Jurnal kromatografi A, 1208 (2008) 189-196

Pemurnian protein
Afinitas partisi protein tagged dengan
mengikat Kolin modul dalam sistem dua fase
larutan
2008 Elsevier BV Semua Hak, milik.
Afinitas kromatografi
Poli (ethylene glycol)
Beatriz Maestro Isabel Velasco b Isabel Castillejo Miguel Kolin-mengikat modul
Ekstraksi cair-cair
Arvalo-Rodrguez b ,
ngel Cebolla b Jess M. Sanz ,
Instituto de Biologa molekul y Celular, Universidad Miguel
Hernndez, Avda. Universidad s/n, 03202 Elche (Alicante),
Spanyol b Biomedal SL, Avda. 5E Amrico Vespucio. 1cita
M12, Sevilla, Spanyol 41092

2. 1. Pendahuluan
r t saya c l e i o n f bstrct

Sejarah artikel: Protein

Kami hadir novel prosedur untuk partisi afinitas pemisahan
rekombinan dan
protein pemurnian
yang mewakili
menyatu untuk modulbioteknologi
cholinebindingperistiwa
C-LytA dalam
Menerima 7 Agustus 2008 sistem dua fase larutan yang mengandungpenting
poly(ethylene glycol) (PEG). Protein
perlu dipertanyakan, taggeddalam
akuntansi denganbeberapa
modul C-LytA
kasusdan terkena
untuk 50-
Diterima 25 Agustus 2008 sistem dua fasa kuantitatif terlokalisasi pada
90%tahap
dariPEG-kaya, sedangkan
biaya total produksipenambahan
di industriberikutnya alami
tingkat [1]. ligan Kolin
Afinitas khusus
adsorpsi pada
Tersedia online 3 September 2008 bergeser lokalisasi mereka ke tahap PEG-miskin olehsolid
perpindahan polimermerupakan
dari situs-situs pengikatan. Dijelaskan prosedur
dukungan kromatografi prosedur yang biasa digunakan
sederhana, terukur dan direproduksi, dan telah berhasil diterapkan untuk pemurnian
untuk pemisahan polipeptida rekombinan, tagged, baik ditujukan terhadap
Kata kunci:
pemurnian atau bioreaktor setup [2-4]. Namun, kebutuhan untuk persiapan
Sistem dua fase larutan
empat protein beragam, sehingga imbal hasil tinggi dan kemurnian. resin dan daur ulang, dan lain aspek negatif dan masalah seperti kolom
menjatuhkan atau perubahan dalam stabilitas dan parameter enzimatik
protein adsorbed, telah memupuk mencari prosedur alternatif. Dalam
 pengertian ini, berair dua fasa sistem (ATPSs) telah berhasil digunakan
dalam pemurnian banyak protein dari bunga [5,6], dan mungkin dapat
dilaksanakan dalam proses industri hilir [7]. ATPSs terbentuk ketika dua
polimer solusi atau polimer dan garam, dicampur pada konsentrasi yang
lebih tinggi dari nilai yang kritis, sehingga mereka memisahkan menjadi
dua fase keseimbangan. Paling sering digunakan ATPSs melibatkan
pencampuran polietilen glikol (PEG) atau terkait polimer seperti
thermoseparating etilen-oksida-propilena-oksida copolymer [8,9] dengan
garam dextran atau fosfat. Sistem ini memberikan keuntungan menarik
baik untuk laboratorium dan industri
Corresponding penulis. Tel.: + 34 966658460; Faks: + 34 966658758. Alamat
e-mail: jmsanz@umh.es (J.M. Sanz).
0021-9673 / $ Lihat depan masalah 2008 Elsevier BV Semua Hak, milik.
doi: 10.1016 /j.chroma. 2008.08.106
proses. Mereka biaya-efektif, mudah untuk skala [10] dan cocok untuk terus
beroperasi [11]. Banyak variabel dapat dimanipulasi untuk memperbaiki
partisi, dan kompatibilitas dengan deterjen memungkinkan
thepurificationofmembraneproteins[12]. Selain itu, akan Proline dibagi pada
ATPSs yang terkena ringan fisik kimia kondisi sebagai fase kedua terdiri
dari air (70-90%) dan interfacial ketegangan antara mereka sangat rendah [13],
menguntungkan massa transfer reaksi enzim. Namun, penggunaan ATPSs
untuk pemurnian protein secara rutin, baik pada tingkat industri atau
laboratorium telah terhambat oleh prediktabilitas umumnya miskin koefisien
partisi protein apapun diberikan di ATP tertentu, sebagai hasil parameter ini
dari interaksi kompleks sifat makromolekul seperti berat molekul, komposisi
asam amino, hydrophobicityandelectrostaticforces[13-16]. Severalapproaches
mengambil keuntungan dari afinitas untuk ligan tertentu untuk langsung
