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Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical ARTIGO

35(6):551-562, nov-dez, 2002.

Anticorpos antipromastigotas vivas de Leishmania (Viannia) braziliensis,


detectados pela citometria de fluxo, para identificao da infeco
ativa na leishmaniose tegumentar americana
Anti-live Leishmania (Viannia) braziliensis promastigote antibodies, detected by flow
cytometry, to identify active infection in american cutaneous leishmaniasis

Roberta Dias Rodrigues Rocha1, Clia Maria Ferreira Gontijo1, Silvana Maria Eli-Santos1 2 ,
Andra Teixeira Carvalho1 3, Rodrigo Corra-Oliveira1, Marcos Jos Marques4,
Odair Genaro, Wilson Mayrink4 e Olindo Assis Martins-Filho1*

Resumo Neste estudo, descrevemos etapas iniciais de padronizao de uma nova metodologia para deteco
de anticorpos antipromastigotas vivas de Leishmania (Viannia) braziliensis, pela citometria de fluxo e a anlise
de sua aplicabilidade para estudos clnicos. Foram avaliados 39 indivduos com sorologia convencional (RIFI)
positiva para leishmaniose, classificados quanto ausncia/presena de leso (L- e L+). Os resultados foram
expressos sob a forma de percentual de parasitas fluorescentes positivos (PPFP). A anlise dos dados, na
diluio 1:1.024, permitiu distinguir 95% dos pacientes L+ como um grupo de alta reatividade (PPFP>50%) e
72% dos indivduos L- como um grupo de baixa reatividade (PPFP50%). A anlise dos ttulos da reao de
imunofluorescncia indireta no demonstrou nenhuma relao com a ausncia/presena de leso. Em conjunto,
nossos dados sugerem a aplicabilidade da citometria de fluxo na identificao dos casos de infeco ativa, o
que no tem sido possvel atravs das reaes sorolgicas convencionais.
Palavras-chaves: Leishmaniose tegumentar americana. Leishmania (Viannia) braziliensis. Anticorpos
antipromastigotas vivas. Citometria de fluxo.

Abstract In the current study we described initial standardization steps of a new methodology to detect anti-
live Leishmania (Viannia) braziliensis promastigote antibodies by flow cytometry, followed by analysis of its
applicability to clinical studies. We have studied 39 individuals with positive conventional serology to leishmaniasis,
classified according to the absence/presence of cutaneous lesions (L- and L+). The results were expressed as
percentage of positive fluorescent parasites (PPFP). Data analysis at dilution of 1:1,024, allowed the distinction
of 95% of L+ patients as a group of high reactivity (PPFP>50%) and 72% of L- individuals as a group of low
reactivity (PPFP50%). The analysis of immunofluorescence assay titers did not show any relationship with the
absence/presence of lesion. Together, our data support the applicability of flow cytometry to identify cases of
active infection, which has not been possible through conventional serological reactions.
Key-words: American cutaneous leishmaniasis. Leishmania (Viannia) braziliensis. Anti-live promastigote
antibodies. Flow cytometry.

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) uma apresenta uma prevalncia de 12 milhes de casos,
zoonose causada por protozorios parasitas sendo que cerca de 350 milhes de pessoas encontram-
intracelulares do gnero Leishmania, com uma ampla se em risco de adquirir a infeco41. No Brasil, assim
distribuio geogrfica em reas tropicais e subtropicais como em outros pases do Novo Mundo, a LTA constitui
das Amricas31. Constitui uma enfermidade polimrfica um problema de sade pblica. Dados epidemiolgicos
da pele e das mucosas, caracterizada pela existncia demonstram que, no Brasil, a LTA representa a segunda
de uma variedade de formas clnicas, variando de leses doena tropical de maior prevalncia, sendo as regies
auto-resolutivas a leses desfigurantes. A doena norte e nordeste as principais reas endmicas13

1. Laboratrio de Doena de Chagas do Centro de Pesquisas Ren Rachou da Fundao Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, MG. 2. Departamento de Propedutica
da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG. 3. Escola de Farmcia da Universidade Federal de Ouro Preto, Belo
.
Horizonte, MG. 4. Departamento de Parasitologia do Instituto de Cincias Biolgicas da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG.In memorian
Apoio Financeiro: Centro de Pesquisas Ren Rachou da Fundao Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, MG.
Endereo para correspondncia: Dr. Olindo Assis Martins-Filho. Av. Augusto de Lima 1715, Barro Preto, 30190-002 Belo Horizonte, MG, Brasil.
e-mail: oamfilho@cpqrr.fiocruz.br
Recebido para publicao em 5/3/2002.

