Tecnologa Bioambiental:

Diseo y composicin de consorcios microbianos fngicos-bacterianos sintticos que

mejoran la actividad enzimtica lignoceluloltica

Jiajun Hu a, Yiyun Xue a, Hongcheng Guo a, Min-tian Gao a, , Jixiang Li b, Shiping

Zhang b, Yiu Fai Tsang c

Un Laboratorio Clave de Shanghai de Cultivos de Bio-Energa, Escuela de Ciencias de la

Vida, Universidad de Shanghai, Shanghai 200444, China
B Instituto de Investigacin Avanzada de Shanghai, Academia China de Ciencias,
Shanghai 20110, China
C Departamento de Ciencias y Estudios Ambientales, la Universidad de Educacin de
Hong Kong, Hong Kong, China

Hgado: Se crearon consorcios microbianos sinrgicos para producir enzimas

lignocelulolticas. Fue difcil encontrar dos cepas con interacciones sinrgicas positivas.
La adicin de una comunidad microbiana celuloltica enriqueci el nmero de especies.
La respuesta positiva entre las cepas se pudo estudiar utilizando secuencias de alto
rendimiento. Las cepas bacterianas y fngicas juegan Papel importante en las
interacciones.
Grficamente abstracto:
informacin del artculo :
Articulo de historia: Recibido el 7 de noviembre de 2016 Recibido en forma revisada 15 de
diciembre de 2016 Aceptado el 16 de diciembre de 2016 Disponible en lnea 22 Diciembre
2016 Palabras clave: Interaccin microbiana Consorcios microbianos sinrgicos Bacterias
Hongos Produccin de enzimas lignocelulolticas

abstracto

Las interacciones microbianas son importantes para el metabolismo ya que pueden

mejorar o reducir la eficiencia metablica. Para mejorar la actividad enzimtica
lignoceluloltica, se ide una serie de consorcios microbianos sinrgicos de creciente
diversidad y complejidad utilizando cepas de hongos, incluyendo Trichoderma reesei,
Penicillium decumbens, Aspergillus tubingensis y Aspergillus niger. Sin embargo,
cuando se aadi a los consorcios una comunidad microbiana tamizada con capacidad
celuloltica para aumentar el nmero de cepas, engendr ms interacciones
microbianas con las cepas anteriores y mejor universalmente la actividad de la b-
glucosidasa de los consorcios. El anlisis de la estructura de la comunidad microbiana
revel que las bacterias en los consorcios son ms importantes para la actividad
enzimtica lignoceluloltica que los hongos. Un genoma de hongos y bacterias en los
consorcios puede interactuar con T. reesei y son miembros potenciales de un consorcio
de microorganismos sinrgicos. Estos consorcios microbianos diseados pueden ser
aplicados potencialmente para degradar eficaz y econmicamente la lignocelulosa.
2016 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

1. Introduccin

La lignocelulosa es la fuente de carbono renovable ms abundante en la tierra y

tambin es una materia prima potencial de biocombustible. Los biocombustibles, los
candidatos lgicos para reemplazar los combustibles derivados del petrleo, han
atrado gran inters debido a la escasez mundial de combustibles

Autor de correspondencia.
Direccin de correo electrnico: mtgao@shu.edu.cn (M.-t. Gao).

Y problemas ambientales (Gouveia y Oliveira, 2009). Los ccteles de enzimas

lignocelulticas que contienen una serie de enzimas involucradas en la hidrlisis de
diferentes partes de la estructura lignocelulsica son cruciales para convertir la
biomasa lignocelulsica en biocombustibles (Delabona et al., 2013).
La celulasa comercial es comnmente producida por hongos, y Tri- choderma reesei en
particular se ha investigado ampliamente debido a su mayor capacidad para producir
celulasa. Sin embargo, la celulasa derivada de T. reesei exhibe baja actividad b-
glucosidasa, que Es su principal limitacin (Zhang et al., 2014). La adicin externa de b-
glucosidasa producida por otras cepas (Qian et al., 2016) y la transformacin gentica de T. reesei
con genes b-glucosidasa homloga y heterloga (Rana et al., 2014) son estrategias que pueden
usarse para Complementan la actividad de la b-glucosidasa. Sin embargo, el uso de la costosa b-
glucosidasa aumenta el coste econmico de todo el proceso. Y el mtodo de transformacin
gentica sufre del problema prctico del riesgo de contaminacin gentica, es decir, el caldo para
cultivar el hongo manipulado tiene que ser tratado para evitar la entrada de los hongos en el
ambiente natural despus del cultivo, y esto tambin da como resultado un aumento En el costo
total de produccin para la produccin de celulasa. Una estrategia adicional para aumentar la
produccin de b-glucosidasa es el co-cultivo de cepas de actividad alta de b-glucosidasa con T.
reesei (Gutierrez-Correa et al., 1999). Se inform que el co-cultivo de T. reesei y Aspergillus
saccharolyticus aument la actividad de la avicelasa en un 30% en comparacin con el monocultivo
de T. reesei (Kolasa et al., 2014). El prerrequisito de un co-cultivo eficaz es que se ha encontrado
una combinacin microbiana con interacciones positivas entre los miembros, lo que requiere un
gran nmero de experimentos para examinar diversas combinaciones. Esto limita el nmero de
cepas para el co-cultivo. Algunos consorcios microbianos constan de ms de 10 cepas (Shruti y
Malik, 2015) como MCHCA, que est compuesta de 16 cepas (Poszytek et al., 2016). Cada cepa
de MCHCA tiene alta actividad celuloltica pero las interacciones microbianas entre las cepas no se
han explorado en detalle (Poszytek et al., 2016). Algunas de las 16 cepas no pueden mejorar
positivamente la actividad celuloltica de MCHCA y algunas pueden incluso reducir la actividad
celuloltica. Despreciar las interacciones entre las cepas microbianas puede limitar la ulterior
optimizacin de la actividad enzimtica. Las interacciones microbianas son diversas y complicadas,
y pueden resultar de combinaciones microbianas que Estn todava sin descubrir. Por lo tanto, la
bsqueda de un mtodo, Basado en tecnologa de secuenciacin de alto rendimiento. En
comparacin con las combinaciones simples de un nmero limitado de cepas de
hongos, esto podra ser un mejor enfoque para encontrar interacciones beneficiosas
entre microorganismos y podra mejorar an ms estas interacciones optimizando la
estructura de la comunidad microbiana. Este estudio servir de base para futuros
esfuerzos para desarrollar comunidades sintticas mejores y ms robustas que puedan
ser utilizadas en aplicaciones de biotecnologa industrial para producir eficientemente
la celulasa extracelular, lo cual ser importante para explotar los recursos de biomasa
lignocelulsica.