lokalisasi protein menarik tahap tertentu [17]. Pada banyak kesempatan,
penggunaan translational fusions sebagai tag polipeptida yang berbeda, seperti
triptofan dan urutan tirosin-kaya, hidrofobik [18], Poli-histidine ekor [19] atau
kombinasi dari kedua [20] diperlukan. Namun, sistem partisi ini
disempurnakan afinitas tidak bebas dari kerugian, seperti ekspresi penurunan
protein dan kelarutan, atau kebutuhan untuk derivatisasi dari PASAK [17].
Modul C-LytA milik keluarga domain Kolin mengikat (Pfam ID kode
PF01473: http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/Pfam/ getacc? PF01473). C-LytA
merupakan bagian C-terminal amidase LytA dari Streptococcus pneumoniae
dan bertanggung jawab untuk lampiran dari enzim ini Kolin residu pada
permukaan dinding sel [21]. C-LytA polipeptida adalah protein ulangi asam
135 amino, dibangun dari enam dilestarikan - jepit rambut yang
mengkonfigurasi Kolin mengikat empat situs [22]. Setiap situs Kolin mengikat
dibentuk oleh dua aromatik residu dari satu jepit rambut dan satu lagi dari
berikutnya, dengan kontribusi dari jaringan tepi hidrofobik tambahan. Ligan
terikat oleh hidrofobik dan kation- interaksi, yang secara signifikan
meningkatkan stabilitas protein [23,24]. Afinitas C-LytA Kolin dan Kolin
analog struktural [25,26] memungkinkan untuk digunakan sebagai sebuah tag
afinitas untuk satu langkah pemurnian hibrida protein dinyatakan dalam
Escherichia coli, oleh adsorpsi tertentu untuk sederhana yang mengandung
amina resin kromatografi seperti DEAE-selulosa, diikuti oleh tertentu elution
dengan Kolin [27-32]. Untuk itu kami memutuskan untuk memeriksa apakah
C-LytA tag mungkin juga dipekerjakan di afinitas partisi di ATPSs yang
mengandung PASAK. Di sini kita menunjukkan bahwa C-LytA dapat
mengikat PEG molekul dalam situs mengikat Kolin, yang dapat digunakan
untuk mengumpulkan C-LytA dan protein C-LytA-tagged pada tahap PASAK,
sedangkan penambahan Kolin membalikkan ini interaksi dan mengarahkan
protein ke tahap PEG-miskin. Ini memungkinkan penyucian empat protein
yang beragam dan menunjukkan bahwa cholinebinding polipeptida Tag dapat
digunakan dalam sistem mudah termodulasi untuk partisi diprediksi dan
mudah pemurnian rekombinan protein pada ATPSs. 2. eksperimental
2.1. bahan
PEG8000, dextran DxT500, dan Kolin klorida yang dibeli dari Sigma (St
Louis, MO, USA).
2.2. bakteri strain dan plasmid
Escherichia coli strain REG-1 dan REG-21 yang disediakan oleh
Biomedal (Seville, Spanyol). Pembangunan plasmid vektor diwakili dalam
gambar 1. Plasmid pALEX2-Ca-GFP (coding untuk protein GFP-C-LytA)
ini dibangun oleh penyisipan pasangan basis 718 (bp) SphI -Stusaya
fragmen yang mengandung urutan pengkodean GFP dari pJBA111 [33]
antara SphI dan SmaI situs komersial vektor pALEX2-CA (Biomedal).
PALEXb-Lip36 konstruksi (protein C-LytA-Lip36), BamHI-HindIII bp
959 fragmen p36 KEKURANGAN gen infantum Pertamina menambahkan
[34] disisipkan antara BamHI dan HindIII situs komersial vektor pALEXc
(Biomedal). Pembangunan pALEX2c-LacZ (LYTAG-Galactosidase),
fragmen 3116 bp BamHI-HindIII lacZ E. coli gen pengkodean -
galactosidase disisipkan antara BamHI dan HindIII situs komersial vektor C-LytA protein dimurnikan oleh afinitas kromatografi dari strain E.
pALEX2c (Biomedal). Akhirnya, konstruksi pALEXb-ProtA (C-LytA- coli overproducing RB791 tambatan plasmid pCE17 [21]. Bahan-bahan
ProtA), 433 bp polimerase produk reaksi berantai (PCR) pengkodean dua yang dioptimalkan dan protokol yang terkandung dalam ekspresi Protein
salinan Staphylococcus aureus protein IgG afinitas domain Z diperkuat C-LYTAG dan sistem pemurnian (Biomedal)
dengan primers MAO55 (Forward): 5
-CGCGGATCCGAAAACCGCGGCTCTTGCGC-3 MAO56 (Reverse): 5
-CGCGGATCCTCAGGTTGACTTCCCCGCGGAGTTCGCGTC-3, dicerna
dengan BamHI dan kloning di situs BamHI komersial vektor pALEXb
(Biomedal).