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Em indivduos por tadores de LTA, o sistema chama a ateno para os baixos nveis de anticorpos2 8 27 38 39
imunolgico capaz de montar uma resposta celular e e uma ausncia de relao desses nveis com a presena
humoral induzida por antgenos derivados do parasita9. de infeco ativa7 39. Recentemente, desenvolvemos em
Devido importncia da LTA em sade pblica, muitos nosso laboratrio uma metodologia para identificao de
estudos esto sendo realizados com o objetivo de anticorpos antiformas tripomastigotas vivas do
caracterizar melhor os mecanismos imunolgicos Trypanosoma cruzi25, que avalia no contexto ex vivo a
associados infeco. Vrios trabalhos sugerem que a reatividade de anticorpos dirigidos contra antgenos de
resposta imune celular do tipo 1, caracterizada pela membrana do parasita, evitando, dessa forma, a
produo de IFN-gamma, tenha um papel protetor na reatividade dos soros com estruturas intracitoplasmticas,
LTA1 3 4 28. Entretanto, a contribuio da resposta imune alvos da reatividade cruzada com outros tripanosomatdeos.
humoral neste contexto ainda controversa e o De maneira anloga, padronizamos esta metodologia para
envolvimento de anticorpos na proteo bem como em deteco de anticorpos anti formas vivas de Leishmania
mecanismos imunopatolgicos da doena no esto (V.) braziliensis. Este estudo visa avaliar a existncia de
ainda bem estabelecidos30 33. Os mtodos que avaliam a uma correlao entre a resposta imune humoral e a
resposta imune humoral so baseados, at o momento, presena de infeco ativa.
exclusivamente na pesquisa sorolgica in vitro, utilizando Neste estudo apresentamos dados referentes
antgenos solveis ou preparaes antignicas padronizao desta metodologia e sua habilidade em
de parasitas fixados, tais como a reao de identificar, na diluio 1:1.024, uma reatividade
imunofluorescncia indireta (RIFI), a hemoaglutinao diferencial em casos de infeco em atividade clnica
indireta (HAI) e o ensaio imunoenzimtico (ELISA). A (L+). Nossos resultados sugerem a aplicabilidade da
anlise de anticorpos atravs dos mtodos de sorologia citometria de fluxo na diferenciao de casos de
convencional, alm de apresentar reatividade cruzada infeco ativa, o que no tem sido possvel atravs do
com outras espcies da famlia Trypanosomatidae6 24 uso de mtodos sorolgicos convencionais.
MATERIAL E MTODOS
Populao avaliada. A Tabela 1 resume as (sorolgico e parasitolgico) realizado em reas
informaes referentes aos grupos de indivduos endmicas para leishmaniose, nos Municpios de
avaliados. Os indivduos includos nesse estudo foram Araua e Caratinga, MG, Brasil, no perodo de 1996 a
selecionados a partir de um inqurito clnico-laboratorial 2000.

Tabela 1 - Distribuio dos grupos de indivduos avaliados, segundo idade e sexo.


Grupos Idade (anos) Sexo
N faixa mdia dpm mediana M F
Etapas de padronizao
PN 10 24-50 38,99,1 41 7 3
PNE 10 4-62 29,221,4 29 5 5
PL 7 2-57 35,222,1 33 4 3
Anlise do mtodo
NE 10 4-62 29,221,4 29 5 5
L- 18 7-72 42,018,9 45 5 13
L+ 21 9-69 29,517,5 23 16 5
M= masculino; F= feminino; PN= mistura de soros normais de rea no endmica; PNE= mistura de soros normais de rea endmica;
PL= mistura de soros de pacientes portadores de LTA; NG= indivduos normais de rea endmica; L- = indivduos RIFI+ com ausncia de
leso; L+ = pacientes RIFI+ com presena de leso.

Para as etapas iniciais de padronizao da por uma mistura de soros de indivduos saudveis,
metodologia de pesquisa de anticorpos antiformas residentes em Araua, MG, apresentando sorologia
promastigotas vivas de L. (V.) braziliensis foram utilizadas convencional negativa para leishmaniose (PNE=10).
misturas de soros de indivduos residentes em Araua, Para os ensaios de anlise do mtodo, foram
MG, apresentando sorologia convencional (RIFI) positiva utilizadas amostras individuais de soros de indivduos
para leishmaniose, intradermorreao de Montenegro residentes em Araua e Caratinga, MG, com sorologia
positiva e presena de leso ativa (PL=7). O controle convencional positiva para leishmaniose (n=39),
negativo de rea no endmica foi constitudo por uma classificados em dois subgrupos em funo da ausncia
mistura de soros de voluntrios saudveis, residentes ou presena de leso (L- =18; L+ =21). Todos os
em Belo Horizonte, MG, apresentando sorologia indivduos do grupo L+ apresentavam diagnstico
convencional negativa para leishmaniose (PN=10). O parasitolgico positivo. O grupo controle negativo de
grupo controle negativo de rea endmica foi constitudo rea endmica foi constitudo por amostras individuais