2. Materiales y mtodos

2.1. Las cepas fngicas y la comunidad microbiana celuloltica

Trichoderma reesei RUT-C30 (CICC 13052), Penicillium decumbens (CICC 40361),

Aspergillus tubingensis (CICC 40613) y Aspergillus niger (CICC 41125) fueron
suministrados por el Centro de Cultivos Industriales de China (CICC).
Una comunidad microbiana celuloltica fue aislada del suelo agrcola. El procedimiento
de aislamiento fue el siguiente. Se recolectaron muestras de suelo agrcola de
Zhumadian, provincia de Henan, China. Se mezcl una muestra que contena 150 g de
tierra y 15 g de paja de arroz despus del triturado (recogida de Chongming, Shanghai,
China)
500 ml de vial de muestra sin sellado, y luego se transfiere a un frasco de muestra de 2
litros y sellado. El vial de muestra se puso en una incubadora a 30C durante 4
semanas. El frasco de muestra de 2 litros se abri una vez por semana para admitir un
poco de aire. Se recogi una muestra de 5 g del vial de muestra de 2 litros despus del
cultivo y se coloc en un matraz de agitacin de 250 ml con 50 ml de agua estril y
perlas de vidrio y despus se agit a 160 rpm durante
1 h. Por ltimo, la muestra lquida se recogi y se diluy a 103,
4 y 10 5 usando agua estril. Alcuotas (1 ml) de lo anterior
Interacciones microbianas basadas en tantas cepas como sea posible Y como pocos
experimentos como sea posible es importante para disear arti-diluyentes (10) Mixtos
microbianos mixtos de diversidad diversa y complejidad de interacciones microbianas.
Estos consorcios microbianos tienen grandes aplicaciones potenciales en el tratamiento
de los problemas mundiales de salud, energa y medio ambiente.
En experimentos previos, se combin una comunidad microbiana con una variedad de
bacterias no fotossintticas y mltiples cepas aisladas para generar congestin
microbiana sinttica con capacidad de fijacin de CO2 (Hu et al., 2016). La eficiencia de
fijacin de CO2 de un consorcio autotrfico-heterotrfico sinttico fue mayor que la
suma de las eficiencias tericas de fijacin de CO2 de sus miembros microbianos (Hu et
al., 2016). Este enfoque puede aplicarse de manera similar en la elaboracin de un
consorcio sinrgico con alta actividad enzimtica lignoceluloltica.
En este estudio, en primer lugar, se combinaron mltiples cepas fngicas celulolticas
de varias maneras para idear un consorcio fngico sinrgico con alta actividad
enzimtica lignoceluloltica. Estas cepas fngicas incluyeron T. reesei y Penicillium
decumbens, que se han usado tpicamente para la produccin industrial de celulasa, ya
que generan protenas extracelulares en grandes cantidades (Delabona et al.
2013; Qin et al., 2013), y Aspergillus niger y Aspergillus tubinsensis, que podran
interactuar positivamente con T. reesei durante un proceso de co-cultivo (Kolasa et al.,
2014; Shimokawa et al., 2013). Sin embargo, un consorcio de hongos con interacciones
microbianas que optimizan la actividad enzimtica lignoceluloltica puede ser muy
difcil de encontrar simplemente combinando un nmero limitado de cepas. En
segundo lugar, se introdujo una comunidad microbiana filtrada que incluye muchas
cepas, incluso miles de cepas, como un miembro de los consorcios microbiolgicos. Las
interacciones microbianas dirigidas causadas por una o mltiples cepas aisladas dentro
de la comunidad microbiana examinada podran ser identificadas midiendo la actividad
enzimtica lignoceluloltica. Adems, se podran identificar cepas de la comunidad
microbiana examinada que desempean un papel crucial en las interacciones
microbianas. Conteniendo 50 ml de Medio I y se mantuvieron durante 2 semanas a 30C y 200
rpm. La comunidad microbiana con la mayor actividad de b-glucosidasa fue elegida en este estudio
como miembro de los consorcios para aumentar el nmero de cepas. Medio I contenido (g / L):
celulosa (Avicel PH-101, Sigma-Aldrich, MO, EE.UU.), 10; Extracto de levadura, 0,4; KH _ {2} PO _
{4}, 2; (NH _ {4}) _ {2} SO _ {4} 1,4; MgSO _ {4} 7H _ {2} O, 0,3; CaCl _ {2}, 0,3; FeSO _ {4} 7H _
{2} O, 0,005; MnSO _ {4} 0,0011; ZnSO _ {4} 7H _ {2} O, 0,0035; CoCl _ {2} 6H _ {2} O, 0,0037. Al
combinar las cepas anteriores y la comunidad microbiana celuloltica, se ide en este estudio una
serie de consorcios microbianos sintticos de creciente diversidad y complejidad. 2.2. Produccin
de celulasa Se utilizaron consorcios microbianos compuestos de los cuatro hongos y la comunidad
microbiana celuloltica para producir celulasa en este estudio. Se utilizaron diferentes mtodos de
cultivo de siembra y de inoculacin para cada cepa en base a sus diferentes caractersticas para
garantizar la consistencia del estado microbiano inicial y las concentraciones en los experimentos
de fermentacin. Los cultivos de siembra para T. reesei y P. decumbens se prepararon agitando el
medio II inoculado en matraces de 100 ml en un agitador rotatorio a 200 rpm y 30C durante 1 d. A.
tubingensis y A. niger se cultivaron en placas de agar de peptona dextrosa de extracto de levadura
(YPD) a 30C durante 4 d. La comunidad microbiana celuloltica se enriqueci mediante cultivo en
Medio I a 200 rpm y 30C durante 4 das. La razn por la que A. tubingensis y A. niger no se
enriquecieron en la fase lquida es que fueron inoculados en el medio lquido a travs de un
fragmento de talo fun- cial y luego ambos crecieron para formar un grupo. Esto dio lugar a
dificultades para inocular con precisin una porcin del grupo en el siguiente experimento. La razn
por la cual el Medio II no se utiliz para enriquecer la comunidad microbiana celuloltica es que los
principales

