadas fibras fusiformes durante a diviso
celular, permitindo o movimento ordeiro dos cromossomas para os plos da clula.
Microncleos: pequenos ncleos separados e adicionais dos ncleos das clulas principais, produzidos
durante a telefase da mitose (meiose) por fragmentos do cromossoma ou cromossomas inteiros que
ficam para trs (lagging).
Eritrcito normocromtico: eritrcito maduro a que faltam ribossomas e que pode, por conseguinte,
distinguir-se dos eritrcitos policromticos imaturos por colorao selectiva dos ribossomas.
Eritrcito policromtico: eritrcito imaturo, numa fase de desenvolvimento intermediria, que ainda
contm ribossomas e pode, por conseguinte, distinguir-se dos eritrcitos normocromticos maturos
por colorao selectiva dos ribossomas.

1.3 Princpio do mtodo de ensaio


Os animais so expostos substncia em estudo por uma via apropriada. Se for utilizada a medula,
os animais so sacrificados passado o tempo necessrio aps a exposio, a medula extrada e so
feitas preparaes coradas (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Quando utilizado o sangue perifrico, o sangue
recolhido passado o tempo necessrio aps a exposio e so preparados esfregaos corados (4)
(8) (9) (10). Nos estudos com sangue perifrico, as amostras de clula devem ser colhidas to cedo
quanto possvel aps a ltima exposio substncia em estudo. As preparaes so analisadas para
a presena de microncleos.

1.4 Descrio do mtodo de ensaio


1.4.1 Preparao
1.4.1.1 Seleco das espcies animais
Quando se pretender utilizar preparaes da medula, recomenda-se a utilizao de ratos ou ratazanas,
embora possa ser utilizada qualquer espcie de mamfero que seja apropriada. Quando se utilizar
o sangue perifrico, recomenda-se a utilizao de ratos. Contudo, pode ser utilizada qualquer espcie
4916 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

de mamfero que seja apropriada, desde que se trate de uma espcie em que o bao no remove
os eritrcitos micronucleados ou que apresente uma sensibilidade adequada para a deteco de agentes
que causam aberraes cromossmicas estruturais ou numricas. Devem ser utilizados animais saudveis
jovens de linhas de laboratrio com caractersticas bem conhecidas. No incio do estudo, a diferena
de peso entre os animais deve ser mnima, no devendo exceder 20 % do peso mdio de cada
sexo.

1.4.1.2 Condies de acomodao e alimentao


Devem ser aplicadas as condies gerais referidas na introduo geral, parte B, embora o objectivo
para a humidade deva ser de 50 %-60 %.

1.4.1.3 Preparao dos animais


Os animais adultos saudveis jovens so distribudos aleatoriamente pelos grupos de controlo e pelos
grupos expostos. Os animais so identificados de forma inequvoca, devendo ser aclimatados s condies
de laboratrio durante pelo menos cinco dias. As gaiolas devem ser dispostas de modo que eventuais
efeitos devidos respectiva colocao sejam minimizados.

1.4.1.4 Preparao das doses


As substncias slidas devem ser dissolvidas ou suspensas em solventes ou veculos adequados e,
se necessrio, diludas antes de serem administradas aos animais. As substncias lquidas podem ser
adicionadas directamente aos sistemas em estudo e ou diludas antes de serem adicionadas s clulas.
Devem ser utilizadas preparaes frescas da substncia em estudo, a menos que os dados de estabilidade
demonstrem que o respectivo armazenamento no coloca problemas para o ensaio.

1.4.2 Condies do ensaio

1.4.2.1 Solvente/veculo
O solvente/veculo no deve reagir com a substncia em estudo nem produzir efeitos txicos nas
doses utilizadas. Caso se utilizem solventes/veculos cujas propriedades no se encontrem totalmente
elucidadas, devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que possvel,
recomenda-se a utilizao de solventes/veculos aquosos.

1.4.2.2 Controlos
Cada experincia deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente/veculo) para cada
sexo. Com excepo da exposio substncia em estudo, todos os animais, incluindo os dos grupos
de controlo, devem ser manuseados de forma idntica.
Os controlos positivos devem produzir microncleos in vivo aos nveis de exposio a que se espera
o surgimento de um aumento detectvel em relao linha de base. A dose de controlo positivo
a administrar deve ser escolhida de modo que os seus efeitos sejam claros mas tambm a que as
lminas codificadas no sejam imediatamente identificadas pela pessoa que procede s leituras.
aceitvel que o controlo positivo seja administrado por uma via diferente da substncia em estudo
e que s seja realizada uma amostra. A possibilidade de utilizao de produtos qumicos de uma
classe relacionada para o controlo positivo deve ser considerada, quando existam. As substncias de
controlo positivo podem incluir, por exemplo:

Substncia Nmero CAS Nmero EINECS

Metanossulfonato de etilo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62-50-0 200-536-7


Etilnitrosureia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 759-73-9 212-072-2
Mitomicina C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50-07-7 200-008-6
Ciclofosfamida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50-18-0 200-015-4
Ciclofosfamida monohidrato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6055-19-2
Trietilenomelamina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51-18-3 200-083-5

Para cada colheita devem tambm realizar-se controlos negativos, em que os animais so expostos
apenas ao solvente ou veculo, procedendo-se do mesmo modo que num ensaio normal, a menos
que existam dados histricos de controlo aceitveis em relao variabilidade de animal para animal
e frequncia da ocorrncia de clulas com aberraes cromossmicas. Se s estiver prevista uma
amostra dos controlos negativos, a altura mais apropriada a primeira amostra. Alm disso, devem
igualmente ser utilizados controlos no expostos substncia em estudo, a menos que j existam
dados de estudos anteriores ou publicados que mostrem que o solvente/veculo escolhido no induz
nenhum efeito deletrio ou mutagnico.
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4917

Se for utilizado o sangue perifrico, uma amostra anterior exposio poder servir para o controlo
negativo, mas apenas nos estudos de menor durao (ou seja, 1 a 3 exposies), desde que os dados
respeitantes a essa amostra estejam de acordo com o esperado em funo de experincias anteriores.

1.5 Procedimento

1.5.1 Nmero e sexo dos animais

Cada grupo exposto e de controlo deve incluir pelo menos cinco animais analisveis por sexo (11).
Se no momento do estudo existirem dados disponveis de estudos com as mesmas espcies e com
utilizao da mesma via de administrao que demonstrem que no h qualquer diferena substancial
da toxicidade entre os sexos, ser suficiente testar um nico sexo. Nos casos em que a exposio
humana aos produtos qumicos possa ser especfica a cada sexo, como acontece com alguns produtos
farmacuticos, o ensaio deve ser executado com animais do sexo em causa.

1.5.2 Programao do tratamento

No possvel recomendar qualquer programao especfica para a exposio (ou seja, uma, duas
ou mais exposies com intervalos de 24 horas). As amostras recolhidas durante regimes de administrao
prolongada so aceitveis, desde que o estudo demonstre a existncia de um efeito positivo ou, para
um estudo negativo, desde que a toxicidade seja demonstrada ou que se utilize uma dose limite,
com administrao at ao momento da colheita. As substncias de ensaio podem igualmente ser admi-
nistradas numa dose dividida, ou seja, duas exposies no mesmo dia, separadas por apenas algumas
horas, para facilitar a administrao de grandes volumes.
O ensaio pode ser executado de duas formas:
a) Os animais so expostos substncia em estudo uma nica vez. As amostras de medula so colhidas
pelo menos duas vezes, a primeira das quais pelo menos 24 horas aps a exposio, com intervalos
apropriados entre as colheitas mas no ultrapassando as 48 horas aps a exposio. Uma eventual
colheita antes de 24 horas aps a exposio ter de ser justificada. As amostras de sangue perifrico
so colhidas pelo menos duas vezes, a primeira das quais pelo menos 36 horas aps a exposio,
com intervalos apropriados entre as colheitas mas no ultrapassando as 72 horas aps a exposio.
Quando for identificada uma resposta positiva numa determinada colheita, no ser necessrio
continuar o estudo;
b) Se forem utilizadas duas ou mais exposies dirias (por exemplo: duas ou mais exposies com
intervalos de 24 horas), a primeira amostra deve ser colhida 18 a 24 horas depois da exposio
final no caso do sangue perifrico (12).

Quando necessrio, podero ser recolhidas amostras adicionais.

1.5.3 Doses

Se for realizado um estudo para avaliao da gama de doses a administrar, por no estarem disponveis
dados apropriados, esse estudo deve ser executado no mesmo laboratrio, utilizando as mesmas espcies,
linha celular, sexo e regime de exposio a utilizar no estudo principal (13). Se a substncia for txica,
devero ser utilizadas trs doses diferentes para a primeira amostragem, abrangendo uma gama com-
preendida entre a toxicidade mxima e uma toxicidade reduzida ou quase nula. Na segunda amostragem
s ser necessrio avaliar a dose mxima, que definida como a dose que produz sinais de toxicidade
tais que indiquem que a utilizao a doses superiores, com o mesmo regime de administrao, produzir
mortalidade. As substncias com actividade biolgica especfica em doses baixas e no txicas (como
acontece com as hormonas e agentes mitognicos) podero constituir uma excepo aos critrios de
fixao da dose, devendo ser avaliadas caso a caso. A dose mxima pode igualmente ser definida
como a dose que produz algumas indicaes de toxicidade na medula (por exemplo: reduo da pro-
poro de eritrcitos imaturos em relao aos eritrcitos totais na medula ou no sangue perifrico).

1.5.4 Ensaio limite

Se um ensaio com uma dose de pelo menos 2000 mg/kg de peso corporal numa nica exposio
ou em duas exposies no mesmo dia no produzir nenhum efeito txico perceptvel e se, com base
nos dados respeitantes a substncias estruturalmente relacionadas, no for previsvel a existncia de
toxicidade gentica, poder no ser considerado necessrio um estudo completo com utilizao de
trs doses diferentes. Para os estudos de maior durao, a dose limite de 2000 mg/kg de peso cor-
poral/dia para as exposies at 14 dias e de 1000 mg/kg de peso corporal/dia para as exposies
de durao superior a 14 dias. A exposio prevista para o ser humano pode indicar a necessidade
de se utilizarem doses mais elevadas nos ensaios limite.

1.5.5 Administrao das doses

A substncia em estudo geralmente administrada por sonda esofgica, utilizando um tubo estomacal
ou cnula de intubao apropriada, ou por injeco intraperitoneal. Podero ser aceites, mediante
4918 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

justificao, outras vias de administrao. O volume mximo de lquido que pode ser administrado
de cada vez por sonda esofgica ou por injeco depende tambm do tamanho do animal de ensaio,
no devendo exceder 2 ml/100 g de peso corporal. A utilizao de volumes mais elevados deve ser
justificada. Com excepo das substncias que causem irritao ou que sejam corrosivas, cujos efeitos
sero normalmente agravados em concentraes mais altas, a variabilidade do volume de ensaio deve
ser minimizada atravs do ajustamento das concentraes, por forma a garantir um volume constante
e independente da dose a administrar.

1.5.6 Preparao da medula/sangue


As clulas da medula so retiradas do fmur ou da tbia imediatamente aps o sacrifcio. Geralmente,
as clulas so retiradas do fmur ou da tbia, preparadas e coradas de acordo com mtodos j definidos.
O sangue perifrico retirado da veia caudal ou de outro vaso sanguneo apropriado. As clulas
de sangue so imediatamente sujeitas a uma colorao supravital (8) (9) (10) ou ento so preparados
esfregaos que depois so corados. A utilizao de uma colorao especfica para o ADN [por exemplo:
laranja de acridina (14) ou pironina-y de milho 33 258 plus da Hoechst (15)] pode eliminar alguns
dos erros associados utilizao de uma colorao no especfica para o ADN. Esta vantagem no
impossibilita a utilizao de coloraes convencionais (por exemplo: Giemsa). Outros sistemas [por
exemplo: colunas de celulose para remoo das clulas nucleadas (16)] podem igualmente ser utilizados,
desde que se demonstre que esses sistemas funcionam de forma adequada para a preparao de
microncleos em laboratrio.

1.5.7 Anlise
A proporo de eritrcitos imaturos em relao aos eritrcitos totais (imaturos+maduros) determinada
para cada animal, atravs da contagem de pelo menos 200 eritrcitos no caso da medula e de 1000
eritrcitos no caso do sangue perifrico (17). Todas as lminas, incluindo as dos controlos positivos
e negativos devem ser codificadas independentemente antes da anlise microscpica. A eventual ocor-
rncia de eritrcitos imaturos micronucleados deve ser analisada em pelo menos 2000 eritrcitos imaturos
por animal. A contagem de eritrcitos maduros micronucleados poder ser utilizada como informao
adicional. Ao analisar as lminas, a proporo de eritrcitos imaturos em relao aos eritrcitos totais
no deve ser inferior a 20 % do valor de controlo. Quando os animais forem sujeitos a uma exposio
contnua durante quatro semanas ou mais, podero ser tambm analisados 2000 eritrcitos maduros
por animal, para determinao da ocorrncia de microncleos. Os sistemas automatizados de anlise
(tratamento de imagens e citometria de fluxo e suspenses celulares) so alternativas aceitveis
avaliao manual, se apropriadamente justificadas e validadas.

2 Dados
2.1 Tratamento dos resultados
Os dados respeitantes a cada animal devem ser apresentados num quadro. A unidade experimental
o animal. Para cada animal devem ser verificados separadamente o nmero de eritrcitos imaturos,
o nmero de eritrcitos imaturos micronucleados e a proporo de eritrcitos imaturos em relao
aos eritrcitos totais. Quando os animais tiverem sido expostos substncia em estudo em contnuo
durante quatro semanas ou mais, devem tambm ser recolhidos dados em relao aos eritrcitos
maduros. Para cada animal deve ser apresentada a proporo de eritrcitos imaturos em relao
aos eritrcitos totais e, se for considerado necessrio, de eritrcitos maduros micronucleados. Se no
houver qualquer evidncia de uma diferena na resposta entre os sexos, os dados de ambos os sexos
podero ser combinados para fins estatsticos.

2.2 Avaliao e interpretao dos resultados


H diversos critrios para determinar um resultado positivo, como por exemplo um aumento do nmero
de clulas micronucleadas relacionado com a dose ou um claro aumento do nmero de clulas micro-
nucleadas num determinado grupo e numa determinada amostragem. Deve ser tomada em considerao,
antes de mais, a importncia biolgica dos resultados. Como auxlio para a avaliao dos resultados
dos ensaios, podero ser utilizados mtodos estatsticos (18) (19), embora a significncia estatstica
no deva ser o nico elemento para a determinao de uma resposta positiva. Os resultados ambguos
devem ser esclarecidos atravs de estudos adicionais, de preferncia com modificao das condies
experimentais.
Uma substncia cujos resultados no cumpram os critrios acima indicados no presente ensaio con-
siderada no mutagnica.
Embora a maioria de experincias tenha resultados claramente positivos ou negativos, em casos raros
o conjunto dos dados no permitir que se obtenha uma opinio inequvoca sobre a actividade da
substncia em estudo, podendo acontecer que os resultados continuem a ser ambguos ou duvidosos,
independentemente do nmero de vezes que a experincia seja repetida.
Um resultado positivo no ensaio dos microncleos indica que a substncia em estudo induz a ocorrncia
dos mesmos, como resultado de danos nos cromossomas ou no sistema mittico dos eritroblastos
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4919

da espcie testada. Um resultado negativo indica que, nas condies do ensaio, a substncia em estudo
no induz a ocorrncia de microncleos nos eritroblastos imaturos da espcie testada.
Deve ser discutida a probabilidade de a substncia em estudo ou os seus metabolitos alcanarem
o sistema circulatrio geral ou especificamente o tecido objectivo (ou seja, a toxicidade sistmica).

3 Apresentao de relatrios

Relatrio de ensaio

O relatrio de ensaio deve incluir a seguinte informao:


Solvente/veculo:
justificao para a escolha do veculo;
solubilidade e estabilidade da substncia em estudo no solvente/veculo, se conhecida.

Animais de ensaio:
espcie/linha celular utilizada;
nmero, idade e sexo dos animais;
origem, condies de acomodao, alimentao, etc.;
peso de cada animal no incio do ensaio, incluindo a gama de pesos, a respectiva mdia e o
desvio padro para cada grupo.

Condies de ensaio:
controlos positivos e negativos (veculo/solvente);
resultados do estudo para definio da gama de doses, quando tenha sido realizado;
justificao para a seleco das doses;
preparao da substncia em estudo;
modo de administrao da substncia em estudo;
justificao da via de administrao escolhida;
mtodo para a verificao de que a substncia em estudo atingiu a circulao geral ou o tecido
objectivo, quando aplicvel;
converso da concentrao da substncia em estudo (ppm) na alimentao/abeberao para a dose
real (mg/kg peso corporal/dia), quando aplicvel;
qualidade dos alimentos e da gua;
descrio pormenorizada dos calendrios de exposio e amostragem;
mtodos de preparao das lminas;
mtodos de medio da toxicidade;
critrios de contabilizao dos eritrcitos imaturos micronucleados;
nmero de clulas analisadas por animal;
critrios definidos para que o estudo seja considerado positivo, negativo ou no conclusivo.

Resultados:
sinais de toxicidade;
proporo de eritrcitos imaturos em relao aos eritrcitos totais;
nmero de eritrcitos imaturos micronucleados em cada animal;
mdias e desvios padro dos eritrcitos imaturos micronucleados por grupo;
relao dose-resposta, quando seja possvel de determinar;
anlise estatstica e respectivo mtodo;
dados relativos ao controlo negativo realizado em paralelo com o ensaio e dados histricos sobre
o controlo negativo;
dados relativos ao controlo positivo realizado em paralelo com o ensaio.

Discusso dos resultados.


Concluses.

4 Bibliografia

(1) Heddle, J. A. (1973), A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18,
pp. 187-190.
(2) Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, pp. 9-15.
(3) Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J. G., and
Newell, G. W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation
Res., 123, pp. 61-118.
(4) Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C., Salamone, M. F., and Heddle, J. A. (1990),
The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report
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4920 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

(5) MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N., and Wehr, C. M. (1983), Micronuclei in Circulating
Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in
Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell
and T. S. Miya, Elsevier, Amsterdam, pp. 555-558.
(6) MacGregor, J. T., Heddle, J. A., Hite, M., Margolin, G. H., Ramel, C., Salamone, M. F., Tice,
R. R., and Wild, D. (1987), Guidelines for lhe Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian
Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, pp. 103-112.
(7) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R., and Shelby, M. E. (1990), The in vivo Erythrocyte
Micronucleus Test: Measurement at Steady State lncreases Assay Efficiency and Permits Integration
with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol., 14, pp. 513-522.
(8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus
Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation
Res., 245, pp. 245-249.
(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992), Micronucleus Test with Mouse
Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report
of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS, Mutation Res., 278, pp. 83-98.
(10) The Collaborative Study Group for lhe Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS, MMS: The Mam-
malian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). Protocol
recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10,
pp. 153-159.
(11) Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blackey, D. H., Kirch-Volders, M.,
Oleson, Jr., F. B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S., and Vannier, B. (1994),
in vivo, Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mutation Res., 312, pp. 293-304.
(12) Higashikuni, N., and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised sampling time of 30 6 h after
double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, pp. 313-319.
(13) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse,
D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J., and Rochold, M. (1992), Report
of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting
in in vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.
(14) Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent
Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241-247.
(15) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining
Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33 258 and Pyronin Y, Mutation
Res., 120, pp. 269-275.
(16) Romagna, F., and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Muta-
tion Res., 213, pp. 91-104.
(17) Collapudi, B., and McFadden, L. G. (1995), Sample size for lhe estimation of polychromatic
to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 347,
pp. 97-99.
(18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G., and Henderson, L. (1990),
In Vivo Cytogenetics Assay, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended
Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part I, revised,
Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
(19) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold,
M., Papworth, D. G., and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic
Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, UKEMS Sub-
-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Cambridge University Press,
Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.

ANEXO VII
B.13/14 Mutagenicidade Ensaio de mutao reversa em bactrias
1 Mtodo
O presente mtodo idntico ao mtodo OCDE TG 471 Ensaio de mutao reversa bacteriana
(1997).

1.1 Introduo
O ensaio de mutao reversa bacteriana utiliza estirpes de Salmonelas typhimurium e Escherichia coli
carentes em aminocidos para detectar mutaes pontuais, causadas pela substituio, adio ou supres-
so de um ou mais pares de bases do ADN (1) (2) (3). O princpio do presente ensaio de mutao
reversa bacteriana a deteco de mutaes que invertem as mutaes existentes nas estirpes de
ensaio, restaurando a capacidade funcional das bactrias sintetizarem um cido essencial. As bactrias
com mutao reversa so detectadas pela sua capacidade de crescimento na ausncia do aminocido
em que as estirpes de ensaio eram carentes.
As mutaes pontuais causam diversas doenas genticas humanas, existindo provas substanciais de
que as mutaes pontuais em oncogenes e em genes supressores de tumores nas clulas somticas
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4921

esto envolvidas na formao de tumores nos seres humanos e em animais experimentais. O ensaio
de mutao reversa bacteriana rpido, barato e relativamente fcil de execuo. Muitas das estirpes
de ensaio tm diversas caractersticas que as tornam mais sensveis para a deteco de mutaes,
nomeadamente sequncias de ADN identificativas dos locais de inverso, aumento da permeabilidade
celular a grandes molculas e eliminao ou aumento da ocorrncia de erros nos processos de reparao
do ADN. A especificidade das estirpes de ensaio pode fornecer alguma informao til sobre os
tipos de mutaes induzidos pelos agentes genotxicos. J existe uma grande base de dados com
resultados respeitantes a uma vasta gama de ensaios de mutao reversa bacteriana, tendo sido desen-
volvidas metodologias com caractersticas bem conhecidas e que utilizam produtos qumicos com dife-
rentes propriedades fsico-qumicas, nomeadamente compostos temporrios.
V. tambm a parte B da introduo geral.

1.2 Definies

Ensaio de mutao reversa com Salmonelas typhimurium ou Escherichia coli: detecta mutaes em
estirpes carentes num determinado aminocido (histidina ou triptofano, respectivamente), que tem
como resultado a produo de uma estirpe independente do abastecimento externo desse aminocido.
Mutagneos de substituio de um par de base: so os agentes que causam uma alterao das bases
do ADN. No ensaio de mutao reversa essa alterao pode ocorrer no local da mutao original
ou num local diferente do genoma bacteriano.
Mutagneos por deslocao do quadro de leitura: so agentes que causam a adio ou supresso de
um ou mais pares de bases no ADN, modificando dessa forma o quadro de leitura do ARN.

1.3 Consideraes iniciais

O ensaio de mutao reversa bacteriana utiliza clulas procariotas, que diferem das clulas de mamfero
em caractersticas como a absoro, metabolismo, estrutura dos cromossomas e processos de reparao
do ADN. Os ensaios conduzidos in vitro exigem geralmente a utilizao de uma fonte exgena de
activao metablica. Os sistemas de activao metablica in vitro no reproduzem inteiramente as
condies in vivo nos mamferos. O ensaio no fornece, por conseguinte, informao directa sobre
a potncia mutagnica e carcinognica da substncia nos mamferos.
O ensaio de mutao reversa bacteriana geralmente utilizado para a despistagem inicial da actividade
genotxica e, nomeadamente, para detectar a induo de mutaes pontuais. Uma extensa base de
dados demonstrou que muitos produtos qumicos que do resultados positivos no presente ensaio
apresentam uma actividade mutagnica noutros ensaios. H exemplos de agentes mutagnicos que
no so detectados pelo presente ensaio, podendo as razes para essas falhas ser atribudas natureza
especfica do ponto final detectado, a diferenas na activao metablica ou ainda a diferenas na
biodisponibilidade. Por outro lado, elementos que aumentem a sensibilidade do ensaio de mutao
reversa bacteriana podem conduzir sobrestimao da actividade mutagnica.
O ensaio de mutao reversa bacteriana pode no ser apropriado para a avaliao de certas classes
de produtos qumicos, nomeadamente compostos altamente bactericidas (por exemplo: certos anti-
biticos) e produtos que se pensa (ou que se sabe) que interferem especificamente com o sistema
de replicao das clulas de mamferos (por exemplo: alguns inibidores da topoisomerase e alguns
compostos anlogos a nucleosdeos). Nesses casos, poder ser mais apropriado utilizar ensaios de
mutao em clulas de mamferos.
Embora muitos dos compostos que do resultados positivos no presente ensaio sejam carcinogneos
para os mamferos, essa correlao no absoluta. Com efeito, a correlao depende da classe qumica
e, por outro lado, alguns agentes carcinogneos no so detectados no ensaio pelo facto de o seu
mecanismo ou mecanismos de actuao, no genotxicos, no afectar(em) as clulas bacterianas.

1.4 Princpio do mtodo de ensaio

As suspenses bacterianas so expostas substncia em estudo tanto na presena como na ausncia


de um sistema de activao metablico exgeno. No mtodo de incorporao em placas, as suspenses
so misturadas num revestimento de gelose e depois vertidas na superfcie de uma lmina de gelose
com meio mnimo. No mtodo com incubao prvia, a mistura de tratamento incubada e s depois
misturada com uma cobertura de gelose e preparada em placas com meio mnimo. Independentemente
da tcnica que tenha sido utilizada, as colnias com mutao reversa so contadas e comparadas
com o nmero de colnias com mutao reversa espontnea em placas de controlo com solvente,
aps dois ou trs dias de incubao.
Esto descritos diversos procedimentos para executar o ensaio de mutao reversa bacteriana. Entre
os mais geralmente utilizados esto o mtodo de incorporao em placas (1) (2) (3) (4), o mtodo
com incubao prvia (2) (3) (5) (6) (7) (8), o mtodo em flutuao (9) (10) e o mtodo em sus-
penso (11). As adaptaes necessrias para os ensaios de gases ou vapores tambm se encontram
descritas (12).
4922 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

Os procedimentos descritos no presente mtodo dizem principalmente respeito aos mtodos de incor-
porao em placas e com incubao prvia. Qualquer dos dois aceitvel para a realizao de expe-
rincias na presena e na ausncia de um sistema de activao metablica. Algumas substncias podero
ser detectadas de forma mais eficaz utilizando o mtodo com incubao prvia. Essas substncias
pertencem a classes qumicas que incluem as nitrosaminas alifticas de cadeia curta, os metais, os
aldedos, os corantes azicos e compostos diazicos, os alcalides de priolizidina, os compostos allicos
e os compostos nitro (3). Por outro lado, certas classes de mutagneos nem sempre so detectadas
quando se utilizam os procedimentos padro, tais como o mtodo de incoporao em placas ou o
mtodo com incubao prvia. Esses casos so considerados especiais e recomenda-se fortemente
que sejam utilizados procedimentos alternativos para a sua deteco. Esto j identificados os seguintes
casos especiais (e exemplos dos procedimentos que podem ser utilizados para a sua deteco):
corantes azicos e compostos diazticos (3) (5) (6) (13), gases e compostos qumicos (12) (14) (15)
(16) e glicsidos (17) (18) volteis. Qualquer desvio do procedimento padro ter de ser cientificamente
justificado.

1.5 Descrio do mtodo de ensaio

1.5.1 Preparao

1.5.1.1 Bactrias
Devem ser utilizadas culturas frescas de bactrias na fase final do crescimento exponencial ou no
incio da fase estacionria (aproximadamente 109 clulas/ml). No devem ser utilizadas culturas em
fase estacionria adiantada. essencial que as culturas utilizadas na experincia contenham um ttulo
elevado de clulas viveis, que pode ser demonstrado por dados histricos de controlo sobre as curvas
de crescimento ou durante o prprio ensaio, atravs da determinao das clulas viveis em placas.
A temperatura de incubao recomendada 37oC.
Devem ser utilizadas pelo menos cinco estirpes das bactrias, entre as quais quatro estirpes de S. typhi-
murium (TA1535; TA1537 ou TA97 ou TA97a; TA98, e TA100) para as quais foi demonstrado que
so fiveis e do resultados reprodutveis entre laboratrios. Essas quatro estirpes de S. typhimurium
tm um par com as bases GC no local da inverso primria e sabe-se que no permitem detectar
certos agentes mutagneos oxidantes, de ligao cruzada nem hidrazinas. Essas substncias podem
ser detectadas utilizando as estirpes E. coli WP2 ou S. typhimurium TA102 (19) que tm um par
com as bases AT no local da inverso primria. Por conseguinte, a combinao de estirpes
recomendada :
S. typhimurium TA1535; e
S. typhimurium TA1537 ou TA97 ou TA97a; e
S. typhimurium TA98; e
S. typhimurium TA100; e
E. coli WP2 uvrA, ou E. coli WP2 uvrA (pKM101), ou S. typhimurium TA102.
Para a deteco de agentes mutagneos causadores de ligaes cruzadas poder ser prefervel incluir
a estirpe TA102 ou acrescentar uma estirpe capaz de reparar o ADN de E. coli [por exemplo: E. coli
WP2 ou E. coli WP2 (pKM101)].
Devem ser utilizados os procedimentos estabelecidos para a preparao de culturas de arranque, veri-
ficao dos mercadores e armazenamento. As quantidades de aminocidos necessrios para o cres-
cimento (histidina para as estirpes de S. typhimurium e triptofano para as estirpes de E. coli) devem
ser demonstradas para cada preparao de cultura de arranque conservada. Outras caractersticas
fenotpicas devem tambm ser verificadas, a saber: a presena ou ausncia de plasmdeos de Factor-r,
quando necessrio [ou seja, resistncia ampicilina nas estirpes TA98, TA100 e TA97 ou TA97a,
WP2 uvrA e WP2 uvrA (pKM101) e resistncia ampicilina e tetraciclina na estirpe TA102]; presena
de mutaes caractersticas (ou seja, mutao rfa em S. typhimurium, atravs da sensibilizao com
violeta de cristal, e mutao uvrA em E. coli ou mutao uvrB em S. typhimurium, atravs da sensibilizao
com raios ultravioleta) (2) (3). As estirpes devem ainda apresentar, de forma espontnea, contagens
de mutaes reversas nas gamas de frequncia esperadas em funo dos dados histricos de controlo
do laboratrio e tambm, de preferncia, da literatura.

1.5.1.2 Meio
Ser utilizado um meio mnimo de gelose apropriado (por exemplo: contendo meio mnimo Vogel-
-Bonner E. e glucose) e uma cobertura de gelose com histidina e biotina ou triptofano para permitir
alguma diviso celular (1) (2) (9).

1.5.1.3 Activao metablica


As bactrias devem ser expostas substncia em estudo tanto na presena como na ausncia de
um sistema adequado de activao metablica. O sistema mais geralmente utilizado uma fraco
ps-mitocondrial reforada com co-factor (S9) preparada a partir de fgados de roedores tratados
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4923

com agentes de induo enzimtica, como por exemplo Aroclor 1254 (1) (2) ou uma mistura de
fenobarbitona e b-naftoflavona (18) (20) (21). A fraco ps-mitocondrial geralmente utilizada em
concentraes na gama de 5 % a 30 % v/v na mistura S9. A escolha e o estado do sistema de activao
metablico podem depender da classe dos produtos qumicos em estudo. Em alguns casos pode revelar-se
adequado utilizar vrias concentraes diferentes de fraco ps-mitocondrial. Para os corantes azicos,
para os compostos diazicos, poder ser mais indicado um sistema de activao metablica
redutor (6) (13).

1.5.1.4 Substncia em estudo/preparao


As substncias slidas devem ser dissolvidas ou suspensas em solventes ou veculos adequados e,
se necessrio, diludas antes da exposio das bactrias. As substncias lquidas podem ser adicionadas
directamente aos sistemas em estudo e ou diludas antes de serem adicionadas s clulas. Devem
ser utilizadas preparaes frescas da substncia em estudo, a menos que os dados de estabilidade
demonstrem que o respectivo armazenamento no coloca problemas para o ensaio.
O solvente/veculo no deve reagir com a substncia em estudo, devendo ser compatvel com a sobre-
vivncia das clulas e com a actividade da mistura S9. Caso se utilizem solventes/veculos cujas pro-
priedades no se encontrem totalmente elucidadas, devem fornecer-se dados que justifiquem a sua
compatibilidade. Sempre que possvel, recomenda-se a utilizao de solventes/veculos aquosos. Quando
forem realizados ensaios de substncias instveis na presena de gua, os solventes orgnicos utilizados
devem ser anidros.

1.5.2 Condies do ensaio

1.5.2.1 Estirpes (v. 1.5.1.1)


1.5.2.2 Concentrao de exposio
A citotoxicidade e a solubilidade na mistura final constituem alguns dos critrios a ter em conta
na determinao da maior quantidade da substncia em estudo a utilizar.
Poder ser til determinar a toxicidade e insolubilidade atravs de uma experincia preliminar. A
citotoxicidade pode ser detectada pela reduo do nmero de colnias com mutao reversa, pela
presena de colnias mais claras ou de menores dimenses ou pelo grau de sobrevivncia das culturas
expostas. A citotoxicidade de uma substncia pode variar na presena de sistemas de activao meta-
blicos. A insolubilidade deve ser avaliada em funo da precipitao verificvel a olho nu na mistura
final nas condies reais do ensaio.
A concentrao mxima de ensaio recomendada para substncias solveis no citotxicas de 5 mg/placa
ou de 5 ll/placa. Para as substncias no citotxicas insolveis a 5 mg/placa ou a 5 ll/placa, uma ou
mais das concentraes ensaiadas devem ser insolveis na mistura final. As substncias de ensaio
citotxicas abaixo dos 5 mg/placa ou 5 ll/placa devem ser ensaiadas at uma concentrao citotxica.
O precipitado no deve interferir com a contagem.
Numa experincia inicial devem ser utilizadas pelo menos cinco concentraes analisveis diferentes
da substncia em estudo, com intervalos aproximadamente semilogartmicos (ou seja, M10 ) entre
as concentraes. Para a investigao da relao concentrao-resposta podero ser indicados intervalos
menores. Poder ser contemplada a possibilidade de ensaiar concentraes superiores a 5 mg/placa
ou 5 ll/placa, quando se pretender avaliar substncias que contenham quantidades substanciais de
impurezas potencialmente mutagnicas.

1.5.2.3 Controlos negativos e positivos


Cada experincia deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente ou veculo) especficos
para cada estirpe, devendo, para os controlos positivos, ser escolhidas concentraes que demonstrem
o desempenho eficaz de cada ensaio.
Para os ensaios com utilizao de um sistema de activao metablica, a substncia de referncia
para os controlos positivos deve ser seleccionada com base no tipo de estirpe de bactria utilizada.
As seguintes substncias so exemplos de controlos positivos apropriados para os ensaios com activao
metablica:

Substncia Nmero CAS Nmero EINECS

9,10-dimetilantraceno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 781-43-1 212-308-4


7,12-dimetilbenzo[a]antraceno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57-97-6 200-359-5
Benzo[a]pireno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50-32-8 200-028-5
2-aminoantraceno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 613-13-8 210-330-9
Ciclofosfamida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50-18-0 200-015-4
Ciclofosfamida monohidrato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6055-19-2
4924 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

A seguinte substncia um controlo positivo apropriado para o mtodo de activao metablico


redutor:

Substncia Nmero CAS Nmero EINECS

Vermelho do Congo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 573-58-0 209-358-4

O 2-aminoantraceno no deve ser utilizado como nico indicador da eficcia da mistura S9. Se essa
substncia for utilizada, cada lote S9 deve ser igualmente caracterizado com um agente mutagnico
que exija activao metablica por enzimas microssmicos, como, por exemplo, o benzo[a]pireno ou
o dimetilbenzo[a]antraceno.
As seguintes substncias so exemplos de controlos positivos especficos apropriados para cada estirpe,
adequados para os ensaios sem utilizao de um sistema exgeno de activao metablica:

Substncia Nmero CAS Nmero EINECS Estirpe

Nitrito de sdio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26628-22-8 247-852-1 TA1535 e TA100


2-nitrofluoreno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 607-57-8 210-138-5 TA98
9-aminoacridina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90-45-9 201-995-6 TA1537, TA97 e TA97A
ICR 191 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17070-45-0 241-129-4 TA1537, TA97 e TA97A
Hidroperxido de isopropilbenzeno . . . . . . . . . . . 80-15-9 201-254-7 TA102
Mitomicina C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50-07-7 200-008-6 WP2 uvrA e TA102
N-etil-N-nitro-N-nitrosoguanidina . . . . . . . . . . . . 70-25-7 200-730-1 WP2, WP2 uvrA e WP2 uvrA
(pKM101)
4-nitroquinolina-1-xido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56-57-5 200-281-1 WP2, WP2 uvrA e WP2 uvrA
(pKM101)
Furilfuramida (AF2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3688-53-7 Estirpes com plasmdeos

Podem utilizar-se no controlo positivo outras substncias adequadas. A possibilidade de utilizao


de produtos qumicos de uma classe afim para o controlo positivo deve ser considerada, quando existam.
Devem tambm realizar-se controlos negativos, consistindo apenas em solvente ou veculo e sem a
substncia em estudo, que sero sujeitos exactamente ao mesmo procedimento que os grupos expostos.
Alm disso, devem igualmente ser utilizados controlos no expostos substncia em estudo, a menos
que existam dados histricos de controlo que demonstrem que o solvente escolhido no induz qualquer
efeito deletrio ou mutagnico.

1.5.3 Procedimento

Para o mtodo de incorporao em placas (1) (2) (3) (4) sem activao metablica, utilizam-se geralmente
0,05 ml ou 0,1 ml da soluo de ensaio, 0,1 ml de cultura bacteriana fresca (aproximadamente 108 clulas
viveis) e 0,5 ml de tampo estril, que so misturados com 2,0 ml de gelose de cobertura. Para
o ensaio com activao metablica utilizam-se geralmente 0,5 ml de mistura de activao metablica,
que contm uma quantidade adequada de fraco ps-mitocondrial (entre 5 % a 30 % v/v na mistura
de activao metablica), misturada com a gelose de cobertura (2,0 ml), as bactrias e a substncia
em estudo/soluo de ensaio. O contedo de cada tubo misturado e deitado sobre uma placa de
meio mnimo de gelose. A gelose de cobertura deve solidificar antes da incubao.
No mtodo com incubao prvia (2) (3) (5) (6), a substncia em estudo/soluo de ensaio previamente
incubada com a estirpe de ensaio (aproximadamente 108 clulas viveis) e o tampo estril ou o
sistema de activao metablica (0,5 ml), geralmente durante 20 minutos ou mais a 30oC-37oC, antes
de ser misturada com a gelose de cobertura e deitada sobre uma placa com meio mnimo de gelose.
Normalmente, so utilizados 0,05 ml ou 0,1 ml da substncia em estudo/soluo de ensaio, 0,1 ml
de cultura bacteriana e 0,5 ml da mistura S9 ou de tampo estril, misturados com 2,0 ml de gelose
de cobertura. Os tubos devem ser arejados durante a pr-incubao, utilizando o agitador.
Para uma avaliao adequada da variao devem ser utilizadas placas em triplicado para cada dose.
A utilizao de placas em duplicado aceitvel desde que seja justificada cientificamente. A perda
ocasional de uma placa no invalida necessariamente o ensaio.
As substncias gasosas ou volteis devem ser ensaiadas por mtodos apropriados, por exemplo em
recipientes selados (12) (14) (15) (16).