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de indivduos saudveis, residentes em Araua, MG, lavagem, procedia-se a contagem do nmero de


apresentando sorologia convencional negativa para parasitas e a suspenso celular ajustada para
leishmaniose (NE=10). aproximadamente 5x106 ou 10x106 promastigotas/ml.
Coleta e processamento das amostras. As Estudo dos anticorpos IgG por citometria de
amostras de soros foram inativadas a 56C por 30 fluxo. Os ensaios de citometria de fluxo para o estudo
minutos e centrifugadas a 1.000g a 4C por 5 minutos de anticorpos antiformas vivas de L. (V.) braziliensis
para remoo de partculas. Aps a centrifugao, o presentes em soro de pacientes portadores de LTA
sobrenadante foi aliquotado e estocado a -20C at sua foram realizados segundo protocolo descrito por
utilizao. No momento do uso, as amostras foram Martins-Filho et al25 para pesquisa de anticorpos anti
descongeladas, diludas em soluo salina tamponada tripomastigotas vivas do Trypanosoma cruzi, adaptado
com fosfato-PBS (0,15M, 8g/l de NaCl, 2g/l de KCl, para microplacas, conforme descrito a seguir: alquotas
2g/l de KH2PO4 e 1,15g/l de Na2HPO4, pH 7,2, Sigma de 50l do soro diludo em PBS-10% SFB (1:64 a
Chemical Corp., St. Louis, MO) suplementado com 10% 1:131.072) foram adicionadas em placas de 96 poos,
de soro fetal bovino (Sigma Chemical Corp, St. Louis, fundo em U (LINBRO, ICN Biomedicals, Inc. Aurora,
MO), centrifugadas a 4C, 1.000g por 5 minutos e os Ohio) juntamente com 50l da suspenso de parasitas
sobrenadantes utilizados para os ensaios de citometria (2,5 x 105 ou 5 x 105 parasitas/poo). A mistura foi
de fluxo. Este trabalho foi avaliado e aprovado pelo incubada a 25C por 30 minutos ou a 37C por 30
Comit de tica em Pesquisa da Fundao Oswaldo minutos, lavada duas vezes com 150l de PBS-10%
Cruz, 0070/99-CPE/FIOCRUZ. SFB por centrifugao (4C, 1.000g por 10 minutos) e
Cultivo das formas promastigotas. As formas o sobrenadante desprezado.
promastigotas de L. (V.) braziliensis (MHOM/BR/75/ Para revelao da ligao de IgG na superfcie do
2903) foram cultivadas em erlenmeyers contendo meio parasita, procedeu-se incubao das formas
gar-sangue, Novy-MacNeal-Nicolle associado ao meio promastigotas, na presena de 50l de anticorpo
lquido complexo liver infusion tryptose - LIT, conhecido policlonal anti-IgG humano (especfico para a poro
como meio NNN-LIT. As culturas foram mantidas em Fc) marcado com isotiocianato de fluorescena-FITC
estufa B.O.D (modelo 347) a temperatura de 24 1C, (Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO) nas diluies
durante o perodo de quatro dias. A cada quatro dias 1:200, 1:400 e 1:800 em PBS-10% SFB. As
as culturas foram examinadas quanto a motilidade, temperaturas e tempos de incubao foram variveis,
morfologia e ausncia de contaminao e os parasitas sendo 30 minutos a 25C para os parasitas incubados
foram re-inoculados pela transferncia de 1x10 6 com o soro humano a 25C por 30 minutos; 37C por
promastigotas/ml para um novo erlenmeyer contendo 30 minutos e 4C por 60 minutos para os parasitas
NNN-LIT. Este procedimento foi repetido a cada quatro incubados com o soro humano a 37C por 30 minutos,
dias para manuteno de culturas em fase log. As sempre ao abrigo da luz. Os parasitas foram novamente
culturas de quatro dias de cultivo em meio NNN-LIT lavados duas vezes com 150l de PBS-10% SFB
foram tambm utilizadas para o inculo de parasitas por centrifugao (4C, 1.000g, 10 minutos) e o
(1x106 promastigotas/ml) para um erlenmeyer contendo sobrenadante desprezado. Os parasitas foram ento
apenas a fase lquida LIT. No meio contendo apenas fixados com 200l de soluo fixadora para citometria
LIT, os parasitas foram incubados por um perodo de 4, (10g/l de paraformaldedo, 10,2g/l de cacodilato de sdio
7 e 10 dias de cultivo para serem utilizados nos e 6,65g/l de cloreto de sdio, pH 7,2, Sigma Chemical
experimentos de padronizao da metodologia. Corp, St. Louis, MO) e incubados por pelo menos 30
Preparo das formas promastigotas para os minutos a 4C. As amostras foram mantidas a 4C, ao
ensaios de imunofluorescncia por citometria de abrigo de luz, at o momento da leitura no citmetro de
fluxo. Os parasitas, em diferentes dias de cultivo em LIT fluxo (FACScan-Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA).
(4, 7 e 10 dias) foram transferidos para tubos de Para cada ensaio foi feito um controle interno da
polipropileno de 50ml (Falcon), homogeneizados em reao, para avaliar a ligao inespecfica do anticorpo
vrtex a baixa rotao (rotao 4) para desfazer os secundrio. Neste controle, os parasitas foram
grumos. Em seguida, a suspenso foi submetida a uma incubados na ausncia de soro humano, porm na
centrifugao diferencial (25C, 200g por 10 minutos) presena do anticorpo secundrio anti-IgG humano
para remoo de contaminantes como eritrcitos e fluoresceinado. Em todos as baterias de testes foram
grumos de parasitas no sedimento. Para recuperao includas amostras de soros controles positivo e
dos parasitas no sobrenadante, estes foram deixados negativo para LTA.
em repouso por 10 minutos a temperatura ambiente. O
sobrenadante foi transferido para outro tubo de Aquisio e anlise dos dados da citometria de
polipropileno de 50ml e o sedimento foi desprezado. Em fluxo. A aquisio e anlise dos dados foram realizadas
seguida os parasitas foram lavados em PBS contendo no citmetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson)
10% de SFB, por duas vezes, por centrifugao a 4C, empregando o software Cell-Quest. Para cada amostra
1.000g por 10 minutos. O sedimento formado foi individual foram adquiridas informaes relativas aos
homogeneizado cuidadosamente. Ao final das etapas de parmetros tamanho, granulosidade e intensidade