2.3. protein ekspresi

Gambar 1. Plasmid diagram. Semua frame terbuka membaca kloning terkendali promotor Pm dan menyatu dalam bingkai dengan modul C-LytA, atau versi berkurang dan meningkatkan LYTAG
(pALEX2c-LacZ).
digunakan. Untuk menghapus Kolin terikat, protein murni yang kemudian
diterapkan ke kolom desalting HiTrap (1,6 cm2,5 cm) (GE Healthcare) di
20 citaC equilibrated dalam buffer natrium fosfat 20 mM, pH 7.0, ditambah
50 mM NaCl, dan disimpan di 80 citaC. Protein konsentrasi bertekad
spectrophotometrically seperti sebelumnya dijelaskan [21] menggunakan
koefisien penyerapan molar di 280nm 62,540 M1 cm1.
GFP-C-LytA protein dimurnikan oleh afinitas kromatografi dari strain
E. coli overproducing REG-21 tambatan plasmid pALEX2-Ca-GFP,
mengikuti petunjuk yang digambarkan dalam ekspresi Protein C-LYTAG
dan sistem pemurnian (Biomedal).
Untuk pemurnian fusions C-LytA di ATPSs, 5 ml budaya semalam REG
Escherichia coli -1 pALEX2-CaGFP, pALEXb-Lip36, pALEX2c-LacZ
atau pALEXb-ProtA plasmid yang mengandung tumbuh di 37 citaC dan
kemudian diencerkan 100 kali lipat dalam 500 ml LB menengah (10 g/l
tryptone, ekstrak ragi 5 g/l, 10 g/l NaCl) mengandung 100 g/l ampicillin.
Budaya yang berkembang di 37 citaC untuk kepadatan optik di 600nm dari
tentang 0,8-1.0, ketika ekspresi gen diinduksi dengan 2 mM salisilat dan
diinkubasi bermalam di 20 citaC. sel dipanen oleh sentrifugasi di 4 citaC
(5000 g, 10 min) dan resuspended dalam 30 ml pH fosfat kalium 8.0,
ditambah 10 mM MgCl2 dan DNAseI (50U/ml). Suspensi sel disahkan
melalui pers Perancis dan kemudian disentrifugasi 15min 10.000 g.
Pemurnian lebih lanjut digambarkan dalam teks.
2.4. protein karakterisasi
Konsentrasi protein ditentukan dengan menggunakan Bio-Rad Protein
Assay (Bio-Rad, Mnchen, Jerman). Prosedur ini digunakan untuk sampel
diencerkan ekstrak dan protein murni, seperti kami menemukan bahwa
kecil jumlah PASAK dan dextran interferred dengan prosedur kuantisasi
biasa protein baik oleh absorbansi UV atau colorimetry. Di sisi lain,
konsentrasi GFP-C-LytA di setiap langkah dari pemurnian khusus diukur 3.
oleh fluoresensi di spectrofluorimeter (SFM 25, Kontron instrumen,
Zurich, Swiss) dengan eksitasi dan wavelengths Pollution 475nm dan
515nm, masing-masing. Kekosongan yang disiapkan dengan menggunakan
semua komponen kecuali protein. Kurva kalibrasi yang berhubungan
fluoresensi intensitas dengan konsentrasi protein dibuat menggunakan
GFP-C-LytA sebelumnya disucikan oleh afinitas kromatografi (lihat atas).
Semua tahap protein pemurnian diikuti oleh polyacrylamide
Elektroforesis hadapan natrium lauryl sulfat (SDS-HALAMAN) [35]. Gel
yang diwarnai dengan EZBlue (Sigma). Sejak PASAK dan DxT500 yang
ditemukan untuk menghasilkan jalur sangat menyimpang, sampel yang
kadang-kadang diencerkan 100 kali lipat mengurangi beban polimer dan
gel yang menggunakan Gel kode perak SNAP noda KitII (Pierce,
Rockford, IL, USA) bernoda perak.
2.5. dichroism melingkar
Edaran dichroism (CD) percobaan dilakukan di J-815
spectropolarimeter (JASCO, Tokyo, Jepang) dilengkapi dengan sistem
Peltier PTC-423S. Panjang gelombang isotermal spektrum yang diperoleh
pada kecepatan pemindaian 50nmmin1 dengan waktu respon 2s dan rata-
rata selama setidaknya 6 scan 20 citaC. Protein konsentrasi adalah 6.3 M
dan cuvette jalan-panjang adalah 1 mm atau mm 2. buffer 20 mM natrium
fosfat (pH 6,0-8,0), 20 mM natrium asetat (pH 3.5-5.5) atau glisin 20 mM
(pH 2.5 3.0) , plus thecorrespondingadditionsineachcase.
Sampleswerecentrifuged 5 menit sebelum CD mengukur. Ellipticities ([])
dinyatakan dalam satuan (degcm2 dmol1),
usingtheresidueconcentrationofproteinbefore sentrifugasi. Untuk CD-
dipantau pemindaian suhu denaturasi percobaan sampel berlapis dengan
minyak mineral untuk menghindari penguapan, dan tingkat Penghangat
Ruangan adalah cita60 Ch1.
2.6. kegiatan tes
-Galactosidase aktivitas diukur menggunakan o- nitrophenyl-d-
galactopiranoside (ONPG) seperti yang dijelaskan oleh Miller [36]. Unit
aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah yang menghasilkan 1nmol o-
nitrofenol per menit di 28 citaC dan pH 7.0.
3. hasil dan diskusi
PEG adalah komponen yang mana-mana di paling ditandai ATPSs [5,37].
Di sisi lain, Kolin mengikat empat situs C-LytA berisi terkena pelarut tirosin
dan triptofan residu [22] yang mungkin mengakomodasi PEG molekul seperti
yang dijelaskan untuk mengikat asetilkolin situs serupa Torpedo
acetylcholinesterase [38]. Protein ini, situs mengikat kation (dibentuk oleh
wajah sisi-rantai aromatik) diduduki oleh kelompok-kelompok2 CH inhibitor,
mendirikan CH- interaksi yang mirip kation- interaksi yang dibuat oleh Kolin
yang tidak asetilkolin. Itu harus menunjukkan situs C-LytA mengikat Kolin
yang juga dibentuk oleh kelompok aromatik sisi-rantai, jadi interaksi yang
serupa dengan