1.5.4 Incubao

Todas as placas de cada ensaio devem ser incubadas a 37oC durante 48-72 horas. Aps a incubao,
contam-se as colnias com mutao reversa em cada placa.
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4925

2 Dados

2.1 Tratamento dos resultados

Os dados devem ser apresentados sob a forma do nmero de colnias com mutao reversa por
placa. O nmero de colnias com mutao reversa nas placas de controlo negativas (controlo do
solvente e, se tiver sido utilizado, controlo no exposto) e positivas deve tambm ser apresentado.
As contagens individuais das placas, o nmero mdio de colnias com mutao reversa por placa
e o respectivo desvio padro devem ser apresentados para a substncia em estudo e para os controlos
positivos e negativos (no expostos substncia em estudo e ou solvente).
No h nenhuma exigncia concreta para a verificao de uma resposta positiva clara. Os resultados
ambguos devem ser melhor esclarecidos, de preferncia com modificao das condies experimentais.
Os resultados negativos tm de ser confirmados caso a caso. Nos casos em que a confirmao dos
resultados negativos no seja considerada necessria, deve ser apresentada uma justificao. Para a
realizao de experincias adicionais, deve ser analisada a possibilidade de modificao dos parmetros
do estudo, por forma a aumentar a gama de condies avaliadas. Os parmetros que podem even-
tualmente ser alterados incluem a gama de concentraes, o mtodo de tratamento (incorporao
em placas ou pr-incubao em meio lquido) e as condies de activao metablica.

2.2 Avaliao e interpretao dos resultados

H diversos critrios para determinar um resultado positivo, tais como um aumento do nmero de
colnias por placa com mutao reversa em pelo menos uma estirpe, com ou sem sistema de activao
metablico, que esteja relacionado com a concentrao na gama ensaiada e ou que seja reprodutvel
numa ou mais das concentraes ensaiadas (23). Deve ser tomada em considerao, antes de mais,
a importncia biolgica dos resultados. Como auxlio para a avaliao dos resultados dos ensaios
podero ser utilizados mtodos estatsticos (24). Contudo, a significncia estatstica no deve ser o
nico elemento de determinao para uma resposta positiva.
Uma substncia cujos resultados no cumpram os critrios acima indicados no presente ensaio con-
siderada no mutagnica.
Embora a maioria de experincias tenha resultados claramente positivos ou negativos, em casos raros
o conjunto dos dados no permitir que se obtenha uma opinio inequvoca sobre a actividade da
substncia em estudo, podendo acontecer que os resultados continuem a ser ambguos ou duvidosos,
independentemente do nmero de vezes que a experincia seja repetida.
Um resultado positivo no ensaio de mutao reversa bacteriana indica que a substncia induz mutaes
pontuais por substituio das bases ou por deslocao do quadro de leitura no genoma de Salmonelas
typhimurium e ou Escherichia coli. Um resultado negativo indica que, nas condies do ensaio, a
substncia no mutagnica para as espcies ensaiadas.

3 Apresentao de relatrios

Relatrio de ensaio

O relatrio de ensaio deve incluir a seguinte informao:


Solvente/veculo:
justificao para a escolha do solvente/veculo;
solubilidade e estabilidade da substncia em estudo no solvente/veculo, se conhecida.

Estirpes:
estirpes usadas;
nmero de clulas por cultura;
caractersticas da estirpe.

Condies de ensaio:
quantidade da substncia em estudo por placa (mg/placa ou ml/placa), com justificao da escolha
da dose e do nmero de placas preparadas por concentrao;
meios utilizados;
tipo e composio do sistema de activao metablica, incluindo critrios de aceitabilidade;
protocolo do tratamento.

Resultados:
sinais de toxicidade;
sinais de precipitao;
contagens individuais das placas;
nmero mdio de colnias com mutao reversa por placa e respectivo desvio padro:
4926 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

relao dose-resposta, quando seja possvel de determinar;


anlise estatstica, quando tenha sido realizada;
dados relativos aos controlos negativo (solvente/veculo) e positivo realizados em paralelo com
o ensaio, com as respectivas gamas, valores mdios e desvios padro;
dados histricos relativos aos controlos negativo (solvente/veculo) e positivo realizados em paralelo
com o ensaio, com as respectivas gamas, valores mdios e desvios padro.

Discusso dos resultados.


Concluses.

4 Bibliografia

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(19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J., and Gatehouse, D. G. (1990), Comparison of Salmonella
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(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K., and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polych-
lorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: In Vitro Metabolic Activation
in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85-88.
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4927

(21) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Tatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M.,
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(22) Maron, D., Katzenellenbogen, J., and Ames, B. N. (1981), Compatibility of Organic Solvents
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(23) Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E., and Zeiger, E. (1987),
Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity,
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(24) Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchell, I., Robinson, W. D., and Tweats,
D. J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Sub-Committee on
Guidelines for Mutagenicity Testing. Part II Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirk-
land, D. J., Cambridge University Press, pp. 28-65.

ANEXO VIII

B.17 Mutagenicidade Ensaio de mutao gnica em clulas de mamferos in vitro

1 Mtodo

O presente mtodo idntico ao mtodo OCDE TG 476 Ensaio de mutao gnica de mamferos
in vitro (1997).

1.1 Introduo

O ensaio de mutao gnica em clulas de mamferos in vitro pode ser utilizado para detectar mutaes
gnicas induzidas por substncias qumicas. As linhas celulares que podem ser utilizadas incluem as
clulas L5178U do linfoma do rato, as linhas celulares CHO, CHO-AS52 e V79 do hamster chins
e as clulas linfoblastides humanas TK6 (1). Nessas linhas celulares, os pontos finais genticos mais
utilizados so as mutaes da timidina quinase (TK), da hipoxantina-guanina fosforibosil transferase
(HPRT) e do transgene de xantina-guanina fosforibosil transferase (XPRT). Os ensaios de mutao
TK, HPRT e XPRT detectam diferentes gamas de ocorrncias genticas. A localizao autossmica
das mutaes TK e XPRT pode permitir a deteco de ocorrncias genticas (por exemplo: supresso
de grandes sequncias) que no so detectadas no locus HPRT nos cromossomas X (2) (3) (4) (6).
No ensaio de mutao gnica em clulas de mamferos in vitro podem ser utilizadas culturas de qualquer
linha celular ou estirpe de caractersticas bem conhecidas. As clulas utilizadas so seleccionadas com
base na sua capacidade de desenvolvimento em cultura e na estabilidade da frequncia das mutaes
espontneas.
Os ensaios realizados in vitro exigem geralmente a utilizao de uma fonte exgena de activao
metablica. Os sistemas de activao metablicos in vitro no reproduzem inteiramente as condies
in vivo nos mamferos. Devem portanto ser evitadas condies que conduzam a resultados que no
reflectem uma mutagenicidade intrnseca. Os eventuais resultados positivos no resultantes de muta-
genicidade intrnseca podem ser causados por alteraes do pH, da presso osmtica ou por nveis
elevados de citotoxicidade (7).
O presente ensaio utilizado para o controlo de eventuais agentes mutagneos e carcinogneos em
mamferos. Embora muitos dos compostos que do resultados positivos no presente ensaio sejam
carcinogneos para os mamferos, essa correlao no absoluta. Com efeito, a correlao depende
da classe qumica e, por outro lado, h cada vez mais dados que provam que alguns agentes carcinogneos
no so detectados no ensaio porque parecem actuar atravs de mecanismos no genotxicos ou
atravs de mecanismos ausentes nas clulas bacterianas (6).
V. tambm a parte B da introduo geral.

1.2 Definies

Mutao para diante: mutao gentica do tipo parental para a forma mutante que causa uma alterao
ou perda de actividade enzimtica da funo da protena codificada.
Mutagneos por substituio de um par de bases: substncias que causam a substituio de um ou
vrios pares de bases do ADN.
Mutagneos por deslocao do quadro de leitura: substncias que causam a adio ou supresso de
um par de bases ou de uma sequncia de pares de bases do ADN.
Perodo de expresso fenotpica: perodo que decorre at que os produtos dos genes inalterados se
esgotem nas clulas recentemente sujeitas a uma mutao.
Frequncia de mutao: relao entre o nmero de clulas mutantes observadas e o nmero de clulas
viveis.
Crescimento total relativo: aumento no nmero de clulas por unidade de tempo, por comparao
com uma populao de controlo, calculado como o produto da relao entre o crescimento em suspenso
4928 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

e no controlo negativo com a relao entre a eficincia de clonagem em suspenso e no controlo


negativo.
Crescimento relativo em suspenso: relao entre o aumento no nmero de clulas durante o perodo
de expresso em suspenso e no controlo negativo.
Viabilidade: eficincia de clonagem das clulas expostas incubadas em placas, aps o perodo de expres-
so, sob condies selectivas.
Sobrevivncia: eficincia de clonagem das clulas expostas incubadas em placas no fim do perodo
de exposio; a sobrevivncia geralmente expressa em relao sobrevivncia da populao celular
de controlo.

1.3 Princpio do mtodo de ensaio

As clulas deficientes em timidina quinase (TK) devido mutao TK +/- K TK -/- so resistentes
aos efeitos citotxicos do anlogo de pirimidina da trifluorotimidina (TFT). As clulas que dispem
de timidina quinase so sensveis ao TFT, que causa inibio do metabolismo celular e impede a
diviso da clula. Logo, as clulas mutantes podem proliferar na presena de TFT, o que no acontece
com as clulas normais, com timidina quinase. Da mesma forma, as clulas carentes em HPRT ou
XPRT so seleccionadas pela resistncia 6-tioguanina (TG) ou 8-azaguanina (AG). As propriedades
da substncia em estudo devem ser cuidadosamente tomadas em considerao se o ensaio de mutao
gnica em clulas de mamferos for utilizado para ensaiar uma substncia anloga das bases ou um
composto relacionado com o agente selectivo. Assim, por exemplo, deve ser investigada qualquer
suspeita de toxicidade selectiva da substncia em estudo para as clulas mutantes e no mutantes.
Logo, o desempenho do sistema/agente selectivo deve ser confirmado quando se ensaiarem produtos
qumicos estruturalmente relacionados com o agente selectivo (8).
As clulas em suspenso ou em cultura em monocamada so expostas substncia em estudo tanto
na presena como na ausncia de um sistema de activao metablica durante um perodo de tempo
apropriado, sendo depois cultivadas para determinar a citotoxicidade e para permitir a expresso feno-
tpica antes de seleccionar o mutante (9) (10) (11) (12) (13). A citotoxicidade geralmente determinada
atravs da medio da eficincia relativa de clonagem (sobrevivncia) ou do crescimento total relativo
das culturas aps o perodo de exposio. As culturas expostas so mantidas em meio de crescimento
durante um perodo de tempo suficiente, que varia em funo do locus seleccionado e do tipo de
clula, por forma a permitir uma expresso fenotpica to boa quanto possvel das mutaes induzidas.
A frequncia de mutao determinada inoculando um nmero conhecido de clulas num meio
com agente selectivo para as clulas mutantes e num meio sem agente selectivo para determinao
das respectivas eficincias de clonagem (viabilidade). Aps um perodo de incubao apropriado, as
colnias so contadas. A frequncia de mutao calculada a partir do nmero de colnias mutantes
no meio selectivo e do nmero de colnias no meio no selectivo.

1.4 Descrio do mtodo de ensaio

1.4.1 Preparao

1.4.1.1 Clulas
O presente ensaio pode ser realizado com diversos tipos de clulas, nomeadamente subclones das
clulas L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 ou TK6. Os tipos de clula utilizados no presente ensaio
devem ter uma sensibilidade demonstrada a mutagneos qumicos, uma eficincia de clonagem elevada
e uma frequncia de mutao espontnea estvel. As clulas devem ser verificadas para detectar eventuais
contaminaes por microplasma, no devendo ser utilizadas se estiverem contaminadas.
O ensaio deve ser concebido para ter uma determinada sensibilidade e definio. O nmero de clulas
e de culturas e as concentraes da substncia em estudo a utilizar sero reflexo dos parmetros
definidos (14). O nmero mnimo de clulas viveis que devem sobreviver exposio e ser utilizadas
em cada fase do ensaio deve basear-se na frequncia da mutao espontnea. A ttulo indicativo,
deve ser utilizado um nmero de clulas pelo menos 10 vezes superior ao inverso da frequncia
de mutao espontnea, com um mnimo recomendado de 106 clulas. Para verificao da consistncia
do desempenho do ensaio, devem estar disponveis dados histricos adequados sobre o sistema celular
utilizado.

1.4.1.2 Meios e condies de cultura


Devem ser utilizados meios de cultura e condies de incubao (recipientes, temperatura, CO2, con-
centrao e humidade) apropriados. Os meios devem ser escolhidos de acordo com o sistema selectivo
e com o tipo de clulas utilizados no ensaio. particularmente importante que sejam escolhidas
condies de cultura que garantam o crescimento ptimo das clulas durante o perodo de expresso
e a capacidade de formao de colnia por parte das clulas mutantes e no mutantes.
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4929

1.4.1.3 Preparao das culturas


As clulas so propagadas a partir de culturas de arranque, inoculadas no meio de cultura e incubadas
a 37oC. Antes da realizao no presente ensaio, as culturas podero ter de ser limpas de clulas
mutantes eventualmente presentes.

1.4.1.4 Activao metablica


As bactrias devem ser expostas substncia em estudo tanto na presena como na ausncia de
um sistema adequado de activao metablica. O sistema geralmente mais utilizado uma fraco
ps-mitocondrial reforada com co-factor (S9) preparada a partir de fgados de roedores tratados
com agentes de induo enzimtica, como por exemplo Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18) ou uma
mistura de fenobarbitona e b-naftoflavona (19) (20).
A fraco ps-mitocondrial geralmente utilizada em concentraes na gama de 1 %-10 % v/v no
meio de ensaio final. A escolha e estado do sistema de activao metablico podem depender da
classe do produto qumico em estudo. Em alguns casos, poder ser apropriado utilizar mais de uma
concentrao de fraco ps-mitocondrial.
Alguns desenvolvimentos, nomeadamente a produo por engenharia gentica de linhas celulares que
expressem enzimas de activao especficas, podem ter algum potencial em termos de activao end-
gena. A escolha das linhas celulares utilizadas deve ser cientificamente justificada (por exemplo: pela
importncia da isoenzima do citocromo P450 para o metabolismo da substncia em estudo).

1.4.1.5 Substncia em estudo/preparao


As substncias slidas devem ser dissolvidas ou suspensas em solventes ou veculos adequados e,
se necessrio, diludas antes da exposio das clulas. As substncias lquidas podem ser adicionadas
directamente aos sistemas em estudo e ou diludas antes de serem adicionadas s clulas. Devem
ser utilizadas preparaes frescas da substncia em estudo, a menos que os dados de estabilidade
demonstrem que o respectivo armazenamento no coloca problemas para o ensaio.

1.4.2 Condies de ensaio


1.4.2.1 Solvente/veculo
O solvente/veculo no deve reagir com a substncia em estudo, devendo ser compatvel com a sobre-
vivncia das clulas e com a actividade da mistura S9. Caso se utilizem solventes/veculos cujas pro-
priedades no se encontrem totalmente elucidadas, devem fornecer-se dados que justifiquem a sua
compatibilidade. Sempre que possvel, recomenda-se a utilizao de solventes/veculos aquosos. Quando
forem realizados ensaios de substncias instveis na presena de gua, os solventes orgnicos utilizados
devem ser anidros. A gua poder ser removida atravs de um filtro molecular.

1.4.2.2 Concentraes de exposio


A citotoxicidade, a solubilidade no sistema de ensaio e as alteraes do pH ou da presso osmtica
constituem alguns dos critrios a ter em conta na determinao de concentrao mxima.
A citotoxicidade deve ser determinada tanto na presena como na ausncia de um sistema de activao
metablica na experincia principal, utilizando um indicador apropriado da integridade e crescimento
das clulas, tal como a eficincia relativa de clonagem (sobrevivncia) ou o crescimento relativo total.
Poder ser til determinar a toxicidade e insolubilidade atravs de uma experincia preliminar.
Devem ser utilizadas pelo menos quatro concentraes analisveis. Quando existir citotoxicidade, essas
concentraes devem abranger uma gama de toxicidade que varie da toxicidade mxima a quase nula:
o que significa geralmente que as concentraes devem variar num factor de 2 a M10 . Se a concentrao
mxima for definida por razes de citotoxicidade, a sobrevivncia relativa (eficincia relativa de clo-
nagem) ou o crescimento relativo total devem ser da ordem dos 10 %-20 % (mas no inferiores a
10 %). Para as substncias com citotoxicidade relativamente baixa, a concentrao mxima do ensaio
deve ser a mais baixa de 5 mg/ml, 5 ml/ml ou 0,01 M.
Para substncias relativamente insolveis a dose mxima a utilizar deve ser igual ou superior ao limite
de solubilidade nas condies de cultura. A insolubilidade no meio final a que as clulas so expostas
deve ser demonstrada. Poder ser til avaliar a solubilidade no incio e no fim do tratamento, uma
vez que a mesma se pode alterar durante a exposio no sistema de ensaio devido presena de
clulas, de S9, de soro, etc. A insolubilidade pode ser detectada vista desarmada. O precipitado
no deve interferir com as contagens necessrias.

1.4.2.3 Controlos negativos e positivos


Cada experincia deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente/veculo), tanto
na presena como na ausncia de um sistema de activao metablica. Quando for utilizada activao
metablica, o produto qumico de controlo positivo deve ser o mesmo que exige activao para dar
uma resposta mutagnica.
4930 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

As substncias de controlo positivo podem ser, por exemplo:

Condio de activao metablica Locus Substncia Nmero CAS Nmero EINECS

Ausncia de activao metablica HPRT . . . . . . . . . . . . . . . . . Metanossulfonato de etilo . . . . . 62-50-0 200-536-7


exgena. Etil nitrosureia . . . . . . . . . . . . . . 759-73-9 212-072-2

TK (colnias pequenas e Metanossulfonato de metilo . . . 66-27-3 200-625-0


grandes).

XPRT . . . . . . . . . . . . . . . . . Metanossulfonato de etilo . . . . . 62-50-0 200-536-7


Etil nitrosureia . . . . . . . . . . . . . . 759-73-9 212-072-2

Presena de activao metablica HPRT . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-3-Metilcolantreno . . . . . . . . . . 56-49-5 200-276-4


exgena. N-Nitrosodimetilamina . . . . . . . 62-75-9 200-549-8
7,12-Dimetilbenzantraceno . . . . 57-97-6 200-359-5

TK (colnias pequenas e Ciclofosfamida . . . . . . . . . . . . . . 50-18-0 200-015-4


grandes). Ciclofosfamida monohidrato . . . 6055-19-2
Benzo[a]pireno . . . . . . . . . . . . . . 50-32-8 200-028-5
3-3-Metilcolantreno . . . . . . . . . . 56-49-5 200-276-5

XPRT . . . . . . . . . . . . . . . . . N-n-Nitrosodimetilamina (nveis 62-75-9 200-549-8


elevados de S9).
Benzo[a]pireno . . . . . . . . . . . . . . 50-32-8 200-028-5

Podem ser utilizadas outras substncias de referncia apropriadas para o controlo positivo. Assim,
se um laboratrio dispuser, por exemplo, de uma base de dados histricos sobre a utilizao de 5-bromo
2-deoxiuridina (nmero CAS 59-14-3, nmero EINECS 200-415-9), essa substncia de referncia poder
tambm ser utilizada. Quando existam, deve ser analisada a possibilidade de utilizar produtos qumicos
de controlo positivos de classes qumicas relacionadas.
Devem tambm realizar-se controlos negativos, consistindo apenas em solvente ou veculo e sem a
substncia em estudo, que sero sujeitos exactamente ao mesmo procedimento que os grupos expostos.
Alm disso, devem igualmente ser utilizados controlos no expostos substncia em estudo, a menos
que existam dados histricos de controlo que demonstrem que o solvente escolhido no induz qualquer
efeito deletrio ou mutagnico.

1.4.3 Procedimento
1.4.3.1 Exposio substncia em estudo
As clulas em proliferao devem ser expostas substncia em estudo tanto na presena como na
ausncia de um sistema de activao metablica durante um perodo de tempo apropriado (3 a 6 horas
geralmente eficaz). O perodo de exposio pode ser alargado a um ou mais ciclos celulares.
Para cada concentrao a ensaiar podem ser utilizadas culturas expostas nicas ou em duplicado.
Quando forem utilizadas culturas nicas, o nmero de concentraes deve ser aumentado, por forma
a garantir um nmero de culturas adequado para a anlise (por exemplo: pelo menos oito concentraes
analisveis). Devem tambm ser includas culturas de controlo negativas (solventes) duplicadas.
As substncias gasosas ou volteis devem ser ensaiadas por mtodos apropriados, por exemplo em
recipientes selados (21) (22).

1.4.3.2 Medio da sobrevivncia, viabilidade e frequncia de mutao


No fim do perodo de exposio, as clulas so lavadas e cultivadas para determinar a sobrevivncia
e para permitir a expresso fenotpica das mutaes. A medio de citotoxicidade atravs da deter-
minao da eficincia relativa de clonagem (sobrevivncia) ou do crescimento total relativo das culturas
geralmente iniciada aps o perodo de exposio.
Para cada locus h um tempo mnimo definido para permitir uma expresso fenotpica quase ptima
das mutaes recentemente induzidas (o HPRT e o XPRT exigem pelo menos de seis a oito dias
e o TK pelo menos dois dias). As clulas so cultivadas em meios com presena e ausncia do agente
selectivo para determinao, respectivamente, do nmero de mutaes e da eficincia de clonagem.
A medio da viabilidade (utilizada para calcular a frequncia de mutao) iniciada no fim do
perodo de expresso atravs de cultura em placas com meio no selectivo.
Se a substncia em estudo der um resultado positivo no ensaio L5178Y TK +/-, deve ser realizada
uma medio do tamanho das colnias em pelo menos uma das culturas de ensaio (a concentrao
mxima com resultado positivo) e nos controlos negativos e positivos. Se a substncia em estudo
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4931

der um resultado negativo no ensaio L5178Y +/-, deve ser realizada uma medio do tamanho das
colnias nos controlos negativos e positivos. Nos estudos que utilizem TK6TK +/-, a medio do tamanho
das colnias poder tambm ser realizada.

2 Dados
2.1 Tratamento dos resultados
Os dados devem incluir a determinao de citotoxicidade e da viabilidade, para alm da contagem
das colnias e das frequncias de mutao nas culturas expostas e nas culturas de controlo. No caso
de um resultado positivo no ensaio L5178Y TK +/-, as colnias devem ser contabilizadas utilizando
o critrio das colnias pequenas e grandes em pelo menos uma das concentraes da substncia em
estudo (a concentrao mxima com resultado positivo) e nos controlos negativos e positivos. A natureza
molecular e citognica das clulas mutantes que formam colnias grandes e pequenas j foi investigada
em pormenor (23) (24). No ensaio TK +/-, as colnias devem ser contabilizadas utilizando os critrios
do crescimento normal (colnias grandes) e do crescimento lento (colnias pequenas) (25). As clulas
mutantes que tenham sofrido danos genticos mais extensos apresentam tempos de duplicao maiores,
pelo que formam colnias mais pequenas. Esses danos variam tipicamente da perda da totalidade
dos genes a aberraes cromossmicas s visveis por anlise do caritipo. A induo de mutaes
que resultam no aparecimento de colnias pequenas foi associada com produtos qumicos que induzem
aberraes cromossmicas graves (26). As clulas menos seriamente afectadas por mutaes apresentam
taxas de crescimento semelhantes s clulas parentais e formam colnias grandes.
Deve ser apresentada a sobrevivncia (eficincias relativas de clonagem) ou o crescimento total relativo.
A frequncia de mutao deve ser expressa como a relao entre o nmero de clulas mutantes
e o nmero de clulas sobreviventes.
Devem ser fornecidos dados individuais das culturas. Para alm disso, todos os dados devem ser
apresentados sob a forma de um quadro.
No h nenhuma exigncia concreta para a verificao de uma resposta positiva clara. Os resultados
ambguos devem ser melhor esclarecidos, de preferncia com modificao das condies experimentais.
Os resultados negativos tm de ser confirmados caso a caso. Nos casos em que a confirmao dos
resultados negativos no seja considerada necessria, deve ser apresentada uma justificao. Para a
realizao de experincias adicionais, deve ser analisada a possibilidade de modificao dos parmetros
do estudo, por forma a aumentar a gama de condies avaliadas. Os parmetros que podem even-
tualmente ser alterados incluem a gama de concentraes e as condies de activao metablica.

2.2 Avaliao e interpretao dos resultados


H diversos critrios para determinar um resultado positivo, tais como um aumento da frequncia
de mutao que esteja relacionado com a concentrao na gama testada e ou que seja reprodutvel.
Deve ser tomada em considerao, antes de mais, a importncia biolgica dos resultados. Como auxlio
para a avaliao dos resultados dos ensaios, podero ser utilizados mtodos estatsticos. Contudo,
a importncia estatstica no deve ser o nico elemento de determinao para uma resposta positiva.
Uma substncia cujos resultados no cumpram os critrios acima indicados no presente ensaio con-
siderada no mutagnica.
Embora a maioria das experincias tenha resultados claramente positivos ou negativos, em casos raros
o conjunto dos dados no permitir que se obtenha uma opinio inequvoca sobre a actividade da
substncia em estudo, podendo acontecer que os resultados continuem a ser ambguos ou duvidosos,
independentemente do nmero de vezes que a experincia seja repetida.
Um resultado positivo no ensaio de mutao gnica em clulas de mamferos in vitro indica que
a substncia induz mutaes gnicas nas culturas de clulas de mamferos utilizadas. Uma resposta
positiva concentrao que seja reprodutvel mais significativa. Um resultado negativo indica que,
nas condies do ensaio, a substncia no induz mutaes gnicas nas culturas de clulas de mamfero
utilizadas.

3 Apresentao de relatrios
Relatrio de ensaio
O relatrio de ensaio deve incluir a seguinte informao:
Solvente/veculo:
justificao para a escolha do veculo;
solubilidade e estabilidade da substncia em estudo no solvente/veculo, se conhecida.

Clulas:
tipo e origem das clulas;
nmero de culturas celulares;
4932 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

nmero de transferncias, quando aplicvel;


mtodos de manuteno da cultura celular, quando aplicvel;
ausncia de micoplasma.

Condies de ensaio:
justificao para a seleco das concentraes e do nmero de culturas, incluindo, por exemplo,
dados sobre a citotoxicidade e sobre as limitaes de solubilidade, quando disponveis;
composio dos meios, concentrao de CO2;
concentrao da substncia em estudo;
volumes adicionados do veculo e da substncia em estudo;
temperatura de incubao;
tempo de incubao;
durao de tratamento;
densidade celular durante a exposio;
tipo e composio do sistema de activao metablica, incluindo critrios de aceitabilidade;
controlos positivos e negativos;
durao do perodo de expresso (incluindo o nmero de clulas inoculadas e os calendrios de
subcultura e de alimentao, quando aplicvel);
agentes selectivos;
critrios definidos para que o estudo seja considerado positivo, negativo ou no conclusivo;
mtodos utilizados para a enumerao dos nmeros de clulas mutantes e viveis;
definio das colnias cuja dimenso e tipo so caracterizados (incluindo os critrios para a definio
de colnias pequenas e grandes, conforme apropriado).

Resultados:
sinais de toxicidade;
sinais de precipitao;
dados sobre o pH e a presso osmtica durante a exposio substncia de ensaio, caso tenham
sido determinados;
dimenso das colnias, caso tenha sido medida pelo menos para os controlos positivos e negativos;
capacidade do laboratrio para a deteco de pequenas colnias mutantes no sistema L5178Y
TK +/-, quando aplicvel;
relao dose-resposta, quando seja possvel de determinar;
anlise estatstica, quando tenha sido realizada;
dados relativos ao controlo negativo (solvente/veculo) e positivo realizados em paralelo com o
ensaio;
dados histricos sobre o controlo negativo (solvente/veculo) e positivo, com as gamas, valores
mdios e desvios padro;
frequncia das mutaes.

Discusso dos resultados.


Concluses.

4 Bibliografia

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ANEXO IX
B.23 Ensaio de aberraes cromossmicas em espermatognias de mamfero
1 Mtodo
O presente mtodo idntico ao mtodo OCDE TG 483 Ensaio de aberrao cromossmica em
espermatognias de mamfero (1997).

1.1 Introduo
O objectivo do ensaio in vivo de aberraes cromossmicas em espermatognias de mamfero identificar
as substncias que causam aberraes cromossmicas estruturais nas clulas espermatognias de mam-
4934 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

fero (1) (2) (3) (4) (5). As aberraes estruturais podem ser de dois tipos: cromossmicas ou cromatdicas.
A maior parte dos mutagneos qumicos induzem aberraes cromatdicas, mas tambm podem ocorrer
aberraes cromossmicas. O mtodo no foi concebido para medir aberraes numricas e no
normalmente utilizado com esse objectivo. As mutaes cromossmicas e eventos relacionados causam
diversas doenas genticas humanas.
O presente ensaio mede eventos a nvel dos cromossomas de clulas germinais espermatognias e,
por conseguinte, pressupe-se que tenha um carcter de previso da induo de mutaes transmissveis
nas clulas germinais.
No presente ensaio utilizam-se normalmente roedores. O ensaio citognico in vivo detecta aberraes
cromossmicas nas mitoses das espermatognias. O mtodo no diz respeito a outros tipos de clulas.
Para detectar aberraes cromatdicas em clulas espermatognias deve examinar-se a primeira diviso
mittica da clula aps a exposio, antes que as eventuais leses sejam perdidas por via de divises
celulares subsequentes. Para obteno de informao adicional sobre as clulas germinais das esper-
matognias expostas pode proceder-se anlise dos cromossomas durante a meiose, para deteco
de aberraes cromossmicas na diacinese-metafase I, momento em que as clulas expostas passam
forma de espermatcitos.
O presente ensaio in vivo foi concebido para investigar se os agentes mutagneos das clulas somticas
tambm so activos para as clulas germinais. Alm disso, o ensaio das espermatognias relevante
para a avaliao dos riscos de mutagenicidade, na medida em que permite a considerao dos elementos
do metabolismo in vivo, da farmacocintica e dos processos de reparao do ADN.
Nos testculos esto presentes diversas geraes de espermatognias, com diferentes graus de sen-
sibilidade ao tratamento qumico. Logo, as aberraes detectadas representam uma resposta agregada
das vrias populaes de clulas espermatognias expostas, com predominncia para as clulas esper-
matognias mais diferenciadas, que so em maior nmero. Dependendo da sua posio no testculo,
diferentes geraes de espermatognias podero ou no ser expostas circulao geral, devido
barreira fsica e fisiolgica constituda pelas clulas de Sertoli e barreira sangue-testculo.
Se existirem provas de que nem a substncia em estudo nem nenhum dos seus metabolitos reactivos
entram em contacto com o tecido objectivo, o presente ensaio no apropriado.
V., tambm, a parte B da introduo geral.

1.2 Definies
Aberrao cromatdica: leso estrutural de um cromossoma expressa na ruptura, ou na ruptura seguida
de unio, de cromatdeos simples.
Aberrao cromossmica: leso estrutural de um cromossoma expressa na ruptura, ou na ruptura seguida
de unio, de ambos os cromatdeos no mesmo local.
Lacuna: leso acromtica de extenso inferior largura de um cromatdeo e que determine um ligeiro
desalinhamento do mesmo.
Aberrao numrica: alterao do nmero de cromossomas relativamente ao nmero de cromossomas
caracterstico das clulas utilizadas.
Poliploidia: nmero de cromossomas mltiplo do nmero haplide (n), mas diferente do diplide
(ou seja; 3n, 4n, e assim por diante).
Aberrao estrutural: alterao da estrutura dos cromossomas detectvel por exame microscpico das
clulas em metafase sob a forma de supresso de segmentos, de alteraes de partes da sequncia
ou da troca de segmentos num cromatdeo ou entre cromatdeos.

1.3 Princpio do mtodo de ensaio


Os animais so expostos substncia em estudo atravs de um modo de exposio apropriado, sendo
sacrificados passado o tempo necessrio aps a exposio. Antes do sacrifcio, os animais so tratados
com um agente de fixao da metafase (por exemplo: colchicina ou Colcemidd). Seguidamente, so
feitas preparaes de cromossomas a partir das clulas germinais e, aps serem coradas, as clulas
em metafase so analisadas para deteco de aberraes cromossmicas.

1.4 Descrio do mtodo de ensaio


1.4.1 Preparao
1.4.1.1 Seleco das espcies animais
Geralmente, so utilizados ratos ou hamsters chineses machos, embora possam ser utilizados machos
de qualquer outra espcie de mamfero apropriada. Devem ser utilizados animais adultos saudveis
jovens das raas de laboratrio mais comuns. No incio do estudo, a diferena de peso entre os animais
deve ser mnima, no devendo exceda 20 % do peso mdio de cada sexo.
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4935

1.4.1.2 Condies de acomodao e alimentao


Devem ser aplicadas as condies gerais referidas na introduo geral, parte B, embora o objectivo
para a humidade deva ser de 50 %-60 %.

1.4.1.3 Preparao dos animais


Os animais machos adultos saudveis jovens so distribudos aleatoriamente pelos grupos de controlo
e pelos grupos expostos. As gaiolas devem ser dispostas de modo que eventuais efeitos devidos
respectiva colocao sejam minimizados. Os animais so identificados de forma inequvoca, devendo
ser aclimatados s condies de laboratrio durante pelo menos cinco dias antes de se iniciar o estudo.

1.4.1.4 Preparao das doses


As substncias slidas devem ser dissolvidas ou suspensas em solventes ou veculos adequados e,
se necessrio, diludas antes de serem administradas aos animais. As substncias lquidas podem ser
adicionadas directamente aos sistemas em estudo e ou diludas antes de serem adicionadas s clulas.
Devem ser utilizadas preparaes frescas da substncia em estudo, a menos que os dados de estabilidade
demonstrem que o respectivo armazenamento no coloca problemas para o ensaio.

1.4.2 Condies do ensaio


1.4.2.1 Solvente/veculo
O solvente/veculo no deve reagir com a substncia em estudo, no devendo produzir efeitos txicos
nas doses utilizadas. Caso se utilizem solventes/veculos cujas propriedades no se encontrem totalmente
elucidadas, devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que possvel,
recomenda-se a utilizao de um solvente/veculo aquoso.

1.4.2.2 Controlos
Cada experincia deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente/veculo). Com excep-
o da exposio substncia em estudo, todos os animais, incluindo os dos grupos de controlo,
devem ser manuseados de forma idntica.
Os controlos positivos devem produzir aberraes estruturais in vivo nas clulas espermatognias quando
administrados aos nveis de exposio a que se espera o surgimento de um aumento detectvel em
relao linha de base.
A dose de controlo positiva a administrar deve ser escolhida de modo que os seus efeitos sejam
claros mas tambm que as lminas codificadas no sejam imediatamente identificadas pela pessoa
que procede s leituras. aceitvel que o controlo positivo seja administrado por uma via diferente
da substncia em estudo e que s seja realizada uma amostra. A possibilidade de utilizao de produtos
qumicos de uma classe relacionada para o controlo positivo deve ser considerada, quando existam.
As substncias de controlo positivo podem incluir, por exemplo:

Substncia Nmero CAS Nmero EINECS

Ciclofosfamida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50-18-0 200-015-4


Ciclofosfamida mono-hidrato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6055-19-2
Ciclo-hexilamina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108-91-8 203-629-0
Mitomicina C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50-07-7 200-008-6
Acrilamida monomrica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79-06-1 201-173-7
Trietilenomelamina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51-18-3 200-083-5

Para cada amostragem prevista devem ser includos controlos negativos expostos apenas ao solvente
ou veculo, que sero sujeitos exactamente ao mesmo procedimento que os grupos expostos, a menos
que existam dados histricos de controlo aceitveis em relao variabilidade de animal para animal
e frequncia da ocorrncia de clulas com aberraes cromossmicas. Alm disso, devem ser tambm
preparados controlos no expostos substncia em estudo, a menos que existam dados de controlo
histricos ou publicados que mostrem que o solvente/veculo escolhido no induz qualquer efeito
deletrio ou mutagnico.

1.5 Procedimento
1.5.1 Nmero de animais
Cada grupo exposto e de controlo deve incluir pelo menos cinco animais machos analisveis.

1.5.2 Programao do tratamento


As substncias de ensaio so preferivelmente administradas numa ou em duas doses (ou seja, numa
s exposio ou em duas exposies). As substncias podero igualmente ser administradas numa
4936 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

dose dividida, ou seja, duas exposies no mesmo dia, separadas por apenas algumas horas, para
facilitar a administrao de grandes volumes. Qualquer outro regime de administrao ter de ser
cientificamente justificado.
No grupo exposto dose mais elevada sero realizadas duas amostras aps a exposio. Uma vez
que a cintica celular poder ser afectada pela substncia em estudo, sero colhidas duas amostras,
uma cerca de 24 horas aps a exposio e outra cerca de 48 horas aps a exposio. Para os restantes
animais deve ser colhida uma amostra 1,5 ciclos celulares normais ou 24 horas aps a exposio,
a no ser nos casos em que se saiba que a utilizao de outros tempos de amostragem mais apropriada
para a deteco dos efeitos (6).
Para alm disso, podero ser utilizados outros tempos de amostragem. Assim, por exemplo, no caso
de produtos qumicos que possam induzir lagging cromossmico ou efeitos independentes do factor S,
poder ser necessrio fazer a amostragem mais cedo (1).
A necessidade ou no de uma repetio da exposio ter de ser avaliada caso a caso. Se o tratamento
for repetido, os animais devem ser sacrificados 24 horas (1,5 ciclos celulares) aps a ltima exposio.
Quando necessrio, podero ser realizadas amostras adicionais.
Antes do sacrifcio, os animais so injectados intraperitonealmente com uma dose apropriada de um
agente de fixao da metafase (por exemplo: Colcemid d ou colchicina). As amostras sero colhidas
a intervalos regulares a partir desse momento. Esse intervalo corresponde a aproximadamente 3-5
horas para os ratos e a 4-5 horas para os hamsters chineses.

