MMOIRES ORIGINAUX 595

Mise au point de microtests

phosphatase alcaline et peroxydase
pour le contrle de la pasteurisation du lait de vache
par
D. MONGET et P. LAVIOLETTE
Laboratoire de Biologie - 406
Institut National des Sciences Appliques
69621Villeurbanne cedex

INTRODUCTION

L'tude des enzymes dans le secteur laitier s'est dveloppe avec

l'introduction de la pasteurisation qui ncessite la mise en uvre de
mthodes rapides et fiables pour distinguer un lait cru d'un lait
chauff. Il est en effet indispensable de vrifier si la temprature de
pasteurisation a t correctement respecte et ventuellement si du
lait cru n'a pas t ajout du lait pasteuris la suite d'une erreur
de manipulation ou d'un incident technique.
Parmi les enzymes que contient le lait, la peroxydase (Pien, 1945),
et la phosphatase alcaline (Hansen et al., 1953 ; Jacquet et Villette,
1954 ; Alais, 1975 ; Linden et Ged, 1976) ont t les plus tudies et
sont utilises depuis plus de 30 ans pour le contrle de la pasteurisa-
tion. En effet, si la peroxydase est un peu moins thermolabile que la
phosphatase alcaline, leur dnaturation par la chaleur exige des condi-
tions de dure et temprature qui encadrent troitement celles que
requiert la pasteurisation. Tout lait pasteuris correctement doit
avoir une phosphatase alcaline ngative ..
En France, les normes officielles de pasteurisation sont les sui-
vantes:
- pour la pasteurisation : 63 C pendant 30 mn (pasteurisa-
tion basse), ou 95 C instantanment. En fait dans la pratique, une
temprature intermdiaire est utilise, gnralement au moins 80 C
pendant quelques secondes (pasteurisation haute). Une telle pasteu-
risation doit dtruire totalement la peroxydase ;
- pour la pasteurisation employe pour obtenir un lait dit de
haute qualit : 72 C 75 C pendant 15 s.
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Bien que peu rpandu, ce dernier mode de pasteurisation moins

pousse, associ un contrle bactriologique trs strict (30 000 ger-
mes/ml au maximum), a l'avantage de prserver les qualits organo-
lep tiques et la majeure partie des lments nutritifs du lait, tout en
assurant la destruction quasi-totale des micro-organismes pathognes
qu'il peut renfermer.
Par arrt du 2 juin 1955, les mthodes officielles de dosage sont:
- pour la phosphatase alcaline, la mthode de Sanders et Sager
(1947) dont le principe est la mesure colorimtrique du phnol libr
par l'enzyme partir du phnylphosphate ;
- pour la peroxydase, la mthode de Dupouy (voir Pien, 1945),
dont le principe est la mesure colorimtrique de l'oxydation chimique
du gaacol sous l'action de l'oxygne libr par l'enzyme partir de
l'eau oxygne.
Devant l'importance de ces deux enzymes dans le domaine laitier,
nous nous sommes proposs de miniaturiser partir du dispositif API
ZYM (Monget, 1975), une mthode de dosage pour chacune d'elles,
qui demande une mise en uvre la plus simple possible pour l'utilisa-
teur. Pour juger de l'efficacit de ces deux microtests, nous compare-
rons leur sensibilit celle des mthodes officielles, en les prouvant
sur:
des chantillons de laits de vache:
cru;
pasteuris des degrs divers
UHT;
des mlanges de laits de vache cru et pasteuris.

MATERIEL ET METHODES

1. Ralisation des tests API ZYM Phosphatase alcaline et

Peroxydase
Phos phatase alcaline
Principe : la phosphatase alcaline hydrolyse la phnolphtaline
monophosphate et libre dans le milieu la phnol phtaline qui vire
de l'incolore au rose lorsque le pH est suprieur 10.
On prpare un tampon carbonate-bicarbonate 0,3 M pH 10,5 en
dissolvant dans 1 1 d'eau:
25,81 g de carbonate de sodium;
4,83 g de bicarbonate de sodium
- 113 mg de phnolphtaline monophosphate sont alors dis-
sous dans 100 ml du tampon prcdent et 40 /kl de cette solution,
soit 100 nanomoles de substrat, sont inoculs dans des cupules API
ZYM.
 MMOIRES ORIGINAUX 597