La fuente de carbono en el Medio II es glucosa, que puede cambiar la estructura de la comunidad

microbiana y resultar en la disminucin de las proporciones de cepas con alta actividad celuloltica.
Los microorganismos se inocularon segn la composicin de los consorcios microbianos. Las
concentraciones de inoculacin de los microorganismos fueron las siguientes: T. reesei y P.
decumbens, 1 ml de medio de cultivo; Comunidad microbiana celuloltica, 0,1 ml de medio de
cultivo; A. tubingensis y A. niger, un fragmento de talo fngico de dimetro 6 mm. Los medios de
cultivo de T. reesei, P. decum- bens y la comunidad microbiana celuloltica se eliminaron por
centrifugacin antes de la inoculacin, y despus se aadi un volumen igual de Medio III reciente.
Cada alcuota de la comunidad de microorganismos celulolticos se inocul en el medio de
produccin de celulasa en un matraz de 100 ml en un agitador rotatorio a 200 rpm y 30C. El
volumen total del Medio III y el inculo fue de 30 ml. Todos los estudios de fermentacin se
repitieron dos veces. Medio Bsico Contenido (g / L): peptona, 10; Extracto de levadura, 0,5; Licor
de maz, 10; KH _ {2} PO _ {4}, 24; C4H4O6K2, 4,7; MgSO _ {4} 7H _ {2} O, 1,2; (NH _ {4}) _ {2}
SO _ {4}, 5; Tween 80, 1 ml; Y el pH se ajust a 4.0. El Medio Bsico se filtr a travs de papel de
filtro cualitativo para reducir partculas en suspensin. El Medio II contena Medio Bsico y 20 g / l
de glucosa. El Medio III contena Medio Bsico y 50 g / l de celulosa. Cada placa de agar YPD
contena (g / l): extracto de levadura, 10; Peptona, 20; Glucosa, 20; Agar, 20..

2.3. Ensayo de actividad enzimtica

La actividad de celulasa se produce a travs de los efectos sinrgicos de tres

componentes principales: exoglucanasa (EC 3.2.1.91), endoglucanasa (EC
3.2.1.4), y glucosidasa (EC 3.2.1.21). Las actividades de la exoglucosa, endoglucanasa
y glucosidasa se representan a menudo por la actividad del papel de filtro (FPase),
carboximetil celulasa (CMCase) y b-glucosidasa (pNPGase), respectivamente. Adems
de estos tres tipos de enzimas, las xilanasas son tambin importantes en el proceso de
hidrolizar la celulosa (Zhao et al., 2012). Las xilanasas pueden despolitizar xilanos a
partir de compuestos de celulosa-hemicelulosa y, adems, mejorar el acceso de las
celulasas a las superficies de celulosa (Shi et al., 2013). Una mezcla de estas enzimas
con altas actividades ser beneficiosa para convertir la biomasa lignocelulsica en
azcares fermentables.
La FPasa se determin como se describe por Ghose (Ghose, 1987). Las actividades de
CMCasa y xilanasa se estimaron utilizando CMC-Na y xilano de madera de haya (Sigma-
Aldrich) como sustratos, respectivamente. El sistema de reaccin que contiene 500 lL
de preparacin enzimtica y
500 lL de sustrato al 1% en 50 mmol / L de tampn acetato (pH 4,8) se incub
Bated durante 60 minutos a 45 C (para CMCase) o 50 C (para xilanasa), seguido de la
adicin de 3 ml de DNS y la ebullicin durante 5 min para terminar la reaccin. La
absorbancia a 540 nm se determin despus de enfriar a temperatura ambiente.
La actividad de pNPGasa se estim utilizando pNPG (Sigma - Aldrich) como sustrato. Se
incub el sistema de reaccin que contena 100 lL de preparacin enzimtica, 800 lL de
tampn acetato 50 mmol / L (pH 4,8) y 100 lL de pNPG 10 mmol / L en tampn acetato
50 mmol / L a 45C durante 10 min. La reaccin se detuvo aadiendo
500 lL de Na _ {2} CO _ {3} 1 mol / L, y la absorbancia se midi a
420 nm.
Una unidad de actividad enzimtica se defini como la cantidad de enzima requerida
para liberar 1 lmol equivalente de azcar reductor de cada sustrato por minuto en las
condiciones de ensayo estndar.