1.5.3 Doses

Se for realizado um estudo para avaliao da gama de doses a administrar, por no estarem disponveis
dados apropriados, esse estudo deve ser executado no mesmo laboratrio, utilizando as mesmas espcies,
linha celular e regime de exposio a utilizar no estudo principal (7). Se existir toxicidade, sero
utilizadas trs doses diferentes para a primeira amostragem. Essas doses devem abranger uma gama
de toxicidade mxima a quase nula. Na segunda amostragem s ser necessrio avaliar a dose mais
elevada. A dose mais elevada definida como a dose que produz sinais de toxicidade tais que indiquem
que a utilizao de doses superiores, com o mesmo regime de administrao, produzir mortalidade.
As substncias com actividade biolgica especfica em doses baixas e no txicas (como acontece
com as hormonas e agentes mitognicos) podero constituir uma excepo aos critrios de fixao
da dose, devendo ser avaliadas numa base casustica. A dose mais elevada pode igualmente ser definida
como uma dose que produz algumas indicaes de toxicidade nas espermatognias (por exemplo:
reduo da taxa de mitose das espermatognias na primeira e segunda metafases meiticas; essa reduo
no deve ser superior a 50 %).

1.5.4 Ensaio limite

Se um ensaio com uma dose de pelo menos 2000 mg/kg de peso corporal numa nica exposio
ou em duas exposies no mesmo dia no produzir nenhum efeito txico perceptvel e se no for
previsvel a existncia de toxicidade gentica com base nos dados respeitantes a substncias estru-
turalmente relacionadas, poder no ser considerado necessrio um estudo completo com utilizao
de trs doses diferentes. A exposio prevista para o ser humano pode indicar a necessidade de se
utilizarem doses mais elevadas nos ensaios limite.

1.5.5 Administrao das doses

A substncia em estudo geralmente administrada por sonda esofgica, utilizando um tubo estomacal
ou cnula de intubao apropriada, ou por injeco intraperitoneal. Podero ser aceites, mediante
justificao, outras vias de administrao. O volume mximo de lquido que pode ser administrado
de cada vez por sonda esofgica ou por injeco depende tambm do tamanho do animal de ensaio,
no devendo exceder 2 ml/100 g de peso corporal. A utilizao de volumes mais elevados deve ser
justificada. Com excepo das substncias que causem irritao ou que sejam corrosivas, cujos efeitos
sero normalmente agravados em concentraes mais altas, a variabilidade do volume de ensaio deve
ser minimizada atravs do ajustamento das concentraes, por forma a garantir um volume constante
para todas as doses a administrar.

1.5.6 Preparao dos cromossomas

Imediatamente aps o sacrifcio devem ser preparadas suspenses celulares de um ou de ambos os


testculos, que sero seguidamente expostas a uma soluo hipotnica e fixadas. As clulas so depois
esfregadas em lminas e coradas.

1.5.7 Anlise

Devem ser analisadas pelo menos 100 clulas em metafase avanada de cada animal (ou seja, um
mnimo de 500 metafases por grupo). Este nmero poder ser menor quando se verificarem taxas
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4937

elevadas de aberraes. Todas as lminas, incluindo as dos controlos positivos e negativos, devem
ser independentemente codificadas antes da anlise microscpica. Uma vez que os procedimentos
de preparao das lminas do frequentemente lugar ruptura de uma certa proporo das clulas
em metafase, com perda de cromossomas, as clulas contabilizadas devem conter um nmero de
centrmeros igual a 2 n 2.

2 Dados

2.1 Tratamento dos resultados

Os dados respeitantes a cada animal devem ser apresentados num quadro. A unidade experimental
o animal. Para cada animal devem ser verificados o nmero de clulas com aberraes cromossmicas
e o nmero de aberraes cromossmicas por clula. Os diferentes tipos de aberrao cromossmica
estrutural devem ser enumerados com os respectivos nmeros e frequncias para os grupos expostos
substncia em estudo e de controlo. A ocorrncia de lacunas registada em separado e includa
no relatrio, mas no geralmente contabilizada para o clculo da frequncia total das aberraes.
Se para alm das mitoses tambm se observarem meioses, a relao entre o nmero de mitoses e
de metafases I ou II das espermatognias deve ser determinada num total de 100 clulas em diviso
por animal, para medio da citotoxicidade em todos os animais expostos substncia em estudo
e do controlo negativo, de forma a poder estabelecer se existem efeitos citotxicos. Se s se observarem
mitoses, o ndice mittico deve ser calculado utilizando pelo menos 1000 clulas de cada animal.

2.2 Avaliao e interpretao dos resultados

H diversos critrios para determinar um resultado positivo, como por exemplo um aumento do nmero
de clulas com aberraes cromossmicas relacionado com a dose ou um claro aumento do nmero
de clulas com aberraes num determinado grupo e numa determinada amostragem. Deve ser tomada
em considerao, antes de mais, a importncia biolgica dos resultados. Como auxlio para a avaliao
dos resultados dos ensaios podero ser utilizados mtodos estatsticos (8), embora a significncia esta-
tstica no deva ser o nico elemento para a determinao de uma resposta positiva. Os resultados
ambguos devem ser esclarecidos atravs de estudos adicionais, de preferncia com modificao das
condies experimentais.
Uma substncia cujos resultados no cumpram os critrios acima indicados no presente ensaio con-
siderada no mutagnica.
Embora a maioria de experincias tenha resultados claramente positivos ou negativos, em casos raros
o conjunto dos dados no permitir que se obtenha uma opinio inequvoca sobre a actividade da
substncia em estudo, podendo acontecer que os resultados continuem a ser ambguos ou duvidosos,
independentemente do nmero de vezes que a experincia seja repetida.
Um resultado positivo no ensaio in vitro para aberraes cromossmicas em espermatognias indica
que a substncia em estudo induz aberraes cromossmicas estruturais nas clulas germinais das
espcies testadas. Um resultado negativo indica que, nas condies do ensaio, a substncia em estudo
no induz aberraes cromossmicas estruturais nas clulas germinais das espcies testadas.
Deve ser discutida a probabilidade de a substncia em estudo ou os seus metabolitos alcanarem
o sistema circulatrio geral ou especificamente o tecido objectivo.

3 Apresentao de relatrios

Relatrio de ensaio

O relatrio de ensaio deve incluir a seguinte informao:


Solvente/veculo:
justificao para a escolha do veculo;
solubilidade e estabilidade da substncia em estudo no solvente/veculo, se conhecida.

Animais de ensaio:
espcie/linha celular utilizada;
nmero e idade dos animais;
origem, condies de acomodao, alimentao, etc.;
peso de cada animal no incio do ensaio, incluindo a gama de pesos, a respectiva mdia e o
desvio padro para cada grupo.

Condies de ensaio:
resultados do estudo para definio da gama de doses, quando tenha sido realizado;
justificao para a seleco das doses;
justificao da via de administrao escolhida;
4938 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

preparao da substncia em estudo;


modo de administrao da substncia em estudo;
justificao do momento do sacrifcio;
converso da concentrao da substncia em estudo (ppm) na alimentao/abeberao para a dose
real (mg/kg peso corporal/dia), quando aplicvel;
qualidade dos alimentos e da gua;
descrio pormenorizada dos calendrios de tratamento e amostragem;
mtodos de medio da toxicidade;
substncia utilizada para fixar a metafase, respectiva concentrao e durao da exposio;
mtodos de preparao das lminas;
critrios de contabilizao das aberraes,
nmero de clulas analisadas por animal;
critrios definidos para que o estudo seja considerado positivo, negativo ou no conclusivo.

Resultados:
sinais de toxicidade;
ndice mittico;
proporo de clulas espermatognias em mitose em relao s clulas em metafase I ou II;
tipo e nmero de aberraes, dicriminados para cada animal;
nmero total de aberraes por grupo;
nmero de clulas aberrantes por grupo;
relao dose-resposta, quando seja possvel determinar;
anlise estatstica, quando tenha sido realizada;
dados relativos ao controlo negativo realizado em paralelo com o ensaio;
dados histricos sobre o controlo negativo, com os respectivos gama, valor mdio e desvio padro;
dados relativos ao controlo positivo realizado em paralelo com o ensaio;
alteraes da ploidia, quando observadas.

Discusso dos resultados.


Concluses.
4 Bibliografia
(1) Adler, I. D. (1986), Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related
to their Cell-Cycle Specifications, in Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic
Efccts and Applied Mutagenesis, Ramel, C., Lambert, B., and Magnusson, J. (eds.), Liss, New York.
pp. 477-484.
(2) Adler, I. D. (1984), Cytogenic tests in Mammals, in Mutagenicity Testing: a Practical Approach,
ed. S. Venitt and J. M. Parry, IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.
(3) Evans, E. P., Breckon, G., and Ford, C. E. (1964), An Air-drying Method for Meiotic Preparations
from Mammalian Tests, Cytogenetics and Cell Genetics, 3, pp. 289-294.
(4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G., and Henderson L. (1990), In Vivo Cyto-
genetic Assays, in D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures.
UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Cambridge
University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
(5) Yamamoto, K., and Kikuchi, Y. (1978), A New Method for Preparation of Mammalian Sper-
matogonial Chromosomes, Mutation Res., 52, pp. 207-209.
(6) Adler, I. D., Shelby, M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T.,
and Tanaka, N. (1994), International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures.
Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests, Mutation Res., 312,
pp. 313-318.
(7) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse,
D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J., and Richold, M. (1992), Report of
British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in
In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.
(8) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold,
M., Papworth, D. G., and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic
Assays, in D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Subcommittee
on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge,
New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.

ANEXO X
B.39 Ensaio in vivo da sntese no programada (UDS) de ADN em clulas do fgado de mamferos
1 Mtodo
O presente mtodo idntico ao mtodo OCDE TB 486 Ensaio in vivo da sntese no programada
(UDS) de ADN em clulas do fgado de mamferos (1997).
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4939

1.1 Introduo
O objectivo do ensaio in vivo da sntese no programada (UDS) de ADN em clulas do fgado de
mamferos identificar as substncias que induzem a reparao do ADN nas clulas do fgado de
animais expostos substncia em estudo (1) (2) (3) (4).
O presente ensaio in vivo apresenta um mtodo para investigao dos efeitos dos produtos qumicos
genotxicos sobre o fgado. O valor limite medido indicativo dos danos e da subsequente reparao
do ADN em clulas do fgado. O fgado geralmente o local principal de metabolizao dos compostos
absorvidos, pelo que particularmente apropriado para avaliar os danos do ADN in vivo.
Se existirem provas de que nem a substncia em estudo nem nenhum dos seus metabolitos reactivos
entram em contacto com o tecido objectivo, o presente ensaio no apropriado.
O ponto final da sntese no programada (UDS) de ADN medido atravs da determinao da
incorporao de nucletidos marcados por clulas que no se encontram numa fase de sntese pro-
gramada de ADN (fase S). A tcnica mais utilizada a determinao da incorporao de timidina
marcada com trtio (3H-TdR) por auto-radiografia. Nos ensaios UDS in vivo so geralmente utilizados
fgados de rato. Podem tambm ser utilizados outros tecidos, mas no esse o objectivo do presente
mtodo.
A deteco de uma resposta UDS depende do nmero de bases do ADN excizadas e substitudas
no local danificado. Por conseguinte, o ensaio UDS particularmente vlido para a deteco de
reparao de cadeias longas (20-30 bases) induzida pela substncia. A reparao de cadeias curtas
(1-3 bases) , pelo contrrio, detectada com uma sensibilidade muito mais baixa. Alm disso, podem
existir eventos mutagnicos decorrentes da no reparao, reparao incorrecta ou de problemas de
replicao das leses do ADN. A extenso da resposta UDS no d qualquer indicao em relao
fidelidade do processo de reparao. Alm disso, possvel que um agente mutagneo reaja com
o ADN, mas que os danos do ADN no sejam posteriormente reparados atravs de um processo
de reparao da exciso. A ausncia de informao especfica sobre a actividade mutagnica do ensaio
UDS compensada pela potencial sensibilidade do seu ponto final, uma vez que medido na totalidade
do genoma.
V. tambm a parte B da introduo geral.

1.2 Definies
Clulas em reparao: apresentam uma granulao nuclear lquida (NNG) superior a um valor pre-
determinado, a justificar pelo laboratrio que conduz o ensaio.
Granulao nuclear lquida (NNG): medida quantitativa da actividade celular UDS em ensaios auto-
-radiogrficos UDS, calculada pela subtraco do nmero mdio de grnulos citoplsmicos em sectores
citoplsmicos equivalentes ao ncleo (CG), ao nmero de grnulos nucleares (NG): NNG=NG CG.
As contagens NNG so calculadas para cada clula e so depois ponderadas para as clulas de uma
cultura, em culturas paralelas, etc.
Sntese no programada (UDS) de ADN: sntese de reparao do ADN aps exciso e remoo de
uma sequncia de ADN que contm uma regio danificada por induo de substncias qumicas ou
de agentes fsicos.

1.3 Princpio do mtodo de ensaio


O ensaio UDS in vivo em clulas do fgado de mamferos indica a ocorrncia de uma sntese de
reparao do ADN aps exciso e remoo de uma sequncia de ADN que continha uma regio
danificada por induo de substncias qumicas ou de agentes fsicos. O ensaio baseia-se geralmente
na incorporao de 3H-TdR no ADN de clulas do fgado com uma baixa proporo de clulas na
fase S do ciclo celular. A incorporao de 3H-TdR geralmente determinada por auto-radiografia,
uma vez que esta tcnica no to sensvel interferncia das clulas em fase S como, por exemplo,
a contagem de cintilao em meio lquido.

1.4 Descrio do mtodo


1.4.1 Preparao
1.4.1.1 Seleco das espcies animais
Geralmente so utilizados ratos, embora possa ser utilizada qualquer outra espcie de mamfero apro-
priada. Devem ser utilizados animais adultos saudveis jovens das raas de laboratrio mais comuns.
No incio do estudo, a diferena de peso entre os animais deve ser mnima, no devendo exceder 20 %
do peso mdio de cada sexo.

1.4.1.2 Condies de acomodao e alimentao


Devem ser aplicadas as condies gerais referidas na introduo geral, parte B, embora o objectivo
para a humidade deva ser de 50 %-60 %.
4940 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

1.4.1.3 Preparao dos animais


Os animais adultos saudveis jovens so distribudos aleatoriamente pelos grupos de controlo e pelos
grupos expostos. As gaiolas devem ser dispostas de modo que eventuais efeitos devidos respectiva
colocao sejam minimizados. Os animais so identificados de forma inequvoca, devendo ser acli-
matados s condies de laboratrio durante pelo menos cinco dias antes de se iniciar o estudo.

1.4.1.4 Preparao das doses


As substncias slidas devem ser dissolvidas ou suspensas em solventes ou veculos adequados e,
se necessrio, diludas antes de serem administradas aos animais. As substncias lquidas podem ser
adicionadas directamente aos sistemas em estudo e ou diludas antes de serem adicionadas s clulas.
Devem ser utilizadas preparaes frescas da substncia em estudo, a menos que os dados de estabilidade
demonstrem que o respectivo armazenamento no coloca problemas para o ensaio.

1.4.2 Condies do ensaio


1.4.2.1 Solvente/veculo
O solvente/veculo no deve reagir com a substncia em estudo, no devendo produzir efeitos txicos
nas doses utilizadas. Caso se utilizem solventes/veculos cujas propriedades no se encontrem totalmente
elucidadas, devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que possvel,
recomenda-se a utilizao de um solvente/veculo aquoso.

1.4.2.2 Controlos
Cada experincia deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente/veculo). Com excep-
o da exposio substncia em estudo, todos os animais, incluindo os dos grupos de controlo,
devem ser manuseados de forma idntica.
Os controlos positivos devem ser substncias comprovadamente causadoras de UDS quando admi-
nistradas aos nveis de exposio a que se espera o surgimento de um aumento detectvel em relao
linha de base. Os controlos positivos que exijam activao metablica devem ser utilizados em doses
que desencadeiem uma resposta moderada (4). A dose de controlo positiva a administrar deve ser
escolhida de modo que os seus efeitos sejam claros, mas tambm que as lminas codificadas no
sejam imediatamente identificadas pela pessoa que procede s leituras. As substncias de controlo
positivo podem incluir, por exemplo:

Tempo de amostragem Substncia Nmero CAS Nmero EINECS

Amostragens iniciais (2-4 horas) . . . . . . . N-nitrosodimetilamina . . . . . . . . . . . . . . 62-75-9 200-249-8


Amostragens finais (12-16 horas) . . . . . . N-2-fluorenilacetamida (2-AAF) . . . . . . 53-96-3 200-188-6

Podem ser utilizadas outras substncias de controlo positivo apropriadas. O controlo positivo pode
ser administrado por uma via diferente da substncia em estudo.

1.5 Procedimento
1.5.1 Nmero e sexo de animais
Deve ser utilizado um nmero de animais suficiente para que a variao biolgica natural seja tomada
em considerao nos resultados do ensaio, com pelo menos trs animais analisveis por grupo. Se
j existir uma base de dados histricos significativa, os grupos de controlo positivo e negativo podero
conter apenas um ou dois animais.
Se no momento do estudo existirem dados disponveis de estudos com as mesmas espcies e com
utilizao da mesma via de administrao que demonstrem que no h qualquer diferena substancial
de toxicidade entre os sexos, ser suficiente testar um nico sexo, de preferncia o sexo masculino.
Nos casos em que a exposio humana aos produtos qumicos possa ser especfica a cada sexo, como
acontece com alguns produtos farmacuticos, o ensaio deve ser executado com animais do sexo em
causa.

1.5.2 Programao do tratamento


As substncias de ensaio so preferivelmente administradas numa nica exposio.

1.5.3 Doses
Normalmente, so utilizadas pelo menos duas doses diferentes. A dose mais elevada definida como
a dose que produz sinais de toxicidade tais que indiquem que a utilizao de doses superiores, com
o mesmo regime de administrao, produzir mortalidade. Em termos gerais, a dose inferior deve
ser de 25 %-50 % da dose mais elevada.
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4941

As substncias com actividade biolgica especfica em doses baixas e no txicas (como acontece
com as hormonas e agentes mitognicos) podero constituir uma excepo aos critrios de fixao
da dose, devendo ser avaliadas caso a caso. Se for realizado um estudo para avaliao da gama de
doses a administrar, por no estarem disponveis dados apropriados, esse estudo deve ser executado
no mesmo laboratrio, utilizando as mesmas espcies, linha celular, sexo e regime de exposio a
utilizar no estudo principal.
A dose mais elevada pode igualmente ser definida como uma dose que produz algumas indicaes
de toxicidade no fgado (por exemplo, ncleos picnticos).

1.5.4 Ensaio limite

Se um ensaio com uma dose de pelo menos 2000 mg/kg de peso corporal numa nica exposio
ou em duas exposies no mesmo dia no produzir nenhum efeito txico perceptvel e se no for
previsvel a existncia de toxicidade gentica com base nos dados respeitantes a substncias estru-
turalmente relacionadas, poder no ser considerado necessrio um estudo completo. A exposio
prevista para o ser humano pode indicar a necessidade de se utilizarem doses mais elevadas nos
ensaios limite.

1.5.5 Administrao das doses

A substncia em estudo geralmente administrada por sonda esofgica, utilizando um tubo estomacal
ou cnula de intubao apropriada. Podero ser aceites, mediante justificao, outras vias de admi-
nistrao, mas a via intraperitoneal no recomendada, uma vez que poder expor o fgado substncia
em estudo directamente, e no atravs do sistema circulatrio. O volume mximo de lquido que
pode ser administrado de cada vez por sonda esofgica ou por injeco depende tambm do tamanho
do animal de ensaio, no devendo exceder 2 ml/100 g de peso corporal. A utilizao de volumes mais
elevados deve ser justificada. Com excepo das substncias que causem irritao ou que sejam cor-
rosivas, cujos efeitos sero normalmente agravados em concentraes mais altas, a variabilidade do
volume de ensaio deve ser minimizada atravs do ajustamento das concentraes, por forma a garantir
um volume constante para todas as doses a administrar.

1.5.6 Preparao das clulas de fgado

As clulas do fgado so normalmente preparadas a partir dos animais expostos substncia em


estudo 12-16 horas aps a administrao da substncia em estudo. Geralmente ser necessrio realizar
uma primeira amostra (normalmente 2-4 horas aps a exposio), que s no ter de ser utilizada
quando haja uma resposta positiva clara s 12-16 horas. Contudo, podem ser utilizados outros tempos
de amostragem, desde que sejam justificados com base em dados toxicocinticos.
As culturas celulares de curta durao do fgado de mamferos so geralmente preparadas irrigando
o fgado in situ com colagenase e deixando que algumas clulas livres separadas do fgado h pouco
tempo se fixem a uma superfcie apropriada. As clulas do fgado de animais do controlo negativo
devem ter uma viabilidade de pelo menos 50 % (5).

1.5.7 Determinao da UDS

As clulas de fgado de mamfero isoladas h pouco tempo so geralmente incubadas num meio
que contm 3H-TdR durante um perodo adequado, por exemplo 3-8 horas. No final do perodo
de incubao, as clulas so lavadas para remover o meio residual e depois incubadas num meio
com excesso de timidina no rotulada, para diminuir a radioactividade no incorporada (lavagem
a frio). As clulas so ento enxaguadas, fixadas e secas. Para os tempos de incubao mais prolongados,
pode no ser necessria a lavagem a frio. As lminas so mergulhadas na emulso auto-radiogrfica,
expostas na obscuridade (ou seja, refrigeradas durante 7-14 dias), reveladas e coradas, aps o que
se procede contagem dos grnulos de prata expostos. Devem ser preparadas duas ou trs lminas
de cada animal.

1.5.8 Anlise

As preparaes devem conter um nmero suficiente de clulas com morfologia normal para permitir
uma avaliao significativa da UDS. As preparaes so examinadas microscopicamente para sinais
de citotoxicidade evidente (por exemplo, picnose e nveis diminudos de radiao proveniente da timina
rotulada).
As lminas devem ser codificadas antes da contagem dos grnulos. Normalmente so contadas 100 clulas
de cada animal, de pelo menos duas lminas; se forem contadas menos de 100 clulas/animal, deve
ser fornecida uma justificao. As contagens dos grnulos dos ncleos em fase S no so tomadas
em considerao, mas a proporo de clulas em fase S pode ser registada.
O grau de incorporao da 3H-TdR nos ncleos e citoplasma das clulas morfologicamente normais,
evidenciado pelo depsito de grnulos de prata, deve ser determinado por mtodos apropriados.
4942 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

As contagens de grnulos so determinadas nos ncleos (grnulos nucleares, NG) e em sectores do


citoplasma equivalentes ao ncleo (grnulos citoplsmicos, CG). As contagens de CG so feitas no
sector do citoplasma mais rotulado ou fazendo a mdia de dois ou trs locais com grnulos citoplsmicos
escolhidos aleatoriamente junto regio do ncleo. Outros mtodos de contagem (por exemplo, con-
tagem de clulas inteiras) podem ser utilizados, se se justificarem (6).

2 Dados
2.1 Tratamento dos resultados
Devem ser apresentados dados relativos a cada lmina e a cada animal. Para alm disso, todos os
dados devem ser apresentados sob a forma de um quadro. As contagens de granulao nuclear lquida
(NNG) devem ser calculadas para cada clula, para cada animal, para cada dose e para cada tempo
de colheita, subtraindo as contagens CG das contagens NG. Se forem contadas as clulas em reparao,
os critrios para definir essas clulas devem ser justificados e baseados em dados histricos ou dos
controlos negativos realizados em paralelo com o ensaio. Os resultados numricos podem ser avaliados
atravs de mtodos estatsticos. Os mtodos estatsticos a utilizar eventualmente devem ser escolhidos
e justificados antes da realizao do estudo.

2.2 Avaliao e interpretao dos resultados


Os exemplos de critrios para a definio de uma resposta como positiva/negativa incluem:
positiva i) Valores de NNG positivos, acima de um limiar predefinido, justificado com base nos
dados histricos do laboratrio;
ou ii) Valores de NNG significativamente superiores aos do controlo em paralelo;
negativa i) Valores de NNG iguais/inferiores ao limiar de controlo histrico;
ou ii) Valores de NNG no significativamente superiores aos do controlo em paralelo.

A importncia biolgica dos dados deve ser considerada, ou seja, devem ser tomados em considerao
parmetros como a variao de animal para animal, a relao dose/resposta e a citotoxicidade. Como
auxlio para a avaliao dos resultados dos ensaios, podero ser utilizados mtodos estatsticos, embora
a significncia estatstica no deva ser o nico elemento para a determinao de uma resposta positiva.
Embora a maioria das experincias tenha resultados claramente positivos ou negativos, em casos raros
o conjunto dos dados no permitir que se obtenha uma opinio inequvoca sobre a actividade da
substncia em estudo, podendo acontecer que os resultados continuem a ser ambguos ou duvidosos
independentemente do nmero de vezes que a experincia seja repetida.
Um resultado positivo no ensaio UDS em clulas do fgado de mamferos in vivo indica que a substncia
em estudo induz danos no ADN das clulas do fgado de mamferos in vivo que podem ser reparados
por sntese no programada de ADN in vitro. Um resultado negativo indica que, nas condies do
ensaio, a substncia em estudo no induz danos no ADN que sejam detectveis pelo presente ensaio.
Deve ser discutida a probabilidade de a substncia em estudo ou os seus metabolitos alcanarem
o sistema circulatrio geral ou especificamente o tecido objectivo (ou seja, a toxicidade sistmica).

3 Apresentao de relatrios
Relatrio de ensaio
O relatrio de ensaio deve incluir a seguinte informao:
Solvente/veculo:
justificao para a escolha do veculo;
solubilidade e estabilidade da substncia em estudo no solvente/veculo, se conhecida.

Animais de ensaio:
espcie/linha celular utilizada;
nmero, idade e sexo dos animais;
origem, condies de acomodao, alimentao, etc.;
peso de cada animal no incio do ensaio, incluindo a gama de pesos, a respectiva mdia e o
desvio padro para cada grupo.

Condies de ensaio:
controlos positivos e negativos veculo/solvente;
resultados do estudo para definio da gama de doses, quando tenha sido realizado;
justificao para a seleco das doses;
preparao da substncia em estudo;
modo de administrao da substncia em estudo;
justificao da via de administrao escolhida;
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4943

mtodos usados para verificar se o agente em estudo atingiu o sistema circulatrio geral, caso
tenham sido utilizados;
converso da concentrao da substncia em estudo na alimentao/abeberao (ppm) para a dose
real (mg/kg peso corporal/dia), quando aplicvel;
qualidade dos alimentos e da gua;
descrio pormenorizada dos calendrios de tratamento e amostragem;
mtodos de medio da toxicidade;
mtodo de preparao e cultura das clulas do fgado;
tcnica de auto-radiografia utilizada;
nmero de lminas preparadas e nmero de clulas contabilizadas;
critrios de avaliao;
critrios definidos para que o estudo seja considerado positivo, negativo ou no conclusivo.

Resultados:
valores mdios das contagens de grnulos nucleares, grnulos citoplsmicos e da granulao nuclear
lquida para cada lmina, animal e grupo;
relao dose-resposta, quando seja possvel determinar;
anlise estatstica, quando tenha sido realizada;
sinais de toxicidade;
dados relativos aos controlos positivos e negativos (solvente/veculo) realizados em paralelo com
o ensaio;
dados histricos relativos aos controlos positivos e negativos (solvente/veculo) realizados em paralelo
com o ensaio, com os respectivos gama, valor mdio e desvio padro;
nmero de clulas em reparao, caso tenham sido contabilizadas;
nmero de clulas em fase S, caso tenham sido contadas;
viabilidade das clulas.

Discusso dos resultados.


Concluses.

4 Bibliografia
(1) Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson, B., and Penman, M. G. (1985), An Assessment of the In
Vivo Rat Hepatocyte DNA Repair Assay, Mutation Res., 156, pp. 1-18.
(2) Butterworth, B. E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., Mirsalis, J., Probst, G., and Williams, G.
(1987), A Protocol and Guide for the In Vivo Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay, Mutation Res.,
189, pp. 123-133.
(3) Kennelly, J. C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson, B., Benford, D. J., Dean, S. W.,
and Mitchell, I. de G. (1993), In Vivo Rat Liver UDS Assay, in Kirkland, D. J., and Fox M.
(eds.), Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recommended Procedures, UKEMS Subcommittee
on Guidelines for Mutagenicity Testing Report. Part II revised, Cambridge University Press, Cambridge,
New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 52-77.
(4) Madle, S., Dean, S. W., Andrae, U., Brambilla, G., Burlinson, B., Doolittle, D. J., Furihata, C.,
Hertner, T., McQueen, C. A., and Mori, H. (1993), Recommendations for the Performance of
UDS Tests In Vitro and In Vivo, Mutations Res., 312, pp. 263-285.
(5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E., and Hechenberger-Freudl, C. (1993), Assessment of the
Relation Between the Initital Viability and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes
Used for the In Vivo/In Vitro DNA Repair Assay (UDS), Mutation Res., 291, pp. 21-27.
(6) Mirsalis, J. C., Tyson, C. K., Butterworth, B. E. (1982), Detection of Genotoxic Carcinogens in
the In Vivo/In Vitro Hepatocyte DNA Repair Assay, Environ Mutagen, 4, pp. 553-562.

ANEXO XI
B.40 Corrosividade cutnea
1 Mtodo
1.1 Introduo
O Centro Europeu de Validao de Mtodos Alternativos (ECVAM, Centro Comum de Investigao,
Comisso Europeia) reconheceu a validade cientfica de dois ensaios in vitro para a corrosividade
cutnea, o ensaio de resistncia elctrica transcutnea (transcutaneous electrical resistance TER) em
pele de rato e um ensaio com um modelo de pele humana (ECVAM, Centro Comum de Investigao,
Comisso Europeia) (1) (2) (3). Os estudos de validao levados a cabo pelo ECVAM demonstraram
que ambos os ensaios permitem distinguir de forma fivel as substncias corrosivas das no corrosivas
para a pele. Para alm disso, o protocolo do ensaio baseado no modelo de pele humana permitiu
distinguir correctamente entre os diferentes graus de efeito corrosivo (R35 altamente corrosivo
e R34 corrosivo) (2). Apresentam-se a seguir a descrio e os procedimentos de ambos os ensaios;
a escolha do ensaio depende das exigncias especficas e das preferncias do utilizador.
V. tambm a introduo geral, parte B.
4944 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

1.2 Definies

Corrosividadede cutnea: produo de danos irreversveis dos tecidos cutneos no seguimento da apli-
cao de material de ensaio.

1.3 Substncias de referncia

Nenhuma especificada, mas v. pontos 1.5.3.4 e 1.7.2.3.

1.4 Princpio do mtodo de ensaio Ensaio TER em pele de rato

O material a testar aplicado durante um perodo de at 24 horas sobre a superfcie da epiderme


de discos de pele de ratos jovens sacrificados sem crueldade. Os materiais corrosivos so identificados
pela sua capacidade de causarem uma perda da integridade normal do stratum corneum e da funo
de barreira, perda essa que medida pela reduo do TER intrnseco abaixo de um determinado
limiar (5 kZ) (4) (5). Os materiais simplesmente irritantes e os materiais no irritantes no reduzem
o TER abaixo desse limiar. Para as substncias tensoactivas e para os compostos orgnicos neutros,
pode ainda ser incorporado no ensaio um passo de ligao a um corante [para as definies neste
contexto, v. a referncia (6)], a fim de reduzir o nmero de falsos positivos caracterstico dos ensaios
deste tipo de substncias qumicas (2) (7).

1.5 Descrio do mtodo de ensaio Ensaio TER em pele de rato

1.5.1 Animais

Para a preparao dos discos de pele so utilizados ratos jovens (20-23 dias) (Wistar ou estirpe com-
parvel). Os pelos dorsais e dos flancos so removidos cuidadosamente, com a ajuda de pequenas
tesouras. Os animais so depois cuidadosamente lavados e esfregados, devendo a zona da pele que
ir ser utilizada ser mergulhada numa soluo antibitica (contendo, por exemplo, estreptomicina,
penicilina, cloranfenicol e anfoteriicina a concentraes suficientes para inibir o crescimento bacteriano).
Os animais so novamente lavados com uma soluo antibitica no terceiro ou no quarto dia aps
a primeira lavagem, devendo depois ser utilizados num prazo de trs dias (para a preparao das
peles no devero ser utilizados animais com uma idade superior a 31 dias).

1.5.2 Preparao dos discos de pele

Os animais so sacrificados sem crueldade. A pele dorsal dos animais depois retirada e a gordura
em excesso removida atravs de raspagem cuidadosa. A pele colocada sobre a extremidade de
um tubo de politetrafluoroetileno/(PTFE), com o cuidado de garantir que a superfcie epidrmica
esteja em contacto com o tubo. A pele fixa na extremidade do tubo com uma junta tnica em
borracha e elimina-se o tecido em excesso. As dimenses do tubo e da junta tnica so as apresentadas
na figura 1. A junta tnica deve ser envolvida em vaselina, de forma a garantir a estanquecidade
da sua unio com o tubo de PTFE. O tubo depois suspenso por uma mola dentro de uma cmara
com uma soluo de sulfato de magnsio (154 mM) (figura 2).

1.5.3 Procedimento de ensaio

1.5.3.1 Aplicao do material de ensaio

As substncias de ensaio lquidas (150 ml) so aplicadas na superfcie epidrmica no interior do tubo
(figura 2). Quando a substncia de ensaio for slida, dever ser aplicada uma quantidade suficiente
para garantir a cobertura de toda a superfcie epidrmica. Por cima dessa substncia depois acres-
centada gua desionizada (150 ml) e os tubos so ligeiramente agitados. As substncias de ensaio
devero estar em contacto com toda a superfcie da pele. No caso de algumas substncias slidas,
poder ser necessrio aquecer a mistura a 30oC para fluidificar a substncia ou ainda proceder a
uma moagem para obteno de um material granular ou pulverulento.
Para cada substncia de ensaio sero utilizados trs discos de pele. As substncias de ensaio so
aplicadas durante um perodo de 24 horas (v. tambm o ponto 1.5.3.4). A substncia de ensaio dever
depois ser removida por lavagem em gua corrente a uma temperatura mxima de 30oC at remoo
completa de todo o material. A remoo das substncias de ensaio que tenham eventualmente soli-
dificado poder ser facilitada utilizando um jacto de gua a uma temperatura de cerca de 30oC.

1.5.3.2 Medies TER

A TER medida utilizando um databridge de corrente alterna de baixa voltagem (por exemplo: AIM
401 ou 6401, ou outro modelo equivalente). Antes da medio da resistncia elctrica, a tenso superficial
da pele reduzida atravs da adio de um volume suficiente de etanol a 70 % para cobrir toda
a epiderme. Aps alguns segundos, o etanol dever ser removido invertendo o tubo e o tecido
depois hidratado atravs da adio de 3 ml de soluo de sulfato de magnsio (154 mM). Os elctrodos
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4945

do databridge so colocados em duas extremidades do disco de pele de forma a medir a resistncia


em kZ/disco (figura 2). As dimenses dos elctrodos e o comprimento de elctrodo que dever ficar
livre por baixo da mola so indicados na figura 1. A parte interior (mais grossa) do elctrodo dever
estar apoiada borda do tubo de PTFE durante a medio da resistncia, de forma a garantir que
o comprimento de elctrodo mergulhado na soluo de sulfato de magnsio seja constante. O elctrodo
exterior (mais fino) dever ser colocado dentro da cmara receptora de forma a tocar o fundo da
mesma. A distncia entre a parte inferior da mola e o fundo do tubo de PTFE dever ser mantida
constante (figura 1), visto que afecta o valor de resistncia medido.
De notar que nos casos em que seja medida uma resistncia superior a 20 kZ, isso se poder dever
ao facto de a substncia de ensaio estar a impedir o acesso da soluo ao disco de epiderme. Para
resolver esse problema, uma das possibilidades ser tapar o tubo de PTFE com o dedo, usando luvas
de borracha, e agitar durante cerca de 10 segundos. A soluo de sulfato de magnsio dever ento
ser deitada fora e substituda por soluo fresca para a realizao da medio.
A mdia dos valores de TER medidos poder ser aceite, desde que os valores medidos em amostras
de controlo positivo e negativo simultneas com o ensaio se encontrem dentro dos valores normais
para o mtodo. As substncias de controlo que podero ser utilizadas e os respectivos valores aceitveis
para a metodologia e instrumentos aqui descritos so:

Controlo Substncia Gama de resistncia (kZ)

Positivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . cido clordrico 10 M (36 %) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5-1,0


Negativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . gua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10-25

1.5.3.3 Procedimento alterado para as substncias tensoactivas e para as substncias orgnicas neutras
Se os valores de TER das substncias de ensaio que sejam tensoactivas ou que sejam substncias
orgnicas neutras forem inferiores ou iguais a 5 kZ, poder proceder-se a uma avaliao da penetrao
de corantes nos tecidos. Esse procedimento permitir determinar se os resultados so ou no falsos
positivos (2).

1.5.3.3.1 Aplicao e eliminao do corante sulforhodamina B


Aps o tratamento inicial com a substncia de ensaio, aplicam-se superfcie epidrmica de cada
disco de pele 150 ml de uma soluo a 10 % (p/v) do corante sulforhodamina B em gua destilada,
durante 2 horas. Os discos so depois lavados em gua corrente temperatura ambiente durante
cerca de 10 segundos, a fim de remover o corante em excesso/no fixado. Os discos de pele devero
ento ser cuidadosamente retirados do tubo de PTFE e colocados num recipiente (por expemplo:
um frasco de 20 ml) com gua desmineralizada (8 ml). Os frascos so cuidadosamente agitados durante
5 minutos, para remover o corante que eventualmente ainda exista em excesso/no fixado. Esse pro-
cedimento de lavagem dever depois ser repetido, aps o que os discos de pele devero ser transferidos
para frascos com 5 ml de uma soluo a 30 % (p/v) de dodecil sulfato de sdio (SDS) em gua destilada
e incubados a 60oC de um dia para o outro. Aps a incubao, os discos de pele so retirados e
deitados fora, e a soluo centrifugada durante 8 minutos a 21oC (fora relativa de centrifugao:
D 175). Uma amostra de 1 ml do sobrenadante ser ento diluda num factor de 1:5 (v/v) [ou seja,
1 ml+4 ml] numa soluo a 30 % (p/v) de SDS em gua destilada. A densidade ptica (DO) da soluo
dever ento ser medida a cerca de 565 nm.