Remarque: la molarit leve du tampon est ncessaire pour

maintenir un pH suprieur 10 dans la cupule. Sans cette prcaution,
le lait qui possde un fort pouvoir tampon acide abaisse le pH au-
dessous de 10 et empche la mise en vidence colorimtrique directe
de l'enzyme.
Peroxydase (Monget, 1978)
Principe: en prsence de peroxydase et d'eau oxygenee, l'O-toli-
dine se transforme en un produit d'oxydation fortement color en
bleu:
- 71,2 mg de dichlorhydrate d'O-tolidine et 1 g de polyvinyl-
pyrrolidone, utilis comme agent dispersant et mouillant, sont dis-
sous dans 100 ml de tampon acide citrique / citrate de sodium 0,1 M,
pH 4,0. L'inoculation des cupules est ralise avec 40ftl de cette solu-
tion, soit 100 nanomoles d'O-tolidine.
Les tests Phosphatase alcaline et Peroxydase sont schs
37 C pendant 4 h l'obscurit, puis conservs dans un rcipient
opaque la lumire, temprature ambiante et sous dshydratant.
Pour faciliter leur utilisation, nous avons associ les deux micro-
tests au sein de bandelettes dtachables deux cupules, regroupes
par vingt-cinq sur une mme galerie.

2. Pratique des tests

Phosphatase alcaline Peroxydase

une goutte HzOz dilue

(60ul d'HzOz 30V/100 ml HzO)

deux gouttes de lait

t
une goutte de lait

t
incubation 30mn ou plus
t
incubation 1 15mn

t
coloration rose
~
apparition rapide d'une coloration
en prsence de l'enzyme bleue si la raction est positive

Remarques:
- les tests sont gnralement effectus temprature ambiante.
La raction de la peroxydase est particulirement instable au-del
de 30 C - 32 C ;
598 LE LAIT / NOVEMBRE-DCEMBRE 1978/ N 579-580

0.0 610nm

0,5

10 20 JO 4
"'9 de phenol 1iber

fig. 1

Courbe d'talonnage pour la recherche de la phosphatase alcaline

par la mthode de Sanders et Sager (1947).

- il est important de respecter la quantit d'eau oxygne ajou-

te dans le test peroxydase , Pour des concentrations trop leves,
l'enzyme est inhibe;
- si le test ({ phosphatase alcaline doit se prolonger au-del
de 1 h, prvoir une bote d'incubation faisant office de chambre
humide.

RESULTATS

Nous avons essentiellement compar la sensibilit des deux micro-

tests que nous proposons pour le contrle de la pasteurisation celle
des mthodes officielles. .
La figure 1 reprsente la courbe d'talonnage du dosage de la phos-
phatase alcaline par la mthode de Sanders et Sager (1947).
L'preuve la peroxydase par la mthode de Dupouy fournit seu-
lement une estimation semi-quantitative de l'activit de l'enzyme.

1. Influence du chauffage
Le tableau 1 regroupe l'ensemble des rsultats que nous avons
obtenus partir :
- de lait cru ;
 TABLEAU 1
Etude compare de la recherche de la phosphata se alcaline et de la peroxydase de laits de vache crus et pasteuriss,
par les mthodes officielles et les microtests API ZYM

Phosphatase alcaline Peroxydase

Mthode de Microtest Mthode de Microtest

Sanders et Sager API ZYM Dupouy API ZYM

Lait cru (dix chantillons) > 40 (1) +++++ (2) +++++ (3) +++++ (3)

60 C >40 +++++ +++++ +++++

62 C >40 +++++ +++++ +++++
64 C >40 +++++ +++++ +++++
66 C >40 +++ +++++ +++++
68 C
0
24,8 ++ +++++ +++++
Lait pasteuris 20 s 70 C 5,7 t (+2 h) +++++ +++++
72 C 2,1 0 +++++ +++++
WC 1,9 0 +++ +++++
76 C 1,7 0 ++ +++++
78 C 1,5 0 + +++
80 C
0
<1 0 0 +
82 C <1 0 0 0

Lait pasteuris du commerce (cinq chantillons) <1 0 0 0

Lait D.H.T. (trois chantillons) <1 0 0 0

(1) Enug de phnol libr / 0,5 ml de lait en 1 h 37C.