Fig. 2. Analisis stabilitas C-LytA oleh jauh-UV CD. (A) gelombang spektrum direkam di
20citaC di pH 7.0 (diisi simbol) dan pH 5.0 (terbuka simbol) dalam ketiadaan aditif (lingkaran),
hadapan 10% PASAK (segitiga) atau di hadapan Kolin 140 mM (kotak); (B) pH titrasi dipantau dilokalisasi di bagian bawah, garam-kaya fase (Fig. 3B) dan rasio GFP-tagged
oleh CD 223nm dalam ketiadaan aditif (diisi lingkaran), hadapan 10% PASAK (terbuka
lingkaran) atau di hadapan Kolin 150 mM (diisi kotak); (C) termal stabilitas C-LytA dipantau
protein (khusus diukur oleh fluoresensi) protein total konten (diukur oleh
oleh CD dalam ketiadaan aditif (), dalam kehadiran 10% PEG 10% () dan di depan mata Kolin protein standar kuantisasi prosedur) adalah dekat dengan 1 (tabel 1).
150 mM (X). Sebaliknya, distribusi yang lebih seragam GFP diamati ketika sebuah kontrol
PEG dalam kasus yang terakhir mungkin. Oleh karena itu, kami memutuskan eksperimen dilaksanakan dengan ditandai protein (tabel 1). Hasil ini jelas
untuk memeriksa interaksi mungkin C-LytA dengan PASAK oleh CD. Seperti menunjukkan bahwa modul C-LytA mengarahkan partisi fusion GFP-CLytA
yang ditunjukkan dalam gambar 2A, penambahan 10% PEG disebabkan ke tahap PEG kaya dalam mode hampir kuantitatif, meningkat secara
perubahan moderat dalam spektrum CD C-LytA pada pH 7.0, mirip dengan substansial yang terus-menerus partisi (K). Partisi ini digunakan
yang disebabkan oleh Kolin. Selain itu, ellipticity C-LytA menampilkan alsoveryefficientevenwhenhighlyconcentratedcellextractswere (gambar 4).
minimal di sekitar pH 5 (Fig. 2A dan B), mungkin akibat protein agregasi
Meskipun, seperti disebutkan, protein GFP-C-LytA sangat murni pada
dekat titik isoelektrik dihitung (5.4). Namun demikian, agregasi ini dicegah
tahap ini, kami memutuskan untuk mengeksplorasi kondisi yang mengarah ke
baik oleh Kolin dan PASAK, yang dipulihkan spektrum CD asli (Fig. 2A dan
adalah
B). Selain itu, sementara unligated C-LytA mengalami denaturasi termal dua
langkah karena akumulasi lipat menengah [24] (Fig. 2C), selain Kolin atau
PEG diinduksi transisi satu langkah karena untuk destabilization dari
menengah, meskipun stabilisasi panas yang disebabkan oleh ligan alami jelas
lebih tinggi. Diambil bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa PEG
mungkin meniru, sampai batas tertentu, peran Kolin dan menduduki situs-situs
pengikatan yang sama. Ini mungkin juga menjelaskan temuan kami
sebelumnya yang pemurnian C-LytA di DEAEcellulose equilibrated dengan
10% PEG dicapai dengan hanya 10% efisiensi berkaitan dengan ketiadaan
senyawa, karena kebanyakan dari protein yang terkandung pada awalnya
dalam ekstrak hilang dalam aliran-melalui.
Mengingat interaksi C-LytA-PASAK, partisi preferensial CLytA di fase
PEG ATP berdasarkan polimer ini bisa diantisipasi. Untuk memeriksa
hipotesis ini kami bekerja hijau protein berpendar (GFP) menyatu untuk C-
LytA karena lokalisasi protein hibrida ini (GFP-C-LytA) dapat dengan mudah
dipantau dan diukur oleh fluoresensi. Protein ini C-LytA yang tidak berada di
posisi C-terminal, seperti orangtua protein LytA seluruh [21]. Ekstrak sel
disusun seperti yang dijelaskan dalam bagian 2.3. Dibersihkan supernatant
(1.4 mg/ml total protein) Huguang dibagi pada campuran PEG/garam yang
terdiri dari 15% PEG-8000 dan 12.5% dipotassium hydrogenphosphate (PEG
fosfat sistem) diperoleh dengan menambahkan jumlah yang sesuai dari setiap
komponen padat untuk ekstrak. Setelah solubilization semua komponen
dengan lembut tapi menyeluruh mencampur, sistem dua fase larutan
dihasilkan oleh sentrifugasi (5 menit di 10.000 g). Berdasarkan pemisahan
dua fase, akumulasi kuat GFP-C-LytA terdeteksi pada tahap atas, PEG-kaya
(Fig. 3A). Koefisien partisi di ATP dihitung dengan mengukur fluoresensi GFP
yang tidak dalam setiap fase (tabel 1). Selain itu, protein fusi sudah lebih dari
90% murni pada tahap ini, seperti kebanyakan dari ekstrak protein yang
Fig. 3. Pemurnian dari GFP-C-LytA di PEG/fosfat dari E. coli REG-1 [pALEX2-Ca-GFP]. (A)
foto-foto yang diambil selama pemurnian. (B) analisis 100-fold diencerkan sampel sebesar 12%
SDS-HALAMAN dan perak noda.
Gambar 4. Efek ekstrak konsentrasi pada sifat-sifat partisi GFP-C-LytA
di PEG fosfat. (A) 0,45 mg/ml; (B) 0,9 mg/ml; (C) 1.9 mg/ml; (D) 4.0 mg
/ ml. sampel yang diterangi dengan cahaya UV untuk menginduksi GFP
fluoresensi.