1.5.3.3.2 Clculo do teor em corante


O teor do corante sulforhodamina B por disco calculado a partir dos valores de DO (coeficiente
de extino molar do corante sulforhodamina B a 565 nm=8,7104; peso molecular=580). O teor
dever ser determinado para cada disco de pele e tambm em termos de valor mdio dos replicados.
Podero ser aceitveis valores mdios para a ligao do corante, desde que os valores medidos nos
controlos se encontrem dentro das gamas normais para o mtodo. As gamas de concentrao do
corante que podero ser utilizadas nas substncias de controlo para a metodologia e instrumentos
aqui descritos so:

Gama de teores
Controlo Substncia em corante
(lg/disco)

Positivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . cido clordrico 10 M (36 %) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40-100


Negativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . gua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15-35

1.5.3.4 Informao adicional


As substncias de ensaio tambm podero ser aplicadas por perodos de tempo menores (por exemplo,
2 horas), para identificao dos materiais mais severamente corrosivos. Contudo, no estudo de validao,
4946 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

verificou-se que o ensaio TER resulta na sobrestimao do potencial corrosivo de diversos materiais
de ensaio quando se utiliza uma aplicao de apenas 2 horas (2), embora permita uma identificao
correcta das substncias corrosivas e no corrosivas aps uma aplicao ao longo de 24 horas.
As propriedades e dimenses do aparelho a utilizar nos ensaios e o procedimento experimental aplicado
podem influenciar os valores de TER obtidos. O limiar de corroso de 5 kX foi desenvolvido a partir
dos dados obtidos com o aparelho e com os procedimentos descritos no presente mtodo. Podero
ser aplicveis outros limiares e valores de controlo se as condies do ensaio forem significativamente
diferentes. Logo, recomenda-se que a metodologia e os valores para o limiar de resistncia sejam
calibrados atravs do ensaio de uma srie de materiais de referncia a seleccionar de entre os materiais
utilizados no estudo de validao (3).

1.6 Princpio do mtodo de ensaio Ensaio em modelo de pele humana


O material de ensaio aplicado localmente por um perodo que poder ir at 4 horas num modelo
tridimensional de pele humana, que inclui uma epiderme reconstruda com um stratum corneum fun-
cional. Os materiais corrosivos so identificados pela sua capacidade de diminuio da viabilidade
celular (que poder ser determinada, por exemplo, utilizando o ensaio de reduo MTT) abaixo de
determinados limiares em funo dos perodos de exposio utilizados. O princpio do ensaio baseia-se
na hiptese de que as substncias qumicas corrosivas so as que conseguem penetrar o stratum corneum
(por difuso ou por eroso) e que so suficientemente citotxicas para causar morte celular nas camadas
celulares subjacentes.

1.7 Descrio do mtodo de ensaio Ensaio em modelo de pele humana


1.7.1 Modelo de pele humana
Os modelos de pele humana podem ter diversas origens, mas devem sempre cumprir determinados
critrios. Assim, o modelo dever ter um stratum corneum funcional e uma camada subjacente de
clulas vivas. O stratum corneum dever ter uma funo de barreira adequada. Essa caracterstica
poder ser comprovada atravs da demonstrao da resistncia do modelo citotoxicidade aps aplicao
de substncias comprovadamente citotxicas mas que normalmente no conseguem atravessar o stratum
corneum. Para alm disso, dever demonstrar-se que o modelo permite obter resultados reprodutveis
em determinadas condies experimentais.
A viabilidade celular das clulas vivas do modelo dever ser suficiente para permitir distinguir bem
os resultados das substncias de controlo positivo e negativo. A viabilidade celular (medida, por exemplo,
pela reduo do MTT, ou seja, por um valor de DO) aps a exposio substncia de controlo
negativo dever manter-se em nveis aceitveis para o modelo de pele especfico que esteja a ser
utilizado. Da mesma forma, os valores da viabilidade celular aps exposio substncia de controlo
positivo (por comparao com a viabilidade do controlo negativo) dever tambm situar-se dentro
de determinados limites. Mais importante ainda, o modelo preditivo utilizado dever ter sido certificado
de acordo com normas de validao internacionais (2).

1.7.2 Procedimento de ensaio


1.7.2.1 Aplicao do material de ensaio
Para os materiais lquidos dever ser aplicada uma quantidade suficiente para cobrir toda a superfcie
de pele (no mnimo 25 ll/cm2). Para os materiais slidos dever ser tambm aplicada uma quantidade
suficiente para cobrir toda a pele e humidificada por forma a garantir um bom contacto com a pele:
quando necessrio, os slidos podero ser modos antes da aplicao. Dever ser demonstrado que
o mtodo de aplicao utilizado adequado para diversos tipos qumicos (2). Aps o perodo de
exposio, o material de ensaio dever ser cuidadosamente lavado da superfcie da pele com uma
soluo salina.

1.7.2.2 Medio da viabilidade celular


A viabilidade celular poder ser medida atravs de qualquer mtodo quantitativo devidamente validado.
O ensaio utilizado mais frequentemente a reduo do MTT, que permite comprovadamente obter
resultados fiveis e reprodutveis entre laboratrios (2). O disco de pele colocado numa soluo
MTT a 0,3 mg/ml, a 20oC-28oC durante 3 horas. O precipitado azul de formazan depois extrado
(extraco com solvente) e a sua concentrao medida atravs da determinao da DO a um com-
primento de onda entre 545 nm e 595 nm.

1.7.2.3 Outras informaes


O modelo de pele utilizado, tal como o protocolo exacto para o tempo de exposio, os procedimentos
de lavagem, etc., tero um impacte significativo sobre os resultados em termos de viabilidade celular.
Recomenda-se que a metodologia e o modelo preditivo sejam calibrados atravs do ensaio de uma
srie de padres a escolher de entre os produtos qumicos utilizados no estudo de validao do
ECVAM (3). Um dos factores crticos ser a demonstrao da reprodutibilidade do mtodo utilizado
infra e interlaboratrios para diversos produtos qumicos, de acordo com as normas internacionais.
O mtodo dever cumprir, no mnimo, os critrios de validade cientfica j definidos (2) e os resultados
dos estudos de validao devem ser publicados em revista cientfica dedicada a estudos comparativos.
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2 Dados
2.1 Tratamento dos resultados
2.1.1 Ensaio TER em pele de rato
Os valores de resistncia (kX) do material de ensaio, dos controlos positivo e negativo e de qualquer
produto qumico padro utilizado devero ser apresentados sob a forma de uma tabela, incluindo
todos os dados relativos aos replicados/repetio de experincias, os valores mdios e as classificaes
da deduzidas em termos de corrosividade.

2.1.2 Ensaio em modelo de pele humana


Os valores da DO e os dados relativos aos clculos da percentagem de viabilidade celular do material
de ensaio, dos controlos positivo e negativo e de qualquer produto qumico padro utilizado devero
ser apresentados sob a forma de uma tabela, incluindo todos os dados relativos aos replicados/repetio
de experincias, os valores mdios e as classificaes da deduzidas em termos de corrosividade.

2.2 Avaliao e interpretao dos resultados


2.2.1 Ensaio TER em pele de rato
Caso o valor mdio de TER obtido para a substncia de ensaio seja superior a 5 kX, a substncia
considerada no corrosiva. Se o valor do TER for inferior a ou igual a 5 kX e se a substncia
em causa no for tensoactiva nem um composto orgnico neutro, ser considerada corrosiva.
Se a substncia for tensoactiva ou um composto orgnico neutro e se o valor de TER for inferior
ou igual a 5 kX, poder proceder-se a um tratamento com corante. Se o teor mdio de corante dos
discos for superior ou igual ao teor mdio de corante dos discos de controlo positivo com HCl a
36 % testados em simultneo, o resultado da substncia de ensaio um positivo verdadeiro e portanto
a substncia deve ser considerada corrosiva. Se o teor mdio de corante dos discos for inferior ao
teor mdio de corante dos discos de controlo positivo com HCl a 36 % testados em simultneo, o
resultado da substncia de ensaio um falso positivo e portanto a substncia deve ser considerada
como no corrosiva.

2.2.2 Ensaio em modelo de pele humana


O valor de DO do controlo negativo representa 100 % de viabilidade celular, pelo que os valores
obtidos para cada amostra de ensaio podero ser utilizados para calcular uma percentagem de viabilidade
relativa em relao ao controlo negativo. A percentagem que dever ser considerada para separar
os materiais de ensaio corrosivos dos no corrosivos (ou para distinguir entre as diferentes classes
de corrosividade) devero ser claramente definidos no modelo preditivo durante a validao do mtodo,
e deve ser demonstrado, no quadro do estudo de validao, que esse valor apropriado (2).

3 Apresentao dos resultados


Relatrio de ensaio
O relatrio do ensaio dever incluir, pelo menos, as seguintes informaes:
Substncia de ensaio:
identificao, caractersticas fsicas e, se necessrio, fsico-qumicas. Se forem utilizadas substncias
de referncia, dever ser tambm apresentada a mesma informao em relao a essas substncias.

Condies do ensaio:
procedimento de ensaio utilizado;
descrio e justificao de eventuais modificaes.

Resultados:
tabelas com os valores de resistncia (ensaio TER) ou com as percentagens de viabilidade celular
(ensaio em modelo de pele humana) dos materiais de ensaio, dos controlos positivo e negativo
e de qualquer produto qumico padro que tenha sido utilizado, incluindo todos os dados relativos
aos replicados/repetio de experincias e valores mdios;
descrio de outros efeitos eventualmente observados.

Discusso dos resultados.


Concluses.

4 Bibliografia
(1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views, ATLA, 26, pp. 275-280.
(2) Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balis, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile,
D. J., Holzhutter, H-G. & Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on
4948 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

in vitro tests for skin corrosivity 2, Results and evaluation by the Management Team, Toxicology
in Vitro, 12, pp. 483-524.
(3) Barratt, M. D., Brantom, P. G., Fentem, J. H., Gerner, I., Walker, A. P. & Worth, A. P. (1998),
The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection
and distribution of the test chemicals, Toxicology in Vitro, 12, pp. 471-482.
(4) Oliver, G. J. A., Pemberton, M. A. & Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test modi-
fications and validation, Food & Chemical Toxicology, 24, pp. 507-512.
(5) Botham, P. A., Hall, T. J., Dennett, R., McCall, J. C., Basketter, D. A., Whittle, E., Cheeseman,
M., Esdaile, D. J. & Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory
trial, Toxicology in Vitro, 6, pp. 191-194.
(6) Worth, A. P., Fentem, J. H., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J.
& Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion,
ATLA, 26, pp. 709-720.
(7) Botham, P. A., Chamberlain, M., Barratt, M. D., Curren, R. D., Esdaile, D. J., Gardner, J. R.,
Gordon, V. C., Hildebrand, B., Lewis, R. W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec,
M., Regnier, J. F., Steiling, W., Walker, A. P. & Balls, M. (1995), A prevalidation study on
in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLA,
23, pp. 219-255.

FIGURA 1

Dimenses do tubo de PTFE

Dimenses do elctrodo
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4949
FIGURA 2

Montagem para o ensaio TER em pele de rato

ANEXO XII
B.41 Fototoxicidade ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU
1 Mtodo
1.1 Introduo
A fototoxicidade definida como uma reaco txica decorrente da primeira exposio da pele a
determinadas substncias qumicas, com posterior exposio luz ou por irradiao da pele na sequncia
da administrao sistmica de uma substncia qumica.
A informao decorrente do ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU utilizada para definir o
potencial fototxico de uma substncia em estudo, ou seja, a existncia ou ausncia de possveis riscos
associados a uma substncia em estudo, por exposio radiao UV e visvel.
Dado que o objectivo toxicolgico do ensaio in vitro consiste na determinao da fotocitotoxicidade
decorrente da aco combinada de uma substncia e de uma radiao, o ensaio permite identificar
compostos que exibem fototoxicidade in vivo na sequncia da sua administrao sistmica e difuso
na pele, bem como compostos fotoirritantes na sequncia da sua aplicao tpica na pele.
O ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU foi elaborado e validado entre 1992 e 1997 no mbito
de um projecto conjunto UE/COLIPA (1) (2) (3), com o objectivo de estabelecer um mtodo in
vitro vlido destinado a substituir os diversos ensaios in vivo utilizados. Num seminrio da OCDE
realizado em 1996 foi recomendada a adopo de uma abordagem sequencial in vitro para avaliar
a fototoxicidade (4).
Os resultados do ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU foram comparados com os efeitos de
fototoxicidade/fotoirritao aguda in vivo em animais e no homem, tendo o ensaio revelado uma excelente
previsibilidade dos referidos efeitos. O ensaio no concebido para detectar outros efeitos nocivos
decorrentes da aco combinada das substncias qumicas e a das radiaes, nomeadamente a foto-
genotoxicidade, a fotoalergia e a fotocarcinogenicidade, embora muitas substncias qumicas que apre-
sentam essas propriedades exibam uma reaco positiva no ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU.
O ensaio no tambm concebido para avaliar o potencial fototxico.
O apndice I apresenta abordagem sequencial para a determinao da fototoxicidade de substncias
qumicas.
4950 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

1.2 Definies
Irradincia: intensidade da radiao ultravioleta (UV) ou visvel que incide numa superfcie, expressa
em W/m2 ou mW/cm2.
Dose de radiao: quantidade (=intensidadetempo) de radiao ultravioleta (UV) ou visvel que
incide numa superfcie, expressa em joules (=Ws) por unidade de superfcie (por exemplo, J/m2
ou J/cm2).
Bandas de comprimentos de onda da radiao UV: as designaes recomendadas pela CIE (Commission
Internationale de lclairage) so: UVA (315 nm-400 nm), UVB (280 nm-315 nm) e UVC
(100 nm-280 nm). Utilizam-se tambm outras designaes: o limite entre UVB e UVA frequentemente
situado a 320 nm, podendo as radiaes UVA subdividir-se em UV-A1 e UV-A2, com uma separao
a cerca de 340 nm.
Viabilidade celular: parmetro que mede a actividade total de uma populao celular (por exemplo,
absoro do pigmento vital vermelho neutro pelos lisosomas celulares); em funo da varivel deter-
minada e do tipo de ensaio realizado, possvel correlacionar a viabilidade celular com o nmero
total e ou a vitalidade das clulas.
Viabilidade celular relativa: viabilidade celular expressa em relao aos ensaios de controlo negativos
(apenas com o solvente) efectuados ao longo do procedimento de ensaio (+UV ou UV), na ausncia
da substncia em estudo.
Modelo de previso: algoritmo utilizado para transformar os resultados de um ensaio de toxicidade
numa previso do potencial de toxicidade: No mbito das presentes directrizes de ensaio, podem
utilizar-se os parmetros PIF e MPE para transformar os resultados do ensaio de fototoxicidade in
vitro 3T3 NRU numa previso do potencial fototxico.
PIF (photo irritation factor Factor de fotoirritao): factor obtido por comparao entre duas con-
centraes citotxicas igualmente eficazes (EC50) da substncia em estudo, respectivamente sem ( UV)
e com exposio (+UV) a uma dose no citotxica de radiao UVA/visvel.
MPE (mean photo effect Fotoefeito mdio): parmetro obtido por tratamento matemtico do traado
de duas curvas concentrao-efeito obtidas, respectivamente, sem ( UV) e com (+UV) exposio
a uma dose no citotxica de radiao UVA/visvel.
Fototoxicidade: reaco txica aguda decorrente da exposio da pele a determinadas substncias qu-
micas e sua posterior exposio luz, ou por irradiao da pele aps a administrao sistmica de
uma substncia qumica.
Fotoirritao: subcategoria do termo fototoxicidade utilizada apenas para descrever as reaces foto-
txicas da pele decorrentes da exposio, por aplicao tpica ou administrao oral, a substncias
qumicas. As referidas reaces fototxicas provocam sempre danos celulares no especficos (do tipo
eritema solar).
Fotoalergia: reaco imunolgica adquirida, que no ocorre na sequncia da primeira exposio
substncia qumica e radiao, sendo necessrio um perodo de induo de uma ou duas semanas
para que se observe reaco cutnea.
Fotogenotoxicidade: reaco genotxica observada para um parmetro gentico, produzido na sequncia
da exposio das clulas a uma dose no genotxica de radiao UV/visvel e a uma substncia qumica
no genotxica.
Fotocarcinogenicidade: carcinogenicidade induzida pela exposio repetida s radiaes e a uma subs-
tncia qumica. Utiliza-se o termo fotocarcinognese quando o efeito cancergeno das radiaes
UV reforado pela exposio a uma substncia qumica.

1.3 Substncias de referncia


Alm da clorpromacina utilizada para o controlo positivo, que deve ser analisada paralelamente em
cada ensaio, recomenda-se a utilizao como substncias de referncia no ensaio de fototoxicidade
3T3 NRU de um subconjunto das substncias qumicas utilizadas para o mesmo fim nos ensaios inter-
laboratoriais (1) (3) (13).

1.4 Consideraes preliminares


Existem inmeras referncias aos efeitos fototxicos de muitas substncias (5) (6) (7) (8). A nica
caracterstica comum das referidas substncias consiste na capacidade de absorver a energia luminosa
da radiao solar. De acordo com a primeira lei da fotoqumica (lei de Grotthaus-Draper), necessria
a absoro de uma quantidade suficiente de quanta de luz para que se observe fotorreaco. Deste
modo, antes de realizar um ensaio biolgico em conformidade com as presentes directrizes, deve
determinar-se o espectro de absoro no UV/visvel da substncia em estudo (por exemplo de acordo
com a directriz 101 da OCDE). Caso o coeficiente de extino/absoro molar seja inferior a
10 lmol-1cm-1, a substncia carece de potencial fotorreactivo, no sendo necessrio submet-la
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4951

ao ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU nem a qualquer outro ensaio biolgico para a determinao
de efeitos fotoqumicos nocivos (apndice I).

1.5 Princpio de mtodo

Foram identificados quatro mecanismos mediante os quais a absoro de luz por um cromforo pode
ocasionar uma reaco fototxica (7): todos os referidos mecanismos se traduzem em danos celulares.
Deste modo, o ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU baseia-se na comparao da citotoxicidade
de uma substncia submetida a ensaio com ou sem exposio a uma dose no citotxica de radiao
UVA/visvel. No mbito do ensaio, a citotoxicidade expressa numa reduo, em termos de con-
centrao, da absoro do pigmento vermelho neutro vital [neutral red NR (9)] 24 horas aps a
administrao da substncia em estudo e a irradiao.
Efectua-se uma cultura de clulas Balb/c 3T3 durante 24 horas, at formao de monocamadas.
Para cada substncia em estudo, procede-se pr-incubao, durante 1 hora, de duas placas de 96 alvo-
los com oito concentraes diferentes da substncia. Expe-se uma das placas a uma dose no citotxica
de 5 J/cm2 UVA (experincia +UV), mantendo-se a outra na obscuridade (experincia UV). Segui-
damente, o meio de tratamento substitudo, em ambas as placas, por um meio de cultura: aps
uma nova incubao de 24 horas, determina-se a viabilidade celular por anlise da absoro do vermelho
neutro (neutral red uptake NRU) durante 3 horas. Calcula-se a viabilidade celular relativa, expressa
em percentagem das amostras de controlo isentas da substncia em estudo, para cada uma das oito
concentraes de ensaio. Para a previso do potencial fototxico, comparam-se as reaces, em termos
de concentraes, obtidas com (+UV) e sem ( UV) irradiao, em geral ao nvel EC50, ou seja,
a concentrao que inibe a viabilidade celular em 50 % relativamente s amostras de controlo isentas
da substncia.

1.6 Critrios de qualidade

Sensibilidade das clulas s radiaes UVA dados de referncia: deve comprovar-se periodicamente
a sensibilidade das clulas s radiaes UVA. Para tal, as clulas so inoculadas densidade utilizada
no ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU e irradiam-se as mesmas, no dia seguinte, com uma
dose de 1 a 9 J/cm2 de radiao UVA. Um dia depois determina-se a viabilidade celular atravs
do ensaio NRU. As clulas satisfazem os critrios de qualidade se, na sequncia da irradiao com
5 J/cm2 UVA, a sua viabilidade for superior ou igual a 80 % da viabilidade das amostras mantidas
na obscuridade. A viabilidade obtida utilizando a dose mxima de radiao UVA de 9 J/cm2 no
deve ser inferior a 50 % da obtida com as amostras mantidas na obscuridade. O processo deve repetir-se
aproximadamente em cada 10 passagens celulares.
Sensibilidade das clulas das amostras de controlo negativas radiao UVA ensaio em curso: o ensaio
satisfaz os critrios de qualidade se as amostras de controlo negativas [clulas numa soluo salina
equilibrada de Earl (earls balanced salt solution EBSS) contendo ou no 1 % de dimetilssulfxido
(DMSO) ou 1 % de etanol (EtOH)] no ensaio +UVA apresentarem uma viabilidade igual ou superior
a 80 % da das clulas no irradiadas, no mesmo solvente, no ensaio paralelo realizado na obscuridade
( UVA).
Viabilidade das amostras de controlo negativas: a densidade ptica absoluta (OD540 NRU) determinada
no extracto NR das amostras de controlo negativas indica se as 1104 clulas inoculadas por alvolo
apresentam um tempo de replicao normal no decurso dos dois dias do ensaio. O ensaio satisfaz
os critrios se a densidade ptica mdia (OD540 NRU) das amostras de controlo no tratadas for
igual ou superior a 0,2.
Controlo positivo: paralelamente a cada ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU deve efectuar-se
um ensaio com uma substncia fototxica conhecida. Recomenda-se a utilizao de clorpromacina
(CPZ), substncia de controlo positivo utilizada no estudo de validao EU/COLIPA. Foram definidos
os seguintes critrios de aceitao para o uso de CPZ em conformidade com o protocolo normalizado
do ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU: CPZ irradiada (+UVA), EC50=0,1 lg/ml a 2,0 lg/ml;
CPZ no irradiada ( UVA), EC50=7,0 lg/ml a 90,0 lg/ml. O factor de fotoirritao (PIF), ou seja,
a variao da EC50 deve ser de, pelo menos, 6.
Em vez da CPZ podem utilizar-se nos referidos controlos positivos paralelos outras substncias foto-
txicas conhecidas, adequadas categoria qumica ou s caractersticas de solubilidade da substncia
em estudo. Neste caso, devem definir-se como critrios de aceitao para o ensaio, com base nos
dados acumulados, os intervalos dos valores da EC50 e o PIF ou o MPE.

1.7 Descrio do mtodo

1.7.1 Preparao

1.7.1.1 Clulas
Recomenda-se a utilizao de uma linhagem celular permanente de fibroblastos de rato Balb/c
3T3, clon 31 proveniente do ATCC ou ECACC, idntica utilizada no ensaio de validao. Podem
4952 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

tambm obter-se resultados satisfatrios por recurso a outras clulas ou linhagens celulares, aplicando
o mesmo protocolo de ensaio, se as condies de cultura forem adequadas s necessidades especficas
das clulas; todavia, nesse caso, necessrio demonstrar a equivalncia.
Deve comprovar-se regularmente que as clulas no esto contaminadas por micoplasmas, devendo
as mesmas apenas ser utilizadas se os resultados das referidas comprovaes forem satisfatrios.
Uma vez que a sensibilidade das clulas s radiaes UVA pode aumentar com o nmero de passagens,
devem utilizar-se clulas Balb/c 3T3 que tenham sido objecto do menor nmero possvel de passagens,
preferivelmente menos de 100. Deve comprovar-se periodicamente a sensibilidade das clulas Balb/c
3T3 s radiaes UVA por recurso ao procedimento de controlo de qualidade descrito nas presentes
directrizes.

1.7.1.2 Meios e condies de cultura


Devem utilizar-se meios de cultura e condies de incubao adequados s passagens celulares comuns
e ao procedimento de ensaio. No caso das clulas Balb/c 3T3, recomenda-se o uso de DMEM enri-
quecido com 10 % de soro de bovino recm-nascido, 4 mM de glutamina, penicilina e estreptomicina,
incubado a 37oC numa atmosfera hmida com 7,5 % de CO2. particularmente importante que
as condies de cultura celular permitam manter o ciclo celular nos valores normais das clulas
ou da linhagem celular utilizadas.

1.7.1.3 Preparao das culturas


Inoculam-se num meio de cultura de densidade adequada clulas provenientes de culturas-me con-
geladas, efectuando-se pelo menos uma subcultura antes de utiliz-las no ensaio de fototoxicidade
in vitro 3T3 NRU.
Para o ensaio de fototoxicidade, inoculam-se as clulas num meio de cultura de densidade tal que
impea a confluncia das culturas antes do termo do ensaio, ou seja, aquando da determinao da
viabilidade celular 48 horas aps a inoculao das clulas. No caso das clulas Balb/c 3T3 cultivadas
em placas de 96 alvolos, recomenda-se uma densidade de 1104 clulas por alvolo.
Para cada substncia em estudo, inoculam-se as clulas de modo idntico em duas placas diferentes
de 96 alvolos, mantendo-se as condies de cultura ao longo de todo o ensaio, excepto durante
o perodo de irradiao de uma das substncias (+radiao UVA/visvel), enquanto que a outra se
mantm na obscuridade ( radiao UVA/visvel).

1.7.1.4 Activao metablica


Embora, de modo geral, seja necessrio recorrer a sistemas de activao metablica para todos os
ensaios in vitro de previso do potencial genotxico ou carcinognico, no domnio da fototoxicologia
no se conhece ainda qualquer substncia qumica que necessite de uma transformao metablica
para actuar como fototoxina in vivo ou in vitro. Por conseguinte, no se considera necessrio nem
cientificamente justificado utilizar um sistema de activao metablica no presente ensaio.

1.7.1.5 Substncia em estudo Preparao


As substncias devem preparar-se imediatamente antes da utilizao, excepto se os dados de estabilidade
mostrarem que possvel armazen-las. Caso seja provvel a ocorrncia de fotodegradao rpida,
pode ser necessrio preparar as referidas substncias luz vermelha.
As substncias em estudo so dissolvidas em solues-tampo salinas, tais como uma soluo salina
equilibrada de Earl (EBSS) ou uma soluo-tampo salina de fosfatos (phosphate buffered saline PBS),
que no devem conter componentes proteicos nem corantes indicadores de pH que absorvam a luz,
de modo a evitar interferncias durante a irradiao.
As substncias de ensaio fracamente solveis em gua devem dissolver-se em solventes adequados
numa concentrao 100 vezes superior concentrao final desejada, diluindo-se de seguida na pro-
poro 1:100 com a soluo-tampo salina. Caso se utilize um solvente, a sua concentrao volmica
deve permanecer constante (1 %) em todas as culturas, isto , tanto nas amostras de controlo negativo
como nas amostras da substncia em estudo em todas as concentraes.
Recomenda-se o uso do dimetilssulfxido (DMSO) e do etanol (EtOH) como solventes. Podem uti-
lizar-se outros solventes de citotoxicidade reduzida (por exemplo, acetona), devendo contudo avaliar-se
devidamente as suas propriedades especficas, nomeadamente a possibilidade de reagir com a substncia
em estudo, de reduzir o efeito fototxico ou de captar radicais.
Se necessrio, pode recorrer-se a um agitador mecnico, a um banho de ultra-sons e ou ao aquecimento
a 37oC para facilitar a dissoluo.

1.7.1.6 Irradiao com UV Preparao


Fonte de radiao: a escolha de uma fonte de radiao e de uma filtrao adequadas constitui o
factor determinante dos ensaios de fototoxicidade. As regies do visvel e do UVA encontram-se,
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4953

em geral, associadas fotossensibilizao (7) (10), enquanto que a gama do UVB possui menor impor-
tncia neste domnio, apresentando em contrapartida uma elevada citotoxicidade directa que mul-
tiplicada por 1000 entre 313 nm e 280 nm (11). Os critrios de seleco da fonte de radiao adequada
devem incluir o requisito essencial da emisso de comprimentos de onda que a substncia em estudo
absorve: por outro lado, a dose de luz (passvel de ser obtida num perodo razovel) deve ser suficiente
para detectar os fotossensibilizadores conhecidos. Alm disso, os comprimentos de onda e as doses
utilizadas no devem causar danos desnecessrios ao sistema em estudo, nomeadamente devido
emisso de calor (regio do infravermelho).
Considera-se que a melhor fonte de luz produzida por simuladores de radiao solar, que utilizam
arcos de xnon ou arcos de mercrio dopado-halogeneto de metal. Estes ltimos apresentam a vantagem
de emitir menos calor e de ser mais econmicos, mas no reproduzem exactamente a luz solar. Dado
que todos os simuladores de radiao solar emitem quantidades considerveis de radiao UVB, devem
utilizar-se filtros adequados para atenuar os respectivos comprimentos de onda altamente citotxicos.
No ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU deve utilizar-se um espectro de irradincia praticamente
isento de UVB (UVA:UVB D 1:20). A referncia 3 inclui um exemplo da distribuio da irradincia
espectral do simulador de radiao solar filtrada utilizado na validao do ensaio de fototoxicidade
in vitro 3T3 NRU (3).
Dosimetria: antes de cada ensaio de fototoxicidade deve comprovar-se a intensidade da radiao (irra-
dincia) por recurso a um medidor de UV de banda larga adequado, previamente calibrado em funo
da fonte de radiao. Deve comprovar-se o desempenho do aparelho, recomendando-se para tal a
utilizao de um segundo medidor de UV de referncia do mesmo tipo, calibrado do mesmo modo.
A utilizao, a intervalos superiores, de um espectrorradimetro para medir a irradincia espectral
da fonte de luz filtrada e comprovar a calibrao do medidor de UV de banda larga constitui a
soluo ideal, embora a manipulao dos instrumentos em causa necessite de pessoal devidamente
qualificado.
O ensaio de validao mostrou que a dose de 5 J/cm2 (UVA) no apresenta citotoxicidade para
as clulas Balb/c 3T3, sendo suficientemente potente para activar as substncias qumicas fracamente
fototxicas. Para obter 5 J/cm2 no perodo de 50 minutos, deve ajustar-se a irradincia a 1,666 mW/cm2.
Caso se utilize outra linhagem celular ou outra fonte de radiao, pode ser necessrio adaptar ligei-
ramente a dose de raios UVA de um modo que no danifique as clulas e seja suficiente para detectar
as fototoxinas de referncia. A durao da exposio calculada de acordo com a expresso:
dose de irradiao (J/cm2) 1000
t (min) = (1 J = 1 W seg)
irradincia (mW/cm2) 60

1.7.2 Condies de ensaio

A concentrao mxima da substncia em estudo no deve exceder 100 mg/ml, uma vez que todas
as substncias fototxicas foram detectadas a concentraes inferiores: alm disso, a concentraes
superiores, aumenta a incidncia de falsos resultados positivos (13). O pH da concentrao mais elevada
da substncia em estudo deve ser adequado (compreendido entre 6,5 e 7,8).
Devem determinar-se de forma adequada, em ensaios prvios, as gamas de concentrao da substncia
em estudo com (+UVA) e sem ( UVA) irradiao. A gama e o intervalo de uma srie de concentraes
devem ajustar-se de modo que as curvas concentrao-resposta sejam fundamentadas experimental-
mente. Devem utilizar-se concentraes em progresso geomtrica, com um factor de diluio constante.

1.7.3 Procedimento (1)

1.7.3.1 Primeiro dia


Prepara-se uma suspenso de 1105 clulas/ml no meio de cultura e colocam-se 100 ml de meio
de cultura apenas nos alvolos perifricos de uma placa de microtitulao de 96 alvolos (=ensaios
em branco). Nos restantes alvolos colocam-se 100 ml de suspenso de 1105 clulas/ml (=1104
clulas/alvolo). Preparam-se duas placas com cada substncia em estudo, destinando-se uma a deter-
minar a citotoxicidade ( UVA) e a outra a fotocitotoxicidade (+UVA).
Incubam-se as clulas durante 24 horas (7,5 % CO2, 37oC) at formao de uma monocamada semi-
confluente. O referido perodo de incubao permite a recuperao, a aderncia e o crescimento
exponencial das clulas.

1.7.3.2 Segundo dia


Aps a incubao, decanta-se o meio de cultura celular e efectuam-se, por alvolo, duas lavagens
com 150 ll de EBSS/PBS. Adicionam-se 100 ll de EBSS/PBS com a concentrao adequada da substncia
em estudo ou, no caso das amostras de controlo negativo, apenas solvente. Adicionam-se oito con-
centraes diferentes da substncia em estudo. Incubam-se as clulas com a substncia em estudo
durante 60 minutos, na obscuridade (7,5 % CO2, 37oC).
4954 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

Na componente (+UVA) do ensaio, irradiam-se as clulas durante 50 minutos, temperatura ambiente,


atravs da cobertura da placa de 96 alvolos, com uma dose de 1,7 mW/cm2 UVA (=5 J/cm2). Utilizar
um ventilador para evitar a condensao de gua sob a cobertura. Para o ensaio ( UVA), colocar
na obscuridade a segunda srie de placas, temperatura ambiente, durante 50 minutos (=tempo
de exposio aos raios UVA).
Decanta-se a soluo de ensaio, efectuando duas lavagens com 150 ml de EBSS/PBS. Substitui-se
a EBSS/PBS pelo meio de cultura e incuba-se (7,5 % CO2, 37oC) at ao dia seguinte (18-22 horas).

1.7.3.3 Terceiro dia


Anlise microscpica:
Examinam-se as clulas num microscpio com dispositivo de contraste de fase. Registam-se as alteraes
morfolgicas das clulas devidas aos efeitos citotxicos da substncia em estudo. A comprovao em
causa recomendada com o objectivo de excluir erros experimentais, embora as observaes efectuadas
no seu mbito no sejam utilizadas para avaliar a citotoxicidade nem a fototoxicidade.

Ensaio de absoro do vermelho neutro:


Lavam-se as clulas com 150 ll de EBSS/PBS pr-aquecida. Remove-se a soluo de lavagem sacudindo
ligeiramente. Adicionam-se 100 ll de meio com NR e incuba-se durante 3 horas a 37oC, em atmosfera
hmida com 7,5 % CO2.
Aps a incubao, elimina-se o meio com NR e lavam-se as clulas com 150 ml de EBSS/PBS. Decanta-se
e enxuga-se totalmente a EBSS/PBS. (Alternativa: centrifugar a placa invertida.)
Adicionam-se exactamente 150 ll de soluo de desoro do NR (soluo de etanol/cido actico
recentemente preparada).
Agita-se rapidamente a placa num agitador de microplacas durante 10 minutos, at que o NR seja
extrado das clulas e forme uma soluo homognea.
Mede-se a densidade ptica do extracto de NR a 540 nm num espectrofotmetro, utilizando como
referncia os ensaios em branco. Armazenam-se os dados num ficheiro de formato adequado (por
exemplo, ASCII), com vista ao seu tratamento posterior.

2 Resultados

2.1 Qualidade e quantidade dos resultados

Os dados devem permitir uma anlise significativa das respostas obtidas para cada concentrao, com
e sem irradiao UVA/visvel. Caso se observe fototoxicidade, tanto a gama de concentraes como
o intervalo entre cada concentrao devem ser estabelecidos de modo que permitam adaptar o traado
de uma curva aos dados experimentais. Uma vez que a substncia em estudo pode no produzir
efeitos citotxicos concentrao-limite de 100 mg/ml definida para o ensaio realizado na obscuridade
( UVA), exibindo todavia uma elevada citotoxicidade no ensaio com irradiao (+UVA), pode ser
necessrio utilizar em cada componente do ensaio gamas de concentrao de magnitude diversa, de
modo a obter resultados de qualidade adequada. Caso no se observe citotoxicidade em nenhuma
das componentes do ensaio ( UVA e +UVA), bastar utilizar concentraes separadas por um intervalo
aprecivel, at concentrao mxima.
No necessrio comprovar um resultado claramente positivo, repetindo o ensaio. Os resultados
claramente negativos no necessitam tambm de comprovao caso o ensaio tenha sido realizado
com concentraes suficientemente altas. Nessas circunstncias, bastar realizar um ensaio principal
e um ou vrios ensaios prvios com o objectivo de definir as gamas de concentrao.
Os ensaios cujos resultados se situem no limite do modelo de predio devem ser repetidos para
fins comprovativos.
Caso se considere necessrio repetir o ensaio, pode ser importante alterar as condies experimentais
de modo a obter um resultado inequvoco. Neste contexto, a preparao das solues da substncia
constitui um aspecto fundamental. A alterao das referidas condies, expressa, por exemplo, na
utilizao de co-solventes, na triturao da amostra ou na utilizao de um banho de ultra-sons, pode,
pois, revelar-se fundamental. Como alternativa, pode tambm alterar-se o perodo da incubao antes
da irradiao: no caso de substncias instveis em gua, pode ser conveniente reduzir o referido perodo.

2.2 Tratamento dos resultados

Se possvel, deve determinar-se a concentrao de substncia em estudo que induz uma inibio de
50 % da absoro celular de vermelho neutro (EC50). Para tal, pode aplicar-se aos resultados de con-
centrao-resposta qualquer mtodo de regresso no linear adequado (de preferncia, uma funo
de Hill ou uma regresso logstica) ou outros mtodos de ajustamento (14). Antes de utilizar um
determinado valor de EC50 nos clculos posteriores, deve comprovar-se devidamente a qualidade do
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4955

ajustamento. Podem tambm utilizar-se no clculo do valor de EC50 mtodos de ajustamento grfico.
Nesse caso, recomenda-se a utilizao de papel probabilstico (eixo x: log, eixo y: probit), uma vez
que, frequentemente, a funo concentrao-resposta se torna praticamente linear na sequncia da
transformao.