(2) Note de 0 + + + + -i- , selon l'intensit de la coloration, aprs une incubation de 1 h temprature ambiante.
t = trace (0 < t < -i-).
(3) Note de 0 + + + + -t-, selon l'intensit de la coloration, ap rs une incubation de 10 mn temprature ambiante.
600 LE LAIT / NOVEMBRE-DCEMBRE 1978 / N 579-580

- de lait cru que nous avons chauff entre 60 C et 82 C au

bain-marie pendant 20 s dans un tube capillaire en verre trs fin
(diamtre intrieur 2 mm, paisseur de la paroi 0,2 mm), dfaut
d'avoir pu disposer d'un pasteurisateur exprimental ;
- de laits du commerce pasteuriss (pasteurisation haute) et
V.H.T.
Ce tableau indique clairement la diffrence de thermolabilit
entre la phosphatase alcaline et la peroxydase: aprs un chauffage de
20 s la premire enzyme est dnature vers 70 C et la seconde vers
80 C.
Selon les normes, on considre qu'un lait est bien pasteuris lors-
que la quantit de phnol libr par la phosphatase alcaline dans la
mthode de Sanders et Sager (1947) ne dpasse pas 2fLg pour 0,5 ml
de lait. Ainsi dans le cas prsent, en utilisant un tube capillaire, la
pasteurisation est correcte, pour un temps de chauffage de 20 s, si la
temprature est au moins gale 72 C.
La zone de temprature 72 C - 75 C, pour un temps de chauffage
de 20 s, correspond une pasteurisation dite de haute qualit
pour laquelle la phosphatase alcaline est dtruite (quantit de phnol
libr infrieure 2fLg/0,5ml de lait), alors que la peroxydase demeure
active.
La pasteurisation industrielle la plus couramment effectue (pas-
teurisation haute) dnature la peroxydase et a fortiori la phosphatase
alcaline. Ce rsultat est obtenu exprimentalement en chauffant le lait
au-del de 81 C pendant 20 s.
Ainsi, en raison des proprits thermolabiles diffrentes de ces
deux enzymes, il est trs facile de distinguer les deux types de pasteu-
risation :

Phosphatase alcaline Peroxydase

Pasteurisation classique dtruite dtruite

Pasteurisation de haute qualit dtruite active

Pour l'preuve la phosphatase alcaline, la mthode API ZYM

(1 h d'incubation, temprature ambiante) et celle de Sanders et Sager
(1947) ont une sensibilit voisine. Bien que le seuil minimal de dtec-
tion de l'enzyme (70 C pendant 20 s) soit sans aucun doute plus facile
dterminer au moyen d'un photomtre que visuellement, nos rsul-
tats montrent qu'un cart de 1 C en de de celui-ci est parfaitement
 MMOIRES ORIGINAUX 601

reprable l'aide du microtest API ZYM et donc qu'il est possible

d'estimer sans risque d'erreur le seuil de 70 C au degr prs. Ce
dernier peut tre apprci sans difficult lorsque le microtest est
pratiqu en 2 h. Cette dure correspond au temps total ncessaire pour
doser la phosphatase alcaline par la mthode de Sanders et Sager
(1947).
Le dosage de la peroxydase apparat un peu plus sensible avec
le microtest API ZYM que par la mthode de Dupouy, puisque pour
un chauffage de 20 s, les seuils de dtection de l'enzyme se situent res-
pectivement 80 C et 78 C.

2. Adjonction de lait cru du lait pasteuris haute temprature

Nous avons effectu diffrents mlanges de lait cru et de lait
pasteuris du commerce, dans le but de rechercher la concentration
minimale dtectable de lait cru qui peut tre ajoute accidentellement
du lait dj trait par la chaleur (tab. 2).
Il ressort qu'avec les microtests API ZYM, tout comme avec les
mthodes officielles, l'preuve la phosphatase alcaline est mieux
adapte que celle de la peroxydase pour la mise en vidence de
mlanges faibles taux de lait cru.
La mthode API ZYM pour la recherche de la phosphatase alca-
line (incubation 1 h temprature ambiante) apparat un peu moins
sensible que celle de Sanders et Sager (1947), les seuils de dtection
tant respectivement de 1 p. 100 et de 0,5 p. 100. Les rsultats devien-
nent par contre comparables si l'incubation du microtest est ralise
37 C. Notons qu'en prolongeant la dure de la raction enzyma-
tique, on amliore nettement les performances de celui-ci, puisqu'aprs
une nuit d'incubation (16 h) temprature ambiante, on peut dtec-
ter jusqu' 0,1 p. 100 d'apport de lait cru dans le lait pasteuris.
Alors que le seuil de 5 p. 100 est parfaitement lisible avec le test
API ZYM Peroxydase . 10 p. 100 constitue la limite de positivit
de la mthode de Dupouy. Ce rsultat confirme que le test API ZYM
est plus sensible que la technique officielle.