2.4. Extraccin de ADN, amplificacin por PCR de genes 16S y 18S rRNA, y
secuenciacin

El ADN bacteriano se extrajo utilizando un aislamiento de ADN PowerSoil

Kit (MO BIO Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con Instrucciones del
fabricante. Las regiones V4 de la bacteria
16S y fngicos 18S rRNA genes de cada muestra fueron amplificados con la costumbre
de cdigos de barras primers y secuenciado en una plataforma Illumina MiSeq (Kozich
et al., 2013). Las regiones V4 de los genes 16S y 18S rRNA se amplificaron utilizando
pares de primers
520F / 802R (Claesson et al., 2009) y TAReuk454FWD1 / TAReuk-REV3 (Stoeck et al.,
2010), respectivamente. Todas las lecturas de las muestras han sido enviadas al Centro
Nacional de Informacin Biotecnolgica (NCBI). Las muestras y sus nmeros de acceso
en NCBI son: C fungicida parte, SRR4302304; C parte bacteriana, SRR4302315; Parte
de hongo CR (2 d), SRR4302305; Parte de hongo CR (4 d), SRR4302310; Parte de
hongo CR (6 d), SRR4302311; Parte bacteriana CR (2 d), SRR4302316; Parte bacteriana
CR (4 d), SRR4302317; Parte bacteriana CR (6 d), SRR4302306; Parte de hongos CRT (2
d), SRR4302312; Parte de hongos CRT (4 d), SRR4302313; Parte de hongos CRT (6 d),
SRR4302314; Parte bacteriana CRT (2 d), SRR4302307; Parte bacterial CRT (4 d),
SRR4302308; Y parte bacteriana CRT (6 d), SRR4302309.
2.5. Bioinformtica y anlisis estadstico

El preprocesamiento de datos se realiz principalmente utilizando el software mothur

(Schloss et al., 2009). Las secuencias se agruparon en unidades taxonmicas
operativas (OTU) a una identidad de secuencia del 97% (mtodo de vecino ms
alejado).
Las correlaciones entre las variables se evaluaron mediante la prueba de correlacin de
Spearman utilizando SPSS versin 23 (IBM, Armonk, NY, EE.UU.). La significacin
estadstica se defini como P <0,05.

3. Resultados y discusin

3.1. Ensayos enzimticos de los consorcios de hongos sintticos diseados

En comparacin con un solo hongo, un consorcio fngico sinrgico ideado puede ser
ms eficaz en la produccin de enzimas lignocelulolticas debido a las interacciones
entre los diferentes hongos. Para la bsqueda de interacciones microbianas
constructivas, se seleccionaron cuatro hongos, incluyendo T. reesei, P. decumbens, A.
tubingensis y A. niger, que tienen diferentes actividades enzimticas lignocelulolticas.
Usando estos cuatro hongos, se ide una serie de consorcio fngico sinrgico de
creciente diversidad y complejidad. Las actividades de las enzimas lignocelulolticas de
los consorcios de hongos se muestran en la Fig. 1.
Se utilizaron las actividades de cuatro enzimas cruciales (Fase, CMCasa, pNPGasa y
xilanasa) que participan en el proceso de degradacin de la celulosa para medir la
actividad enzimtica lignoceluloltica. Las actividades de las cuatro enzimas de A. niger
y A. tubingensis fueron todas inferiores a las de T. reesei y P. decumbens en cada nodo
de tiempo. Las actividades de Fpase, CMCase y pNPGase de A. niger y A. tubingensis
fueron similares ya niveles bajos. Las actividades de la Fase de T. reesei y P.
decumbens fueron similares. La actividad xilanasa de T. reesei, que alcanz un nivel
alto a 2 d, fue siempre superior a la de P. decumbens. La actividad de pNPGase de P.
decumbens fue mayor que la de T. reesei, y fue aproximadamente 283% mayor que la
de T. reesei a los 6 d.
En los consorcios fngicos sin T. reesei, incluyendo decumbensniger ("especie 1-
especie 2" significa que el consorcio estaba compuesto de especies 1 y 2, los
siguientes consorcios se denominan de la misma manera), decumbens-tubingensis,
niger -tubingensis y decumbens-niger-tubingensis, las actividades de las cuatro
enzimas se realizaron en niveles bajos y similares a los de A. niger y A. tubingensis. En
comparacin, en los consorcios fngicos con T. reesei, incluyendo reesei-decumbens,
reesei-niger (RN), reesei-tubingensis (RT), reesei- decumbens-niger (RDN), reesei-
decumbens tubingensis, reesei-niger- Tubingensis, y reesei-decumbens-reesei-niger, las
actividades de la
fig. 1. Mapa trmico de las actividades enzimticas lignocelulolticas de los consorcios
fngicos compuestos por los cuatro hongos. R, D, N y T, que son T. reesei, P.
decumbens, A. niger y A. tubingensis, respectivamente.