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relativa de fluorescncia de 10.000 parasitas. A Figura 1A valores do percentual de parasitas fluorescentes


mostra a distribuio caracterstica e homognea que positivos (PPFP) para cada amostra individual (Figura
as formas promastigotas apresentam em grficos de 1C e D). A anlise dos resultados foi realizada segundo
tamanho versus granulosidade, o que permite o descrito por Martins-Filho et al25 estabelecendo um
posicionamento de um marcador sobre a regio valor de PPFP de 20% como um ponto de corte entre
correspondente populao de interesse (R1). Esse resultados positivos e negativos. Nas etapas de
perfil foi obtido ajustando-se os ganhos de tamanho e padronizao da metodologia, onde foram empregadas
granulosidade, em escala log, com valores E00 e 300, misturas de soros, os valores de PPFP foram
respectivamente. Utilizando histogramas de intensidade classificados em positivo ou negativo para cada
de fluorescncia em funo do nmero de parasitas, diluio da mistura. Na anlise do mtodo, onde foram
procedia-se a anlise da intensidade de fluorescncia avaliados os soros individuais, os valores de PPFP
relativa apresentada pela populao selecionada. Para foram classificados em positivo ou negativo
cada experimento foi estabelecido um limiar de considerando a mdia dos valores obtidos para cada
positividade de no mximo 2%, em funo da curva de grupo de soros testados. Num estudo posterior, foi
fluorescncia do tubo controle de ligao inespecfica estabelecido um valor de PPFP de 50% como limiar
do anticorpo secundrio (Figura 1B). Em seguida, entre baixa e alta reatividade, segundo descrito por
empregando-se o mesmo marcador foram obtidos os Cordeiro et al10.

B C D
Figura 1 - Seqncia de anlise de anticorpos anti promastigotas vivas de L. (V.) braziliensis por citometria de fluxo.
Seleo da populao de formas promastigotas de Leishmania (V.) braziliensis, em grficos de tamanho e granulosidade
(A). Histogramas individuais representando o percentual de parasitas fluorescentes (PPFP) obtidos com controle
interno da reao (B), aps a incubao com um soro no infectado (C) e com soro de um paciente portador de
leishmaniose (D). O posicionamento do marcador (M1) segue o critrio de se obter no mximo 2% de PPFP para o
controle interno da reao, segundo descrito em material e mtodos.

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Anlise estatstica. A anlise estatstica foi ONEWAY. Diferenas estatisticamente significativas


realizada utilizando o software Minitab 9.2. O estudo foram identificadas pelo teste t de Student. A diferena
estatstico comparativo entre grupos foi realizado entre grupos foi considerada significativa quando
empregando a Anlise de Var incia - ANOVA p<0,05.
RESULTADOS
Etapas iniciais de padronizao. Influncia da fase perfil de reatividade que permitiam identificar a mistura
de cultivo de promastigotas na pesquisa de anticorpos de soros PL como positiva (PPFP>20%) e as misturas PN
anti formas promastigotas vivas: a Figura 2 mostra os e PNE como negativas (PPFP20%), nas diluies do soro
resultados da reatividade de IgG total anti formas humano 1:1.024 a 1:4.096. O uso de promastigotas de 7
promastigotas vivas de L. (V.) braziliensis, expressos dias de cultivo promoveu um aumento nos valores de PPFP
como PPFP, em mistura de soros de indivduos no para a mistura PN e PNE, embora apenas na mistura PN
infectados (PN), de indivduos no infectados de rea os resultados de PPFP foram superiores a 20%, nas
endmica para leishmaniose (PNE) e de pacientes diluies do soro humano 1:1.024 e 1:2.048. A utilizao
por tadores de leishmaniose (PL). A anlise dos de promastigotas de 10 dias de cultivo promoveu uma
resultados mostrou que os ensaios realizados com elevao menos intensa nos valores de PPFP apenas da
promastigotas de 4 dias de cultivo apresentaram um mistura PN.

Figura 2 - Influncia da fase de cultivo do parasita (A= 4 dias, B= 7 dias e C= 10 dias) nos valores de PPFP aps
incubao de promastigotas vivas de L. (V.) braziliensis com soro humano a 37C/30 minutos em diferentes diluies,
seguida por incubao com anticorpo secundrio anti-IgG humano conjugado com FITC (1:400) a 4C/60 minutos. Os
resultados esto expressos como valores individuais de PPFP para cada diluio da mistura de soros, segundo descrito
em material e mtodos.