2.3 Avaliao dos resultados (modelos de previso)

2.3.1 Modelo de previso verso 1: factor de fotoirritao (PIF)

Se, tanto em presena (+UVA) como na ausncia ( UVA) de radiao, se obtiverem curvas con-
centrao-resposta completas, pode calcular-se o factor de fotoirritao (PIF) por recurso frmula
seguinte:
EC50 ( UV)
a) PIF =
EC50 (+UV)

A obteno de um valor PIF 5 traduz a ausncia de potencial fototxico, enquanto que um PIF 5
traduz a existncia de potencial fototxico.
Se uma substncia se revelar citotxica quando irradiada (+UVA) mas no na ausncia de irradiao
( UVA), no possvel calcular o PIF, embora o referido resultado indique a existncia de potencial
fototxico. Em tais casos, pode calcular-se um valor PIF se o ensaio de citotoxicidade ( UV) tiver
decorrido at concentrao de ensaio mxima (Cmx), valor que se utiliza no clculo de PIF:
Cmx ( UV)
b) PIF =
EC50 (+UV)

Caso se obtenha apenas um valor PIF, qualquer valor superior a 1 traduz um potencial fototxico.
Se no for possvel calcular a EC50 ( UV) nem a EC50 (+UV) porque a substncia no produz
efeitos citotxicos mesmo concentrao de ensaio mxima, tal significa que a substncia no possui
potencial fototxico. Nessas condies, utiliza-se um PIF=*1 terico para caracterizar o resultado.
Cmx ( UV)
c) PIF = *1 =
Cmx (+UV)

Caso se obtenha apenas um valor PIF=*1, o ensaio traduz a ausncia de potencial fototxico.
Nos casos b) e c), devem tomar-se na devida conta as concentraes obtidas no ensaio de fototoxicidade
in vitro 3T3 NRU aquando da previso do potencial fototxico.

2.3.2 Modelo de previso verso 2: fotoefeito mdio (MPE)

Como alternativa, pode utilizar-se uma nova verso do modelo de previso do potencial fototxico
elaborada com base nos dados obtidos no estudo de validao EU/COLIPA (15) e comprovada num
ensaio cego realizado no mbito de um estudo posterior relativo fototoxicidade in vitro de substncias
utilizadas como filtros de UV (13). Este modelo permite superar a limitao do modelo baseado
no PIF nos casos em que no possvel obter um valor de EC50. O modelo utiliza o fotoefeito
mdio (MPE), que constitui um parmetro baseado na comparao das curvas concentrao-resposta,
na sua totalidade. A Universidade Humboldt de Berlim elaborou um programa informtico especial
para a aplicao do modelo MPE, que pode obter-se gratuitamente.

2.4 Interpretao dos resultados

A obteno de um resultado positivo no ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU (PIF 5 ou


MPE 0,1) indica que a substncia em estudo apresenta potencial fototxico. Se o referido resultado
foi obtido com concentraes inferiores a 10 mg/ml, provvel que a substncia em estudo apresente
tambm efeitos fototxicos em diversas condies de exposio in vivo. Caso se obtenha um resultado
positivo apenas com a concentrao de ensaio mxima de 100 mg/ml, pode ser necessrio, para avaliar
o perigo ou o poder fototxico, ter em conta outros aspectos, tais como a penetrao e a absoro
cutneas e a possvel acumulao da substncia na pele, ou submeter a substncia a outro tipo de
ensaios, com o objectivo de confirmar os resultados, utilizando, por exemplo, um modelo de pele
humana in vitro.
A obteno de um resultado negativo no ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU (PIF 5 ou
MPE 0,1) indica que a substncia em estudo no apresenta efeitos fototxicos nas clulas de mamfero
cultivadas nas condies em causa. Se for possvel submeter a substncia a ensaio at concentrao
mxima de 100 mg/ml, a obteno de um resultado negativo indica que a mesma no possui de potencial
fototxico, sendo improvvel que produza efeitos fototxicos in vivo. Nos casos em que se obtenham
reaces txicas idnticas (EC50+UV e EC50 UV) com concentraes inferiores, devem interpretar-se
os dados do mesmo modo. Todavia, caso no se observe toxicidade (+UV e UV) e a solubilidade
em gua da substncia em estudo tenha limitado as concentraes utilizadas a menos de 100 mg/ml,
4956 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

pode questionar-se a compatibilidade da substncia com o mtodo de ensaio, devendo encarar-se


a possibilidade de realizar um ensaio de confirmao (por exemplo, com um modelo de pele in vitro
ou ex vivo, ou um ensaio in vivo).

3 Relatrio

Relatrio do ensaio

O relatrio do ensaio deve incluir as seguintes informaes:


Substncia em estudo:
dados de identificao e nmero CAS, se conhecido;
natureza fsica e pureza;
propriedades fsico-qumicas relevantes para a realizao do estudo;
estabilidade e fotoestabilidade, se conhecidas.

Solvente:
justificao da escolha do solvente;
solubilidade da substncia em estudo no solvente;
percentagem de solvente presente no meio de tratamento (EBSS ou PBS).

Clulas:
tipo e provenincia das clulas;
ausncia de micoplasma;
nmero de passagens celulares, se conhecido.
sensibilidade das clulas radiao UVA, determinada com o equipamento de irradiao utilizado
no ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU.

Condies de ensaio a) incubao antes do tratamento e aps o mesmo:


tipo e composio do meio de cultura;
condies de incubao (concentrao de CO2, temperatura e humidade);
durao da incubao (tratamento prvio e posterior).

Condies de ensaio b) tratamento com a substncia:


fundamentao da escolha das concentraes da substncia em estudo utilizadas nos ensaios com
e sem irradiao UV/visvel;
caso a substncia em estudo seja fracamente solvel e no citotxica, fundamentao da escolha
da maior concentrao utilizada;
tipo e composio do meio de tratamento (soluo-tampo salina);
durao do tratamento qumico.

Condies de ensaio c) irradiao:


fundamentao da escolha da fonte de radiao utilizada;
caractersticas da irradincia espectral da fonte de radiao;
caractersticas de transmisso/absoro do filtro ou filtros utilizados;
caractersticas do radimetro e condies de calibrao;
distncia entre a fonte de radiao e o sistema de ensaio;
irradincia UVA referida distncia, expressa em mW/cm2;
durao da exposio radiao UV/visvel;
dose de radiao UVA (irradinciatempo), expressa em J/cm2;
temperatura utilizada para as culturas celulares irradiadas e as culturas mantidas na obscuridade.

Condies de ensaio d) ensaio NRU:


composio do meio NR;
durao da incubao em NR;
condies de incubao (concentrao de CO2, temperatura e humidade);
condies de extraco do NR (agente de extraco, durao);
comprimento de onda utilizado para a leitura espectrofotomtrica da densidade ptica do NR;
segundo comprimento de onda (referncia), se aplicvel;
substncia utilizada para o ensaio em branco do espectrofotmetro, se aplicvel.

Resultados:
viabilidade celular obtida para cada concentrao da substncia em estudo, expressa em percentagem
da viabilidade mdia dos controlos;
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4957

curvas concentrao-resposta (concentrao da substncia em estudo viabilidade celular relativa),


obtidas nos ensaios +UVA e UVA paralelos;
anlise dos dados provenientes das curvas concentrao-resposta: se possvel, clculo automtico/cl-
culo do valor de EC50 (+UVA) e EC50 ( UVA);
comparao das duas curvas concentrao-resposta obtidas com e sem irradiao UVA/visvel, cal-
culando o factor de fotoirritao (PIF) ou o fotoefeito mdio (MPE).
classificao do potencial fototxico;
critrios de aceitao do ensaio a) controlo negativo paralelo:
viabilidade absoluta (densidade ptica do extracto de NR) das clulas irradiadas e as no
irradiadas;
dados de referncia do controlo negativo, mdia e desvio padro;
critrios de aceitao do ensaio b) controlo positivo paralelo;
EC50 (+UVA), EC50 ( UVA) e PIF da substncia de controlo positivo;
dados de referncia da substncia de controlo positivo: EC50 (+UVA), EC50 ( UVA) e PIF,
mdia e desvio padro.

Discusso dos resultados.


Concluses.

4 Bibliografia
(1) Spielmann, H., Balls, M., Do ring, B., Holzhu tter, H. G., Kalweit, S., Klecak, G., LEplattenier,
H., Liebsch, M., Lovell, W. W., Maurer, T., Moldenhauer, F., Moore, L., Pape, W., Pfannenbecker,
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in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay,
Toxicology in Vitro, 8, pp. 793-796.
(2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for
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ber 1997, ATLA, 26, pp. 7-8.
(3) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., Pechovitch, G., De Silva, O., Holzhtter,
H. G., Clothier, R., Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W., Maurer, T., Pfan-
nenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W., and Brantom, P. (1998),
EU/COLIPA In vitro phototoxicity validation study, results of phase II (blind trial), part 1:
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(4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD
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Test Methods, OECD Publications Office, Paris, 1996.
(5) Lovell, W. W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential,
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(6) Santamaria, L., and Prino, G. (1972), List of the photodynamic substances, Research progress
in organic, biological and medicinal chemistry, vol. 3, part 1, North Holland Publishing Co, Ams-
terdam, pp. XI-XXXV.
(7) Spielmann, H., Lovell, W. W., Hlzle, E., Johnson, B. E., Mauren, T., Miranda, M. A., Pape,
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alterations and neutral red absorption, Toxicology Letters, 24, pp. 119-124.
(10) Lambert, L. A., Warner, W. G., and Kornhauser, A. (1996), Animal models for phototoxicity
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Washington DC, 5th edition, pp. 515-530.
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relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on
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(12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test,
drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team
of the EU/COLIPA project in vitro Photoirritation.
(13) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., De Silva, O., Holzhtter, H. G., Gerberick,
F., Liebsch, M., Lovell, W. W., and Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potencial
of UV Filter Chemicals from annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In
Vitro Phototoxicity Test, ATLA, 26, pp. 679-708.
(14) Holzhtter, H. G., and Quedenau, J. (1995), Mathematical modelling of cellular responses to
external signals, Journal of Biological Systems, 3, pp. 127-138.
(15) Holzhtter, H. G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-
response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA, 25,
pp. 445-462.
(1) A referncia bibliogrfica 12 contm informaes complementares.
4958 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

APNDICE

Papel do ensaio de fototoxicidade 3T3 NRU numa abordagem sequencial


dos ensaios de fototoxicidade de substncias qumicas

ANEXO XIII
ANEXO VI

Critrios gerais de classificao e de rotulagem das substncias e preparaes perigosas


ndice
1 Introduo geral.
2 Classificao com base nas propriedades fsico-qumicas:
2.1 Introduo.
2.2 Critrios para a classificao, escolha de smbolos, indicao de perigos e escolha de frases indicadoras de riscos:
2.2.1 Explosivo.
2.2.2 Comburente.
2.2.3 Extremamente inflamvel.
2.2.4 Facilmente inflamvel.
2.2.5 Inflamvel.
2.2.6 Outras propriedades fsico-qumicas.
3 Classificao com base nas propriedades toxicolgicas:
3.1 Introduo.
3.2 Critrios para a classificao, escolha de smbolos, indicao de perigos e escolha de frases indicadoras de riscos:
3.2.1 Muito txico.
3.2.2 Txico.
3.2.3 Nocivo.
3.2.4 Comentrios relativos utilizao da frase R48.
3.2.5 Corrosivo.
3.2.6 Irritante.
3.2.7 Sensibilizante.
3.2.8 Outras propriedades toxicolgicas.
4 Classificao com base em efeitos especficos na sade humana:
4.1 Introduo.
4.2 Critrios para a classificao, indicao de perigos e escolha de frases indicadoras de riscos:
4.2.1 Substncias carcinognicas.
4.2.2 Substncias mutagnicas.
4.2.3 Substncias com efeitos txicos na reproduo.
4.2.4 Processo para a classificao de preparaes.
5 Classificao com base em efeitos no ambiente:
5.1 Introduo.
5.2 Critrios para a classificao, indicao de perigos e escolha de frases indicadoras de riscos:
5.2.1 Ambiente aqutico.
5.2.2 Ambiente no aqutico.
6 Escolha das recomendaes de prudncia:
6.1 Introduo.
6.2 Recomendaes de prudncia relativas a substncias e preparaes.
7 Proposta de rotulagem.
8 Casos especiais: substncias:
8.1 Garrafas para gases transportveis.
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8.2 Garrafas para gases destinadas ao propano, butano ou gs de petrleo liquefeito (GPL).
8.3 Metais numa forma macia.
8.4 Substncias classificadas com a frase R65.
9 Casos especiais: preparaes:
9.1 Preparaes gasosas (misturas de gases).
9.2 Garrafas para gases destinadas a preparaes com propano, butano ou gs de petrleo liquefeito (GPL) a que foram adicionados
odorizantes.
9.3 Ligas, preparaes com polmeros e preparaes com elastmeros.
9.4 Preparaes classificadas com a frase R65.
9.5 Perxidos orgnicos.

1 Introduo geral

1.1 O objectivo da classificao identificar todas as propriedades toxicolgicas, fsico-qumicas, e eco-


toxicolgicas das substncias e as propriedades toxicolgicas e fsico-qumicas das preparaes que
possam representar um risco durante a manipulao ou utilizao normais. Identificada qualquer pro-
priedade perigosa, a substncia ou preparao deve ser rotulada de modo que os perigos sejam indicados,
a fim de proteger o utilizador, o pblico em geral e o ambiente.

1.2 O presente anexo estabelece os princpios gerais orientadores da classificao e rotulagem das substncias
e preparaes referidas no artigo 5.o do presente Regulamento e no Decreto-Lei n.o 120/92, de 30
de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei
n.o 189/99, de 2 de Junho, bem como noutra legislao relevante relativa a preparaes perigosas.
Destina-se a todas as pessoas (produtores, importadores e autoridades nacionais) envolvidas nos pro-
cessos de classificao e rotulagem de substncias e preparaes perigosas.

1.3 As disposies do presente Regulamento e do Decreto-Lei n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco


que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de
2 de Junho, tm por objectivo pr disposio do pblico em geral e dos trabalhadores um instrumento
fundamental capaz de fornecer as informaes essenciais relativas s substncias e preparaes perigosas.
O rtulo chama a ateno das pessoas que manipulam ou utilizam essas substncias e preparaes
para os perigos inerentes a alguns desses materiais.
O rtulo tambm pode servir para chamar a ateno para informaes mais completas sobre o produto,
relativas a segurana e utilizao, apresentadas noutras formas.

1.4 O rtulo deve atender a todos os perigos potenciais relacionados com a manipulao e utilizao
normais das substncias e preparaes perigosas, na forma em que so colocadas no mercado mas
no necessariamente noutras formas possveis de utilizao final, por exemplo diludas. Os perigos
mais graves so realados por smbolos, e tanto esses perigos como os que decorrem de outras pro-
priedades perigosas so especificados em frases normalizadas indicadoras de riscos. Por outro lado,
com as recomendaes de prudncia formulam-se conselhos relativos s precaues a tomar.
No caso das substncias, a informao completada pela sua designao de acordo com uma nomen-
clatura qumica reconhecida internacionalmente, de preferncia a designao que utilizada no Inven-
trio Europeu das Substncias Qumicas Existentes no Mercado (EINECS) ou na Lista Europeia
das Substncias Qumicas Notificadas (ELINCS), pelo nmero CE e pela meno do nome, morada
e nmero de telefone da pessoa estabelecida na Comunidade e responsvel pela colocao da substncia
no mercado.
No caso das preparaes, a informao completada pela designao ou pelo nome comercial da
preparao, pela designao qumica das substncias que a compem, nos termos do Decreto-Lei
n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro,
e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho, e pela indicao do nome, morada e nmero de telefone
da pessoa estabelecida na Comunidade e responsvel pela colocao da preparao no mercado.

1.5 O Decreto-Lei n.o 82/95, de 22 de Abril, e o presente Regulamento estipulam que os produtores,
distribuidores e importadores de substncias perigosas que figurem no EINECS mas que ainda no
constem no anexo I, devem ser obrigados a proceder a investigaes que os levem a tomar conhecimento
dos dados relevantes disponveis relativos s propriedades dessas substncias. Com base nessas infor-
maes, devem embalar e rotular provisoriamente as referidas substncias em questo, de acordo
com as regras estabelecidas no n.o 3 do artigo 2.o do Decreto-Lei n.o 82/95, de 22 de Abril,
nos artigos 17.o a 20.o do presente Regulamento e com os critrios do anexo VI.

1.6 Em relao s substncias, os dados necessrios para a classificao e rotulagem podem ser obtidos
da seguinte forma:
a) No que diz respeito s substncias relativamente s quais so exigidas as informaes especificadas
no anexo VII, o dossier de base inclui a maioria dos dados necessrios para a classificao e
rotulagem. Esta classificao e rotulagem sero revistas, se for caso disso, quando se dispuser
de novas informaes (anexo VIII);
4960 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

b) No que diz respeito a outras substncias (por exemplo, as substncias referidas no ponto 1.5),
os dados necessrios para a classificao e rotulagem podem ser, se for caso disso, obtidos de
vrias fontes, tais como: resultados de ensaios anteriores, informaes exigidas pela regulamentao
internacional sobre o transporte de matrias perigosas, informaes provenientes de trabalhos de
referncia e da bibliografia e informaes baseadas na experincia prtica. Podem tambm ser
tidos em conta, sempre que adequado, resultados de relaes estrutura-actividade validados, bem
como pareceres de peritos.

Em relao s preparaes, os dados necessrios para a classificao e rotulagem podem ser obtidos
da seguinte forma:
a) No que respeita aos dados fsico-qumicos, por aplicao dos mtodos especificados no anexo V.
No caso das preparaes gasosas, pode ser utilizado um mtodo de clculo da inflamabilidade
e das propriedades oxidantes (v. captulo 9);
b) No que respeita aos dados relativos aos efeitos na sade:
por aplicao dos mtodos especificados no anexo V e ou por aplicao do mtodo convencional
referido na subseco III, artigos 12.o ao 17.o, da Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro,
na redaco que lhe foi dada pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho, ou, no caso da
frase R65, pela aplicao das normas especificadas em 3.2.3;
no entanto, tratando-se da avaliao de propriedades cancergenas, mutagnicas e de toxicidade
para a reproduo, aplicar-se- o mtodo convencional referido na subseco III, artigos 18.o
ao 20.o, da Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro, na redaco que lhe foi dada pelo Decreto-Lei
n.o 189/99, de 2 de Junho.

Nota relativa realizao de ensaios com animais


A realizao de ensaios com animais para a obteno de dados experimentais est sujeita s disposies
do Decreto-Lei n.o 129/92, de 6 de Julho, sua regulamentao e sucessivas alteraes, relativo proteco
dos animais para fins experimentais.

1.7 Aplicao dos critrios do guia:


A classificao deve abranger as propriedades toxicolgicas e fsico-qumicas das substncias e pre-
paraes e, para alm disso, as propriedades ecotoxicolgicas das substncias.
A classificao das substncias e preparaes feita com base nos critrios dos captulos 2 a 4 e,
no caso das substncias, no captulo 5 do presente anexo. Devem ser tidos em conta todos os tipos
de perigos. Por exemplo, a classificao de acordo com o ponto 3.2.1 no implica que pargrafos
como o 3.2.2 ou 3.2.4 possam ser ignorados.
A escolha do(s) smbolo(s) e da(s) frase(s) indicadora(s) de risco feita com base na classificao,
de modo a garantir que a natureza dos perigos potenciais identificados na classificao se encontre
expressa no rtulo.
No obstante os critrios definidos nos pontos 2.2.3, 2.2.4 e 2.2.5, as substncias e preparaes na
forma de aerossis esto sujeitas aos critrios de inflamabilidade especificados no Decreto-Lei n.o 108/92,
de 2 de Junho, regulamentado pela Portaria n.o 778/92, de 10 de Agosto, na sua actual redaco.

1.7.1 Definies:
Por substncias entendem-se os elementos qumicos e seus compostos no estado natural ou tal
como so obtidos por qualquer processo de produo, incluindo qualquer aditivo necessrio para
preservar a estabilidade do produto e qualquer impureza proveniente do processo de produo, mas
excluindo qualquer solvente que possa ser separado sem afectar a estabilidade da substncia nem
modificar a sua composio.
Uma substncia pode ser quimicamente muito bem definida (por exemplo, a acetona) ou ser uma
mistura complexa de componentes de composies variveis (por exemplo, os destilados aromticos).
No caso de algumas substncias complexas, j foram identificados alguns dos seus componentes
individuais.
Por preparaes entendem-se as misturas ou solues constitudas por duas ou mais substncias.

1.7.2 Aplicao dos critrios do guia s substncias:


Os critrios orientadores definidos no presente anexo so directamente aplicveis sempre que os dados
em questo tenham sido obtidos por mtodos de ensaio comparveis aos descritos no anexo V. Nos
outros casos, os dados disponveis devem ser avaliados por comparao dos mtodos de ensaio utilizados
com os indicados no anexo V e com as regras especificadas no presente anexo para a determinao
da classificao e da rotulagem adequadas.
Em determinados casos podero surgir dvidas quanto aplicao dos critrios relevantes, em especial
sempre que estes ltimos necessitem da apreciao de peritos. Em tais casos, o produtor, o distribuidor
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4961

ou o importador devem classificar e rotular provisoriamente a substncia com base na avaliao dos
dados disponveis por uma pessoa competente.
Sem prejuzo do n.o 2 do artigo 18.o, nos casos em que, na sequncia da aplicao do procedimento
supra, subsistam preocupaes sobre possveis incoerncias, deve apresentar-se uma proposta de incluso
da classificao provisria no anexo I. A proposta deve ser apresentada a um Estado membro e ser
acompanhada de dados cientficos adequados (v. tambm o ponto 4.1).
Pode adoptar-se um procedimento anlogo sempre que existam informaes que suscitem dvidas
quanto adequao de uma entrada includa no anexo I.

1.7.2.1 Classificao de substncias que contenham impurezas, aditivos ou componentes individuais:


Quando tenham sido identificados impurezas, aditivos ou componentes individuais de substncias,
tais impurezas, aditivos ou componentes individuais devero ser tidos em conta se os limites de con-
centrao forem iguais ou excederem os limites a seguir especificados:
0,1 %, para as substncias classificadas como muito txicas, txicas, carcinognicas (categoria 1
ou 2), mutagnicas (categoria 1 ou 2) ou txicas para a reproduo (categoria 1 ou 2);
1 %, para as substncias classificadas de nocivas, corrosivas, irritantes, sensibilizantes, carcinognicas
(categoria 3), mutagnicas (categoria 3) ou txicas para a reproduo (categoria 3);

salvo se o anexo I do presente Regulamento especificar valores inferiores.


Com excepo das substncias especificamente enumeradas no anexo I, a classificao, no que se
refere s propriedades fsico-qumicas e aos perigos para a sade, deve ser efectuada em conformidade
com o disposto no Decreto-Lei n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria
n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho; quanto rotulagem,
deve ser efectuada em conformidade com o disposto na mesma legislao.
A classificao em relao s propriedades fsico-qumicas efectuada de acordo com os critrios
do captulo 2 e em relao aos efeitos perigosos para o ambiente e efectuada em conformidade com
os critrios do captulo 5 do presente anexo.
No caso do amianto (650-013-00-6), esta regra geral no se aplica at que um limite de concentrao
seja fixado no anexo I. As substncias que contm amianto devem ser classificadas e rotuladas em
conformidade com os princpios definidos nos artigos 17.o a 20.o do presente Regulamento.

1.7.3 Aplicao dos critrios do guia s preparaes:


Os critrios orientadores definidos no presente anexo so directamente aplicveis sempre que os dados
em questo tenham sido obtidos por mtodos de ensaio comparveis aos descritos no anexo V, com
excepo dos critrios definidos no captulo 4, aos quais apenas aplicvel o mtodo convencional.
Nos outros casos, os dados disponveis devem ser avaliados, comparando os mtodos de ensaio utilizados
com os indicados no anexo V e com as regras especificadas no presente anexo, para determinao
da classificao e rotulagem adequadas.
Se os riscos para a sade forem avaliados por aplicao do mtodo convencional referido no Decreto-Lei
n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro,
e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho, os limites de concentrao individuais aplicveis so
os especificados:
no anexo I do presente Regulamento;
ou no Decreto-Lei n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97,
de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho, no caso de a substncia ou
substncias no figurarem no anexo I do presente Regulamento, ou nele figurem sem limites de
concentrao.

No caso das preparaes que contm misturas de gases, a classificao relativa aos efeitos na sade
ser estabelecida pelo mtodo de clculo, com base nos limites de concentrao individuais que figuram
no anexo I, ou, se esses limites no figurarem no anexo I, com base nos critrios do Decreto-Lei
n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro,
e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho.

1.7.3.1 Preparaes ou substncias descritas no ponto 1.7.2.1 utilizadas como componentes de outras
preparaes:
A rotulagem destas preparaes deve obedecer s disposies do artigo 7.o e cumprir as condies
previstas no Decreto-Lei n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria
n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho. Contudo, em alguns
casos, as informaes dadas no rtulo da preparao ou substncia descrita no pargrafo 1.7.2.1 so
insuficientes para permitir que outros produtores, que pretendam utiliz-las como constituintes da
sua ou suas preparaes, efectuem a classificao e rotulagem correctas dessa ou dessas preparaes.
4962 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

Nesses casos, a pessoa estabelecida na Comunidade e responsvel pela colocao da preparao ou


substncia original, descrita no pargrafo 1.7.2.1, no mercado, quer seja o produtor, o importador
ou o distribuidor, dever fornecer, o mais rapidamente possvel, mediante pedido justificado, todos
os dados necessrios relativos s substncias perigosas presentes, de modo a permitir a correcta clas-
sificao e rotulagem da nova preparao. Esses dados tambm so necessrios para que a pessoa
responsvel pela colocao da nova preparao no mercado possa cumprir os outros requisitos da
presente legislao.

2 Classificao com base nas propriedades fsico-qumicas

2.1 Introduo:
Os mtodos de ensaio relativos s propriedades explosivas, comburentes e de inflamabilidade includos
no anexo V do presente Regulamento tm por fim dar um significado especfico s definies gerais
apresentadas nas alneas a) a e) do artigo 3.o do presente Regulamento. Os critrios advm directamente
dos mtodos de ensaio do anexo V, quando mencionados.
Se se dispuser de informaes adequadas que indiquem que, na prtica, as propriedades fsico-qumicas
das substncias e preparaes (exceptuam-se os perxidos orgnicos) so diferentes das reveladas
pelos mtodos de ensaio do anexo V, essas substncias e preparaes devero ser classificadas de
acordo com os eventuais perigos que representem para as pessoas que as manipulem ou para outras
pessoas.

2.2 Critrios para a classificao, escolha de smbolos e indicaes de perigo e escolha de frases indicadoras
de riscos:
No caso das preparaes, haver que ter em conta os critrios referidos no Decreto-Lei n.o 120/92,
de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e
pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho.

2.2.1 Explosivo:
As substncias e preparaes sero classificadas como explosivas e caracterizadas pelo smbolo E
e pela indicao de perigo explosivo em funo dos resultados dos ensaios referidos no anexo V
e desde que sejam explosivas na forma em que so colocadas no mercado. obrigatria uma frase
indicadora de risco, atribuda de acordo com os critrios a seguir definidos:
R2 Risco de exploso por choque, frico, fogo ou outras fontes de ignio:
substncias e preparaes, salvo as excepes a seguir indicadas.

R3 Grande risco de exploso por choque, frico, fogo ou outras fontes de ignio:
as substncias e preparaes particularmente sensveis, tais como os sais do cido pcrico ou
o PETN.

2.2.2 Comburente:
As substncias e preparaes sero classificadas como comburentes e caracterizadas pelo smbolo
O e pela indicao de perigo comburente em funo dos resultados dos ensaios referidos no
anexo V. obrigatria uma frase indicadora de risco, atribuda com base nos resultados dos ensaios
em funo dos seguintes critrios:
R7 Pode provocar incndio:
perxidos orgnicos que apresentam propriedades inflamveis mesmo quando no esto em
contacto com outros materiais combustveis.

R8 Favorece a inflamao de matrias combustveis:


outras substncias e preparaes oxidantes, incluindo os perxidos inorgnicos, que possam
provocar incndios ou aumentar o risco de incndio quando em contacto com matrias
combustveis.

R9 Pode explodir quando misturado com matrias combustveis:


outras substncias e preparaes, incluindo os perxidos inorgnicos, que se tornem explosivas
quando misturadas com matrias combustveis, por exemplo, certos cloratos.

2.2.2.1 Observaes relativas aos perxidos:


No que respeita s propriedades explosivas, os perxidos orgnicos e suas preparaes, na forma
em que so colocados no mercado, so classificados de acordo com os critrios estabelecidos no ponto
2.2.1, com base em ensaios efectuados em conformidade com os mtodos que se apresentam no anexo V.
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4963

No que se refere s propriedades oxidantes, os mtodos do anexo V no so aplicveis aos perxidos


orgnicos.
Quanto s substncias, os perxidos orgnicos ainda no classificados como explosivos so classificados
como perigosos com base na respectiva estrutura (por exemplo, R-O-O-H; R1-O-O-R2).
As preparaes ainda no classificadas de explosivas devem ser classificadas atravs do mtodo de
clculo baseado na percentagem de oxignio activo descrito no ponto 9.5.
Os perxidos orgnicos e suas preparaes ainda no classificados de explosivos so classificados de
explosivos se contiverem:
mais de 5 % de perxidos orgnicos; ou
mais de 0,5 % de oxignio disponvel dos perxidos orgnicos e mais de 5 % de perxidos de
hidrognio.

2.2.3 Extremamente inflamvel:

As substncias e preparaes sero classificadas como extremamente inflamveis e caracterizadas pelo


smbolo F+ e pela indicao de perigo extremamente inflamvel em funo dos resultados dos
ensaios referidos no anexo V. As frases indicadoras de risco sero atribudas de acordo com os critrios
a seguir definidos:

R12 Extremamente inflamvel:


as substncias e preparaes lquidas cujo ponto de inflamao seja inferior a 0oC e cuja
temperatura de ebulio (ou, no caso de um intervalo de ebulio, a temperatura de incio
da ebulio) no exceda 35oC;
as substncias e preparaes gasosas inflamveis em contacto com o ar temperatura e presso
normais.

2.2.4 Facilmente inflamvel:


As substncias e preparaes sero classificadas como facilmente inflamveis e caracterizadas pelo
smbolo F e pela indicao de perigo facilmente inflamvel em funo dos resultados dos ensaios
referidos no anexo V. As frases indicadoras de risco sero atribudas de acordo com os critrios a
seguir definidos:

R11 Facilmente inflamvel


as substncias e preparaes slidas que possam inflamar-se facilmente por breve contacto
com uma fonte de ignio e que continuam a arder ou a ser consumidas depois do afastamento
dessa fonte;
as substncias e preparaes lquidas cujo ponto de inflamao seja inferior a 21oC mas que
no sejam extremamente inflamveis.

R15 Em contacto com a gua liberta gases extremamente inflamveis:


as substncias e preparaes que, em contacto com a gua ou com ar hmido, libertem gases
extremamente inflamveis em quantidades perigosas (no mnimo, 1 l/kg/h).

R17 Espontaneamente inflamvel ao ar:


as substncias e preparaes que possam aquecer e, finalmente, inflamar-se em contacto com
o ar temperatura ambiente, sem qualquer fornecimento de energia.

2.2.5 Inflamvel:
As substncias e preparaes sero classificadas como inflamveis em funo dos resultados dos ensaios
referidos no anexo V. A frase indicadora de risco ser atribuda de acordo com os critrios a seguir
definidos:

R10 Inflamvel:
as substncias e preparaes lquidas cujo ponto de inflamao seja igual ou superior a 21oC
e inferior ou igual a 55oC.
No entanto, foi demonstrado na prtica que no necessrio classificar de inflamvel uma pre-
parao com ponto de inflamao igual ou superior a 21oC e inferior ou igual a 55oC, se essa
preparao no puder, de nenhuma forma, manter a combusto e, nesse caso, apenas se no
envolver qualquer risco para as pessoas que a manipulem ou para outras pessoas.
4964 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

2.2.6 Outras propriedades fsico-qumicas:


s substncias e preparaes classificadas em conformidade com os pargrafos 2.2.1 a 2.2.5 precedentes
ou com os captulos 3, 4 e 5 subsequentes sero atribudas outras frases indicadoras de risco, de
acordo com os critrios a seguir definidos (baseados na experincia adquirida durante a elaborao
do anexo I):

R1 Explosivo no estado seco:


as substncias e preparaes explosivas colocadas no mercado em soluo ou numa forma
hmida, tais como a nitrocelulose com mais de 12,6 % de azoto.

R4 Forma compostos metlicos explosivos muito sensveis:


as substncias e preparaes que possam formar derivados metlicos explosivos sensveis, tais
como o cido pcrico e o cido estfnico.

R5 Perigo de exploso sob a aco do calor:


as substncias e preparaes termicamente instveis no classificadas como explosivas, tais
como o cido perclrico de concentrao superior a 50 %.

R6 Perigo de exploso com ou sem contacto com o ar:


as substncias e preparaes instveis temperatura ambiente, tais como o acetileno.

R7 Pode provocar incndio:


as substncias e preparaes reactivas, tais como o flor e o hidrossulfito de sdio.

R14 Reage violentamente em contacto com a gua:


as substncias e preparaes que reajam violentamente com a gua, tais como o cloreto de
acetilo, os metais alcalinos e o tetracloreto de titnio.

R16 Explosivo quando misturado com substncias comburentes:


as substncias e preparaes que reajam de forma explosiva com agentes oxidantes, tais como
o fsforo vermelho.

R18 Pode formar mistura vapor-ar explosiva/inflamvel durante a utilizao:


as preparaes que, no sendo classificadas como inflamveis, contenham componentes volteis
inflamveis em contacto com o ar.

Rl9 Pode formar perxidos explosivos:


as substncias e preparaes que possam formar perxidos explosivos durante o armazenamento,
tais como o ter etlico e o 1,4 -dioxano.

R30 Pode-se tornar facilmente inflamvel durante o uso:


as preparaes que, no sendo classificadas como inflamveis, possam tornar-se inflamveis
por perda de componentes volteis no inflamveis.

R44 Risco de exploso se aquecido em ambiente fechado:


substncias e preparaes que, no sendo classificadas como explosivas em conformidade
com o ponto 2.2.1, possam, na prtica, apresentar propriedades explosivas quando aquecidas
num ambiente demasiado fechado. o caso, por exemplo, de determinadas substncias que,
quando aquecidas num recipiente de ao, se decompem de forma explosiva mas que no
apresentam essa caracterstica quando aquecidas em recipientes menos resistentes.

Para outras frases indicadoras de risco v. o pargrafo 3.2.7.

3 Classificao com base em propriedades toxicolgicas

3.1 Introduo:

3.1.1 A classificao est associada aos efeitos agudo e a longo prazo das substncias e preparaes, quer
resultem de uma nica exposio quer de uma exposio repetida ou prolongada.
Se tiver sido convenientemente demonstrado que, na prtica, o efeito txico das substncias e das
preparaes nos seres humanos , ou pode ser, diferente do efeito previsto a partir dos resultados
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4965

experimentais obtidos em animais ou por aplicao do mtodo convencional referido no Decreto-Lei


n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro,
e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho, essas substncias e preparaes devero ser classificadas
de acordo com a sua toxicidade nos seres humanos. Contudo, os ensaios em seres humanos devem
ser desaconselhados e, normalmente, no devero ser utilizados para contradizer dados positivos obtidos
em animais.

3.1.2 A classificao das substncias deve ser efectuada com base nos dados experimentais disponveis e
de acordo com os critrios seguintes, que tm em conta a amplitude desses efeitos:
a) Para a toxicidade aguda (efeitos letais e irreversveis aps uma nica exposio), sero utilizados
os critrios dos pargrafos 3.2.1 a 3.2.3;
b) Para a toxicidade subaguda, subcrnica ou crnica, sero utilizados os critrios dos pargrafos
3.2.2 a 3.2.4;
c) Para os efeitos corrosivos e irritantes, sero utilizados os critrios dos pargrafos 3.2.5 e 3.2.6;
d) Para os efeitos de sensibilizao, sero utilizados os critrios do pargrafo 3.2.7;
e) Para os efeitos especficos na sade (carcinognicos, mutagnicos e txicos para a reproduo),
sero utilizados os critrios descritos no captulo 4.

3.1.3 No caso das preparaes, a classificao relativa aos perigos para a sade efectua-se do modo seguinte:
a) Com base no mtodo convencional referido no Decreto-Lei n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco
que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.o 189/99,
de 2 de Junho, na ausncia de dados experimentais. Neste caso, a classificao baseia-se nos limites
de concentrao individuais fixados:
quer no anexo I do presente Regulamento:
quer no Decreto-Lei n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria
n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho, sempre que
a substncia ou substncias no figurarem no anexo I do presente Regulamento ou nele figurem
mas sem limites de concentrao;
b) Ou, no caso de existirem dados experimentais, de acordo com os critrios descritos no pargrafo 3.1.2,
excluindo as propriedades carcinognicas, mutagnicas e de toxicidade para a reproduo referidas
na alnea e) do pargrafo 3.1.2, cuja avaliao deve ser efectuada pelo mtodo convencional esta-
belecido no Decreto-Lei n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria
n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho.
Qualquer que seja o mtodo utilizado para a avaliao dos riscos de uma preparao, deve-se atender
a todos os efeitos perigosos para a sade que so definidos no Decreto-Lei n.o 120/92, de 30 de
Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei
n.o 189/99, de 2 de Junho.

3.1.4 Sempre que a classificao seja estabelecida com base em resultados experimentais obtidos em ensaios
com animais, esses resultados devero ter validade para os seres humanos, reflectindo os riscos de
modo adequado.

3.1.5 A toxicidade aguda por via oral das substncias ou preparaes colocadas no mercado pode ser esta-
belecida quer por um mtodo que permita a determinao do valor DL50 quer atravs da determinao
da dose discriminante (pelo mtodo da dose fixa).
A dose discriminante a dose que provoca toxicidade evidente sem causar mortalidade e dever
ser um dos quatro nveis de dosagem especificados no anexo V (5, 50, 500 ou 2 000 mg/kg de massa
corporal).
O conceito de toxicidade evidente corresponde a efeitos txicos, decorrentes da exposio substncia
testada, to intensos que a exposio dose fixa superior causar, provavelmente, mortalidade.
Os resultados do teste de uma determinada dose podero ser:
menos de 100 % de sobreviventes;
100 % de sobreviventes, embora com toxicidade evidente;
100 % de sobreviventes sem toxicidade evidente.
O mtodo utilizado exige, em alguns casos, que sejam testadas doses inferiores ou superiores, caso
o nvel apropriado no tenha ainda sido testado. Tambm deve ser referido o quadro de avaliao
do mtodo de ensaio B.1 bis anexo V.
Nos critrios dos pargrafos 3.2.1, 3.2.2 e 3.2.3 apenas se apresenta o resultado final dos testes. A
dose de 2000 mg/kg deve ser testada em primeiro lugar quando se pretenda obter informaes sobre
os efeitos txicos das substncias de baixa toxicidade aguda e que no sejam classificadas com base
em toxicidade aguda.
4966 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

3.2 Critrios para a classificao, escolha de smbolos e indicaes de perigo e escolha de frases indicadoras
de riscos:
3.2.1 Muito txico:
As substncias e preparaes sero classificadas como muito txicas e caracterizadas pelo smbolo
T+ e pela indicao de perigo muito txico de acordo com os critrios a seguir especificados.
As frases indicadoras de risco sero atribudas de acordo com os seguintes critrios:

R28 Muito txico por ingesto:


Resultados de toxicidade aguda:
DL50 por via oral, no rato 25 mg/kg;
menos de 100 % de sobreviventes, a 5 mg/kg, por via oral, no rato utilizando o mtodo da
dose fixa.