lokalisasi dalam fasa kaya garam untuk mencapai tingkat

yang lebih tinggi kemurnian. Dalam model interaksi C-
LytA-PEG diusulkan, Kolin harus bersaing dengan PASAK
untuk mengikat C-LytA, mengganggu C-LytA-PEG
interaksi dan karenanya partisi pola GFPC-LytA, dan
memungkinkan pemulihan protein fusion oleh "elution"
dari fase PEG kaya. Untuk lebih lanjut menguji
kemungkinan ini, tahap atas yang mengandung GFPC-LytA
dengan hati-hati dihapus dan ditempatkan dalam tabung
segar. Volume yang sama "mencuci" larutan yang
mengandung 1% PASAK, 16% k-fosfat (komposisi yang
mirip dengan dibuang bawah fase [1,13]) ditambahkan dan
dicampur dengan pembalikan tabung beberapa kali, diikuti
oleh sentrifugasi 5 min 10.000 g, tanpa rilis yang
signifikan dari protein GFP-C-LytA dari PEG-kaya tahap
selama proses ini (Fig. 3A dan B. dan tabel 1). Fase PEG
kaya atas lagi dihapus dan ditempatkan dalam tabung baru.
Akhirnya, volume yang sama dari larutan yang
mengandung 1% PASAK, 16% k-fosfat dan 300mM Kolin
ditambahkan, dicampur dan disentrifugasi. Ini
menyebabkan perubahan dalam koefisien partisi
polipeptida, mengakibatkan elution parsial fusi protein ke
bawah, fase garam kaya oleh perpindahan Peg C-LytA yang
tidak oleh Kolin dan yang selesai setelah ekstraksi kedua
(Fig. 3A dan B, dan tabel 1). Total hasil adalah 23.2mg per
liter budaya (A600 = 1.0), sesuai dengan lebih dari 80% dari
protein yang terkandung dalam homogenate awal, dan
dengan faktor penyucian 4 dekat. Hasil ini lebih baik
daripada yang diperoleh dengan menggunakan
kromatografi padat di DEAE-selulosa di laboratorium kami
(sekitar 15mg per liter, 52% hasil, faktor penyucian diri
sama).
Hasil yang menjanjikan dengan GFP-C-LytA
mendorong kami untuk mengatur skema umum untuk
pemurnian protein (gambar 5) yang kemudian diuji untuk
pemurnian fusions lainnya. Pertama, kami berusaha pemurnian perpaduan C-
LytA untuk antigen p36 KEKURANGAN dari Pertamina menambahkan
(protein C-LytA-Lip36) [34]. Namun, dalam kasus ini, kami mengamati
presipitasi protein rekombinan mungkin karena kekuatan ionik relatif tinggi
disediakan oleh fase fosfat. Seperti ini mungkin terjadi untuk protein lain, kita
mencoba alternatif prosedur menggunakan ATP terdiri dari 6% PEG plus
dextran 6% (DxT500) (PEG dextran sistem) 20mM Tris pH 8,0. Penggunaan
Tris daripada fosfat meningkat pemisahan fase secara signifikan dalam hal ini.
Pencucian dilakukan dengan solusi yang mengandung 0.5% PEG + 16%
DxT500, dan elution akhir dilakukan dengan larutan yang mengandung 0.5%
PEG + 16% DxT500 dan 300mM
Gambar 5. Umum prosedur untuk pemurnian C-LytA
menyatu protein oleh PEG-fosfat atau ATPSs PEG-dextran.
Kolin. Seperti yang ditunjukkan pada gambar 6, protein C-LytA-Lip36 bisa
mudah disucikan, menunjukkan bahwa sifat dari fase bawah bukanlah penentu
dalam hukum properti partisi fusions C-LytA. Hasil itu biasanya 3-5mg per
liter budaya. Untuk lebih mendefinisikan pemulihan protein C-LytA-Lip36, 5
mg dimurnikan C-LytA-Lip36 yang berduri ke 50 ml ekstrak selular E. coli