DISCUSSION ET CONCLUSIONS

L'utilisation de techniques lourdes et dlicates mettre en uvre

constitue l'heure actuelle un gros handicap pour l'industrie laitire,
alors que les contrles systmatiques deviennent de plus en plus nom-
breux. Nous prendrons comme seul exemple l'preuve de la phospha-
tase alcaline par la mthode officielle de Sanders et Sager (1947).
Bien que pratique en routine dans tous les laboratoires, elle n'en
reste pas moins une mthode laborieuse, qui demande la prparation
de six ractifs au minimum et surtout un grand nombre de manipula-
 TABLEAU 2
Sensibilit de la recherche de la phosphatase alcaline et de la peroxydase dans le lait de vache,
en cas d'adjonction par accident de lait cru dans du lait pasteuris du commerce (pasteurisation haute)

Phosphatase alcaline 1
Peroxydase

Mthode de Microtest API ZYM

Mthode de Microtest
Sanders et Sager
Dupouy API ZYM
Ih 16 h

Lait pasteuris du commerce (tmoin) o (1) 0(2) 0(2) 0(3) 0(3)

Lait cru (tmoin) >40 +++++ +++++ +++++ +++++

Lait pasteuris + 10p. 100lait cru > 40 +++ +++++ + ++
Lait pasteuris + 5 p. 100lait cru > 40 ++ ++++ 0 +
Lait pasteuris + 2 p. 100lait cru 27,2 +(+ + 37 C) +++ 0 0

Lait pasteuris + 1 p. 100lait cru 12,0 t (+ 37 C) ++ 0 0

Lait pasteuris + 0,5p. 100lait cru 5,4 o (t 37 C) + 0 0

Lait pasteuris + 0,2p. 100lait cru 1,2 0 + 0 0

Lait pasteuris + 0,1p. 100lait cru < 1 0 t 0 0

1

(1) Enug de phnol libr / 0,5 ml de lait, en 1 h 37C.

(2) Note de 0 + + + + +, selon l'intensit de la coloration. t = trace (0 t < <
1) (incubation temprature ambiante).
(3) Note de 0 + + + + +, selon l'intensit de la coloration, aprs une incubation de 10 mn temprature ambiante.
 MMOIRES ORIGINAUX 603