Cuatro enzimas estaban en niveles ms altos. Las actividades mximas de Fase,

CMCasa y xilanasa de T. reesei y P. decumbens fueron bsicamente las mismas; Sin
embargo, la actividad mxima de pNPGase de P. decumbens fue mucho mayor que la
de T. reesei. Pero las actividades mximas de las cuatro enzimas en los consorcios
fngicos que contenan T. reesei eran mucho ms altas que las de los consorcios
fngicos que contenan P. decumbens. Esto puede deberse a que hubo una fuerte
interaccin negativa entre P. decumbens y los otros hongos en los consorcios,
resultando en actividades enzimticas mucho ms bajas en los consorcios fngicos que
en P. decumbens. Comparado con P. decumbens, T. reesei parece ser un buen miembro
de los consorcios fngicos, ya que promueve las actividades enzimticas de los
consorcios fngicos a niveles altos.
Nuestro objetivo era disear un consorcio de hongos en el que las actividades
enzimticas fueran ms altas que las de hongos nicos e incluso superiores a la suma
de las actividades enzimticas tericas de los componentes fngicos. Las actividades
enzimticas de T. reesei se utilizaron como base para evaluar las actividades
enzimticas del consorcio fngico. Los resultados mostraron que las actividades de
Fpase de RN, RT y RDN a 2 das fueron aproximadamente 37%, 6% y 43% ms altas
que las de T. reesei, respectivamente, y fueron alrededor del 5%, 29% y 34% Mayor a 4
d. Sin embargo, las actividades de Fpase de RN, RT y RDN a 6 d fueron inferiores a T.
reesei. Las actividades CMCase de RN, RT y RDN a 2 das fueron aproximadamente
27%, 22% y 25% ms altas que las de T. reesei, respectivamente, pero similares a las
de T. reesei a las 4d y 6d. Las actividades de la pNPGasa de RN, RT y RDN a 2 d fueron
aproximadamente 33%, 15% y 28% ms altas que las de T. reesei, respectivamente.
Las actividades de pNPGase de RN y RT a 4 das fueron similares a las de T. reesei; Sin
embargo, la actividad de la pNPGasa de RDN era aproximadamente 51% ms alta que
T. reesei. A
6 d, las actividades de pNPGase de RN, RT y RDN fueron todas inferiores a T. reesei. No
hubo diferencias significativas entre las actividades de xilanasa de RN, RT, RDN y T.
reesei.
Un anlisis de correlacin (Tabla 1] de los datos de la Fig. 1 se utiliz para determinar el
papel y el peso de los miembros fngicos de los consorcios. Los resultados mostraron
que la adicin de T. reesei podra mejorar la actividad de la Fpase (correlacin de
Spearman = 0,754, P <0,001), actividad CMCasa (correlacin de Spearman = 0,704, P
<0,001), actividad pNPGasa (correlacin de Spearman = 0,307, p = 0,002 ), Y la
actividad xilanasa (correlacin de Spearman = 0,859, P <0,001). La adicin de P.
decumbens podra mejorar las actividades enzimticas de la Fase (correlacin de
Spearman = 0,192, P = 0,035) y
CMCasa (correlacin de Spearman = 0,207, P = 0,025). La adicin de A. niger reducira
las actividades enzimticas de la Fase (correlacin de Spearman = 0,208, P = 0,024),
CMCasa (correlacin de Spearman = 0,248, P = 0,009) y xilanasa (correlacin de
Spearman = 0,180, P = 0,045). La adicin de A. tubingensis reducira las actividades
enzimticas de la Fase (correlacin de Spearman = 0,231, P = 0,014) y CMCasa
(correlacin de Spearman = 0,208, P = 0,025). Estos datos mostraron que T. reesei
podra mejorar las actividades de las cuatro enzimas de los consorcios fngicos y su
influencia (valores absolutos de las correlaciones de Spearman) fue mucho mayor que
la de P. decumbens, A. niger y A. tubingensis. P. decumbens slo podra mejorar las
actividades de Fase y CMCasa. A. niger y A. tubingensis redujeron las actividades de la
FPasa y CMCasa de los consorcios de hongos.
Los resultados de la Fig. 1 y la Tabla 1 se usaron juntos para un anlisis posterior. Debe
observarse que las actividades de Fpase, CMCasa y pNPGasa de RN a 2 d (Fpase 1.00,
CMCasa 0.71 y pNPGase
0,95) fueron aproximadamente 32%, 8% y 32% superiores a la suma de las actividades
enzimticas tericas de los componentes fngicos (Fpase 0,73
+ 0,03, CMCasa 0,56 + 0,01 y pNPGasa 0,72 + 0,00), respectivamente. La actividad de
la Fpasa de la RT a 4 d (Fpase 1.42) fue aproximadamente 26% mayor que la suma de
las actividades enzimticas tericas de los componentes fngicos (Fpase 1.10 + 0.03).
Estos resultados implican que las interacciones entre T. reesei y A. niger y T. reesei y A.
tubingensis promovieron significativamente las actividades de las enzimas
lignocelulolticas. A. niger y A. tubingensis (ver Tabla 1) desempearon un papel en la
reduccin de las actividades enzimticas de los consorcios de hongos, mientras que las
actividades enzimticas de un consorcio de hongos compuesto por T. reesei y A. niger o
A. tubingensis fueron mejorados. Esto indica que las interacciones microbianas entre T.
reesei y A. niger o A. tubingensis son especiales. Y debera ser posible hacer un uso
eficiente de estas interacciones microbianas mediante la adaptacin de mtodos de
proceso adecuados y una mayor optimizacin.
Las actividades de Fase de T. reesei a las 2, 4 y 6 d fueron 0,73 0,07, 1,10 0,06 y 1,92 0,08,
respectivamente, que aumentaron linealmente con el tiempo. Aunque los incrementos en la
actividad de la Fase de RT y RN a 6 d fueron inferiores a los de T. reesei solo, las actividades de
Fpase de RN a 2 dy RT a 4 d fueron aproximadamente 30-40% mayores que las de T. reesei . Si el
cultivo se detuvo a 2 d o 4 d, la produccin de enzimas extracelulares de los consorcios fngicos
sera mejor que T. reesei. Adems, se supone que las interacciones microbianas.

Tabla 1 Correlaciones entre las actividades de diferentes enzimas y los hongos.

FPas CMCas pNPCas Xylanase

e e e

P 0.00 0.00 0.00 0.000

0 0 2

P 0.03 0.02 0.08 0.424

5 5 4
A. niger S 0.20 0.24 0.00 0.180
P 8
0.02 8
0.00 5
0.48 0.045
4 9 1
A. tubingensis S 0.23 0.20 0.07 0.051
P 1
0.01 8
0.02 4
0.24 0.318
4 5 4

Haba 90 conjuntos de datos de la Fig. 1. S es el coeficiente de correlacin de Spearman. Cuatro

hongos fueron establecidos como variables ficticias con "no aadido" establecido en el nivel 0 y
"aadido" en el nivel 1. Resultados de 0.000 media <0.001. Entre T. reesei y A. niger o A.
tubingensis a 6 d redujo la actividad de Fase de los consorcios de hongos. A. niger y A. tubingensis
fueron inoculados al medio a travs de un fragmento de tlamo fngico y luego ambos crecieron
para formar un grupo. Como resultado, result conveniente retirarlos de RT y RN, lo que condujo a
una reduccin o incluso desaparicin de las interacciones negativas entre T. reezae y A. niger o A.
tubingensis. Y las interacciones microbianas positivas entre T. reesei, A. niger y A. tubingensis
pueden fortalecerse an ms optimizando sus concentraciones iniciales de inoculacin. Sin
embargo, la actividad enzimtica crucial de pNPGase no mejor en ninguno de los consorcios de
hongos, que necesita ser investigado ms.