R27 Muito txico em contacto com a pele:


Resultados de toxicidade aguda:
DL50 por via cutnea, no rato ou no coelho: 50 mg/kg.

R26 Muito txico por inalao:


Resultados de toxicidade aguda:
CL50 por inalao, no rato, para aerossis ou partculas: 0,25 mg/litro/4h;
CL50 por inalao, no rato, por gases e vapores: 0,5 mg/litro/4h.

R39 Perigo de efeitos irreversveis muito graves:


no caso de existirem elementos concludentes quanto possibilidade da danos irreversveis,
diferentes dos efeitos referidos no captulo 4, atravs de uma nica exposio por uma via
adequada, geralmente na gama de doses acima referida.

Para indicar a via de administrao/exposio, deve ser utilizada uma das seguintes combinaes:
R39/26, R39/27, R39/28, R39/26/27, R39/26/28, R39/27/28, R39/26/27/28.

3.2.2 Txico:
As substncias e preparaes devem ser classificadas como txicas, e caracterizadas pelo smbolo T
e a indicao de perigo txico, de acordo com os critrios a seguir especificados. As frases indicadoras
de risco sero atribudas de acordo com os critrios a seguir definidos:

R25 Txico por ingesto:


Resultados de toxicidade aguda:
DL50 por via oral, no rato: 25 DL50 200 mg/kg;
dose discriminante, 5 mg/kg, por via oral, no rato: 100 % de sobreviventes, mas apresentando
toxicidade evidente.

R24 Txico em contacto com a pele:


Resultados de toxicidade aguda:
DL50 por via cutnea, no rato ou no coelho: 50 DL50 400 mg/kg.

R23 Txico por inalao:


Resultados de toxicidade aguda:
CL50 por inalao, no rato, para aerossis e partculas: 0,25 CL50 1 mg/litro/4 h;
CL50 por inalao, no rato, para gases e vapores: 0,5 CL50 2 mg/litro/4 h.

R39 Perigo de efeitos irreversveis muito graves:


no caso de existirem elementos concludentes quanto possibilidade de danos irreversveis,
diferentes dos efeitos referidos no captulo 4, atravs de uma nica exposio por uma via
adequada, geralmente na gama de doses acima referida.
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4967

Para indicar a via de administrao/exposio, deve ser utilizada uma das seguintes combinaes:
R39/23, R39/24, R39/25, R39/23/24, R39/23/25, R39/24/25, R39/23/24/25.

R48 Risco de efeitos graves para a sade em caso de exposio prolongada:


no caso de efeitos graves (perturbaes funcionais ou alteraes morfolgicas evidentes de
origem toxicolgica) que possam ser causados por exposio repetida ou prolongada por uma
via adequada.

As substncias e as preparaes sero classificadas pelo menos como txicas sempre que estes
efeitos sejam observados a nveis inferiores, numa ordem de grandeza (isto , 10 vezes), aos
nveis estabelecidos para a R48 no pargrafo 3.2.3.
Para indicar a via de administrao/exposio, deve ser utilizada uma das seguintes combinaes:
R48/23, R48/24, R48/25, R48/23/24, R48/23/25, R48/24/25, R48/23/24/25.

3.2.3 Substncias nocivas:


As substncias e preparaes devem ser classificadas de nocivas, sendo-lhes atribudo o smbolo Xn
e a indicao de perigo nocivo, em conformidade com os critrios a seguir especificados. As frases
indicadoras de risco sero atribudas de acordo com os seguintes critrios:
R22 Nocivo por ingesto:
Resultados de toxicidade aguda:
DL50 por via oral, no rato: 200 DL50 2000 mg/kg;
dose discriminante, por via oral, no rato, 50 mg/kg: 100 % de sobrevivncia, mas efeitos txicos
evidentes;
sobrevivncia inferior a 100 % a 50 mg/kg, no rato, por via oral, atravs do procedimento
de dosagem fixa. Ver o quadro de avaliao do mtodo de ensaio B.1, a), do anexo V.

R21 Nocivo em contacto com a pele:


Resultados de toxicidade aguda:
DL50 por contacto com a pele, no rato ou no coelho: 400 DL50 2000 mg/kg.

R20 Nocivo por inalao:


Resultados de toxicidade aguda:
CL50 por inalao, no rato, para aerossis e partculas: 1 CL50 5 mg/litro/4 h;
CL50 por inalao, no rato, para gases e vapores: 2 CL50 20 mg/litro/4 h.

R65 Nocivo: pode causar danos nos pulmes se ingerido:


Substncias e preparaes lquidas que apresentem para o homem um risco de aspirao em
virtude da sua baixa viscosidade, ou seja:
a) Substncias e preparaes que contenham hidrocarbonetos alifticos, alicclicos e aromticos
numa concentrao total equivalente ou superior a 10 % e se caracterizem igualmente por:
um tempo de escoamento inferior a 30 segundos num cone ISO de 3 mm em conformidade
com a norma ISO 2431; ou
uma viscosidade cinemtica inferior a 710-6 m2/s a 40oC, medida por um viscosmetro
capilar calibrado em vidro em conformidade com a norma ISO 3104/3105; ou
uma viscosidade cinemtica inferior a 710-6 m2/s a 40oC, deduzida de medies da vis-
cosidade rotacional em conformidade com a norma ISO 3129;
Nota. No necessrio classificar as substncias e preparaes que satisfazem estes critrios se a sua tenso superficial
mdia, determinada por um tensimetro de du Nuoy ou atravs dos mtodos de ensaio referidos na parte A.5
do anexo V, for superior a 33 mN/m a 25oC;

b) Outras substncias e preparaes classificadas com base na experincia prtica em seres


humanos.

R40 Possibilidade de efeitos irreversveis:


indicaes evidentes da possibilidade de ocorrerem danos irreversveis alm dos referidos
no captulo 4 mediante exposio pontual por uma via adequada, geralmente na gama de
doses acima referida.
4968 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

Para indicar a via de administrao/exposio, deve-se utilizar uma das seguintes combinaes:
R40/20, R40/21, R40/22, R40/20/21, R40/20/22, R40/21/22, R40/20/21/22.

R48 Risco de efeitos graves para a sade em caso de exposio prolongada:


Possibilidade de ocorrncia de danos graves (distrbio funcional ou alteraes morfolgicas
com importncia toxicolgica) mediante a exposio repetida ou prolongada por uma via
adequada.

As substncias e preparaes devem classificar-se, pelo menos, de nocivas sempre que se observem
os referidos efeitos para nveis da ordem de:
via oral, no rato 50 mg/kg (massa corporal)/dia;
via drmica, no rato ou no coelho 100 mg/kg (massa corporal)/dia;
inalao, no rato 0,25 mg/l, 6 h/dia.

Os valores-guia so directamente aplicveis nos casos em que se observem leses graves num
ensaio de toxicidade subcrnica (90 dias). Ao interpretar os resultados de um ensaio de toxicidade
subaguda (28 dias), devem multiplicar-se os valores por um factor aproximado de 3. Os ensaios
de toxicidade crnica (2 anos) disponveis devem ser avaliados caso a caso. Se se encontrarem
disponveis resultados de estudos com diversas duraes, devem utilizar-se, em geral, os resultados
do estudo de maior durao.
Para indicar a via de administrao/exposio, deve utilizar-se uma das seguintes combinaes:
R48/20, R48/21, R48/22, R48/20/21, R48/20/22, R48/21/22, R48/20/21/22.

3.2.3.1 Observaes respeitantes a substncias volteis:


No que respeita a determinadas substncias com elevada presso de vapor, podero existir dados
referentes a efeitos que constituam motivo de preocupao. Essas substncias podero no ser clas-
sificadas com base nos critrios relativos aos efeitos na sade do presente guia (3.2.3) ou no serem
abrangidas pelo ponto 3.2.8. Contudo, quando essas substncias apresentem, comprovadamente, riscos
na manipulao e na utilizao normais, poder ser necessrio classific-las, caso a caso, no anexo I.

3.2.4 Comentrios relativos utilizao da R48:


A utilizao desta frase indicadora de risco refere a gama especfica de efeitos biolgicos, nos termos
a seguir definidos. Na aplicao desta frase indicadora de risco, os efeitos graves para a sade incluiro
a morte e perturbaes funcionais ou modificaes morfolgicas evidentes de origem toxicolgica,
o que particularmente importante nos casos em que as modificaes so irreversveis. Tambm
importante ter em conta no s as modificaes graves especficas num nico rgo ou sistema
biolgico mas tambm as modificaes generalizadas de natureza menos grave, envolvendo diversos
rgos, ou as modificaes graves do estado geral de sade.
Ao fazer-se a avaliao da existncia de provas deste tipo de efeito, ter-se-o em conta as seguintes
directrizes:
1) Elementos que indicam que a frase R48 deve ser aplicada:
a) Mortes devidas substncia;
b):
i) Importantes modificaes funcionais nos sistemas nervosos central ou perifrico, incluindo
a viso, a audio e o olfacto, determinadas por observaes clnicas ou por outros mtodos
adequados (por exemplo, por electrofisiologia);
ii) Importantes modificaes funcionais noutros sistemas orgnicos (por exemplo, nos pulmes);

c) Quaisquer modificaes significativas dos parmetros bioqumicos clnicos, hematolgicos ou


de urinlise que indiquem graves disfunes orgnicas. As perturbaes hematolgicas sero
particularmente importantes se os dados indicarem que so provocadas por diminuio da pro-
duo de clulas sanguneas pela medula ssea;
d) Leses orgnicas graves observadas por exame microscpico na autpsia:
i) Necrose, fibrose ou formao de granuloma graves ou generalizadas em rgos vitais com
capacidade regenerativa (por exemplo, o fgado);
ii) Modificaes morfolgicas graves que sejam potencialmente reversveis mas em que haja
provas concludentes de disfuno orgnica acentuada (por exemplo, degenerao gorda hep-
tica grave, necrose tubular aguda do rim, gastrite ulcerosa);
iii) Provas de morte celular significativa em rgos vitais incapazes de regenerao (por exemplo,
fibrose miocrdica ou necrose neuronal) ou nas populaes de clulas progenitoras (por
exemplo, aplasia ou hipoplasia medular).
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4969

As provas anteriores sero obtidas, na maior parte dos casos, em ensaios com animais. Ao avaliar
os dados obtidos a partir da experincia prtica, deve-se prestar especial ateno aos nveis de exposio:
2) Provas que indicam que a R48 no deve ser aplicada:
A utilizao desta frase indicadora de risco restringe-se aos efeitos graves para a sade em caso
de exposio prolongada. possvel observar diversos efeitos associados a substncias, tanto em
seres humanos como em animais, que no justificam a utilizao da frase R48. Esses efeitos so
importantes sempre que se tente determinar a dose sem efeito de uma substncia qumica. Entre
os exemplos de modificaes bem documentadas que normalmente no justificam a classificao com
a R48, independentemente do seu significado estatstico, contam-se:
a) Observaes clnicas ou modificaes no aumento da massa corporal, do consumo de alimentos
ou da ingesto de gua, que podem possuir alguma importncia toxicolgica mas que, por
si ss, no so indicadores de efeitos graves;
b) Pequenas modificaes dos parmetros bioqumicos clnicos, hematolgicos ou de urinlise,
de importncia toxicolgica mnima ou duvidosa;
c) Modificaes na massa de rgos sem que haja sintomas de disfuno orgnica;
d) Respostas adaptativas (por exemplo, migrao de macrfagos para o pulmo, hipertrofia e
induo enzimtica hepticas, respostas hiperplsicas aos agentes irritantes). Efeitos locais
na pele produzidos por aplicao cutnea repetida de uma substncia que mais adequadamente
classificada com a frase R38 irritante para a pele;
e) Sempre que tenha sido demonstrada a existncia de um mecanismo de toxicidade especfico
da espcie (por exemplo, percursos metablicos especficos).

3.2.5 Corrosivo:
Considera-se que uma substncia ou preparao corrosiva se, ao ser aplicada na pele intacta e
saudvel de um animal, ocorrer a destruio dos tecidos da pele em toda a sua espessura em pelo
menos um animal, durante o ensaio sobre irritao da pele referido no anexo V ou durante a aplicao
de um mtodo equivalente, ou no caso desses resultados serem previsveis, por exemplo, tratando-se
de reaces fortemente cidas ou alcalinas (pH comprovadamente inferior ou igual a 2 ou superior
ou igual a 11,5); deve-se tambm atender capacidade alcalina ou cida.
A classificao poder basear-se em resultados de ensaios in vitro validados.
As substncias e preparaes sero classificadas como corrosivas e caracterizadas pelo smbolo C
e pela indicao de perigo corrosivo. As frases indicadoras de risco sero atribudas de acordo
com os critrios a seguir definidos:
R35 Provoca queimaduras graves:
se, quando aplicada na pele intacta e s de um animal, ocorrer a destruio dos tecidos
da pele em toda a sua espessura aps um perodo de exposio no superior a 3 minutos,
ou se tal resultado for previsvel.

R34 Provoca queimaduras:


se, quando aplicada na pele intacta e s de um animal, ocorrer a destruio dos tecidos
da pele em toda a sua espessura aps um perodo de exposio no superior a 4 horas,
ou se tal resultado for previsvel;
hidroperxidos orgnicos, excepto quando existam provas em contrrio.

3.2.6 Irritante:
As substncias e preparaes sero classificadas de irritantes e caracterizadas pelo smbolo Xi e
pela indicao de perigo irritante de acordo com os critrios a seguir indicados:

3.2.6.1 Inflamao da pele:


A frase indicadora de risco que se segue ser atribuda de acordo com os critrios subsequentes:
R38 Irritante para a pele:
substncias e preparaes que provoquem inflamao significativa da pele, persistente durante
pelo menos 24 horas aps um perodo de exposio no superior a quatro horas, no coelho,
de acordo com o mtodo de ensaio de irritao cutnea referido no anexo V.

A inflamao da pele ser significativa se:


a) O valor mdio, quer no caso da formao de escaras e eritema quer no caso da formao
de edema, calculado para o conjunto dos animais submetidos aos testes, for 2 ou mais; ou
b) Tiver sido observado um valor mdio, calculado para cada animal separadamente, em dois
ou mais animais, quer no caso da formao de escaras e eritema quer no caso da formao
de edema, equivalente a 2 ou mais, no caso de o ensaio do anexo V ter sido conduzido
com trs animais.
4970 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

Em ambos os casos, para o clculo dos respectivos valores mdios, devero ser utilizados todos
os valores relativos a cada um dos efeitos, que tenham sido observados em cada momento de
leitura (24, 48 e 72 horas).
A inflamao da pele tambm ser significativa se persistir em pelo menos dois animais no
final do perodo de observao. Devem ser tomados em conta efeitos particulares, por exemplo,
hiperplasia, descamao, alteraes da cor, fissuras, cicatrizes e alopcia.
Podem tambm obter-se dados importantes com base em ensaios no agudos com animais
[v. comentrios frase R48 na alnea 2, d)]. Os referidos dados so considerados significativos
se os efeitos observados forem idnticos aos descritos supra.
substncias e preparaes que provoquem inflamao significativa da pele, com base em obser-
vaes efectuadas em seres humanos, por contacto imediato, prolongado ou repetido;
perxidos orgnicos, excepto quando existam dados que indiquem o contrrio.

Parestesia:
A parestesia causada no homem pelo contacto cutneo com pesticidas piretrides no considerada
um efeito irritante que justifique a classificao como Xi; R38. Deve, todavia, aplicar-se a frase
S24 a substncias que causem o referido efeito.

3.2.6.2 Leses oculares:


As frases indicadoras de risco que se seguem sero atribudas de acordo com seguintes critrios a
seguir enumerados:
R36 Irritante para os olhos:
substncias e preparaes que, quando aplicadas nos olhos dos animais, provoquem leses
oculares significativas, que ocorram no perodo de 72 horas que se segue exposio e que
persistam durante, pelo menos, 24 horas.

As leses oculares sero significativas se algum dos valores mdios do ensaio de irritao ocular
referido no anexo V for:
superior ou igual a 2 mas inferior a 3, para a opacidade da crnea;
superior ou igual a 1 mas no superior a 1,5, para a leso da ris;
superior ou igual a 2,5, para a vermelhido da conjuntiva;
superior ou igual a 2, para o edema da conjuntiva (quimose);

ou, no caso de o ensaio do anexo V ter sido conduzido em trs animais, se as leses, em dois
ou mais animais, forem equivalentes a um dos valores precedentes, com a ressalva de que, no
que se refere leso da ris, o valor dever ser superior ou igual a 1 mas inferior a 2 e, no
que se refere vermelhido da conjuntiva, o valor dever ser superior ou igual a 2,5.
Em ambos os casos, para o clculo dos respectivos valores mdios, devero ser utilizados todos
os valores relativos a cada um dos efeitos que tenham sido observados em cada momento de
leitura (24, 48 e 72 horas):
substncias e preparaes que provoquem leses oculares significativas, com base na experincia
prtica em seres humanos;
perxidos orgnicos, excepto quando existam provas em contrrio.

R41 Risco de graves leses oculares:


substncias e preparaes que, quando aplicadas nos olhos dos animais, provoquem leses
oculares graves, que ocorram no perodo de 72 horas depois da instilao e que persistam
durante, pelo menos, 24 horas.

As leses oculares sero graves se algum dos valores mdios do ensaio de irritao ocular referido
no anexo V for:
superior ou igual a 3, para a opacidade da crnea;
superior ou igual a 1,5, para a leso da ris.

O mesmo se dever passar se o ensaio efectuado tiver sido efectuado em trs animais, se algum
dos valores dessas leses, em dois ou mais animais, for:
superior ou igual a 3, para a opacidade da crnea;
superior ou igual a 2, para a leso da ris.
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4971

As leses oculares tambm sero graves quando persistirem no final do perodo de observao.
As leses oculares tambm sero graves se a substncia ou preparao causar colorao irreversvel
dos olhos.
substncias e preparaes que provoquem leses oculares graves, com base na experincia
prtica em seres humanos.

Nota. Quando uma substncia ou preparao classificada como corrosiva, sendo-lhe atribuda a R34 ou a R35, o risco
de leses oculares graves considera-se implcito e a R41 no figurar no rtulo. Contudo, no caso das preparaes ao calcular-se
a soma dos quocientes pelas frmulas do Decreto-Lei n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria
n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho, as substncias classificadas como corrosivas
devem ser consideradas como se lhes tivesse sido atribuda a R41.

3.2.6.3 Irritao do sistema respiratrio:


A frase indicadora de risco que se segue ser atribuda de acordo com os critrios enumerados:
R37 Irritante para as vias respiratrias:
Substncias e preparaes que provoquem irritao grave do sistema respiratrio com base em:
observaes prticas nos seres humanos;
resultados positivos obtidos nos ensaios adequados com animais.

Comentrios relativos utilizao da frase R37

Na interpretao das observaes prticas nos seres humanos, importante estabelecer a distino
entre os efeitos que conduzem a uma classificao com a frase R48 (v. ponto 3.2.4) e os que conduzem
a uma classificao com a frase R37. As condies que conduzem normalmente classificao com
a frase R37 so reversveis e normalmente limitadas s vias respiratrias superiores.
Resultados positivos nos ensaios adequados com animais podem incluir dados obtidos num ensaio
geral de toxicidade, nomeadamente dados histopatolgicos relativos ao sistema respiratrio. Podem
igualmente ser utilizados dados resultantes da medio da bradipneia experimental para avaliar a
irritao das vias respiratrias.

3.2.7 Sensibilizao:
3.2.7.1 Sensibilizao por inalao:
As substncias e preparaes sero classificadas de sensibilizantes e caracterizadas pelo smbolo Xn,
pela indicao de perigo nocivo e pela frase indicadora de risco R42 de acordo com os critrios
a seguir definidos:
R42 Pode causar sensibilizao por inalao:
no caso de existirem provas de que essas substncias ou preparaes podem induzir uma
hipersensibilidade respiratria especfica;
no caso de se obterem resultados positivos nos ensaios adequados com animais;
se a substncia for um isocianato, salvo se, comprovadamente, a substncia no provocar
hipersensibilidade respiratria.

Comentrios relativos utilizao da frase R42

Provas dos efeitos nos seres humanos:


As provas de que a substncia pode provocar uma hipersensibilidade respiratria especfica sero
em princpio baseadas na experincia prtica com os seres humanos. Neste contexto, considera-se
normalmente a asma como uma manifestao de hipersensibilidade, mas podem igualmente ser con-
sideradas outras reaces de hipersensibilidade como a rinite e a alveolite. A condio observada
ter o carcter clnico de uma reaco alrgica. Todavia, no necessrio demonstrar os mecanismos
imunolgicos.
Quando se procede anlise dos elementos resultantes da exposio dos seres humanos, para proceder
classificao, necessrio tomar ainda em considerao, para alm das provas obtidas a partir dos
casos estudados, o seguinte:
a dimenso da populao exposta;
o grau de exposio.

As supramencionadas provas podero ser as seguintes:


antecedentes clnicos e dados obtidos em ensaios das funes respiratrias relacionados com a
exposio substncia, confirmados por outras provas, por exemplo;
uma estrutura qumica associada a substncias conhecidas como provocando uma hipersensibilidade
respiratria;
4972 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

um ensaio imunolgico in vivo (por exemplo, testes de escarificao);


um ensaio imunolgico in vitro (por exemplo, anlise serolgica);
estudos susceptveis de indicar outros mecanismos de aco especficos mas no imunolgicos,
por exemplo, uma irritao ligeira repetida, efeitos induzidos por uma aco farmacolgica;
dados obtidos em ensaios positivos nos brnquios com a substncia, efectuados de acordo com
directrizes reconhecidas para a determinao de uma reaco especfica de hipersensibilidade.

Os antecedentes clnicos devem incluir tanto os antecedentes mdicos como profissionais, a fim de
estabelecer uma relao entre a exposio a uma substncia especfica e o desenvolvimento de uma
hipersensibilidade respiratria. As informaes relevantes incluem nomeadamente factores de agra-
vamento quer no domiclio, quer no local de trabalho, o aparecimento e a evoluo da doena, os
antecedentes familiares e mdicos do paciente em questo. Os antecedentes mdicos devero igualmente
incluir uma meno a outras perturbaes alrgicas ou respiratrias que se tenham manifestado desde
a infncia e igualmente os antecedentes de tabagismo.
Os resultados de ensaios positivos nos brnquios so considerados como fornecendo por si s provas
suficientes para a classificao. Todavia, reconhece-se que na prtica j devero ter sido efectuados
muitos dos exames acima enumerados.
As substncias que apenas provocam sintomas de asma por irritao em indivduos que sofrem de
hiper-reactividade dos brnquios no devem ser classificadas com a frase de risco R42.

Estudos com animais:


Os dados obtidos nos ensaios susceptveis de indicar o potencial de uma substncia para provocar
sensibilizao por inalao nos seres humanos podem incluir:
determinao da IgE (por exemplo, em ratos);
reaces pulmonares especficas nas cobaias.

3.2.7.2 Sensibilizao por contacto com a pele:


As substncias e preparaes sero classificadas como sensibilizantes e caracterizadas pelo smbolo
Xi, pela indicao de perigo irritante e pela frase de risco R43 de acordo com os critrios a
seguir definidos:
R43 Pode causar sensibilizao em contacto com a pele:
se a experincia prtica demonstrar que as substncias ou preparaes podem induzir uma
reaco de sensibilizao por contacto com a pele, num nmero substancial de pessoas; ou
no caso de se verificarem resultados positivos nos ensaios adequados com animais.

Comentrios relativos utilizao da frase R43

Provas dos efeitos nos seres humanos:


Os elementos seguintes (experincia prtica) so suficientes para classificar a substncia com a frase
de risco R43:
dados positivos obtidos por meio dos ensaios epicutneos pertinentes, normalmente em mais de
uma clnica dermatolgica; ou
estudos epidemiolgicos que revelem o aparecimento de dermatites alrgicas de contacto causadas
pela substncia. Devem ser estudadas com uma ateno particular as circunstncias em que uma
elevada percentagem dos que foram expostos apresentam sintomas caractersticos, mesmo se os
casos forem poucos numerosos; ou
dados positivos obtidos em ensaios experimentais com seres humanos (v. igualmente ponto 3.1.1).

Os elementos seguintes so suficientes para classificar uma substncia com a frase de risco R43 sempre
que existirem provas de apoio:
episdios isolados de dermatites alrgicas de contacto; ou
estudos epidemiolgicos em que o acaso, a predisposio ou outros factores de dvida no foram
excludos com um grau de segurana aceitvel.

As provas de apoio podero incluir:


dados obtidos em ensaios com animais realizados de acordo com directrizes reconhecidas, com
resultados no conformes com os critrios enunciados na seco relativa aos estudos com animais
mas suficientemente prximos dos limites para serem considerados como significativos; ou
dados obtidos por meio de mtodos no normalizados; ou
relaes estrutura-actividade adequadas.
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4973

Estudos com animais:


Resultados positivos nos ensaios adequados com animais so:
no caso do mtodo de ensaio, com adjuvantes tipo, para a sensibilizao da pele que descrito
no anexo V ou no caso de outros mtodos de ensaio com adjuvantes do mesmo tipo, considera-se
positiva uma resposta em pelo menos 30 % dos animais;
Com qualquer outro tipo de mtodo de ensaio, considera-se positiva uma resposta em pelo menos
15 % dos animais.

3.2.7.3 Urticria de contacto de origem imunolgica:


Algumas substncias ou preparaes que satisfazem os critrios correspondentes frase R42 podem,
para alm disso, causar urticrias de contacto de origem imunolgica. Neste caso, necessrio incluir
informaes relativas urticria de contacto por meio da utilizao das frases S adequadas, geralmente
as frases S24 e S36/37 e integr-las na Ficha de Dados de Segurana.
Para as substncias que provocam sinais de urticria de contacto de origem imunolgica e que no
satisfazem os critrios correspondentes frase R42, necessrio considerar uma caracterizao por
meio da frase R43.
No existe um modelo animal reconhecido para identificar as substncias que causam urticrias de
contacto de origem imunolgica. Por conseguinte, a classificao dever, de um modo geral, ser baseada
nas provas dos efeitos nos seres humanos semelhantes s que dizem respeito sensibilizao
cutnea (R43).

3.2.8 Outras propriedades toxicolgicas:


s substncias e preparaes classificadas em conformidade com os pontos 2.2.1 a 3.2.7 precedentes
e ou os captulos 4 e 5 sero atribudas outras frases indicadoras de risco, de acordo com os seguintes
critrios, baseados na experincia obtida durante a compilao do anexo I:
R29 Em contacto com a gua liberta vapores txicos:
Para substncias e preparaes que, em contacto com a gua ou a humidade do ar, libertam
gases txicos ou muito txicos (por exemplo, fosforeto de alumnio, pentassulfureto de fsforo)
em quantidades potencialmente perigosas.

R31 Em contacto com cidos liberta gases txicos:


Para substncias e preparaes que reagem com cidos, libertando gases txicos (por exemplo,
hipoclorito de sdio, polissulfureto de brio) em quantidades potencialmente perigosas. Para
substncias utilizadas pelo pblico em geral, mais adequada a frase S50 [no misturar com
. . . (a especificar pelo fabricante)].

R32 Em contacto com cidos liberta gases muito txicos:


Para substncias e preparaes que reagem com cidos, libertando gases muito txicos (por exemplo
sais de cianeto de hidrognio, azida de sdio) em quantidades potencialmente perigosas. Para
substncias utilizadas pelo pblico em geral, mais adequada a utilizao da frase S50 [no
misturar com . . . (a especificar pelo fabricante)].

R33 Perigo de efeitos cumulativos:


Para substncias e preparaes cuja acumulao no organismo humano seja provvel e possa
causar preocupaes mas no seja suficiente para o uso da frase R48.

R64 Pode causar danos nas crianas alimentadas com leite materno:
Para substncias e preparaes absorvidas pelas mulheres que possam interferir com a lactao
ou possam encontrar-se presentes (nomeadamente na forma de metabolitos) no leite materno
em quantidades que suscitem preocupaes sobre a sade dos lactentes.
Para os comentrios sobre a frase R64 e o respectivo uso (bem como em alguns casos, a frase R33),
v. o ponto 4.2.3.3.

R66 A exposio repetida pode causar secura ou fissurao cutneas:


Para substncias e preparaes que possam causar problemas em virtude dos seus efeitos de
secura, descamao ou fissurao cutneas, mas que no satisfazem os critrios da frase R38:
Com base em:
observaes prticas na sequncia do manuseamento ou utilizao normais; ou
dados importantes relativos aos efeitos cutneos previsveis.

V. tambm os pontos 1.6 e 1.7.


4974 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

R67 Os vapores podem causar sonolncia e tonturas:


Para substncias e preparaes volteis que contenham componentes que causem sintomas ine-
quvocos de depresso do sistema nervoso central por inalao, ainda no classificadas em matria
de toxicidade aguda por inalao (R20, R23, R26, R40/20, R39/23 ou R39/26).
Podem utilizar-se as seguintes fontes de informao:
a) Dados provenientes de estudos com animais que mostrem sintomas inequvocos de depresso
do sistema nervoso central por inalao, tais como letargia, descoordenao (incluindo perda
do reflexo de endireitamento) e ataxia:
quer com concentraes/tempos de exposio no superiores a 20 mg/l/4 h;
quer no caso da razo entre a concentrao que causa os referidos efeitos, num perodo
igual ou inferior a 4 horas, e a concentrao do vapor saturado (SVC), a 20oC, seja inferior
ou igual a um dcimo;

b) Dados provenientes de fontes bem documentadas relativos aos seus efeitos no homem (por
exemplo, narcose, sonolncia, diminuio da vigilncia, perda de reflexos, descoordenao,
vertigens), em condies de exposio comparveis s que causam os efeitos supramencionados
em animais.

V. tambm os pontos 1.6 e 1.7.


Para outras frases de risco suplementares v. o ponto 2.2.6.

4 Classificao com base em efeitos especficos na sade humana

4.1 Introduo:
4.1.1 Este captulo define o processo de classificao das substncias que podem produzir os efeitos descritos
a seguir.

4.1.2 Se um produtor, distribuidor ou importador dispuser de informaes que indiquem que uma substncia
deve ser classificada e rotulada em conformidade com os critrios enunciados nos pontos 4.2.1, 4.2.2
ou 4.2.3, deve proceder rotulagem provisria da substncia de acordo com os referidos critrios,
com base numa avaliao das evidncias efectuada por uma entidade competente.

4.1.3 O produtor, distribuidor ou importador deve apresentar aos Estados membros em cujo mercado a
substncia seja colocada, to breve quanto possvel, um documento sntese com todas as informaes
relevantes sobre a mesma. O referido documento deve incluir uma bibliografa com todas as referncias
importantes, nomeadamente dados de relevo no publicados.

4.1.4 Alm disso, um produtor, distribuidor ou importador que disponha de novos dados de relevo para
a classificao e rotulagem de uma substncia, em conformidade com os critrios estabelecidos nos
pontos 4.2.1, 4.2.2 e 4.2.3, deve apresentar os referidos dados, to breve quanto possvel, aos Estados
membros em cujo mercado a substncia seja colocada.

4.1.5 A fim de se estabelecer, na Comunidade, to rapidamente quanto possvel, uma classificao har-
monizada de acordo com o processo previsto no presente Regulamento, os Estados membros que
disponham de informaes relevantes que justifiquem a classificao de uma substncia numa dessas
categorias, fornecidas ou no pelo produtor, devem, o mais rapidamente possvel, envi-las Comisso,
acompanhadas de propostas de classificao e rotulagem.
A Comisso enviar a proposta de classificao e rotulagem recebida aos outros Estados membros.
Qualquer Estado membro poder solicitar Comisso a comunicao das informaes que lhe tenham
sido apresentadas.
Qualquer Estado membro que tenha motivos vlidos para admitir que as propostas de classificao
e rotulagem sugeridas sejam inadequadas, no que diz respeito aos efeitos carcinognicos, mutagnicos
ou de toxicidade para a reproduo, dever notificar a Comisso nesse sentido.

4.2 Critrios para a classificao, indicao de perigos e escolha de frases indicadoras de riscos:

4.2.1 Substncias carcinognicas:


No que diz respeito classificao e rotulagem, e tendo em conta o estado actual dos conhecimentos,
estas substncias so divididas em trs categorias:
1.a categoria substncias conhecidas pelos seus efeitos carcinognicos nos seres humanos. Existem
elementos suficientes para estabelecer uma relao de causa-efeito entre a exposio dos seres humanos
a tais substncias e o desenvolvimento de cancros;
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4975

2.a categoria substncias que devem ser equiparadas a substncias carcinognicas para os seres huma-
nos. Existem elementos suficientes para que se justifique uma forte suspeita de que a exposio dos
seres humanos a tais substncias possa provocar o cancro, sendo essa suspeita estabelecida, em geral,
com base em:
estudos adequados a longo prazo em animais;
outras informaes relevantes;

3.a categoria substncias que se receia possam ter efeitos carcinognicos nos seres humanos mas
em relao s quais as informaes disponveis no so suficientes para que possa ser feita uma
avaliao satisfatria. Existem alguns elementos, obtidos em estudos adequados com animais, mas
esses elementos no so suficientes para justificar a incluso da substncia na 2.a categoria.

4.2.1.1 Sero utilizados os seguintes smbolos e frases indicadoras de risco especficas:


1.a e 2.a categorias:
T; R45 Pode causar cancro.

No entanto, no caso das substncias e preparaes que representem um risco de carcinogenicidade


apenas quando inaladas, por exemplo, na forma de p, vapor ou fumo (as outras vias de exposio,
tais como a ingesto ou o contacto com a pele, no apresentam qualquer risco de carcinogenicidade),
dever utilizar-se o smbolo e a frase indicadora de risco especfica que se seguem:
T; R49 Pode causar cancro por inalao.

3.a categoria:
Xn; R40 Possibilidades de efeitos irreversveis.

4.2.1.2 Comentrios relativos classificao das substncias carcinognicas em categorias:


A classificao de uma substncia na 1.a categoria efectua-se com base em dados epidemiolgicos;
a classificao nas 2.a e 3.a categorias baseia-se, fundamentalmente, em experincias em animais.
Para a classificao como carcinognico na 2.a categoria necessrio dispor de resultados positivos
em duas espcies animais ou provas positivas claras obtidas numa espcie e elementos complementares,
tais como dados de genotoxicidade, estudos metablicos ou bioqumicos, induo de tumores benignos,
relaes estruturais com outros agentes carcinognicos conhecidos ou dados provenientes de estudos
epidemiolgicos que sugiram qualquer associao.
A 3.a categoria engloba, de facto, duas subcategorias:
a) Substncias que foram suficientemente estudadas mas para as quais as provas de induo de tumores
so insuficientes para justificar a classificao na 2.a categoria. Admite-se que novas experincias
no viessem a fornecer mais informaes relevantes no que diz respeito classificao;
b) Substncias que no foram suficientemente estudadas. Os dados disponveis no so adequados
mas constituem motivo de preocupao. Esta classificao provisria; necessrio efectuar mais
experincias antes de se tomar uma deciso final.

Para estabelecer uma distino entre as 2.a e 3.a categorias, so relevantes os argumentos que se
apresentam a seguir, que reduzem o significado da induo experimental de tumores no que se refere
a uma possvel exposio dos seres humanos. Estes argumentos, especialmente quando combinados,
conduzem, na maior parte dos casos, classificao na 3.a categoria, ainda que tenham sido induzidos
tumores em animais:
efeitos carcinognicos apenas com doses muito elevadas que excedem a dose mxima tolerada.
A dose mxima tolerada caracteriza-se por efeitos txicos que, embora no reduzindo o perodo
de vida, se manifestam em conjunto com modificaes fsicas, tais como uma reduo de apro-
ximadamente 10 % no aumento de peso;
formao de tumores, especialmente com doses muito elevadas, apenas em determinados rgos
de algumas espcies conhecidas por serem muito susceptveis formao espontnea de tumores;
formao de tumores, apenas no local de aplicao, em sistemas de ensaio muito sensveis (por
exemplo, aplicao i. p. ou s. c. de alguns compostos localmente activos), se o alvo em causa
no for relevante para os seres humanos;
ausncia de genotoxicidade em ensaios a curto prazo in vivo ou in vitro;
existncia de um mecanismo de aco secundrio que apenas se manifesta acima de uma determinada
dose limite (por exemplo, efeitos hormonais em rgos alvo ou em mecanismos de regulao fisio-
lgica ou estimulao crnica da proliferao celular);
existncia de um mecanismo de formao de tumores especfico de uma determinada espcie (por
exemplo, por percursos metablicos especficos), irrelevante para os seres humanos.
4976 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

Para uma distino entre a 3.a categoria e a ausncia de classificao, so relevantes os seguintes
argumentos, que excluem qualquer preocupao quanto aos seres humanos:
uma substncia no deve ser classificada em nenhuma das categorias se o mecanismo de formao
experimental de tumores tiver sido claramente identificado, com provas seguras de que esse processo
no pode ser extrapolado para os seres humanos;
se os nicos dados disponveis sobre tumores forem relativos aos tumores do fgado de algumas
estirpes sensveis de ratinhos, sem quaisquer outros elementos complementares, a substncia no
poder ser classificada em nenhuma das categorias;
deve-se prestar especial ateno aos casos em que os nicos dados disponveis sobre tumores sejam
a ocorrncia de neoplasias locais e em estirpes onde se saiba que ocorrem espontaneamente com
uma incidncia elevada.

4.2.2 Substncias mutagnicas:


4.2.2.1 No que diz respeito classificao e rotulagem, e tendo em conta o estado actual dos conhecimentos,
estas substncias so divididas em trs categorias:
1.a categoria substncias conhecidas pelos seus efeitos mutagnicos nos seres humanos.
Existem elementos suficientes para se estabelecer uma relao de causa efeito entre a exposio dos
seres humanos a tais substncias e defeitos genticos hereditrios.
2.a categoria substncias que devem ser equiparadas a substncias mutagnicas para os seres humanos.
Existem elementos suficientes para que se justifique uma forte suspeita de que a exposio dos seres
humanos a tais substncias possa provocar defeitos genticos hereditrios, sendo essa suspeita esta-
belecida, em geral, com base em:
estudos adequados em animais;
outras informaes relevantes.