REG-1 (1. 5 mg/ml total protein) dan mengalami partisi di PEG/dextran ATP
seperti dijelaskan di atas. Pemulihan setelah elutions dua adalah 3.1 + 1.1 =
4.2 mg, yaitu. 84% dari total protein berduri, mirip dengan kasus GFP-C-LytA
(tabel 1).
Selanjutnya, kami berusaha pemurnian berukuran tinggi, tetrameric protein
seperti - galactosidase. Di sini, kita digunakan sebagai tag mutan ditingkatkan
dari C-LytA (LYTAG), yang Diperoleh dari 32-amino asam
Nterminaldeletionthatdoesnotaffectitscholine-bindingproperties [24]
sementara meningkatkan kelarutan nya. Meskipun sistem PEG fosfat dan
PASAK dextran diperbolehkan pemurnian protein LYTAG-galactosidase,
solubilities terbaik diperoleh dengan kedua (GB. 7). Gel SDS-HALAMAN
yang agak terdistorsi karena ukuran tinggi LYTAG - galactosidase (tetramer
dari sekitar 525kDa) dikomplekskan dengan PASAK, yang mempengaruhi
mobilitas electrophoretical normal sampel, tapi kemurnian persiapan jelas
dalam setiap kasus. Tabel 2 menggambarkan karakteristik langkah berikutnya
pemurnian dalam sistem PEG dextran. Sekitar 70% protein dinyatakan bisa
disucikan, dengan aktivitas tertentu pada substrat chromophoric kecil (ONPG)
271-288U/g yang di dekat perjanjian yang dihitung sebelumnya untuk DEAE-
selulosa dimurnikan protein (300U/g) [27]. Hal ini penting bahwa dalam hal
ini modul Kolin mengikat terletak di bagian N-terminal protein fusion,
menampilkan lokalisasi tag tidak relevan untuk menentukan sifat partisi.
Akhirnya, kami menguji sifat partisi C-LytA hibrida dengan polipeptida
Bioteknologi yang menghasilkan relevan seperti protein A dari
Staphylococcus aureus [39]. Protein ini biasanya digunakan sebagai metode
yang dapat diandalkan untuk mendeteksi/memurnikan total IgG dari campuran
protein kasar. Gambar 8 menunjukkan bahwa fusion C-LytA-ProtA dapat
efisien dipartisi dan dimurnikan PEG fosfat dan PASAK dextran sistem.
Kemurnian persiapan dinilai oleh Densitometri SDS-HALAMAN gel,
menghasilkan 91% dan nilai-nilai 94% untuk elution pertama dan kedua di
PEG/fosfat, masing-masing (Panel A), dan 91% di PEG/dextran (Panel B)
hasil akhir dihitung sebagai 80mg per liter budaya (A600 = 3.7). Demikian pula
untuk fusion C-LytA-Lip36, kami diukur pemulihan C-LytAProtA oleh
spiking 10mg dari protein murni ke 50ml seluler E. coli REG-1 ekstrak (1. 5
mg/ml total protein). Setelah dua elutions dengan Kolin, pemulihan di
PEG/fosfat (7.9 mg, 79%) dan PEG/dextran (7.2 mg, 72%) adalah sangat
mirip dan menunjukkan hasil yang tinggi dalam kedua kasus.
 Tabel 2
Kuantisasi LYTAG--galactosidase dengan mengukur aktivitas enzim yang menggunakan
Gambar 6. Pemurnian dari C-LytA-Lip36 di PEG/dextran dari E. coli REG-1 [pALEXb- ONPG sebagai substrat, dan perhitungan faktor penyucian dan hasil
Lip36]. SDS-HALAMAN adalah Coomassie bernoda. (A) partisi C-LytA-Lip36 dalam
ketiadaan Kolin. (B) elution C-LytA-Lip36 oleh Kolin.
Gambar 7. Pemurnian LYTAG--galactosidase di PEG/dextran dari E. coli REG-1 [pALEX2c-
LacZ]. SDS-HALAMAN adalah patri Coomassie.

