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Curso de

Biologa Celular e Histologa Mdica

Tcnicas de Procesamiento

Dr. Miguel Lecuona Rodrguez


Departamento de Biologa Celular y Tisular
Facultad de Medicina, UNAM
2014
Qu es la Tcnica Histolgica?

Son una serie de pasos fsicos y qumicos


para obtener una muestra susceptible de
ser analizada al microscopio
Clulas NO procesadas
Se observan en microscopio de contraste de
fases o de campo oscuro:

Clulas de la sangre
Clulas de descamacin
Clulas Procesadas
Tcnica histolgica ordinaria
Tcnica de corte por congelacin
Tcnicas de tincin selectiva
Tcnicas de histoqumica enzimtica
Tcnicas de inmunomarcaje
Otras Tcnicas (Investigacin)
Tcnicas para microscopia electrnica
Tcnica de impregnacin metlica o
argntica
Ultracentrifugacin diferencial
Cultivo de clulas o tejidos
Tcnica Histolgica Ordinaria
1. Obtencin de la muestra
2. Fijacin
3. Deshidratacin
4. Aclaracin o diafanizacin
5. Infiltracin
6. Inclusin
7. Corte
8. Desparafinizacin
9. Rehidratacin
10. Tincin
11. Deshidratacin
12. Aclaracin
13. Montaje
Obtencin de la muestra
Ser vivo: biopsia
Circunstancias o condiciones:
De rutina
Transoperatoria

Cantidad de tejido que se toma de la lesin:


Insicional: un fragmento de la lesin
Excisional: toda la lesin, pudiendo tener fin teraputico

Procedimientos:
Corte
Raspado: de sistemas epiteliales citologia exfoliativa (cervico-vaginal citobrush o
abatelenguas)
Legrado
Puncin
Aspiracin con aguja fina (BAAF)
Aspiracin con aguja gruesa (Tru-cut)
Endoscopia

Cadver: necropsia
FIJACIN
Conservacin de la estructura, evitar
cambios postmortem, como la autolisis, la
putrefaccin o la proliferacin

Qumica: desnaturaliza protenas


proteolticas, estabiliza membranas, inactiva
enzimas (autolisis), antispticos (evita
proliferacin de microorganismos)

Fsica: congelacin
FIJACIN
Los fijadores mas usados son:

Formol (formaldehdo) al 10%: endurece el tejido y tiene


capacidad de penetracin al espacio intracelular, buen poder
fijador; se usa de 12 a 24 horas (ideal); se utiliza un volumen
de 1 a 20 veces el tamao de la muestra.

Glutaraldehido, tetraxido de osmio (para ME)

Alcohol Etlico al 50% o 70%

Mezclas fijadoras; spray: formol-fosfato

Otros: Bouin, Zenker, Sanboni


Deshidratacin
Es gradual para evitar la refraccin
Se utiliza etanol o alcohol etlico al 30%,
50%, 70% y 100%
Aclaramiento o diafanizacin
Se utiliza como ayudante para observar
con mayor calidad los compartimientos
celulares

Se utilizan solventes como: Xilol, Toluol o


Cloroformo (Agentes Aclarantes)

Se dan 2 baos al menos


Infiltracin

Se da en parafina lquida o celoidina


INCLUSIN
Solubles en agua: gelatina, carbowax,
metacrilato de glicol

Solventes orgnicos: parafina, celoidina


CORTE
Se utiliza el micrtomo

Van de 4 a 8 micras por lo general

Se va generando un listn de cortes

Se colocan en una bandeja en bao Mara


con gelatina o albmina

Se separan y se colocan en portaobjetos


Desparafinizacin

Se realiza con Xilol (Agente aclarante)


Rehidratacin

De forma gradual, con agua


TINCIN
Se utiliza para dar contaste a la muestra

Monocrmica (1 colorante) Azul de toluidina

Bicrmica (2 colorantes) H-E ncleo azul-


morado, el resto rosa-naranja

Tricrmica (3 colorantes) Masson: ncleo-


azul oscuro, citoplasma-rojo, colgena-azul,
msculo- rojo;
TINCIN

Hematoxilina: azul-morado, base


(basofilia). Ncleos (cido y basofilo)

Eosina: rosa-naranja, cido (acidofilia)


citoplasma (bsico y acidofilo)
TINCIN
Ortocromasia: se respeta el color del
colorante

Metacromasia: cambio del color original del


colorante (tonalidades) Vg. Azul de Toluidina

Pancromasia: mezcla de varias colorantes


neutros, da como resultado varios colores y
tonalidades Vg. Wright y Giemsa
Deshidratacin