3.a categoria substncias que se receia possam ter efeitos mutagnicos nos seres humanos.
Existem elementos obtidos em estudos adequados de mutagenicidade, mas esses elementos so insu-
ficientes para justificar a incluso da substncia na 2.a categoria.

4.2.2.2 Sero utilizados os seguintes smbolos e frases indicadoras de risco especficas:


1.a categoria:
T; R46 Pode causar alteraes genticas hereditrias.

2.a categoria:
T; R46 Pode causar alteraes genticas hereditrias.

3.a categoria:
Xn; R40 Possibilidades de efeitos irreversveis.

4.2.2.3 Comentrios relativos classificao das substncias mutagnicas em categorias:


Definio de termos:
Uma mutao consiste numa alterao permanente da quantidade ou da estrutura do material gentico
de um organismo, originando uma modificao das suas caractersticas fenotpicas. As alteraes podem
envolver um nico gene, um bloco de genes ou um cromossoma inteiro. Os efeitos que envolvem
genes isolados podem ser consequncia de efeitos sobre uma nica base do ADN (mutaes pontuais)
ou de grandes modificaes no gene, incluindo delees. Os efeitos num cromossoma inteiro podem
envolver modificaes estruturais ou numricas. Uma mutao nas clulas germinativas em organismos
que se reproduzem sexualmente pode ser transmitida descendncia. Um mutagneo um agente
que origina um aumento da ocorrncia de mutaes.
Refira-se que as substncias so classificadas de mutagnicas considerando, especificamente, as leses
genticas hereditrias. No entanto, o tipo de resultados que conduz classificao das substncias
qumicas na 3.a categoria, induo de fenmenos geneticamente relevantes em clulas somticas,
tambm , em geral, considerado um aviso sobre possvel actividade carcinognica.
O desenvolvimento de um mtodo para o ensaio da mutagenicidade um processo contnuo. Para
muitos ensaios novos no existem critrios de avaliao nem protocolos normalizados. Para a avaliao
dos dados de mutagenicidade deve atender-se qualidade da realizao do ensaio e ao grau de validade
do mtodo.
1.a categoria. Para a classificao de uma substncia na 1.a categoria, necessrio dispor de provas
positivas obtidas em estudos epidemiolgicos de mutaes em seres humanos. At data, no se
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4977

conhecem exemplos deste tipo de substncias. Reconhece-se que extremamente difcil obter infor-
maes fiveis a partir de estudos sobre a incidncia de mutaes em populaes humanas ou sobre
o possvel aumento das suas frequncias de ocorrncia.
2.a categoria. Para a classificao de uma substncia na 2.a categoria, necessrio dispor de resultados
positivos obtidos em experincias que demonstrem: a) efeitos mutagnicos; b) outras interaces celu-
lares relevantes, do ponto de vista da mutagenicidade, em clulas germinativas de mamferos in vivo;
ou c) efeitos mutagnicos em clulas somticas de mamferos in vivo, juntamente com provas con-
cludentes de que a substncia ou um metabolito dela decorrente atinge as clulas germinativas.
No que diz respeito classificao na 2.a categoria, consideram-se actualmente adequados os seguintes
mtodos:
2 a) Ensaios de mutagenicidade em clulas germinativas efectuados in vivo:
ensaio de mutao num locus especfico;
ensaio de translocao hereditria;
ensaio de mutao letal dominante.

Estes ensaios demonstram, de facto, a manifestao de uma progenitura afectada ou de um defeito


no embrio em desenvolvimento.

2 b) Ensaios in vivo que revelem uma interaco relevante com clulas germinativas (normalmente
ADN):
ensaios sobre anomalias cromossmicas, detectadas por anlise citogentica, incluindo aneu-
ploidia provocada por separao anmala de cromossomas;
teste de permuta de cromatdeos irmos (SCE);
teste de sntese no programada do ADN (UDS);
ensaio de ligao (covalente) do mutagneo ao ADN das clulas germinativas;
ensaios para outros tipos de leses do ADN.

Estes ensaios fornecem provas mais ou menos indirectas. Os resultados positivos obtidos nestes ensaios
devem, em geral, ser confirmados por resultados positivos obtidos em ensaios de mutagenicidade
em clulas somticas, efectuados in vivo em mamferos ou em seres humanos [v. na 3.a categoria,
de preferncia, os mtodos descritos em 3 a)].

2 c) Ensaios in vivo que demonstrem os efeitos mutagnicos em clulas somticas de mamferos [v. em
3 a)], juntamente com mtodos toxicocinticos, ou outras metodologias que possam demonstrar
que o composto ou um metabolito dele decorrente atinge as clulas germinais.

Nas alneas 2 b) e 2 c) os resultados positivos obtidos em ensaios com hospedeiros ou a demonstrao


de efeitos inequvocos em ensaios in vitro podem ser considerados provas suplementares.

3.a categoria. Para a classificao de uma substncia na 3.a categoria so necessrios resultados
positivos, obtidos em ensaios, que demonstrem: a) efeitos mutagnicos; ou b) outras interaces celulares
relevantes do ponto de vista da mutagenicidade, em clulas somticas de mamferos in vivo. Em par-
ticular, este ltimo caso dever, normalmente, ser confirmado por resultados positivos obtidos em
ensaios de mutagenicidade in vitro.
Para a verificao de efeitos em clulas somticas in vivo, consideram-se actualmente adequados os
seguintes mtodos:
3 a) Ensaios de mutagenicidade em clulas somticas in vivo:
teste do microncleo da medula ssea ou anlise da metafase;
anlise da metafase de linfcitos perifricos;
teste das malhas de cor no plo do ratinho.

3 b) Ensaios de interaco no ADN de clulas somticas in vivo:


teste para observao de permuta de cromatdeos irmos (SCE) em clulas somticas;
teste para observao de sntese no programada do ADN (UDS) em clulas somticas;
ensaio para observao da ligao (covalente) do mutagneo ao ADN das clulas somticas;
ensaio para observao de leses do ADN, por exemplo por eluio alcalina, em clulas
somticas.

As substncias que apresentem resultados positivos apenas num ou mais ensaios de mutagenicidade
in vitro no devero, normalmente, ser classificadas. No entanto, recomenda-se vivamente que sejam
submetidas a investigaes complementares, recorrendo a ensaios in vivo. Em casos excepcionais, por
exemplo, no caso de uma substncia que provoque respostas importantes em diversos ensaios in vivo,
4978 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

para a qual no existam dados significativos obtidos in vivo e que revele afinidades com mutag-
neos/carcinogneos conhecidos, pode encarar-se a possibilidade de o classificar na 3.a categoria.

4.2.3 Substncias com efeitos txicos na reproduo:


4.2.3.1 No que diz respeito classificao e rotulagem, e tendo em conta o estado actual do conhecimento,
estas substncias so divididas em trs categorias:
1.a categoria:
Substncias que, comprovadamente, causam anomalias da fertilidade humana. Existem elementos
suficientes para se estabelecer uma relao de causa-efeito entre a exposio dos seres humanos a
tais substncias e as anomalias na fertilidade.
Substncias que, comprovadamente, tm efeitos txicos no desenvolvimento dos seres humanos. Exis-
tem elementos suficientes para se estabelecer uma relao de causa-efeito entre a exposio dos seres
humanos a tais substncias e os efeitos txicos da decorrentes no desenvolvimento da progenitura.

2.a categoria:
Substncias que devem ser equiparadas a substncias que causam anomalias da fertilidade
humana. Existem elementos suficientes para que se justifique uma forte suspeita de que a exposio
dos seres humanos a tais substncias possa causar anomalias da fertilidade, estabelecida com base
em:
provas concludentes, obtidas em ensaios com animais, de anomalias da fertilidade, sem que se
manifestem efeitos txicos, ou provas da existncia de anomalias da fertilidade para doses prximas
das que provocam outros efeitos txicos, sem que essas anomalias sejam uma consequncia secun-
dria, no especfica, desses efeitos txicos;
outras informaes relevantes.

Substncias que devem ser equiparadas a substncias que tm efeitos txicos no desenvolvimento
dos seres humanos. Existem elementos suficientes para que se justifique uma forte suspeita de
que a exposio dos seres humanos a tais substncias possa ter efeitos txicos no desenvolvimento,
estabelecida em geral com base em:
resultados concludentes obtidos em estudos apropriados com animais, em que se observaram efeitos
na ausncia de sinais de toxicidade materna acentuada ou para doses prximas das que provocaram
outros efeitos txicos mas sem que, neste caso, sejam uma consequncia secundria, no especfica,
desses efeitos txicos;
outras informaes relevantes.

3.a categoria:
Substncias que suscitam preocupaes quanto aos seus efeitos na fertilidade humana. Em geral,
com base em:
resultados obtidos em estudos apropriados em animais que constituem motivo suficiente para jus-
tificar fortes suspeitas quanto existncia de anomalias da fertilidade, na ausncia de efeitos txicos,
ou provas da existncia de anomalias da fertilidade para doses prximas das que provocam outros
efeitos txicos, sem que essas anomalias sejam uma consequncia secundria, no especfica, desses
efeitos txicos, mas que so insuficientes para justificar a incluso da substncia na 2.a categoria;
outras informaes relevantes.

Substncias que suscitam preocupaes quanto possibilidade de ocorrncia de efeitos txicos no


desenvolvimento dos seres humanos. Em geral, com base em:
resultados obtidos em estudos apropriados em animais que constituem motivo suficiente para jus-
tificar fortes suspeitas quanto existncia de efeitos txicos no desenvolvimento, na ausncia de
sinais de toxicidade materna acentuada, ou efeitos observados para doses prximas das que provocam
outros efeitos txicos, sem que sejam uma consequncia secundria, no especfica, desses efeitos
txicos, mas que so insuficientes para justificar a incluso da substncia na 2.a categoria;
outras informaes relevantes.

4.2.3.2 Sero utilizados os seguintes smbolos e frases indicadoras de risco especficas:


1.a categoria:
Substncias que causam anomalias da fertilidade humana:
T; R60 Pode comprometer a fertilidade.

Substncias com efeitos txicos no desenvolvimento:


T; R61 Risco durante a gravidez com efeitos adversos na descendncia.
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4979

2.a categoria:
Substncias que devem ser equiparadas a substncias que causam anomalias da fertilidade humana:
T; R60 Pode comprometer a fertilidade.

Substncias que devem ser equiparadas a substncias com efeitos txicos no desenvolvimento dos
seres humanos:
T; R61 Risco durante a gravidez com efeitos adversos na descendncia.

3.a categoria:
Substncias que suscitam preocupaes quanto ao seu efeito na fertilidade humana:
Xn; R62 Possveis riscos de comprometer a fertilidade.

Substncias que suscitam preocupaes quanto possibilidade de ocorrncia de efeitos txicos no


desenvolvimento dos seres humanos:
Xn; R63 Possveis riscos durante a gravidez de efeitos indesejveis na descendncia.

4.2.3.3 Comentrios relativos classificao das substncias txicas para a reproduo em categorias:
A toxicidade para a reproduo inclui a perturbao das funes ou capacidades reprodutoras masculina
ou feminina e a induo de efeitos nocivos no hereditrios na progenitura. A classificao pode
ser feita com base em dois grupos principais: 1) Efeitos na fertilidade masculina ou feminina; e 2) efeitos
txicos no desenvolvimento.
1) Os efeitos na fertilidade masculina ou feminina compreendem efeitos nocivos no lbido, no com-
portamento sexual, em qualquer aspecto da espermatognese ou da oognese ou nas actividades
hormonais ou respostas fisiolgicas que interfiram na capacidade de fertilizar, na prpria fertilizao
ou no desenvolvimento do ovo at fase de implantao, inclusive.
2) Os efeitos txicos no desenvolvimento so entendidos no seu sentido mais lato, compreendendo
qualquer efeito que interfira no desenvolvimento normal, antes ou depois do nascimento. Abrange
efeitos induzidos ou manifestados no perodo pr-natal e efeitos manifestados no perodo ps-natal,
o que inclui efeitos txicos para o embrio/feto, tais como reduo do peso corporal, atrasos do
crescimento e do desenvolvimento, toxicidade orgnica, morte, aborto, anomalias estruturais (efeitos
teratognicos), perturbaes funcionais, anomalias perinatais e ps-natais e perturbaes do desen-
volvimento fsico e mental ps-natal at puberdade, inclusive.

A classificao com efeitos txicos na reproduo deve ser atribuda s substncias e preparaes
qumicas nos casos em que estas possuam propriedades intrnsecas ou especficas que se traduzam
em efeitos txicos desse tipo. Nos casos em que esses efeitos sejam apenas uma consequncia secundria,
no especfica, de outros efeitos txicos, as substncias e preparaes qumicas no devero ser clas-
sificadas de txicas para a reproduo. As substncias e preparaes qumicas mais preocupantes
so as que se revelam txicas para a reproduo a nveis de exposio que no produzem outros
sinais de toxicidade.
A incluso de um composto na 1.a categoria, devido aos seus efeitos na fertilidade e ou aos seus
efeitos txicos no desenvolvimento, feita com base em dados epidemiolgicos. A incluso nas 2.a
e 3.a categorias feita, sobretudo, com base em dados obtidos em animais. Os dados obtidos em
estudos in vitro ou os estudos com ovos de aves so considerados confirmaes e s podero fun-
damentar uma classificao, excepcionalmente, se no existirem dados in vivo.
Em comum com a maior parte dos outros tipos de efeitos txicos, de esperar que as substncias
que revelem toxicidade para a reproduo no manifestem os seus efeitos nocivos abaixo de um deter-
minado limite. Mesmo quando tenha sido demonstrada a existncia de efeitos claros em estudos com
animais, a sua relevncia para o caso dos seres humanos pode no ser segura, dadas as doses admi-
nistradas. o caso, por exemplo, de efeitos cuja existncia tenha sido demonstrada apenas para doses
elevadas, quando existam diferenas toxicocinticas importantes ou quando a via de administrao
for inadequada. Por estas e outras razes do mesmo tipo, pode suceder que seja atribuda a classificao
na 3.a categoria ou que nenhuma classificao seja atribuda.
O anexo V do presente Regulamento especifica um teste limite para o caso das substncias de baixa
toxicidade. Se uma dose de, pelo menos, 1000 mg/kg, por via oral, no der origem manifestao
de efeitos txicos na reproduo, estudos envolvendo outras doses podem ser considerados desne-
cessrios. Se existirem dados de estudos efectuados com doses superiores dose limite referida, tais
dados devem ser avaliados juntamente com outros dados relevantes. Em circunstncias normais, con-
sidera-se que os efeitos manifestados apenas perante doses superiores dose limite no implicaro,
necessariamente, a classificao com efeitos txicos na reproduo.
4980 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

Efeitos na fertilidade
Para que uma substncia seja classificada na 2.a categoria, devido a perturbaes da fertilidade, devero
existir, normalmente, elementos inequvocos, obtidos numa espcie animal, fundamentados num meca-
nismo de aco ou num local de actuao, uma relao de tipo qumico com outros agentes com
efeitos comprovadamente antifertilidade ou outras informaes, obtidas em seres humanos, que per-
mitam concluir ser provvel que esses efeitos se manifestem nos seres humanos. Nos casos em que
apenas tenham sido efectuados estudos numa espcie, sem que existam outros elementos relevantes
que confirmem os resultados desses estudos, poder classificar-se a substncia na 3.a categoria.
Uma vez que as perturbaes da fertilidade podero ocorrer em associao, no especfica, com toxi-
cidade generalizada intensa, a classificao na 2.a categoria s dever ser atribuda quando, com-
provadamente, existir um certo grau de especificidade dos efeitos txicos relativamente ao sistema
reprodutor. Caso tenha sido demonstrado que as perturbaes da fertilidade verificadas em estudos
com animais foram devidas a incapacidade de acasalamento, para estabelecer uma classificao na
2.a categoria, ser, em geral, necessrio conhecer o mecanismo de aco, de modo a poder determinar-se
se efeitos adversos, como alteraes do tipo de secreo hormonal, podero ocorrer, ou no, nos
seres humanos.

Efeitos txicos no desenvolvimento


Para estabelecer uma classificao na 2.a categoria, deve-se dispor de provas concludentes da existncia
de efeitos nocivos, obtidas em estudos bem conduzidos numa ou mais espcies. Uma vez que os
efeitos nocivos na gravidez ou no perodo ps-natal podero ser uma consequncia secundria de
toxicidade materna, reduzida ingesto de alimentos ou de gua, stress materno, falta de cuidados
maternos, deficincias dietticas especficas, condies deficientes para a criao dos animais, infeces
intercorrentes ou de outras situaes, importante que os efeitos observados ocorram durante estudos
bem conduzidos e com doses a que no esteja associada toxicidade materna acentuada. A via de
exposio tambm importante. Nomeadamente, a injeco intraperitoneal do material irritante pode
provocar leses localizadas do tero e do seu contedo, devendo os resultados destes estudos ser
interpretados com precauo, no implicando, em geral, por si s, a atribuio de uma determinada
classificao.
A classificao na 3.a categoria fundamenta-se em critrios semelhantes aos correspondentes 2.a cate-
goria mas poder ser atribuda nos casos em que a concepo das experincias enferme de deficincias
que tornem as concluses pouco credveis, ou nos casos em que no possa excluir-se a possibilidade
de os efeitos serem devidos a factores inespecficos, por exemplo, toxicidade generalizada.
Em geral, ser estabelecida uma classificao ad hoc na 3.a categoria ou no ser estabelecida nenhuma
classificao nos casos em que os nicos efeitos observados forem pequenas alteraes na incidncia
de anomalias idiopticas, pequenas alteraes na ocorrncia de variantes comuns, como as observadas
nos exames esquelticos, ou pequenas variaes nos exames do desenvolvimento ps-natal.

Efeitos durante o aleitamento


As substncias a que tenha sido atribuda a classificao com efeitos txicos na reproduo e que
suscitem preocupaes quanto aos seus efeitos na lactao, devero, complementarmente, ser rotuladas
com a frase R64 (v. os critrios que constam do ponto 3.2.8).
Para fins de classificao, os efeitos txicos na progenitura que resultem, exclusivamente, de exposio
pela via do leite materno ou os efeitos txicos que resultem de exposio directa das crianas no
sero considerados efeitos txicos na reproduo, salvo quando se traduzam em anomalias do desen-
volvimento da progenitura.
As substncias que no sejam classificadas com efeitos txicos na reproduo mas cuja toxicidade
possa ser motivo de preocupao por transferncia para a criana durante o perodo de aleitamento,
devero ser rotuladas com a frase R64 (v. os critrios correspondentes ao pargrafo 3.2.8). Esta frase
R tambm poder adequar-se s substncias que afectem a quantidade ou a qualidade do leite.

Em geral, a frase R64 ser atribuda com base em:


a) Estudos de toxicocintica que revelem a possibilidade de a substncia estar presente no leite materno
em nveis potencialmente txicos;
b) Resultados de estudos de uma ou duas geraes em animais que revelem a existncia de efeitos
nocivos na progenitura, devidos a transferncias pelo leite;
c) Ou risco para as crianas durante o perodo de aleitamento, comprovado em seres humanos.

As substncias que, comprovadamente, se acumulem no corpo e que, subsequentemente, possam passar


para o leite durante a lactao, podero ser rotuladas com a R33 e a R64.
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4981

4.2.4 Processo para a classificao de preparaes, no que se refere aos efeitos especficos na sade:
Se uma preparao contiver uma ou mais substncias classificadas tendo em conta os critrios acima
estabelecidos, deve ser classificada de acordo com os critrios referidos no Decreto-Lei n.o 120/92,
de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e
pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho (os limites de concentrao so fixados no anexo I da
presente portaria ou no Decreto-Lei n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela
Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho, nos casos
em que desde que a substncia ou as substncias no figurem no anexo I do presente Regulamento
ou nele figurem mas sem limites de concentrao).

5 Classificao com base em efeitos no ambiente


5.1 Introduo:
O principal objectivo da classificao das substncias e preparaes como perigosas para o ambiente
alertar o utilizador para os perigos que essas substncias representam para os ecossistemas. Embora
os critrios actuais se refiram aos ecossistemas aquticos, sabe-se que algumas substncias podem
afectar, simultnea ou alternativamente, outros ecossistemas cujos constituintes podem ir desde a micro-
flora e a microfauna do solo at aos primatas.
Os critrios adiante definidos decorrem directamente dos mtodos de ensaio especificados no anexo V,
desde que sejam mencionados. Os mtodos de ensaio necessrios para o dossier de base referido
no anexo VII so limitados e as informaes obtidas por aplicao desses mtodos podem ser insuficientes
para uma classificao adequada. Para a classificao, podero ser necessrios dados suplementares
(nvel 1, anexo VIII) ou outros estudos equivalentes. Alm disso, a classificao das substncias poder
ser reexaminada medida que se dispuser de novos dados.
Para efeitos de classificao e rotulagem, e tendo em conta o estado actual do conhecimento, estas
substncias so divididas em dois grupos, de acordo com os seus efeitos agudo e ou a longo prazo
em sistemas aquticos ou de acordo com os seus efeitos agudo e ou a longo prazo em sistemas
no aquticos.

5.2 Critrios para a classificao, indicaes de perigo e escolha de frases indicadoras de riscos:
5.2.1 Ambiente aqutico:
5.2.1.1 As substncias sero classificadas de perigosas para o ambiente e caracterizadas pelo smbolo N,
pela indicao de perigo perigoso para o ambiente e por frases indicadoras de risco de acordo
com os critrios a seguir definidos:
R50 Muito txico para os organismos aquticos
e
R53 Pode causar efeitos nefastos a longo prazo no ambiente aqutico.
Toxicidade aguda: CL50 s 96 h (nos peixes) 1 mg/l;
ou CE50 s 48 h (nos Daphnia) 1 mg/l;
ou CI50 s 72 h (nas algas) 1 mg/l;

e
a substncia no facilmente degradvel;
ou
o log Poa (log do coeficiente de partio octanol/gua) 3,0 (salvo se o coeficiente de bioconcentrao,
BCF, determinado experimentalmente for 100).

R50 Muito txico para os organismos aquticos.


Toxicidade aguda: CL50 s 96 h (nos peixes) 1 mg/l;
ou CE50 s 48 h (nos Daphnia) 1 mg/l;
ou CI50 s 72 h (nas algas) 1 mg/l.

R51 Txico para os organismos aquticos


e
R53 Pode causar efeitos nefastos a longo prazo no ambiente aqutico.
Toxicidade aguda: CL50 s 96 h (nos peixes) 1 mg/l CL50 10 mg/l;
ou CE50 s 48 h (nos Daphnia) 1 mg/l CE50 10 mg/l;
ou CI50 s 72 h (nas algas) 1 mg/l CI50 10 mg/l;
e
a substncia no facilmente degradvel;
ou
o log Poa, 3,0 (excepto se o coeficiente de bioconcentrao, BCF, determinado experimentalmente
for 100).
4982 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

5.2.1.2 As substncias sero classificadas de perigosas para o ambiente de acordo com os critrios seguintes.
As frases indicadoras de risco tambm sero atribudas de acordo com os critrios a seguir definidos:
R52 Nocivo para os organismos aquticos
e
R53 Pode causar efeitos nefastos a longo prazo no ambiente aqutico.
Toxicidade aguda: CL50 s 96 h (nos peixes) 10 mg/l CL50 100 mg/l;
ou CE50 s 48 h (nos Daphnia) 10 mg/l CE50 100 mg/l;
ou CI50 s 72 h (nas algas) 10 mg/l CI50 100 mg/l;
e a substncia no facilmente degradvel.
Este ser o critrio aplicado, salvo se existirem outros elementos de carcter cientfico, relativos
degradao e ou toxicidade, suficientes para garantir que nem a substncia nem os produtos da sua
degradao podero constituir um perigo potencial a longo prazo e ou retardado para o ambiente
aqutico. Normalmente esses elementos cientficos suplementares basear-se-o nos estudos exigidos
pelo nvel 1 (anexo VIII) ou em estudos equivalentes, podendo incluir:
i) Prova de potencial comprovado de degradao rpida no ambiente aqutico;
ii) Ausncia de efeitos de toxicidade crnica para um valor de concentrao de 1,0 mg/l, por exemplo
uma concentrao sem efeito observvel superior a 1,0 mg/l, determinada num estudo prolongado
de toxicidade efectuado em peixes ou em Daphnia.

R52 Nocivo para os organismos aquticos:


Substncias que no so abrangidas pelos critrios precedentes deste captulo mas que, com base
nos elementos disponveis relativos sua toxicidade, possam, ainda assim, constituir um perigo para
a estrutura e ou para o funcionamento dos ecossistemas aquticos.

R53 Pode causar efeitos nefastos a longo prazo no ambiente aqutico:


Substncias que no so abrangidas pelos critrios precedentes deste captulo mas que, com base
nos elementos disponveis relativos sua persistncia, potencial acumulao e comportamento e destino
previstos ou observados no ambiente, possam, ainda assim, constituir um perigo a longo prazo e
ou retardado para a estrutura e ou para o funcionamento dos ecossistemas aquticos.
Por exemplo, as substncias pouco solveis em gua, isto , as substncias com uma solubilidade
inferior a 1 mg/l, sero abrangidas por este critrio se:
a) No forem facilmente degradveis; e
b) O log Poa 3,0 (excepto se o coeficiente de bioconcentrao, BCF, determinado experimentalmente
for 100).

Este ser o critrio aplicado, salvo se existirem outros elementos de carcter cientfico, relativos
degradao e ou toxicidade, suficientes para garantir que nem a substncia nem os produtos da sua
degradao podero constituir um perigo potencial a longo prazo e ou retardado para o ambiente
aqutico.
Normalmente esses elementos cientficos suplementares basear-se-o nos estudos exigidos pelo nvel 1
(anexo VIII) ou em estudos equivalentes, podendo incluir:
i) Prova de potencial comprovado de degradao rpida no ambiente aqutico;
ii) Ausncia de efeitos de toxicidade crnica no limite de solubilidade, por exemplo, uma concentrao
sem efeito observvel superior ao limite de solubilidade, determinada num estudo prolongado de
toxicidade efectuado em peixes ou em Daphnia.

5.2.1.3 Comentrios relativos determinao da CI50 em algas e degradao fcil:


se, no caso das substncias fortemente coradas, puder ser demonstrado que a inibio do crescimento
das algas devida, exclusivamente, reduo da intensidade da luz, ento a CI50 s 72 horas,
para algas, no dever ser utilizada como base de classificao.
as substncias sero consideradas facilmente degradveis se forem respeitados os seguintes critrios:
a) Se, em estudos de biodegradao de 28 dias, forem atingidos os seguintes nveis de degradao:
70 %, em ensaios baseados no carbono orgnico dissolvido;
60 % do mximo terico, em ensaios baseados no consumo de oxignio ou na produo
de dixido de carbono.

Estes nveis de biodegradao devero ser obtidos at 10 dias aps o incio da degradao,
ponto considerado como o tempo de degradao de 10 % da substncia; ou
b) Se, nos casos em que apenas existam dados de CQO e CBO5, a relao CBO5/CQO for superior
ou igual a 0,5; ou
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4983

c) Se existirem outros elementos concludentes de carcter cientfico que demonstrem que a subs-
tncia pode ser degradada (bitica e ou abioticamente) no ambiente aqutico, em mais de
70 %, num perodo de 28 dias.

5.2.2 Ambiente no aqutico:


5.2.2.1 As substncias sero classificadas como perigosas para o ambiente e caracterizadas pelo smbolo N,
pela indicao de perigo adequada e por frases indicadoras de risco de acordo com os critrios a
seguir definidos:
R54 Txico para a flora;
R55 Txico para a fauna;
R56 Txico para os organismos do solo;
R57 Txico para as abelhas;
R58 Pode causar efeitos nefastos a longo prazo no ambiente.
Substncias que, com base nos elementos disponveis relativos sua toxicidade, persistncia, acumulao
potencial, bem como comportamento e destino previsveis ou observados no ambiente, possam constituir
um perigo imediato ou a longo prazo e ou retardado para a estrutura e ou para o funcionamento
dos ecossistemas naturais, diferente dos abrangidos pelo ponto 5.2.1 supra. Posteriormente, sero ela-
borados critrios mais pormenorizados.

5.2.2.2 As substncias e preparaes sero classificadas como perigosas para o ambiente e caracterizadas
pelo smbolo N, pela indicao de perigo adequada e por frases indicadoras de risco de acordo
com os critrios a seguir definidos:
R59 Perigoso para a camada de ozono.
Substncias que, com base nos elementos disponveis relativos s suas propriedades, bem como ao
seu comportamento e destino previsveis ou observados no ambiente, possam constituir um perigo
para a estrutura e ou para o funcionamento da camada de ozono da estratosfera. Incluem-se as subs-
tncias enumeradas no anexo I do Regulamento (CE) n.o 3093/94, do Conselho, relativo a substncias
que empobrecem a camada de ozono (JO, L 333, de 22 de Dezembro de 1994, p. 1) e suas alteraes
subsequentes.

6 Escolha das recomendaes de prudncia


6.1 Introduo:
As recomendaes de prudncia (frases S) sero atribudas s substncias e preparaes perigosas
de acordo com os critrios gerais a seguir definidos. Alm disso, no caso de determinadas preparaes,
as recomendaes de prudncia do Decreto-Lei n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco que lhe
foi dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho,
so obrigatrias.
Sempre que se refira o produtor no captulo 6 estar a fazer-se referncia pessoa responsvel pela
colocao da substncia ou preparao no mercado.

6.2 Frases de segurana aplicveis s substncias e preparaes perigosas:


S1 Guardar fechado chave:
mbito de aplicao:
substncias e preparaes muito txicas, txicas ou corrosivas.

Critrios de utilizao:
obrigatria para as substncias e preparaes atrs referidas, vendidas ao pblico em geral.

S2 Manter fora do alcance das crianas:


mbito de aplicao:
todas as substncias e preparaes perigosas.

Critrios de utilizao:
obrigatria para todas as substncias e preparaes perigosas vendidas ao pblico em geral
que no tenham sido apenas classificadas de perigosas para o ambiente.

S3 Guardar em lugar fresco:


mbito de aplicao:
perxidos orgnicos;
outras substncias e preparaes perigosas com ponto de ebulio 40oC.
4984 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

Critrios de utilizao:
obrigatria para os perxidos orgnicos, excepto no caso da utilizao da frase S47;
recomendada para outras substncias e preparaes perigosas com ponto de ebulio 40oC.

S4 Manter fora de qualquer zona de habitao:


mbito de aplicao:
substncias e preparaes muito txicas e txicas.
Critrios de utilizao:
geralmente limitada a substncias e preparaes muito txicas e txicas, como complemento
da frase S13 em casos adequados, nomeadamente quando existam riscos de inalao e a substncia
ou preparao deva ser armazenada em locais distantes das zonas habitacionais. Esta indicao
no tem por objectivo excluir a utilizao adequada dessas substncias ou preparaes em zonas
habitacionais.

S5 Manter sob . . . (lquido apropriado a especificar pelo produtor):


mbito de aplicao:
substncias e preparaes slidas que se inflamem espontaneamente.

Critrios de utilizao:
limitada, normalmente, a casos especiais, por exemplo, sdio, potssio ou fsforo branco.

S6 Manter sob . . . (gs inerte a especificar pelo produtor):


mbito de aplicao:
substncias e preparaes perigosas que devam ser mantidas numa atmosfera inerte.

Critrios de utilizao:
limitada, normalmente, a casos especiais, por exemplo, determinados compostos organometlicos.

S7 Manter o recipiente bem fechado:


mbito de aplicao:
perxidos orgnicos;
substncias e preparaes que possam libertar gases muito txicos, txicos, nocivos ou extre-
mamente inflamveis;
substncias e preparaes que, por absoro de humidade, libertem gases extremamente
inflamveis;
slidos facilmente inflamveis.

Critrios de utilizao:
obrigatria para os perxidos orgnicos;
recomendada para os restantes mbitos de aplicao referidos.

S8 Manter o recipiente ao abrigo da humidade:


mbito de aplicao:
substncias e preparaes que possam reagir violentamente com a gua;
substncias e preparaes que, em contacto com a gua, libertem gases extremamente inflamveis;
substncias e preparaes que, em contacto com a gua, libertem gases muito txicos.

Critrios de utilizao:
limitada, normalmente, aos mbitos de aplicao supra-referidos, quando necessrio reforar
as indicaes de risco das frases R14 e R15 em particular, mas tambm da R29.

S9 Manter o recipiente num local bem ventilado:


mbito de aplicao:
substncias e preparaes volteis que possam libertar vapores muito txicos, txicos ou nocivos;
lquidos extremamente inflamveis ou muito inflamveis e gases extremamente inflamveis.
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4985

Critrios de utilizao:
recomendada para as substncias e preparaes volteis que possam libertar vapores muito
txicos, txicos ou nocivos;
recomendada para lquidos extremamente inflamveis ou muito inflamveis ou gases extre-
mamente inflamveis.

Sl2 No fechar o recipiente hermeticamente:


mbito de aplicao:
substncias e preparaes que possam provocar a exploso do recipiente, por libertao de
gases ou vapores.

Critrios de utilizao:
limitada, normalmente, aos casos especiais acima referidos.

S13 Manter afastado de alimentos e bebidas, incluindo os dos animais:


mbito de aplicao:
substncias e preparaes muito txicas, txicas e nocivas.
Critrios de utilizao:
recomendada para substncias e preparaes que possam ser utilizadas pelo pblico em geral.

S14 Manter ao abrigo de . . . (matrias incompatveis a indicar pelo produtor):


mbito de aplicao:
perxidos orgnicos

Critrios de utilizao:
obrigatria para os perxidos orgnicos e normalmente limitada aos mesmos. Contudo, pode
ser til em casos excepcionais, se a incompatibilidade produzir riscos especficos.

S15 Manter afastado do calor:


mbito de aplicao:
substncias e preparaes que possam decompor-se ou reagir espontaneamente sob a aco
do calor.

Critrios de utilizao:
limitada, normalmente, a casos especiais, como os monmeros, no sendo atribudas se as frases
indicadoras de risco R2, R3 e ou R5 j tiverem sido aplicadas.

S16 Manter afastado de qualquer chama ou fonte de ignio No fumar:


mbito de aplicao:
lquidos extremamente inflamveis ou muito inflamveis e gases extremamente inflamveis.

Critrios de utilizao:
recomendada para as substncias e preparaes referidas, no sendo atribuda se as frases
indicadoras de risco R2, R3 e ou R5 j tiverem sido aplicadas.

S17 Manter afastado de matrias combustveis:


mbito de aplicao:
substncias e preparaes que possam constituir misturas explosivas ou espontaneamente infla-
mveis com matrias combustveis.

Critrios de utilizao:
a utilizar em casos especiais, por exemplo para reforar as frases R8 e R9.

S18 Manipular e abrir o recipiente com prudncia:


mbito de aplicao:
substncias e preparaes que possam produzir uma sobrepresso no recipiente;
substncias e preparaes que possam dar origem a perxidos explosivos.
4986 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

Critrios de utilizao:
normalmente limitada aos casos atrs referidos, sempre que existam riscos de danos para os
olhos e ou as substncias e preparaes possam ser utilizadas pelo pblico em geral.

S20 No comer nem beber durante a utilizao:


mbito de aplicao:
substncias e preparaes muito txicas, txicas ou corrosivas.

Critrios de utilizao:
normalmente limitada a casos especiais (por exemplo, arsnio e compostos de arsnio; fluo-
roacetatos), em particular substncias e preparaes que possam ser utilizadas pelo pblico
em geral.

S21 No fumar durante a utilizao:


mbito de aplicao:
substncias e preparaes cuja combusto origine produtos txicos.

Critrios de utilizao:
limitada, normalmente, a casos especiais (por exemplo, compostos halogenados).

S22 No respirar as poeiras:


mbito de aplicao:
todas as substncias e preparaes slidas perigosas para a sade.

Critrios de utilizao:
obrigatria para todas as substncias e preparaes atrs referidas a que tenha sido atribuda
a frase R42;
recomendada para as substncias e preparaes atrs referidas fornecidas numa forma pul-
verulenta inalvel e cujos riscos para a sade na sequncia da inalao se desconhecem.

S23 No respirar os gases/vapores/fumos/aerossis [termo(s) apropriado(s) a indicar pelo produtor]:


mbito de aplicao:
todas as substncias e preparaes lquidas e gasosas perigosas para a sade.

Critrios de utilizao:
obrigatria para substncias e preparaes atrs referidas a que tenha sido atribuda a frase
R42;
obrigatria para substncias e preparaes destinadas a utilizao por pulverizao. Como com-
plemento, devem prescrever-se as frases S38 ou S51;
recomendada quando seja necessrio chamar a ateno do utilizador para riscos decorrentes
da inalao no referidos nas frases indicadoras de risco atribudas.

S24 Evitar o contacto com a pele:


mbito de aplicao:
todas as substncias e preparaes perigosas para a sade.

Critrios de utilizao:
obrigatria para todas as substncias e preparaes a que tenha sido atribuda a frase R43,
salvo se tiver sido tambm atribuda a frase S36;
recomendada quando seja necessrio chamar a ateno do utilizador para riscos decorrentes
do contacto com a pele (por exemplo, parestesia) no referidos nas frases indicadoras de risco
atribudas. No entanto, poder ser utilizada para reforar tais frases.

S25 Evitar o contacto com os olhos:


mbito de aplicao:
todas as substncias e preparaes perigosas para a sade.
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4987

Critrios de utilizao:
recomendada quando seja necessrio chamar a ateno do utilizador para riscos decorrentes
do contacto com os olhos, no referidos nas frases indicadoras de risco obrigatrias. No entanto,
poder ser utilizada para reforar tais frases;
recomendada para substncias e preparaes corrosivas s quais tenham sido atribudas as frases
R34, R35, R36 ou R41 que possam ser utilizadas pelo pblico em geral.

S26 Em caso de contacto com os olhos, lavar imediata e abundantemente com gua e consultar um
especialista:
mbito de aplicao:
substncias e preparaes corrosivas ou irritantes.

Critrios de utilizao:
obrigatria para as substncias e preparaes corrosivas a que tenha sido atribuda a frase R41;
recomendada para as substncias e preparaes irritantes a que tenha j sido atribuda a frase
R36.

S27 Retirar imediatamente todo o vesturio contaminado:


mbito de aplicao:
substncias e preparaes muito txicas, txicas ou corrosivas.