3.2. Ensayos enzimticos de los consorcios microbianos sintticos diseados que

contienen la comunidad microbiana celuloltica

Los consorcios microbianos con alta actividad enzimtica lignoceluloltica, como el

consorcio MCHCA, pueden establecerse combinando muchas cepas con alta actividad
enzimtica lignoceluloltica (Poszytek et al., 2016). Pero sin determinar las
interacciones microbianas dentro de un consorcio, sera difcil optimizar an ms los
consorcios microbianos (en trminos de nmero, concentracin y reemplazo de cepas).
Normalmente, se requiere un gran nmero de experimentos que implican varias
combinaciones de microorganismos para confirmar tales interacciones positivas;
Adems, se requieren ms experimentos cuando se incluyen ms cepas. Teniendo en
cuenta tanto la ventaja de la riqueza microbiana como la desventaja de que se requiere
un gran nmero de experimentos, se introdujo una comunidad microbiana celuloltica
filtrada como un miembro de los consorcios microbianos en este estudio para aumentar
el nmero de especies microbianas con una cantidad mnima aadida Experimentos. La
adicin de la comunidad microbiana celuloltica a una concentracin baja de inculo no
slo enriqueci el nmero de especies microbianas en los consorcios sintticos, sino
que tambin mantuvo la mayor proporcin de las cepas de hongos en los consorcios
sintticos iniciales. Esto fue favorable para encontrar aquellas interacciones
microbianas causadas principalmente por una o mltiples cepas aisladas dentro de la
comunidad microbiana examinada. En nuestro laboratorio se utiliz un mtodo similar
para disear un consorcio sinttico con alta capacidad de fijacin de CO2 y se
obtuvieron buenos resultados (Hu et al., 2016). Si este mtodo tambin pudiera
utilizarse para disear un consorcio microbiano sinrgico con un alto rendimiento de
enzimas lignocelulolticas, podra constituir un mtodo universal para el cribado de
cepas con interacciones microbianas. Utilizando los cuatro hongos y la comunidad
microbiana celuloltica, se dise una serie de consorcios microbianos sinrgicos de
creciente diversidad y complejidad para identificar consorcios microbianos con altas
actividades enzimticas, en particular actividad alta de pNPGasa. Estos experimentos
se llevaron a cabo al mismo tiempo que los de la Fig. 1 para mantener la consistencia
de la concentracin de inculo y el estado de los microorganismos inoculados y dio
como resultado una mejor estabilidad,
Y la diferenciacin entre los consorcios. Las actividades enzimticas lignocelulolticas de estos
consorcios microbianos se muestran en la Fig. 2. Las actividades de Fpase, CMCasa y xilanasa de
la comunidad microbiana celuloltica (Fig. 2) fueron similares a las de A. tubingensis (Fig. 1),
mientras que la actividad de pNPGasa de la comunidad microbiana celuloltica fue mayor que la de
P. decumbens. Las actividades de pNPGase de los consorcios microbianos con la comunidad
microbiana celuloltica en cada nodo de tiempo (Fig. 2) fueron mayormente mayores que las de los
consorcios microbianos sin la comunidad microbiana celuloltica (Figura 1). La actividad pNPGasa
ms alta de la comunidad microbiana celuloltica fue aproximadamente 197% y 5% ms alta que la
de T. reesei y P. decumbens, respectivamente. De este modo, se utiliz la actividad de pNPGasa
de la comunidad microbiana celuloltica como base para evaluar la actividad de pNPGasa de los
consorcios microbianos. Se puede observar en la fig. 2, que las actividades de pNPGase ms
elevadas de la comunidad (comunidad microbiana celular) -decumbens, community-reese-
tubingensis (CRT), community-decumbens-niger, community-decumbens-tubingensis y community-
decumbens-niger-tubingensis (CDNT ) Fueron aproximadamente el 6%, 9%, 77%, 64% y 126%
ms alto que el de la comunidad microbiana celuloltica, respectivamente. Las actividades de
pNPGase de CDNT a 4 d y 6 d (pNPGasa 18.45 a 4 d, 37,49 a 6 d) eran aproximadamente 25% y
2% superiores a la suma de las actividades tericas de pNPGasa de los componentes microbianos
(pNPGasa 9,61 + 3,91 + 0,85 + 0,41 a 4 d, 16,61 + 15,85 + 2,35 + 1,92 a 6 d),
respectivamente.
Por otra parte, los consorcios microbianos sin T. reesei, incluyendo comunidad-
decumbens, comunidad-tubrculos, y comunidad-tubrculos-niger, y CDNT, exhibieron
Fpase, CMCase, Y las actividades de xilanasa en niveles bajos (Fig. 2). Un anlisis de
correlacin de los datos de la Fig. 2 se utiliz para determinar los papeles y pesos de
los miembros microbianos de los consorcios con la comunidad microbiana celuloltica.
Los resultados mostraron que la adicin de T. reesei mejor las actividades enzimticas
de Fase (correlacin de Spearman = 0,866, P <0,001), CMCasa (correlacin de
Spearman = 0,860, P <0,001) y xilanasa (correlacin de Spearman = 0,866 , P
<0,001). La adicin de P. decumbens mejor las actividades enzimticas de Fpase
(correlacin de Spearman = 0.195, P = 0.029), CMCase (correlacin de Spearman =
0.244, P = 0.008) y pNPGase (correlacin de Spearman = 0.245, P = 0.008). A. niger y
A. tubingensis no tuvieron efectos significativos en las actividades de las cuatro
enzimas (P fueron todas superiores a 0,05). Estos resultados indicaron que T. reesei
todava puede ser un buen miembro de consorcios microbianos con diversidad y
complejidad cada vez mayor, lo que promueve las actividades de la Fase, CMCasa y
xilanasa de los consorcios microbianos a niveles altos, en comparacin con los otros
tres hongos.
Los resultados anteriores indicaron que T. reesei podra usarse para construir muchos
tipos de consorcios microbianos con altas actividades de Fase, CMCasa y xilanasa. La
comunidad microbiana celuloltica