Se saca el agua propia de los colorantes


con alcohol
Aclaracin

Se da un bao en Agente Aclarante para


aumentar la transparencia de la muestra
MONTAJE

Se coloca un cubreobjetos a la muestra


junto con Resina Sinttica o Blsamo de
Canad, como pegamento formando una
capa transparente y adhesiva.
TCNICA DE CORTE POR
CONGELACIN
Usos: en procesamiento de biopsias
transoperatorias
Obtencin: biopsia transoperatoria
Fijacin: por congelacin
Corte: criostato (micrtomo en gabinete refrigerado
a una temp. de -20 C en el interior)
Tincin: HE
Tiempo estimado: 10 minutos
La preparacin solo se puede observar al momento
Otros usos: pruebas de histoqumica enzimtica,
evitando el uso de AA polares como xilol.
TCNICAS DE TINCIN SELECTIVA
Se tien determinados componentes celulares con colorantes especficos:

Para lpidos:
Sudan III y IV: rojos o naranjas
Sudan negro: negro
Rojo oleoso: rojo
cido osmico (tetraoxido de osmio): negro

Para glucgeno y glucoprotenas:


cido perydico de Schiff (PAS); Rojo-magenta para glucgeno, Rojo para glucoprotenas
Carmn de Best: glucogeno

Para DNA sin RNA


Tcnica de Feulgen: rojo ( el RNA no reacciona)

Bensley y Cains: para mitocondrias

Dafano (sales de plata): para aparato de Golgi

Wilder (argentica): para fibras reticulares: caf a negro

Reyes (rojo), Orceina (amarillo), Verhoeff (caf): para fibras elsticas


HISTOQUMICA ENZIMTICA

Detecta un grupo de enzimas especficas


(la misma enzima)
Se va a observar en forma de precipitado
denominado MARCA
Enzima + sustrato = producto(s) +
revelador = MARCA
INMUNOMARCAJE

Se utilizan anticuerpos, se identifican molculas altamente


especficas

Inmunoflorescencia
se utiliza un compuesto fluorescente
muestra fluorescentes los anticuerpos a los cuales se les
pega el antigeno
Puede ser directa: 1 antgeno por 1 anticuerpo
Puede ser indirecta: 1 antgeno por varios anticuerpos

Inmunohistoqumica
se utiliza para marcar enzimas
Joaqun Carrillo Farga
Joaqun Carrillo Farga
Joaqun Carrillo Farga
Joaqun Carrillo Farga
Joaqun Carrillo Farga
Pnfigo vulgar
IHQ indirecta
IHQ negativa
IHQ positiva
CASO CLNICO
Mujer de 58 aos
Lesin difusa en mama derecha que infiltra piel y
complejo arola pezn
Receptores de estrgeno y progesterona
Her2-neu
DIAGNSTICO

Carcinoma ductal infiltrante:


RE y RP (+)
Her-2 Neu (+)
TCNICA PARA MET
Mismos pasos que la tcnica ordinaria:
Diferencias:

Fijacin; en vez de formaldehdo se utiliza glutaraldehido

Infiltracin; en vez de parafina se utilizan resinas plsticas


(epxicas) Vg. EPON y Araldita

Corte: va de 60 a 100 nanometros, se utiliza un ultramicrtomo


cuyas cuchillas son de vidrio o diamante

Se utilizan rejillas de cobre en lugar de portaobjetos


No se quita la resina

Para el contrastado se utilizan sales de metales pesados como el


acetato de plomo y el acetato de Uranilo
IMPREGNACIONES METLICAS O
ARGNTICAS
En lugar de usar tincin de color, se
utilizan sales de Oro y Plata (tonos de
caf a negro)
Se utilizan para procesar muestras de:
tejido nervioso (se tien bien las diferentes
clulas gliales)
La metenamina de plata permite marcar o
teir laminas basales al igual que PAS
ULTRACENTRIFUGACIN DIFERENCIAL
Se utiliza para separar organelos

Despus de la centrifugacin se obtiene un sedimento y un


sobrenadante

Ejemplo:
1. A la primera centrifugacin quedan: en sedimento clulas
completas y en el sobrenadante mitocondrias y otros
organelos

2. Al repetir el proceso en el sedimento quedan los ncleos y


en el sobrenadante los dems organelos

3. Al repetir el proceso en el sedimento quedan mitocondrias


y en el sobrenadante ribosomas
CULTIVO DE CLULAS Y/O TEJIDOS
El procedimiento general es el siguiente:
Obtencin de clulas
Separacin de clulas (si es que no estn separadas)
Se colocan en cajas con medio de cultivo (lquidos a semi-lquidos,
tienen nutrientes y son distintos a los de las bacterias)
Se introducen en incubadores de cultivo, manteniendo temperaturas
de 37C aprox.
Se da un intercambio gaseoso 02-CO2

En buenos cultivos las clulas se pueden reproducir (se resiembran)


Esta tcnica se usa en investigacin mas que en clnica
En cultivo de tejidos las clulas deben organizarse para formar el tejido
(Ingeniera de cultivo de tejidos); las cepas de HELA, es la que se ha
adaptado mejor a las condiciones de cultivo, estas vienen del tumor de
una mujer desde finales de 1950.