tions s'chelonnant sur une dure de 2 h. Aschaffenburg et Mullen

(1949) ont propos de simplifier la mthode par l'emploi du parani-
trophnylphosphate comme substrat.
Pour la recherche et le dosage des enzymes, Jacquet et al. (1975)
sont persuads que la mthode API ZYM, condition de ne retenir
que les caractres les plus intressants, doit rendre de nombreux ser-
vices dans le domaine laitier, en raison prcisment de sa simplicit
d'utilisation. La surveillance de la pasteurisation du lait, examen effec-
tu en grande srie dans les laboratoires spcialiss, devrait tre une
des applications les plus immdiates de la micromthode. C'est pour-
quoi, nous avons slectionn et adapt les tests phosphatase alca-
line et peroxydase ", utiliss pour ce type de contrle. De par leur
conception, le nombre d'oprations la charge de l'utilisateur se
limite l'addition de lait et d'eau oxygne dilue. Il est difficile
d'imaginer mthode plus simple.
Pour l'preuve de la phosphatase alcaline, le choix de la phnol-
phtaline monophosphate comme substrat nous a paru s'imposer.
D'une part, la phnolphtaline, rose en milieu alcalin, est beaucoup
plus visualisable que le paranitrophnol, color en jaune ; d'autre
part, l'utilisation du 2-naphtylphosphate ncessite l'emploi de deux
ractifs, dont le Fast Blue BB pour rvler le 2-naphtol libr par
l'enzyme.
Notre tude comparative a montr qu'il existe une bonne concor-
dance entre les deux microtests phosphatase alcaline et per-
oxydase que nous avons mis au point et les mthodes officielles
de dosage de ces deux enzymes. Pour le contrle de la pasteurisation,
les caractres API ZYM offrent une sensibilit voisine de celle des
techniques classiques. Dans un tube capillaire, il est videmment
impossible de reproduire le traitement physique auquel est soumis
le lait au cours de la pasteurisation industrielle. Aussi, l'utilisation
d'un bain-marie peut-elle tre sujette critique. La dnaturation de
la phosphatase alcaline 72 C montre cependant qu'une incubation
de 20 s, telle que nous la pratiquons, se rapproche des conditions de
la pasteurisation de haute qualit , On peut estimer que quelques
secondes suffisent pour que la temprature du lait l'intrieur du
tube capillaire s'quilibre avec celle du bain-marie.
La contamination de lait chauff haute temprature par du lait
cru est un accident qui se produit de temps autre dans les laiteries
la suite d'une fuite dans un pasteurisateur. Le test API ZYM phos-
phatase alcaline et la mthode de Sanders et Sager (1947) ne per-
mettent pas de mettre en vidence moins de 0,5 p. 100 d'apport de lait
cru, aprs 1 h d'incubation en prsence du substrat. Avec la mthode
d'Aschaffenburg et Mullen (1949) ce seuil est de 1 p. 100 5 p. 100 dans
les mmes conditions. Par contre, lorsque cela s'avre ncessaire, il
est possible d'augmenter la sensibilit du test API ZYM sans modi-
fier le protocole opratoire, en prolongeant simplement la dure de
la raction enzymatique. Le seuil de 0,1 p. 100 peut ainsi tre atteint
604 LE LAIT / NOVEMBRE-DCEMBRE 1978 / N 579-580

en 16 h d'incubation, alors que d'aprs Ainas (1975), il est de 0,2 p. 100

en 24 h par la mthode de diffusion en glose et de 0,3 p. 100 par celle
de Aschaffenburg et Mullen (1949). Une longue incubation ne constitue
pas forcment un inconvnient majeur, dans la mesure o elle peut
tre ralise la nuit.
Outre la simplicit, la rapidit et la sensibilit qu'offre le dispo-
sitif mis au point, nous nous devons de signaler galement deux avan-
tages non ngligeables: son utilisation ne ncessite aucun quipement
de laboratoire et supprime le problme du recyclage de la verrerie,
notamment lors de l'preuve la phosphatase alcaline. Ainsi, toutes
les conditions sont runies pour que ce kit prt l'emploi trouve
facilement une place sur le march aux cts des mthodes tradi-
tionnelles.

Rsum

Deux microtests colorimtriques, simples et rapides, ont t mis

au point pour la recherche de la phosphatase alcaline et de la peroxy-
dase dans le lait de vache, en utilisant respectivement comme substrats
chromognes la phnolphtaline monophosphate et l'O-tolidine.
Ces tests prsentent une sensibilit comparable celle des mtho-
des officielles, aussi bien pour le contrle de la pasteurisation que
pour la dtection de lait cru ajout du lait pasteuris.

Summary

PHOSPHATA SE ALCALlNE AND PEROXYDASE MICROTESTS FOR THE CONTROL

OF PASTEURIZATION OF COW MILK

Two simple, quick and reliable colorimetrie microtests were

fitted to check alcaline phosphata se and peroxydase in cow milk, with
respectively the phenolphtalein monophosphate and the O-tolidine
as chromogenic substrates.
These tests allow a sensitiveness similar to the other official
methods used either for the control of pasteurization or for the
detection of raw milk added to the pasteurized one.

Remerciements

Nous tenons remercier M. AUCLAIR, Directeur de la Station de Techno-

logie laitire (l.N.R.A.) de Jouy-en-Josas, qui a bien voulu procder des essais
de notre matriel et relire notre manuscrit.
Nous remercions galement M. GELIN, Conseiller Scientifique et Technique
du Groupe SCOFF, qui nous a procur tous les documents permettant la
comparaison des rsultats de notre mthode avec les mthodes officielles.

Reu pour publication en juillet 1978.

 MMOIRES ORIGINAUX 605

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