Pemurnian panggung Fase Volume (ml) [Protein] Protein Total (mg) Aktivitas (U/l)
(mg/ml)
Ekstrak N.A. c
30.0 1.3 39 95.2 2.3

Equilibration atas 20,5 0.6 12.3

101
 Menurunkan 8,0 1.0 8,0 < 1 tanpa tahun tanpa tahun N.A. N.A.

Pertama elution Lebih 9.0 9.5 0.3 2.8 4.2 93,3

Kedua elution rendah 0,45 116.8
Lebih
rendah
Hasil (dengan deviasi standar) yang rata-rata empat pengukuran independen.
Calculated sebagai
rasio aktivitas
enzim tertentu
dalam tahap
pemurnian
sehubungan dengan
ekstrak. b Dihitung
sebagai rasio dari
total aktivitas
enzim dalam tahap
pemurnian
sehubungan dengan
ekstrak. c N.A.:
Tidak berlaku. d
Tanpa tahun: Tidak
ditentukan. e Hasil
akumulasi (pertama
dan kedua elution)
= 29 + 41 = 70%.
Gambar 8. () Pemurnian dari C-LytA-ProtA di PEG fosfat. (B) pemurnian C-LytA-ProtA di
PEG dextran.

4. 4. kesimpulan

Kami telah mengembangkan sistem partisi dua fase larutan baru protein
yang berbasis di afinitas C-LytA Tag untuk PASAK dan Kolin. Aspek yang
 paling relevan dari teknologi ini adalah bahwa lokalisasi fusi C-LytA dapat
sangat dimodulasi dengan penambahan Kolin. Oleh karena itu, sebagai bukti-
of-konsep, kita telah menunjukkan pemurnian mudah empat C-LytA-tagged
rekombinan protein dalam ATPSs yang mengandung PEG setelah akumulasi
awal pada tahap PEG-kaya, diikuti oleh elution berikutnya ke tahap PEG-
miskin atas penambahan Kolin. Sistem ini sederhana, cepat, efektif dan
terukur, dan mungkin merupakan sebuah alternatif menarik untuk metode
pemurnian protein lain berbasis di solid-dukungan prosedur. Tampaknya
cukup fleksibel untuk berbagai sistem dua fasa yang mengandung PEG atau
polimer seperti PASAK dan, di atas semua, itu sangat dapat diprediksi,
acharacteristicusuallylackinginmostATPSsdescribedsofar.Other Bioteknologi
aplikasi yang dapat diramalkan, selain digunakan untuk pemurnian protein,
termasuk penggunaan C-LytA-tagged enzim untuk mengkatalisasi reaksi di
salah satu fase (pilihan kehendak, tergantung pada apakah Kolin ditambahkan)
sementara pulih produk yang lain , dengan demikian mengurangi biaya
bioseparation. Selain itu, penambahan Kolin akan memisahkan enzim dari fase
PEG setelah reaksi, membuat mungkin daur ulang polimer untuk ekstraksi
baru. Akhirnya, alat ini setuju untuk digunakan pada skala bangku untuk
pengujian dan set-up proses enzimatik ATPSs sebelum skala ke tingkat
industri.
5. Ucapan terima kasih
Kami berterima kasih S. Varo-Llamas untuk terampil teknis kontribusi
pada beberapa tahapan karya ini. Kami juga ingin mengucapkan terima kasih
kepada C. Fuster bantuan teknis yang sangat baik. Karya ini adalah sebagian
didanai oleh Spanyol Ministerio de kebudayaan dan pendidikan y Ciencia
(MEC) (hibah CIT010000-2005-32 dan COCOK-010000-2003-110).
6. Referensi
[1] M.T. Cunha M.J. Costa C.R. Calado, L.P. Fonseca, M.R. Aires-Barros, J.M. Cabral, J.
Biotechnol. 100 (2003) 55.
[2] M. Uhln, G. Ade, T. Moks, M. Hartmanis, B. Nilsson, skr r. Opin. Biotechnol.
3 (1992) 363.
[3] DS Waugh, tren Biotechnol. 23 (2005) 316.
[4] K. Susanto, M.N. Gupta, Biomol. Eng. 23 (2006) 59.
[5] M. Rito-Palomares, J. Chromatogr. B 807 (2004) 3.