fig. 2. Mapa trmico de las actividades enzimticas lignocelulolticas de los consorcios

microbianos compuestos por los cuatro hongos y la comunidad microbiana celuloltica.
C, R, D, N y T son la comunidad microbiana celuloltica, T. reesei, P. decumbens, A.
niger y A. tubingensis, respectivamente.

Podra utilizarse para mejorar la actividad de la pNPGasa, que complementa a T. reesei.

Community-reesei (CR) fue la combinacin ms simple con estos dos componentes.
Adems, la actividad de la pNPGasa de la CRT fue mayor que la de la comunidad
microbiana celuloltica, mientras que la actividad de la Fpasa de la RT fue mayor que la
suma de las actividades tericas de la Fpase de los componentes microbianos. Por lo
tanto, CRT tambin puede ser una buena combinacin. La adicin de la comunidad
microbiana celuloltica disminuy significativamente la actividad de la Fase de los
consorcios microbianos. Si las interacciones microbianas negativas entre la comunidad
microbiana celuloltica y los hongos que disminuyen la actividad de la Fase pudieran
reducirse, ayudara a optimizar an ms las actividades de todas las enzimas de los
consorcios microbianos.

3.3. Las cepas cruciales de los consorcios microbianos sintticos con alta actividad de pNPGasa
Las cepas en CRT que respondieron positivamente a la adicin de T. reesei y A. tubingensis debe
ser determinada porque estas cepas pueden tener interacciones con T. reesei o A. tubingensis que
pueden ser cruciales para mejorar an ms la actividad enzimtica lignoceluloltica de los
consorcios. Por lo tanto, para determinar y optimizar las cepas funcionales de los consorcios
microbianos sintticos, se utiliz secuenciacin de alto rendimiento para estudiar la estructura de la
comunidad microbiana de los consorcios microbianos sintticos. La comunidad microbiana
celuloltica fue considerada como la estructura inicial de la comunidad microbiana. Y las estructuras
de la comunidad microbiana de los consorcios de microbios sintticos se dividieron en una parte
bacteriana y una parte de hongos, que se analizaron sobre la base de los genes 16S rRNA
bacteriana y fngica 18S rRNA genes, respectivamente. Los ndices de Shannon de las partes
fngicas CR de 0 a 6 d (incluyendo 0, 2, 4 y 6 d) fueron 0,24, 0,38, 0,48 y 0,39, respectivamente.
los Los ndices de Shannon de las partes de hongos de CRT de 0 a 6 d fueron 0,24, 0,79, 0,96 y
0,15, respectivamente. Los ndices de Shannon de las partes bacterianas CR de 0 a 6 d fueron
respectivamente 4,28, 4,78, 4,65 y 4,72. Los ndices de Shannon de las partes bacterianas de CRT
de 0 a 6 d fueron 4,28, 4,35, 4,37 y 5,01, respectivamente. Estos resultados indicaron que la
biodiversidad de las partes fngicas y bacterianas de CR y CRT aument significativamente
despus del cultivo en comparacin con la estructura inicial de la comunidad microbiana. En
segundo lugar, las biodiver- sidades de las partes bacterianas de CR y CRT eran mucho ms ricas
que aquellas De las partes fngicas. Esto indic que la adicin de las cepas de hongos puede
estimular el crecimiento de algunas cepas en la comunidad microbiana celuloltica y el nmero de
cepas bacterianas afectadas puede ser mucho ms que las cepas de hongos afectados. Un
anlisis de correlacin de los datos de la Fig. 2 se utiliz para determinar la relacin entre las
biodiversidades y las actividades de las enzimas lignocelulolticas de los consorcios. Los resultados
mostraron que la biodiversidad de la parte bacteriana CRT se correlacion positivamente con su
actividad Fase, actividad CMCasa, actividad pNPGasa y actividad xilanasa (las correlaciones de
Spearman fueron todas iguales a 1.000, los valores de P fueron todos inferiores a 0.01). Y no hubo
correlacin entre la biodiversidad de la parte de hongos CRT y las actividades de sus cuatro
enzimas (P valores fueron todos iguales a 0,333). Esto indica que la biodiversidad de la parte
bacteriana CRT fue ms importante para la actividad enzimtica lignoceluloltica en comparacin
con la biodiversidad de su parte fngica. Se puede observar en la fig. 3 que la parte fngica de los
consorcios incluy siete gneros fngicos y algunas cepas no cultivadas.
Higo. 3. Anlisis del mapa trmico basado en las distribuciones de los gneros fngicos y en la
abundancia de los consorcios.