Influncia da concentrao do anticorpo murino anti- baixa reatividade (PPFP50%) foram observados para
Fc de IgG humano conjugado ao FITC na pesquisa de a mistura PN nas diluies do conjugado 1:200 e 1:400.
anticorpos anti formas promastigotas vivas: a Figura 3 A reatividade da mistura PL foi alta nas trs diluies
mostra os resultados da reatividade de IgG total anti do conjugado testadas (PPFP >50%).
formas promastigotas vivas de L. (V.) braziliensis, Influncia da temperatura e do tempo de incubao
expressos como PPFP, em mistura de soros de na pesquisa de anticorpos antiformas promastigotas
indivduos no infectados (PN), de indivduos no vivas: a Figura 4 mostra os resultados da reatividade
infectados de rea endmica para leishmaniose (PNE) de IgG total antiformas promastigotas vivas de L. (V.)
e de pacientes portadores de leishmaniose (PL). A braziliensis, expressos como PPFP, em mistura de soros
reatividade da mistura dos soros na diluio 1:1.024 foi de indivduos no infectados (PN), de indivduos no
obtida empregando-se trs diluies do conjugado infectados de rea endmica para leishmaniose (PNE)
(1:200, 1:400 e 1:800). A anlise dos resultados mostrou e de pacientes portadores de leishmaniose (PL). A
valores negativos de PPFP para as misturas PNE nas reatividade da mistura dos soros humanos nas diluies
trs diluies do conjugado empregadas, enquanto para 1:256 a 1:2.048 foi obtida empregando-se diferentes
PN apenas na diluio do conjugado 1:800. Valores de condies de reao no que se refere incubao com

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Figura 3 - Influncia da concentrao do anticorpo secundrio anti-IgG humano


conjugado com FITC nos valores de PPFP aps a incubao de promastigotas
vivas de L. (V.) braziliensis (10 dias de cultivo) com soro humano (1:1.024) a
37C/30 minutos e com o anticorpo secundrio anti-IgG humano a 4C/60
minutos. Os resultados esto expressos como valores individuais de PPFP
para cada mistura de soros, segundo descrito em material e mtodos.

Figura 4 - Influncia da temperatura e do tempo de reao com o soro (A= 37C/30 minutos, B= 25C/30 minutos e C=37C/
30 minutos) e com o anticorpo secundrio anti-IgG humano conjugado com FITC, diludo 1:400 (A= 4C/60 minutos, B= 25C/
30 minutos e C=37C/30 minutos) nos valores de PPFP aps incubao de promastigotas vivas de L. (V.) braziliensis (10 dias
de cultivo) com soro humano em diferentes diluies. Os resultados esto expressos como valores individuais de PPFP para
cada mistura de soros, segundo descrito em material e mtodos.

a mistura de soro e com o anticorpo secundrio diluio 1:400, previamente padronizadas. A anlise dos
conjugado com FITC. Empregamos as condies 25C dados no mostrou nenhuma diferena na reatividade
por 30 minutos e 37C por 30 minutos para a incubao das misturas de soros quando incubadas a 37C,
das promastigotas de 10 dias com as misturas de soros independente das condies de incubao com o
e 25C por 30 minutos, 4C por 60 minutos e 37C por conjugado. Entretanto, a incubao com o soro e com
30 minutos para a incubao com o conjugado na o conjugado a 25C por 30 minutos mostrou valores de

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PPFP positivos para as mistura PN e PNE em diluies Influncia do nmero de promastigotas em


que apresentavam valores negativos de PPFP nas suspenso na pesquisa de anticorpos antiformas
demais condies de incubao, mesmo na diluio do promastigotas de L. (V.) braziliensis: a Figura 5 mostra
soro 1:2.048. os resultados da reatividade de IgG total antiformas

Figura 5 - Influncia do nmero de promastigotas nos valores de PPFP


aps incubao de promastigotas vivas de L. (V.) braziliensis (10 dias de
cultivo) com soro humano (1:1.024) a 37C/30 minutos, e com o anticorpo
secundrio anti-IgG humano conjugado com FITC (1:400) a 37C/30
minutos. Os resultados da reatividade esto expressos como valores de
PPFP para cada soro individual, segundo descrito em material e mtodos.