[6] M.J. Sebastio, J.M.S. Cabral, M.R. Aires-Barros, enzim Microb. Technol. 18 (1996) 251.
[7] GM Zijlstra, C.D. Gooijer, J. Tramper, skr r. Opin. Biotechnol. 9 (1998) 171.
[8] J. Persson, A. Kaul, F. Tjerneld, J. Chromatogr. B 743 (2000) 115.
[9] I.F. Ferreira, A. Azevedo, P.A.J. Rosa, M.R. Aires-Barros, J. Chromatogr. 1195 (2008) 94.
[10] I.A. Sutherland, G. Audo, E. Bourton, F. Couillard, D. Fisher, I. Garrard, P. Hewitson, O.
Intes, J. Chromatogr. 1190 (2008) 57.
[11] A. Veide, T. Lindbck, S.-O. Enfors, enzim Microb. Technol. 6 (1984) 325.
[12] U. Sivars, F. Tjerneld, Biochim. Biophys. Acta 1474 (2000) 133.
[13] PA Albertsson, partisi sel partikel dan makromolekul, 3rd ed., Wiley, New York, 1986.
[14] BA Andrews, A.S. Schmidt, Asenjo ja, Biotechnol. Bioeng. 90 (2005) 380.
[15] J.C.Salgado,B.A.Andrews,M.F.Ortuzar,J.A.Asenjo,J.Chromatogr.A1178(2008) 134.
[16] G. Tubio, B. Nerli, G. Pic, J. Chromatogr. B 799 (2004) 293.
[17] Y. Xu, M.A. Souza, M.Z.R. Pontes, M. Vitolo, A. Pessoa Jr., Braz. Arch. Biol. Technol.
46 (2003) 741.
[18] S. Fexby, L. Blow, tren Biotechnol. 22 (2004) 511.
[19] G. Birkenmeier, MA Vijayalakshmi, T. Stigbrand, G. Kopperschlager, J. Chromatogr. 539
(1991) 267.
[20] F. Bernaudat, L. Blow, Protein Expr. Purif. 46 (2006) 438.
[21] J.M. Sanchez-Puelles, J.M. Sanz, Jl Garca, E. Garca, gen 89 (1990) 69.
[22] C. Fernndez-Tornero, R. Lpez, E. Garca, G. Gimnez-Gallego, A. Romero, Nat. Struct.
Biol. 8 (2001) 1020.
[23] P. Usobiaga, sungguhpun Medrano, M. Gasset, Jl Garca, Jl Saiz, G. Rivas, J. Laynez, M.
Menndez, J. Biol. Chem. 271 (1996) 6832.
[24] B. Maestro, J.M. Sanz, J. Biochem. 387 (2005) 479.
[25] J.M. Sanz, R. Lpez, Jl Garca, FEBS Lett. 232 (1988) 308.
[26] B. Maestro, A. Gonzlez, P. Garca, J.M. Sanz, FEBS J. 274 (2007) 364.
[27] J.M. Sanchez-Puelles, J.M. Sanz, Jl Garca, E. Garca, Eur. J. Biochem. 203 (1992) 153.
[28] S. Ortega, Jl Garca, M. Zazo, J. Varela, I. Munoz-Willery, P. Cuevas, G. GimnezGallego,
bioteknologi 10 (1992) 795.
[29] M.J. Ruz-Echevarra, G. Gimnez-Gallego, R. Sabariegos-Jareno, R. Diaz-Orejas, J. Mol.
Biol. 247 (1995) 568.
[30] B. Akerstrm, L. Lgdberg, T. Berggrd, P. Osmark, A. Lindqvist, Biochim. Biophys. Acta
1482 (2000) 172.
[31] J.Caubin,H.Martin,A.Roa,I.Cosano,M.Pozuelo,J.M.delaFuente,J.M.SnchezPuelles, M.
Molina, C. Nombela, Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 164.
[32] C. Moldes, Jl Garca, P. Garca, appl Environ. Microbiol. 70 (2004) 4642.
[33] J.B. Andersen, C. Sternberg, L.K. Poulsen, S.P. Bjorn, M. Givskov, S. Molin, appl Environ.
Microbiol. 64 (1998) 2240.
[34] G. Gonzalez-Aseguinolaza, S. Taladriz, A. Marquet, V. Larraga, Eur. J. Biochem.
259 (1999) 909.
[35] Inggris Raya Laemmli, alam 227 (1970) 680.
[36] J.H. Miller, eksperimen dalam genetika molekuler, Cold Spring Harbor laboratorium Press,
Cold Spring Harbor, NY, 1972.
[37] H.-O. Johansson, F.M. Magaldi, E. Feitosa, A. Pessoa Jr., J. Chromatogr. 1178 (2008) 143.
[38] G.Koellner,T.Steiner,C.B.Millard,I.Silman,J.L.Sussman,J.Mol.Biol.320(2002) 721.
[39] A. Forsgren, J. Sjquist, J. Immunol. 97 (1966) 822.