La estructura inicial de la comunidad microbiana consisti en aproximadamente 96% de

Trichoderma y 4% de Aspergillus, con las proporciones de otros gneros fngicos a niveles de
traza (menos del 1%). Aspergillus en CR respondi positivamente a la adicin de T. reesei y su
proporcin aument a 10% a 4 d. Esto sugiere que puede haber interacciones positivas entre
Aspergillus y Trichoderma. Muchos estudios han reportado que existen interacciones entre
Aspergillus y Tri- choderma, como la que existe entre Trichoderma reesei y Aspergilus
saccharolyticus, Aspergillus carbonarius o Aspergillus niger (Kolasa et al., 2014) y entre
Trichoderma viride y Aspergillus niger (Chen et al., 2015), que son favorables a la produccin de
enzimas celulolticas. Adems, la proporcin de Spraguea en CR aument bruscamente a 5% a 6
d, que tambin puede ser causada por una interaccin entre Spraguea y Trichoderma. Esto es
digno de estudio adicional. Las investigaciones actuales sobre Spraguea se centraron
principalmente en microsporidios (Colmenero et al., 2015). La proporcin de Trichoderma en CRT
disminuy durante el cultivo, mientras que la de Aspergillus aument continuamente. Como se
mencion anteriormente, hubo una correlacin positiva entre la actividad enzimtica Trichoderma y
Fpase de los consorcios, por lo que una disminucin de la proporcin de Trichoderma puede
conducir a una disminucin de la tasa de aumento de la actividad de la enzima Fase.

Las cepas de las partes bacterianas con una biodiversidad ms rica que las partes fngicas
pueden jugar un papel ms importante en las interacciones entre microorganismos. Se puede
observar en la fig. 4 que las proporciones de Bacillus, Enterococcus y Lactococcus en la estructura
inicial de la comunidad microbiana eran todas altas en aproximadamente el 20%, mientras que
otras cepas eran menos del 5%. Aunque las proporciones de Bacilus, Enterococcus y Lactococcus
en CR y CRT cambiaron durante el cultivo, todas se mantuvieron en niveles altos (alrededor del
10% -20%). Ha habido muchos estudios sobre la produccin de enzimas lignocelulolticas por
Bacillus (Khelil et al., 2016), Enterococcus (Liang et al., 2015) y Lactococcus (Erlandson et al.,
2001). Acinetobacter y Pseu- domonas en CR respondieron positivamente a Trichoderma, y sus
proporciones aumentaron de 1% a 14% (a 6 d) y de 0,4% a 10% (a 6 d), respectivamente. Adems
de las cepas anteriores, las proporciones de Anabaena y Bacteroides en CRT aumentaron de 0,2%
a 4% (a 2 d) y de 0,1% a 2% (a 2 d), respectivamente. Tambin se han realizado estudios sobre la
produccin de enzimas lignocelulolticas por Acinetobacter (Selvam et al., 2014), Anabaena (Gupta
et al., 2012), Bacteroides (Xu y col., 2004), y Pseudomonas (Menendez et al., 2015). Adems, las
cepas en CR y CRT con proporciones de 1% -4% incluyeron Afipia, Alkaliphilus, Burkholderia,
Erwinia, Geobacillus, Ralstonia, Rho- danobacter, Sediminibacterium y Streptococcus
254 J. Hu et al. / Bioresource Technology 227 (2017) 247-255

En resumen, un gnero fngico y 16 gneros bacterianos en CR y CRT respondieron

positivamente a la adicin de Trichoderma o Aspergillus, y entre estos puede haber
interacciones que favorezcan la produccin de enzimas lignocelulolticas. Estas cepas
son miembros potenciales de un consorcio microbiano sinrgico ideado que contiene
Trichoderma y Aspergillus para la produccin de enzimas lignocelulolticas.
Las cepas que podran coexistir con Trichoderma y ser usadas para establecer
consorcios celulolticos podran ser rastreadas eficientemente a travs de la
secuenciacin de alto rendimiento. A continuacin, los consorcios celulolticos
sintticos podran ser escalados en una forma escalable tra- table aadiendo otros
miembros apropiados. Adems, las especies con alta produccin de enzimas
lignocelulolticas en el gnero elegido podran mejorar an ms los rendimientos de las
enzimas lignocelulolticas de los consorcios. La limitacin de los miembros de los
consorcios ayuda a regular la estructura de la comunidad microbiana ya eliminar las
cepas con efectos negativos sobre la produccin de enzimas lignocelulolticas en la
comunidad microbiana celuloltica. Y podra mejorar la actividad de la Fase y otras
enzimas sobre la base del mantenimiento de la presente actividad de la pNPGasa.
El mtodo de combinar mltiples cepas solas con una comunidad microbiana
seleccionada, y luego seleccionar posibles cepas de la comunidad microbiana
examinada que pueden tener interacciones con las cepas solas, fue eficaz para
detectar interacciones microbianas positivas. Adems, este mtodo podra aplicarse
universalmente cuando se buscan diversas interacciones microbianas

4. Conclusiones Los consorcios sintticos fueron ms eficaces en la produccin de enzimas

lignocelulolticas que las cepas nicas debido a interacciones microbianas positivas. Los resultados
mostraron que T. reesei es un buen miembro de consorcios sintticos, ya que puede promover las
actividades enzimticas de los consorcios a niveles altos. La adicin de la comunidad microbiana
celuloltica que contena numerosas cepas a una concentracin inocua baja estimul las
interacciones microbianas dentro de los consorcios sintticos. Las cepas de la comunidad
microbiana celuloltica que respondieron positivamente a la adicin de T. reesei y A. tubingensis
son miembros potenciales de un consorcio microbiano sinrgico ideado para producir enzimas
lignocelulolticas. Expresiones de gratitud Este trabajo fue apoyado por el Fondo Especial para la
Investigacin Agroscientifica en el Inters Pblico (NO 201503135-14); Proyectos de Investigacin
Cientfica del Comit de Ciencia y Tecnologa de Shanghai (N 14540500600 y N 16391902000);
Fundacin Nacional de Ciencias Naturales de China (N 21307093 y N 51408588); Fundacin de
Ciencias Naturales de Shanghai (NO. 16ZR1440000), y el Consejo de Subvenciones de
Investigacin de Hong Kong SAR, China (N 28300015 y N 18202116). Apndice A. Datos
complementarios Los datos complementarios asociados con este artculo se pueden encontrar, en
la versin en lnea, en http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2016.12. 058.

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