promastigotas vivas de L. (V.) braziliensis, expressos


como PPFP, em soros individuais de pacientes
portadores de leishmaniose, empregando-se 250.000
e 500.000 promastigotas/poo, em condies
metodolgicas previamente padronizadas (mistura de
soros na concentrao 1:1024, conjugado na diluio
1:400 e ambas incubaes 37C por 30 minutos) . A
anlise dos resultados no demonstrou nenhuma
diferena significativa nos valores de PPFP quando
foram utilizados 250.000 ou 500.000 promastigotas.
Anlise do mtodo. Anlise comparativa da
reatividade de IgG antiformas promastigotas vivas de
Leishmania (V.) braziliensis e da reatividade na RIFI
em soros de indivduos com ausncia ou presena de
leso: a Figura 6 mostra os resultados da reatividade
de IgG total anti formas promastigotas vivas de L. (V.)
braziliensis, expressos como mdia dos valores de
PPFP, dos soros individuais dos grupos L- e L+,
classificados quanto ausncia ou presena de leso,
respectivamente. A reatividade dos soros individuais foi Figura 6 - Curva de titulao de anticorpos IgG antiformas
obtida aps incubao do soro humano nas diluies promastigotas vivas de L. (V.) braziliensis presentes em soros
(1:64 a 1:131.072) com promastigotas vivas, de 10 dias de indivduos com sorologia convencional positiva para
leishmaniose, classificados quanto a ausncia ou a presena de
de cultivo, nas condies previamente padronizadas. leso (L-, n=18 e L+, n=21), e indivduos no infectados de rea
Os resultados foram classificados em positivos quando endmica (NE). Os resultados da reatividade esto expressos
como mdia dos valores de PPFP para cada grupo avaliado,
PPFP>20% e negativos quando PPFP20%. A anlise segundo descrito em material e mtodos.

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das curvas de titulao dos anticorpos dos soros soro dos grupos L- e L+, considerando a ausncia ou
individuais, expressos como mdia dos valores de PPFP, presena de leso, respectivamente. As Figuras 7A e B
demonstrou que a diluio do soro humano mostram as curvas de titulao de anticorpos dos
1:1.024 ideal para distinguir indivduos no indivduos L- e L+. O estabelecimento de um limiar de
infectados (PPFP20%.) de indivduos infectados reatividade de 50% de PPFP permitiu a separao dos
(PPFP>20%). A anlise dos dados mostrou curvas de indivduos em dois subgrupos: pacientes com alta
titulao de anticor pos que configuram a alta reatividade (PPFP>50%) e indivduos com baixa
sensibilidade do teste e ainda que, o grupo L+ reatividade (PPFP50%). Empregando este critrio, o
estudo da mdia dos valores de PPFP dos grupos L- e
apresentou valor mdio de PPFP maior que o grupo L-
L+, na diluio do soro humano 1:1.024, permitiu classificar
em todas as diluies do soro humano. O grupo L+ o grupo L- como de baixa reatividade e o grupo L+ como
apresentou valor mdio de PPFP positivo at a diluio de alta reatividade (Figura 7C). A anlise estatstica
1:131.072, enquanto o grupo L- apresentou valores demonstrou de forma significativa que 95% dos pacientes
positivos at a diluio 1:2.048. A Figura 7 mostra os do grupo L+ concentram-se no grupo com alta reatividade
resultados da reatividade de IgG total antiformas (PPFP>50%) em contraste com o grupo L-, onde 72%
promastigotas vivas de L. (V.) braziliensis, expressos dos indivduos agrupam-se numa regio de baixa
como valores de PPFP para amostras individuais de reatividade (PPFP50%).

Figura 7 - Reatividade de IgG antiformas promastigotas vivas de L. (V.) braziliensis em soros de indivduos com sorologia
convencional positiva para leishmaniose, classificados quanto a ausncia ou a presena de leso (L-, n=18 e L+, n=21) .
Os resultados esto expressos como valores individuais de PPFP. A reatividade de amostras individuais dos grupos L- e
L+ foi avaliada ao longo da curva de titulao (A e B) e na diluio 1:1.024 selecionada (C).

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Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 35:551-562, nov-dez, 2002.

A Figura 8 mostra os resultados da reatividade de diferena significativa entre o ttulo mdio de RIFI do
IgG, expressos em ttulos da RIFI, para os soros grupo L- e L+. Alm disso, a anlise da disperso dos
individuais dos grupos L- e L+, classificados quanto ttulos da RIFI nos dois grupos no permitiu evidenciar
ausncia ou presena de leso, respectivamente. A a existncia de nenhum agrupamento especfico de
anlise dos resultados no demonstrou nenhuma baixa e alta reatividade.

Figura 8 - Reatividade de anticorpos IgG antiformas promastigotas fixadas de


L.(V.) braziliensis presentes em amostras de soros de indivduos com sorologia
convencional positiva para leishmaniose, classificados quanto a ausncia ou a
presena de leso (L-, n=18 e L+, n=21), avaliados atravs da RIFI. Os resultados
esto expressos como ttulos da RIFI.