Critrios de utilizao:
obrigatria para substncias e preparaes muito txicas a que tenha sido atribuda a frase
R27 e que possam ser utilizadas pelo pblico em geral;
recomendada para substncias e preparaes muito txicas, utilizadas na indstria, a que tenha
sido atribuda a frase R27. Contudo, esta frase de segurana no deve ser utilizada se tiver
sido atribuda a frase S36;
recomendada para substncias e preparaes txicas a que tenha sido atribuda a frase R24,
bem como para substncias e preparaes corrosivas que possam ser utilizadas pelo pblico
em geral.

S28 Aps contacto com a pele lavar imediata e abundantemente com . . . (produtos adequados a
especificar pelo produtor):
mbito de aplicao:
substncias e preparaes muito txicas, txicas ou corrosivas.

Critrios de utilizao:
obrigatria para substncias e preparaes muito txicas;
recomendada para as restantes substncias e preparaes supra-referidas, em especial quando
a gua no for o fluido de lavagem mais indicado;
recomendada para substncias e preparaes corrosivas que possam ser utilizadas pelo pblico
em geral.

S29 No deitar os resduos no esgoto:


mbito de aplicao:
lquidos extremamente inflamveis ou muito inflamveis imiscveis com a gua;
substncias e preparaes muito txicas e txicas;
substncias perigosas para o ambiente.

Critrios de utilizao:
obrigatria para substncias perigosas para o ambiente e caracterizadas pelo smbolo N, que
possam ser utilizadas pelo pblico em geral, excepto se for essa a sua previsvel utilizao;
recomendada para as outras substncias e preparaes supra-referidas que possam ser utilizadas
pelo pblico em geral, excepto se for essa a sua previsvel utilizao.

S30 Nunca adicionar gua a este produto:


mbito de aplicao:
substncias e preparaes que reajam violentamente com a gua.
4988 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

Critrios de utilizao:
normalmente limitada a casos especiais (por exemplo, cido sulfrico); pode ser utilizada, se
adequado, para fornecer informaes to claras quanto possvel, tanto para reforar a frase
R14 ou como alternativa frase R14.

S33 Evitar acumulao de cargas electrostticas:


mbito de aplicao:
substncias e preparaes extremamente inflamveis ou muito inflamveis.

Critrios de utilizao:
recomendada para substncias e preparaes utilizadas na indstria que no absorvam humidade.
Praticamente nunca utilizada para substncias e preparaes colocadas no mercado para uti-
lizao pelo pblico em geral.

S35 Este produto e o seu recipiente devem ser eliminados de modo seguro:
mbito de aplicao:
todas as substncias e preparaes perigosas.

Critrios de utilizao:
recomendada para substncias e preparaes cuja eliminao adequada necessite de directrizes
especficas.

S36 Usar vesturio de proteco adequado:


mbito de aplicao:
perxidos orgnicos;
substncias e preparaes muito txicas, txicas ou nocivas;
substncias e preparaes corrosivas.

Critrios de utilizao:
obrigatria para substncias e preparaes muito txicas e corrosivas;
obrigatria para as substncias e preparaes a que tenham sido atribudas as frases R21 ou
R24;
obrigatria para substncias cancergenas, mutagnicas ou txicas para a reproduo da cate-
goria 3, excepto se os referidos efeitos ocorrerem apenas por inalao das mesmas;
obrigatria para os perxidos orgnicos;
recomendada para substncias e preparaes txicas se o valor de DL50 drmico for desconhecido,
mas a substncia ou preparao puder ser nociva por contacto com a pele;
recomendada para as substncias e preparaes utilizadas na indstria que sejam potencialmente
nocivas para a sade em caso de exposio prolongada.

S37 Usar luvas adequadas:


mbito de aplicao:
substncias e preparaes muito txicas, txicas, nocivas ou corrosivas;
perxidos orgnicos;
substncias e preparaes irritantes da pele ou que causem sensibilizao por contacto com
a pele.

Critrios de utilizao:
obrigatria para substncias e preparaes muito txicas e corrosivas;
obrigatria para substncias e preparaes a que tenham sido atribudas as frases R21, R24
ou R43;
obrigatria para substncias cancergenas, mutagnicas e txicas para a reproduo da categoria 3,
excepto se os referidos efeitos ocorrerem apenas por inalao das mesmas;
obrigatria para os perxidos orgnicos;
recomendada para substncias e preparaes txicas se o valor de DL50 drmico for desconhecido
mas a substncia ou preparao puder ser nociva por contacto com a pele;
recomendada para substncias e preparaes irritantes para a pele.

S38 Em caso de ventilao insuficiente, usar equipamento respiratrio adequado:


mbito de aplicao:
substncias e preparaes muito txicas e txicas.
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4989

Critrios de utilizao:
limitada, normalmente, a casos especiais de utilizao de substncias e preparaes muito txicas
ou txicas, na indstria ou na agricultura.

S39 Usar um equipamento protector para a vista/face:


mbito de aplicao:
perxidos orgnicos;
substncias e preparaes corrosivas, incluindo substncias e preparaes irritantes, que apre-
sentem riscos de danos graves para os olhos;
substncias e preparaes muito txicas e txicas.

Critrios de utilizao:
obrigatria para substncias e preparaes a que tenham sido atribudas as frases R34, R35
ou R41;
obrigatria para os perxidos orgnicos;
recomendada quando seja necessrio chamar a ateno do utilizador, para riscos decorrentes
do contacto com os olhos, no referidos nas frases indicadoras de risco atribudas;
limitada normalmente, a casos excepcionais de substncias e preparaes muito txicas e txicas,
quando existir o risco de salpicos e quando estas substncias e preparaes forem facilmente
absorvidas atravs da pele.

S40 Para limpeza do cho e objectos contaminados por este produto, utilizar . . . (a especificar pelo
produtor):
mbito de aplicao:
todas as substncias e preparaes perigosas.

Critrios de utilizao:
limitada, normalmente, s substncias e preparaes perigosas para as quais a gua no seja
considerada um agente de limpeza adequado (por exemplo, quando for necessrio recorrer
absoro por uma matria pulverulenta, a dissoluo num solvente, etc.) e aos casos em
que, por razes de sade e ou segurana, seja importante fazer uma advertncia no rtulo.

S41 Em caso de incndio e ou exploso no respirar os fumos:


mbito de aplicao:
substncias e preparaes perigosas que libertem gases muito txicos ou txicos durante a
combusto.

Critrios de utilizao:
geralmente limitada a casos especiais.

S42 Durante as fumigaes/pulverizaes usar equipamento respiratrio adequado [termo(s) ade-


quado(s) a especificar pelo produtor]:
mbito de aplicao:
substncias e preparaes destinadas a estas utilizaes mas que possam prejudicar a sade
e a segurana do utilizador se no forem tomadas medidas de precauo apropriadas.

Critrios de utilizao:
limitada, normalmente, a casos especiais.

S43 Em caso de incndio, utilizar . . . (meios de extino a especificar pelo produtor. Se a gua
aumentar os riscos, acrescentar: Nunca utilizar gua):
mbito de aplicao:
substncias e preparaes extremamente inflamveis, facilmente inflamveis e inflamveis.

Critrios de utilizao:
obrigatria para substncias e preparaes que, em contacto com a gua ou a humidade do
ar, libertem gases extremamente inflamveis;
4990 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

recomendada para as substncias e preparaes extremamente inflamveis, facilmente inflamveis


e inflamveis, especialmente quando imiscveis com a gua.

S45 Em caso de acidente ou de indisposio, consultar imediatamente o mdico (se possvel, mostrar-lhe
o rtulo):
mbito de aplicao:
substncias e preparaes muito txicas;
substncias e preparaes txicas e corrosivas;
substncias e preparaes que causem sensibilizao por inalao.

Critrios de utilizao:
obrigatria para as substncias e preparaes acima referidas.

S46 Em caso de ingesto, consultar imediatamente o mdico e mostrar-lhe a embalagem ou o rtulo:


mbito de aplicao:
todas as substncias e preparaes perigosas, excepto as muito txicas, txicas, corrosivas ou
perigosas para o ambiente.

Critrios de utilizao:
obrigatria para todas as substncias e preparaes acima referidas que possam ser utilizadas
pelo pblico em geral, excepto se no existirem motivos para recear perigos decorrentes da
respectiva ingesto, nomeadamente por crianas.

S47 Conservar a uma temperatura que no exceda . . .oC (a especificar pelo produtor):
mbito de aplicao:
substncias e preparaes que se tornem instveis a uma determinada temperatura.

Critrios de utilizao:
limitada, normalmente, a casos especiais (por exemplo, determinados perxidos orgnicos).

S48 Manter hmido com . . . (material adequado a especificar pelo produtor):


mbito de aplicao:
substncias e preparaes que possam tornar-se muito sensveis a fascas, frico ou choque,
no caso de secarem.

Critrios de utilizao:
limitada, normalmente, a casos especiais, por exemplo, nitroceluloses.

S49 Conservar unicamente no recipiente de origem:


mbito de aplicao:
substncias e preparaes sensveis a decomposio cataltica.

Critrios de utilizao:
substncias e preparaes sensveis a decomposio cataltica, por exemplo, determinados per-
xidos orgnicos.

S50 No misturar com . . . (a especificar pelo produtor):


mbito de aplicao:
substncias e preparaes que possam reagir com o produto especificado e libertar gases muito
txicos ou txicos;
perxidos orgnicos.

Critrios de utilizao:
recomendada para as substncias e preparaes acima referidas que possam ser utilizadas pelo
pblico em geral, nos casos em que for uma melhor alternativa s frases R31 ou R32;
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4991

obrigatria para determinados perxidos que possam reagir violentamente com aceleradores
ou promotores de processos.

S51 Utilizar somente em locais bem ventilados:


mbito de aplicao:
substncias e preparaes que possam ou se destinem a libertar vapores, poeiras, aerossis,
fumos, nvoas, etc., com riscos por inalao ou com riscos de incndio ou exploso.
Critrios de utilizao:
recomendada quando a frase S38 no for adequada. Importante para substncias e preparaes
que possam ser utilizadas pelo pblico em geral.

S52 No utilizar em grandes superfcies nos locais habitados:


mbito de aplicao:
substncias volteis muito txicas, txicas e nocivas, e preparaes que as contenham.

Critrios de utilizao:
recomendada quando a sade puder ser prejudicada por uma exposio prolongada a estas
substncias, devido sua volatilizao a partir de grandes superfcies tratadas, em habitaes
ou noutros locais fechados onde possam estar pessoas.

S53 Evitar a exposio obter instrues especficas antes da utilizao:


mbito de aplicao:
substncias e preparaes carcinognicas, mutagnicas e ou com efeitos txicos na reproduo.

Critrios de utilizao:
obrigatria para as substncias e preparaes acima referidas a que tenha sido atribuda, pelo
menos, uma das frases R seguintes: R45, R46, R49, R60 ou R61.

S56 Eliminar este produto e o seu recipiente enviando-os para um local de recolha de resduos perigosos
ou especiais:
mbito de aplicao:
todas as substncias e preparaes perigosas.
Critrios de utilizao:
recomendada para todas as substncias e preparaes perigosas que possam ser utilizadas pelo
pblico em geral e que necessitem de uma eliminao especial.

S57 Utilizar um recipiente adequado para evitar a contaminao do ambiente:


mbito de aplicao:
substncias a que tenha sido atribudo o smbolo N.
Critrios de utilizao:
geralmente limitada a substncias e preparaes que no possam ser utilizadas pelo pblico
em geral.

S59 Solicitar ao produtor/fornecedor informaes relativas recuperao/reciclagem:


mbito de aplicao:
todas as substncias e preparaes perigosas.

Critrios de utilizao:
obrigatria para substncias perigosas para a camada de ozono;
recomendada para outras substncias e preparaes cuja recuperao/reciclagem seja acon-
selhvel.
4992 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

S60 Este produto e o seu recipiente devem ser eliminados como resduos perigosos:
mbito de aplicao:
todas as substncias e preparaes perigosas.

Critrios de utilizao:
recomendada para substncias e preparaes que no sejam utilizadas pelo pblico em geral
s quais no tenha sido atribuda a frase S35.

S61 Evitar a libertao para o ambiente. Obter instrues especficas/fichas de segurana:


mbito de aplicao:
substncias e preparaes perigosas para o ambiente.

Critrios de utilizao:
geralmente utilizada para substncias a que tenha sido atribudo o smbolo N;
recomendada para todas as substncias classificadas como perigosas para o ambiente ainda
no abrangidas.

S62 Em caso de ingesto, no provocar o vmito. Consultar imediatamente um mdico e mostrar-lhe


a embalagem ou o rtulo:
mbito de aplicao:
substncias e preparaes classificadas como nocivas com a frase indicadora de risco R65 de
acordo com os critrios definidos no ponto 3.2.3;
no se aplica s substncias e preparaes colocadas no mercado em recipientes para aerossis
ou em recipientes dotados de um dispositivo de pulverizao selado, v. seces 8 e 9.

Critrios de utilizao:
obrigatria para as substncias e preparaes supramencionadas se forem vendidas ou susceptveis
de serem utilizadas pelo pblico em geral, excepto se forem obrigatrias as frases S45 ou S46.
recomendada para as substncias e preparaes supramencionadas quando forem utilizadas
na indstria, excepto se forem obrigatrias as frases S45 ou S46.

S63 Em caso de acidente por inalao, transferir o acidentado para um local bem ventilado e mant-lo
em repouso:
mbito de aplicao:
substncias e preparaes muito txicas e txicas (gases, vapores, partculas, lquidos volteis);
substncias e preparaes que causem sensibilizao respiratria.

Critrios de utilizao:
obrigatria para substncias e preparaes a que tenham sido atribudas as frases R26, R23
ou R42 e que possam ser utilizadas pelo pblico em geral de um modo que possa resultar
na sua inalao.

S64 Se engolido, lavar a boca com gua (apenas se a pessoa se encontrar consciente):
mbito de aplicao:
substncias e preparaes corrosivas ou irritantes.

Critrios de utilizao:
recomendada para as substncias e preparaes supra que possam ser utilizadas pelo pblico
em geral e relativamente s quais seja adequado o tratamento referido.

7 Rotulagem
7.1 Efectuada a classificao da substncia ou preparao, o rtulo adequado estabelecido com base
nos requisitos dos artigos 18.o e 19.o do presente Regulamento e do Decreto-Lei n.o 120/92, de 30
de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei
n.o 189/99, de 2 de Junho, relativos, respectivamente, s substncias e preparaes. No presente captulo
descreve-se o processo para estabelecer a rotulagem e do-se orientaes de prudncia apropriadas.

O rtulo compreende as seguintes informaes:


a) O nome ou nomes das substncias em questo;
b) O nome, morada e nmero de telefone do produtor/importador;
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4993

c) Os smbolos e indicaes de perigo;


d) Frases indicadoras de riscos especficos (frases R);
e) Recomendaes de prudncia (frases S);
f) No caso das substncias, o nmero CE.

7.1.1 No caso das substncias que figuram no anexo I do presente Regulamento, o rtulo tambm deve
incluir a indicao Rtulo CE.

7.1.2 Seleco das frases indicadoras de risco e das recomendaes de prudncia.


Embora a seleco das frases indicadoras de risco e das recomendaes de prudncia mais adequadas
seja determinada, em primeiro lugar, pela necessidade de fornecer todas as informaes indispensveis,
tambm deve atender-se clareza e ao impacte do rtulo. Tendo presente essa condicionante, no
que se refere clareza, as informaes necessrias devero ser expressas num nmero mnimo de
frases.
No caso das substncias e preparaes irritantes, facilmente inflamveis, inflamveis e comburentes,
no ser necessrio relembrar as frases R e as frases S no rtulo se a embalagem contiver no mximo
125 ml. O mesmo se aplica s substncias nocivas, com idntica condicionante em termos de volume
e desde que no sejam vendidas a retalho ao pblico em geral.

7.1.3 No rtulo ou embalagem das substncias ou preparaes sujeitas ao presente Regulamento e ao Decre-
to-Lei n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12
de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho, no podero figurar menes do tipo:
no txico, no nocivo ou quaisquer outras indicaes anlogas.

7.1.4 O Decreto-Lei n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97,
de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho, contm disposies especficas
relativas rotulagem de algumas preparaes.

7.2 Designao ou designaes qumicas que devem figurar no rtulo:


7.2.1 No rtulo das substncias enumeradas no anexo I do presente Regulamento dever figurar uma das
designaes constantes do anexo I.
No que se refere s substncias que no figuram no anexo I, o seu nome ser estabelecido segundo
uma nomenclatura qumica reconhecida internacionalmente, conforme definido no ponto 1.4.

7.2.2 Para as preparaes, a seleco dos nomes que devem figurar no rtulo ser feita de acordo com
o disposto no Decreto-Lei n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria
n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho.
Nota. No caso das preparaes concentradas destinadas indstria de perfumaria:
a pessoa responsvel pela sua colocao no mercado poder identificar apenas a substncia sensibilizante que considerar
ser a principal responsvel pelo efeito de sensibilizao;
no caso de uma substncia natural, a designao qumica poder ser do tipo: leo essencial de . . . extracto de . . .,
como alternativa s designaes dos componentes do leo essencial ou extracto.

7.3 Escolha dos smbolos de perigo:


O grafismo dos smbolos de perigo e a redaco das indicaes de perigo devem ser conformes com
o anexo II. Os smbolos devem ser impressos a preto sobre fundo amarelo-alaranjado.

7.3.1 Os smbolos de perigo e as indicaes de perigo correspondentes s substncias do anexo I so os


que figuram no presente anexo.

7.3.2 No caso das substncias perigosas que ainda no figurem no anexo I e no que se refere s preparaes,
os smbolos de perigo e as indicaes de perigo sero atribudas de acordo com as regras definidas
no presente anexo.
Quando a uma substncia for atribuvel mais de um smbolo:
a obrigatoriedade da indicao do smbolo T torna os smbolos X e C facultativos;
a obrigatoriedade da indicao do smbolo C torna o smbolo X facultativo;
a obrigatoriedade da indicao do smbolo E torna os smbolos F e O facultativos.

7.4 Escolha das frases indicadoras de risco:


A redaco das frases R deve estar de acordo com o estabelecido no anexo II do presente Regulamento.
Quando sejam aplicveis, devero utilizar-se as frases R combinadas do anexo III.

7.4.1 As frases R correspondentes s substncias do anexo I so as que figuram no presente anexo.


4994 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

7.4.2 No caso das substncias que no figurem no anexo I, as frases R sero seleccionadas de acordo
com os critrios e prioridades a seguir definidos:
a) No caso de perigos de que decorram efeitos na sade:
i) as frases R correspondentes categoria de perigo ilustrada por um smbolo devero figurar
no rtulo;
ii) no que se refere s frases R correspondentes a outras categorias de perigo que no sejam
ilustradas por um smbolo, por fora do artigo 19.o do presente Regulamento;

b) No caso de perigos decorrentes de propriedades fsico-qumicas:


aplicar-se-o os critrios descritos no ponto 7.4.2, alnea a), com a excepo de no ser necessrio
incluir as frases indicadoras de risco extremamente inflamvel ou facilmente inflamvel
se estas repetirem a indicao de perigo ilustrada por um smbolo;

c) No caso de perigos para o ambiente:


as frases R correspondentes categoria de classificao perigoso para o ambiente devero
figurar no rtulo.

7.4.3 No caso das preparaes, as frases R sero seleccionadas de acordo com os critrios e prioridades
a seguir definidos:
a) No caso de perigos de que decorram efeitos na sade:
i) frases R correspondentes categoria de perigo ilustrada por smbolo. Em determinados casos,
as frases R devero ser adoptadas de acordo com o Decreto-Lei n.o 120/92, de 30 de Junho,
na redaco que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei
n.o 189/99, de 2 de Junho. Mais especificamente, devero figurar no rtulo as frases R referentes
ao ou aos componentes responsveis pela classificao da preparao numa categoria de perigo;
ii) frases R correspondentes a outras categorias de perigo em que os componentes tenham sido
classificados mas que no sejam ilustradas por um smbolo, por fora do Decreto-Lei n.o 120/92,
de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro,
e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho;

b) No caso de perigos decorrentes de propriedades fsico-qumicas:


aplicar-se-o os critrios descritos no ponto 7.4.3, alnea a), com a excepo de no ser necessrio
incluir as frases indicadoras de risco extremamente inflamvel ou facilmente inflamvel
se estas repetirem a indicao de perigo ilustrada por um smbolo.

Como regra geral, ser suficiente um mximo de quatro frases R para descrever os riscos decorrentes
das preparaes. Para este efeito, as frases combinadas do anexo III do presente Regulamento sero
consideradas frases simples. No entanto, as frases normalizadas devero abranger todos os perigos
importantes associados preparao.
Contudo se o produtor for de opinio que devem ser identificados perigos para o ambiente, sero
acrescentadas outras frases R, na medida das necessidades.

7.5 Recomendaes de prudncia:


A redaco das frases S deve estar de acordo com o estabelecido no anexo IV do presente Regulamento.
Quando sejam aplicveis, devero utilizar-se as frases S combinadas do anexo IV.

7.5.1 As frases S correspondentes s substncias do anexo I so as que figuram no presente anexo. Na


falta destas, o produtor/importador poder utilizar uma ou mais frases S apropriadas.

7.5.2 Escolha das frases de segurana:


Na seleco das frases de segurana dever atender-se s frases indicadoras de risco includas no
rtulo e tambm utilizao prevista para a substncia ou preparao:
como regra geral, ser suficiente um mximo de quatro frases S para a recomendao de prudncia
mais adequada; para este efeito, as frases combinadas do anexo IV sero consideradas frases simples;
no caso das frases S relativas eliminao, deve utilizar-se uma nica frase, excepto se for claro
que a eliminao do produto e do seu recipiente no apresenta perigos para a sade humana
e para o ambiente. O fornecimento de recomendaes relativas eliminao segura importante,
nomeadamente, no caso das substncias e preparaes vendidas ao pblico em geral;
algumas frases R tornam-se suprfluas se for feita uma seleco cuidadosa das frases S e vice-versa;
as frases S que correspondam claramente a frases R s figuraro no rtulo no caso de se pretender
reforar uma determinada advertncia;
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4995

na seleco das frases de segurana correspondentes a determinadas substncias e preparaes


ser necessrio ter em especial ateno as condies previsveis de utilizao, por exemplo, por
pulverizao e outros efeitos de aerossol. A escolha das frases dever atender utilizao prevista;
as frases S1, S2 e S45 so obrigatrias para todas as substncias e preparaes muito txicas,
txicas e corrosivas vendidas ao pblico em geral;
as frases S2 e S46 so obrigatrias para todas as outras substncias e preparaes perigosas (
excepo das substncias e preparaes apenas classificadas de perigosas para o ambiente) vendidas
ao pblico em geral.

Sempre que as frases seleccionadas de acordo com os critrios estritos referidos no ponto 6.2 resultarem
em redundncias ou ambiguidades ou se revelarem manifestamente desnecessrias em virtude do carc-
ter especfico do produto ou da embalagem, podem suprimir-se algumas frases.

7.6 Nmero CE:


Se uma substncia indicada no rtulo figurar no Inventrio Europeu das Substncias Qumicas Existentes
no Mercado (EINECS) ou na Lista Europeia das Substncias Qumicas Notificadas (ELINCS), os
nmeros EINECS ou ELINCS da substncia devero figurar no rtulo. Este requisito no se aplica
s preparaes.

8 Casos especiais: substncias

8.1 Garrafas de gs:


No caso das garrafas de gs, considera-se que as exigncias em matria de rotulagem so satisfeitas
se forem conformes aos artigos 18.o e 19.o e alnea b) do n.o 10 do artigo 20.o
Todavia, por derrogao aos n.os 1 a 6 do artigo 20.o, pode utilizar-se uma das seguintes alternativas
para garrafas de gs de capacidade inferior ou igual a 150 l de gua:
o formato e as dimenses do rtulo podem ser conformes ao disposto na norma ISO/DP 7225;
as informaes referidas no artigo 18.o e no n.o 3 do artigo 19.o podem ser inscritas num dstico
ou rtulo no destacvel da garrafa.

8.2 Garrafas de gs destinadas ao propano, butano ou gs de petrleo liquefeito (GPL):


Estas substncias esto classificadas no anexo I. Embora sejam classificadas em conformidade com
o artigo 3.o, no apresentam riscos para a sade humana quando colocadas no mercado em garrafas
recarregveis ou em cartuchos no recarregveis, na acepo da norma EN 417, como gases combustveis
apenas utilizados para fins de combusto.
Estas garrafas ou cartuchos devem ser rotulados com o smbolo adequado e igualmente com as frases
R e S que indicam a inflamabilidade. No necessrio inscrever no rtulo informaes relativas
aos efeitos sobre a sade humana. Todavia, as informaes relativas aos efeitos sobre a sade humana
que deveriam figurar no rtulo tero de ser comunicadas ao utilizador profissional pelo responsvel
pela colocao da substncia no mercado, recorrendo ao modelo previsto no artigo 21.o Devem for-
necer-se ao consumidor informaes que lhe permitam adoptar todas as medidas necessrias em matria
de sade e segurana previstas no artigo 22.o

8.3 Metais macios:


Estas substncias ou esto classificadas no anexo I ou devero s-lo nos termos do n.o 2 do artigo 18.o
No entanto, embora algumas das substncias em causa tenham sido classificadas nos termos do artigo 3.o,
no apresentam perigos para a sade humana por inalao, ingesto ou contacto com a pele, bem
como para o ambiente aqutico, na forma em que so colocadas no mercado. Tais substncias no
necessitam de ser rotuladas em conformidade com os artigos 18.o e 19.o Todavia, todas as informaes
que deveriam figurar no rtulo tero de ser comunicadas ao utilizador pelo responsvel pela colocao
do metal no mercado, num formato previsto no artigo 21.o

8.4 Substncias caracterizadas com a frase R65:


As substncias classificadas como nocivas em virtude do risco de aspirao no necessitam de ser
classificadas como nocivas e caracterizadas pela frase R65 nos rtulos, se forem colocadas no mercado
em recipientes para aerossis ou em recipientes dotados de um dispositivo de pulverizao selado.

9 Casos especiais: preparaes

9.1 Preparaes gasosas (misturas de gases):


No caso das preparaes gasosas, deve ter-se em conta:
a avaliao das propriedades fsico-qumicas;
a avaliao dos perigos para a sade.
4996 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

9.1.1 Avaliao das propriedades fsico-qumicas:


9.1.1.1 Inflamabilidade:
A inflamabilidade destas preparaes determinada nos termos do Decreto-Lei n.o 120/92, de 30
de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei
n.o 189/99, de 2 de Junho, de acordo com os mtodos especificados na parte A do anexo V do presente
Regulamento.
Estas preparaes devero ser classificadas em funo dos resultados dos ensaios efectuados e tendo
em considerao os critrios do anexo V e os critrios do guia de rotulagem.
No entanto, por derrogao, no caso de as preparaes gasosas serem produzidas por encomenda
em pequenas quantidades, poder avaliar-se a inflamabilidade dessas misturas gasosas utilizando o
seguinte mtodo de clculo:
a expresso da mistura gasosa
A1 F1+. . .+AiFi+. . . An Fn+B1 I1+. . .+Bi Ii+. . . Bp Ip

em que:
Ai e Bi so as fraces molares;
Fi=gs inflamvel;
Ii=gs inerte;
n=nmero de gases inflamveis;
p=nmero de gases inertes;

pode ser convertida numa frmula em que todos os Ii (gases inertes) so expressos, num equivalente
de azoto, utilizando um coeficiente Ki em que o teor equivalente de gs inflamvel, Ai expresso
pela seguinte frmula:

Ai = Ai ( 100
Ai + Ki Bi
)
Utilizando o valor do teor mximo de gs inflamvel que, em mistura com azoto, origina uma composio
que no inflamvel no ar (Tci), possvel obter a expresso seguinte:
Ai
Si Tci
1

A mistura gasosa ser inflamvel se o valor da expresso anterior for superior a 1. A preparao
ser classificada como extremamente inflamvel e ser-lhe- atribuda a frase R12.
Coeficientes de equivalncia (Ki):
Os valores dos coeficientes de equivalncia Ki, entre os gases inertes e o azoto e os valores dos
teores mximos (Tci) dos gases inflamveis figuram nos quadros 1 e 2 da norma ISO 10156, edio
de 15 de Dezembro de 1990.
Teor mximo de gs inflamvel (Tci):
O valor do teor mximo de gs inflamvel (Tci) figura no quadro 2 da norma ISO 10156, edio
de 15 de Dezembro de 1990.
No caso de o valor Tci de um gs inflamvel no figurar na norma referida, ser utilizado o limite
inferior de explosividade (LIE) correspondente. Se o valor do LIE no for conhecido, o valor Tci
ser fixado em 1 %, em volume.

Observaes
A expresso anterior pode ser utilizada para permitir a rotulagem adequada de determinadas pre-
paraes gasosas; no entanto, no dever ser considerada como um mtodo alternativo da expe-
rimentao, em substituio da determinao dos parmetros tcnicos de segurana.
Alm disso, a expresso no fornece qualquer informao sobre a possibilidade de preparar com
segurana uma mistura que contenha gases comburentes. Ao fazer-se uma estimativa da infla-
mabilidade, esses gases comburentes no so tidos em conta.
A expresso anterior apenas fornece resultados fiveis se os gases inflamveis no se influenciarem
reciprocamente no que diz respeito sua inflamabilidade. Este facto deve ser tido em conta,
por exemplo, no caso dos hidrocarbonetos halogenados.

9.1.1.2 Propriedades comburentes:


Atendendo ao facto de o anexo V do presente Regulamento no incluir um mtodo para a determinao
das propriedades comburentes de misturas gasosas, a determinao dessas propriedades ser efectuada
pelo mtodo de estimativa a seguir descrito.
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4997

O mtodo fundamenta-se na comparao do potencial comburente dos gases componentes de uma


mistura com o potencial de oxidao do oxignio no ar. As concentraes dos gases na mistura so
expressas em percentagem volumtrica.
Considera-se que uma mistura gasosa to ou mais comburente do que o ar no caso de se verificar
a seguinte condio:
S xi Ci 21
i

em que:
xi a concentrao do gs i em percentagem volumtrica;
Ci o coeficiente de equivalncia em oxignio.

Nesse caso, a preparao ser classificada como comburente e ser-lhe- atribuda a frase R8.
Coeficientes de equivalncia entre gases comburentes e o oxignio:
Os coeficientes para o clculo da capacidade comburente de determinados gases, componentes de
uma mistura, em relao capacidade comburente do oxignio no ar, apresentados no ponto 5.2
da norma ISO 10156, edio de 15 de Dezembro de 1990, so os seguintes:
O2 1
N2O 0,6

Se, para um determinado gs, no existir nenhum valor do coeficiente Ci na referida norma, ser-lhe-
atribudo o valor 40.

9.1.2 Avaliao dos efeitos na sade:


A avaliao dos perigos de uma preparao para a sade efectuada nos termos do Decreto-Lei
n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro,
e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho.
Quando a avaliao dos perigos para a sade for efectuada pelo mtodo convencional descrito no
Decreto-Lei n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97,
de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho, tomando como referncia os
limites de concentrao individuais, os limites de concentrao individuais a utilizar sero expressos
em percentagem volumtrica, figurando:
quer no anexo I do presente Regulamento, para o(s) gs(es) em questo.
quer no Decreto-Lei n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria
n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho, nos casos de
os gases considerados no figurarem no anexo I ou nele figurarem sem limites de concentrao.

9.1.3 Rotulagem:
No que se refere s garrafas para gases transportveis, consideram-se os requisitos de embalagem
satisfeitos quando for respeitado o disposto no Decreto-Lei n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco
que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de
2 de Junho.
Todavia, em derrogao ao disposto nos n.os 1 e 2 do artigo 8.o, o formato e as dimenses do rtulo
das garrafas para gases cuja capacidade com gua no exceda 150 l podero regular-se pelos requisitos
da norma ISO 7225. Nesse caso, o rtulo poder ter inscrita a designao genrica ou a designao
industrial/comercial da preparao, desde que as substncias perigosas componentes da preparao
sejam enumeradas no corpo da garrafa de gs de forma clara e indelvel.
As informaes especificadas no artigo 7.o podem ser fornecidas na forma de um disco de informao
durvel ou de um rtulo fixado s garrafas.

9.2 Garrafas para gases destinadas a preparaes com propano, butano ou gs de petrleo liquefeito
(GPL) a que foram adicionados odorizantes:
O propano, o butano e o gs de petrleo liquefeito so classificados no anexo I. Apesar das preparaes
que contm estas substncias serem classificadas em conformidade com o Decreto-Lei n.o 120/92,
de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e
pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho, estas no apresentam perigo para a sade humana quando
colocadas no mercado como gases combustveis libertados unicamente com vista sua combusto
em garrafas cilndricas hermticas recarregveis ou em cartuchos no recarregveis na acepo da
EN 417.
Estas garrafas ou cartuchos devem ser rotulados com o smbolo adequado e indicar as frases de
risco R e S que indicam a inflamabilidade. No necessrio inscrever no rtulo informaes relativas
4998 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A N.o 183 8 de Agosto de 2001

aos efeitos sobre a sade humana. Todavia, as informaes relativas aos efeitos sobre a sade humana
que deveriam figurar no rtulo tero de ser comunicadas ao utilizador profissional pela pessoa res-
ponsvel pela colocao da substncia no mercado, recorrendo ao modelo previsto no Decreto-Lei
n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro,
e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho. No que diz respeito aos consumidores, devero ser-lhes
fornecidas informaes suficientes que lhes permitam tomar todas as medidas necessrias de proteco
da sade e da segurana, tal como previsto no Decreto-Lei n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco
que lhe foi dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de
2 de Junho.

9.3 Ligas, preparaes com polmeros e preparaes com elastmeros:


Estas preparaes sero classificadas em conformidade com o disposto no artigo 3.o e rotuladas em
conformidade com o disposto no Decreto-Lei n.o 120/92, de 30 de Junho, na redaco que lhe foi
dada pela Portaria n.o 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.o 189/99, de 2 de Junho.
No entanto, embora algumas destas preparaes tenham sido classificadas nos termos do n.o 3 do
artigo 3.o, no apresentam perigos para a sade humana por inalao, ingesto ou contacto com
a pele, na forma em que so colocadas no mercado. Tais preparaes no necessitam de ser rotuladas
em conformidade com o artigo 7.o Contudo, todas as informaes que deveriam figurar no rtulo
tero de ser comunicadas ao utilizador profissional atravs de um sistema de informao e recorrendo
ao modelo previsto no artigo 10.o do presente Regulamento.

9.4 Preparaes classificadas com a frase R65:


As preparaes classificadas como nocivas em virtude do risco de aspirao no necessitam de ser
classificadas como nocivas e caracterizadas pela frase R65 nos rtulos, se forem colocadas no mercado
em embalagens para aerossis ou em recipientes dotados de um dispositivo de pulverizao selado.

9.5 Perxidos orgnicos:


Os perxidos orgnicos renem as propriedades de uma substncia comburente e de uma substncia
combustvel numa nica molcula: quando um perxido orgnico se decompe, a parte comburente
da molcula reage, de forma exotrmica, com a parte combustvel (oxidvel). Devido s propriedades
comburentes, os mtodos do anexo V no podem ser aplicados aos perxidos orgnicos.
Recorrer-se- ao seguinte mtodo de clculo baseado na presena de oxignio activo que a seguir
se descreve:
O teor percentual do oxignio disponvel numa preparao que contenha um perxido orgnico
dado pela frmula:

16 S
i
( ni
ci
mi )
em que:
ni o nmero de grupos perxido do perxido orgnico i, por molcula;
ci a concentrao percentual (em massa) do perxido orgnico i;
mi a massa molecular do perxido orgnico i.

ANEXO XIV
ANEXO IX

Parte A
Disposies relativas aos fechos de segurana para crianas
Para alm do disposto no n.o 1, alnea e), do artigo 17.o, devem ser equipados com fechos de segurana para
crianas todos os recipientes, qualquer que seja a sua capacidade, que contenham substncias que representem
um risco de aspirao (Xn; R65) e estejam classificadas e rotuladas de acordo com o ponto 3.2.3 do anexo VI,
com excepo das substncias colocadas no mercado sob a forma de aerossis ou em recipientes equipados com
um dispositivo de pulverizao selado.
1 Embalagens para aberturas repetidas:
Os fechos de segurana para crianas utilizados em embalagens para aberturas repetidas devem obedecer
norma ISO 8317 (edio de 1 de Julho de 1989) relativa a embalagens seguras para crianas exigncias
e mtodos de ensaio de embalagens para aberturas repetidas (Child-resistant packages Requirements and
methods of testing for reclosable packages), adoptada pela Organizao Internacional de Normalizao (ISO).

2 Embalagens para uma nica utilizao:


Os fechos de segurana para crianas usados em embalagens para uma nica utilizao devem obedecer
norma CEN EN 862 (edio de Maro de 1997) relativa a embalagens seguras para crianas exigncias
N.o 183 8 de Agosto de 2001 DIRIO DA REPBLICA I SRIE-A 4999

e procedimentos de ensaio de embalagens para uma nica utilizao, usadas em produtos no farmacuticos
(Packaging Child-resistant packaging Requirements and testing procedures for non-reclosable packages for
nonpharmaceutical products), adoptada pelo Comit Europeu de Normalizao (CEN).

3 Observaes:
1) A comprovao da conformidade com a norma acima referida apenas pode ser certificada por laboratrios
que tenham provado que respeitam as normas europeias da srie EN 45 000.

2) Casos particulares:
Se parecer evidente que uma embalagem suficientemente segura para as crianas, por estas no poderem
ter acesso ao seu contedo sem a ajuda de um utenslio, o ensaio pode no ser efectuado.
Em todos os outros casos e quando houver razes validamente justificadas para duvidar da eficcia do
fecho de segurana para crianas utilizado, a autoridade nacional pode pedir ao responsvel pela colocao
no mercado o fornecimento de uma declarao passada por um laboratrio de ensaios do tipo acima
definido no ponto 3.1, certificando que:
o tipo de fecho utilizado tal que no necessita de ensaios segundo as normas ISO e CEN supra-
mencionadas; ou
o fecho em questo foi sujeito a ensaios, sendo considerado conforme norma supramencionada.

Parte B
Disposies relativas aos dispositivos que permitem detectar os perigos pelo tacto
As prescries tcnicas relativas aos dispositivos que permitem detectar os perigos pelo tacto devem ser conformes
norma EN ISO 11683 (edio de 1997) relativa a indicaes de perigo detectveis pelo tacto (Packaging Tactile
warnings of danger Requirements).

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