DISCUSSO
A LTA uma infeco acompanhada pelo dos resultados no que se refere sensibilidade e
desenvolvimento de resposta imune celular e humoral no especificidade18 19 23 27. De forma anloga RIFI, a
hospedeiro infectado 9 . Com o objetivo de melhor especificidade tambm um desafio na ELISA e tem sido
caracterizar a participao da resposta imune humoral na alvo de investigaes. O uso de antgenos recombinantes
LTA, diversos estudos tm focalizado a ateno na anlise tem melhorado no s especificidade, mas tambm a
da resposta de anticorpos, demonstrando assim que a sensibilidade desses ensaios imunosorolgicos22 32 37.
resposta imune humoral tambm desempenha um Alm dos desafios no diagnstico sorolgico da LTA, deve-
importante papel na evoluo clnica da doena27 30 39. se tambm considerar as dificuldades desses testes em
Dentre os tpicos abordados no estudo da resposta distinguir a infeco em curso dos casos de infeco
humoral, podemos citar ainda aqueles que avaliam o uso passada ou a infeco ativa dos casos onde houve
das investigaes sorolgicas no diagnstico da LTA9 14 29. desenvolvimento de infeco abortiva ou subclnica.
A avaliao da resposta imune humoral tem sido Recentemente demonstramos a aplicabilidade da
geralmente abordada atravs de testes imunosorolgicos, citometria de fluxo na investigao de anticorpos
tais como RIFI, HAI e ELISA. Vrios autores procuram antiformas tripomastigotas vivas do T. cruzi, e sua
superar as limitaes destas tcnicas e o principal desafio utilizao no monitoramento de cura ps- teraputica
tem sido a busca de uma preparao do antgeno ideal especfica em infeco humana por T. cruzi25. Esta
para pesquisa de anticorpos antiLeishmania. Walton et metodologia apresenta alta sensibilidade e permite uma
al40 e Shaw & Lainson36 propuseram o uso de formas anlise mais especfica da resposta humoral, pois
amastigotas do parasita como antgeno para RIFI, mas minimiza as reaes cruzadas, j que avalia, de forma
apesar dos bons resultados obtidos, existe grande seletiva, anticorpos dirigidos contra antgenos de
dificuldade de cultivo desta forma evolutiva. Com o uso de membrana do parasita, evitando, assim, a reatividade
promastigotas do parasita como antgeno da RIFI, o que com epitopos intracitoplasmticos, potentes alvos de
se observa em vrios trabalhos a grande variabilidade reatividade cruzada entre tripanosomatdeos.

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Rocha RDR et al

Considerando as aplicabilidades da citometria de L. major, L. mexicana, respectivamente, observaram que


fluxo, neste estudo apresentamos dados referentes o desenvolvimento de formas metacclicas est
padronizao de uma metodologia para pesquisa de associado com alteraes nos carboidratos de
anticor pos anti for mas promastigotas vivas de superfcie das clulas para ligao com lectinas11 36, no
Leishmania (V.) braziliensis. Esta nova abordagem visa aumento da resistncia das promastigotas destruio
estudar a existncia de uma correlao entre a resposta pelo soro humano12 e na alterao da morfologia e
imune humoral e a presena de infeco ativa, motilidade. Embora as formas promastigotas de
proporcionando assim, uma nova perspectiva para os fase estacionria apresentem maior expresso de
estudos da resposta imune humoral na LTA. carboidratos, como gp63 e de LPG, que favoreciam
ligaes inespecficas de anticorpos polireativos, estas
Para a padronizao da metodologia, numa reaes poderiam ser minimizadas ou eliminadas
abordagem inicial avaliamos a reatividade de IgG total atravs de diluies sucessivas dos soros.
antipromastigotas vivas de Leishmania (V.) braziliensis
em diferentes fases do crescimento em cultura, visando No procedimento de padronizao da diluio do
identificar a preparao antignica que melhor permitiria anticorpo murino anti-Fc de IgG humano conjugado com
distinguir pacientes infectados de indivduos no FITC, a anlise dos resultados conduziu escolha da
infectados. No procedimento de padronizao foi diluio do conjugado 1:400, a qual permitiu distinguir
indivduos no infectados de pacientes portadores de
imprescindvel identificar as condies de cultivo dos
LTA, apresentando valor baixo de PPFP para PN, valor
parasitas, principalmente considerando que os mesmos
negativo de PPFP para PNE e maior valor de PPFP para
seriam utilizados em tcnicas sorolgicas. A expresso PL comparado s demais diluies do conjugado (Figura 3).
de inmeras molculas antignicas, sobretudo as de A diluio 1:200 apresentou valor de PPFP positivo para
superfcie dos parasitas, podem sofrer mudanas, PN e a diluio 1:800, embora tenha apresentado valores
dependendo das condies de cultivo o que pode levar negativos de PPFP para PN e para PNE, houve uma
a perda da infectividade5, e principalmente a mudanas queda no valor do PPFP do PL. A temperatura de
na composio antignica dos parasitas11 21. Neste incubao com o soro humano e com o conjugado foram
contexto, avaliamos a reatividade de IgG utilizando relevantes para a otimizao dos resultados (Figura 4.
parasitas na fase log inicial, log tardia e fase estacionria Optamos pela utilizao da incubao com o soro
de crescimento, que correspondem a parasitas de humano a 37C por 30 minutos considerando a maior
4, 7 e 10 dias de crescimento em cultura (Figura 2). Em especificidade do mtodo nesta condio em relao
todos os experimentos, a utilizao de um inculo incubao a 25C. Em relao incubao com o
proveniente de uma cultura em fase log inicial com conjugado, a escolha da incubao a 37C por 30
menor nmero de passagens in vitro permitiu a minutos, o tempo menor de incubao a 37C foi o fator
obteno das formas promastigotas morfologicamente decisivo, visando otimizao do tempo de reao.
mais homogneas, com um perfil de tamanho e Tambm, na avaliao do nmero de formas
granulosidade bem homogneo como o observado na promastigotas em suspenso para a pesquisa de anticorpos
Figura 1A. Nesta etapa inicial de padronizao, a anti L. (V.) braziliensis, optamos por utilizar 500.000
escolha de variveis, tais como: o nmero de parasitas promastigotas/poo, visando um procedimento de leitura
em suspenso (5 x 105 parasitas/poo), as diluies do mais rpido, otimizando assim a metodologia (Figura 5).
soro (1:1.024 a 1:4.096), a temperatura de reao (37C Uma vez padronizados os diferentes parmetros que
por 30 minutos), a diluio do conjugado (1:400) e a poderiam interferir na anlise sorolgica baseada na
temperatura de incubao (4C por 60 minutos) baseou- citometria de fluxo, realizamos uma anlise comparativa
se nas condies descritas por Martins-Filho et al25 para entre grupos de indivduos residentes em rea
a pesquisa de anticorpos anti-T. cruzi. Nossos dados endmica para LTA, com sorologia convencional positiva
mostraram que os parasitas de fase estacionria (10 para leishmaniose, classificados quanto ausncia ou
dias de cultivo) foram os ideais, uma vez que estas presena de leso. O estudo de amostras individuais
formas promastigotas permitiram distinguir os grupos demonstrou que, na diluio 1:1.024, a presena de
de indivduos infectados e no infectados (Figura 2), leso estava relacionada com valores de PPFP de alta
alm de ser antigenicamente mais complexas e de reatividade (>50%), com 95% dos pacientes (20/21)
maior infectividade11 12 15 20 34 35. Giannini15 mostrou que classificados como de alta reatividade (Figura 7C).
promastigotas da fase estacionria de cultivo so mais Embora o grupo L- tenha apresentado um padro de
infectantes para hamsters que aquelas da fase log. resposta mais heterogneo, com ampla disperso de
Segundo Sacks & Perkins35, na fase estacionria de valores de PPFP, observamos que 72% dos indivduos
crescimento dos parasitas, esto as promastigotas (13/18) podiam ser agrupados em valores de PPFP de
metacclicas que nos meios de cultivo, resultam da baixa reatividade (50%) (Figura 7C). importante
diferenciao de formas promastigotas no infectantes ressaltar que a anlise dos ttulos de reatividade na
da fase log, devido, sobretudo, escassez de nutrientes RIFI no demonstrou nenhuma relao com a ausncia
encontrada no meio de cultura durante a fase ou presena de leso.
estacionria. Doran & Herman11, Franke et al12, Sacks interessante observar que a reatividade do grupo
et al 34, Howard et al20, trabalhando com L. donovani, L- pode representar diferentes estgios da resposta

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Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 35:551-562, nov-dez, 2002.

imune, talvez associada a diferentes momentos no infeco iremos reavaliar o grupo L- subdividindo-o em
desenvolvimento de uma futura leso ou casos onde indivduos com teste de Montenegro positivo ou negativo.
houve desenvolvimento de infeco abor tiva ou O estudo de subclasses de IgG reativos anti formas
subclnica. Alm disso, a possibilidade de reatividade promastigotas vivas em pacientes portadores de LTA e
cruzada no deve ser descartada. O estudo da pacientes portadores outras infeces ser conduzido
reatividade sorolgica de indivduos apresentando para identificar possveis casos de reatividade cruzada.
leses recentes ou leses crnicas est ora em Em suma, nossos resultados sugerem a
andamento em nosso laboratrio e ser importante para aplicabilidade da citometria de fluxo para evidenciar os
esclarecer a primeira hiptese. A possibilidade de esses casos de LTA em atividade clnica, o que no tem sido
indivduos apresentarem leses curadas foi descartada possvel atravs das reaes sorolgicas convencionais.
pela histria clnica e pela ausncia de leses Alm disso, as informaes geradas neste estudo abrem
cicatriciais. A intradermorreao de Montenegro positiva novas perspectivas para pesquisa sorolgica na LTA e
em indivduos de rea endmica sem histria ou estimulam novas investigaes, incluindo a anlise
cicatrizes compatveis com leishmaniose e sem comparativa da reatividade de anticorpos, empregando-
qualquer leso suspeita, aponta para a possibilidade se preparaes de parasitas vivos e fixados, importantes
de formas abortivas ou infeces subclnicas16 17 26. Com para validar a utilizao das formas promastigotas vivas
o objetivo de melhor caracterizar a forma subclnica da nos ensaios sorolgicos na LTA.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem Dra. Elenice Moreira Lemos, Flvia Drumond Cordeiro e ao Dr.Alexandre Reis
Barbosa pela colaborao nas etapas iniciais deste trabalho. Agradecemos ao Centro de Pesquisas Ren Rachou
e a FAPEMIG pelo suporte financeiro.
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