MICROBIOLOGA DEL SUELO

1.- INTRODUCCIN Y OBJETIVOS DE LA PRCTICA

Los microorganismos se encuentran ampliamente distribuidos en la biosfera como

consecuencia de su fcil diseminacin y de su versatilidad trfica.

El suelo, constituido por sustancias minerales y compuestos orgnicos, alberga una

gran diversidad de comunidades microbianas. Estos microorganismos contribuyen en
gran manera a la fertilidad del suelo, soportando el crecimiento de las plantas. A su
vez, las plantas ejercen una notable influencia sobre las comunidades microbianas de
los suelos. La cubierta vegetal del suelo es un factor importante para la determinacin
del tipo y la cantidad de microorganismos presentes. Los exudados de las races y las
partes senescentes de las plantas son una fuente esencial de nutrientes para los
microorganismos del suelo. La rizosfera y las interacciones que se dan en las
micorrizas, as como la susceptibilidad vegetal a los patgenos, ejercen una influencia
selectiva en las comunidades microbianas del suelo. La rizosfera es la fina capa de
suelo que queda adherida a las races de las plantas despus de sacudirlas. Su tamao
depende de la estructura particular del sistema de races, cuya zona de contacto con el
suelo es generalmente muy grande.

Entre los microorganismos que podemos encontrar en el suelo estn los fijadores de
nitrgeno atmosfrico. Slo algunas especies de microorganismos procariotas son
capaces de fijar el nitrgeno atmosfrico (N2) y transformarlo en nitrgeno combinado.
A este proceso se le denomina fijacin biolgica del nitrgeno y los microorganismos
que la realizan pueden dividirse en dos grupos:

A) Microorganismos que fijan N2 en simbiosis con plantas.

B) Microorganismos capaces de fijar N2 viviendo libremente.

Entre los primeros se encuentra Rhizobium, un gnero de la familia Rhizobiaceae. Las

especies de este gnero son Gram negativas y tienen forma de bacilo, no forman
esporas, son aerobias, con metabolismo no fermentativo e inductoras de ndulos en
las races de plantas leguminosas. En el interior de dichos ndulos es donde las clulas
microbianas llevan a cabo la fijacin del nitrgeno. En tales ndulos se establece una
relacin de simbiosis tpica, en la que el microsimbionte, una bacteria, fabrica las
enzimas necesarias para la fijacin de N2 hasta nitrgeno combinado til para la
planta. A su vez, el macrosimbionte, la planta, pone a disposicin de la bacteria
hidratos de carbono como fuente de energa. Casi todas las races de leguminosas son
colonizadas por alguna especie de Rhizobium. En los ndulos, las clulas de Rhizobium
encargadas de fijar el nitrgeno son clulas especializadas en dicha funcin metablica
y que han perdido la capacidad de dividirse, tales clulas reciben el nombre de
bacteroides. Dicha especializacin es irreversible, de manera que para aislar Rhizobium
a partir de un ndulo, es necesario que existan clulas vegetativas no trasformadas en
bacteroides.

El objetivo de esta prctica es observar la variedad de microorganismos que se

desarrollan en un determinado suelo e intentar aislar algunos grupos significativos en
base a sus caractersticas metablicas.

2.- DESARROLLO DE LA PRCTICA

2.1.- Obtencin de cultivos puros de Rhizobium a partir de ndulos de races de

leguminosas.

Ndulos inducidos por Rhizobium en una planta leguminosa

2.1.1.- Con ayuda de una cuchilla o pinza separamos de la raz 5 o 6 ndulos

evitando daarlos. Depositamos los ndulos en una placa de Petri que contenga
alcohol al 70%. Se mantendrn en alcohol 2 o 3 minutos para conseguir la desinfeccin
de la superficie y, por tanto, la eliminacin de otros microorganismos que no
interesen. A partir de este momento todas las operaciones debern realizarse con la
mayor ASEPSIA POSIBLE!.

2.1.2.- Con la pinzas, previamente introducidas en alcohol y flameadas,

transferimos los ndulos a una placa de Petri con agua estril para eliminar los restos
de alcohol. Los ndulos permanecern en agua un par de minutos.

2.1.3.- A continuacin, depositamos los ndulos sobre un portaobjetos

esterilizado con alcohol y los rompemos con la punta de las pinzas hasta obtener un
lquido blanco y lechoso. Este lquido es una suspensin rica en bacteroides y clulas
vegetativas de Rhizobium.

2.1.4.- Con un asa de siembra, previamente esterilizada a la llama y enfriada,

sembramos por agotamiento en una placa de YMA (Yeast Extract, Manitol, Agar) e
incubamos a 28C durante 5-7 das, ya que su crecimiento es muy lento.
2.2.- Observacin de bacteroides

En el mismo portaobjetos utilizado para romper los ndulos relizaremos un frotis con
el lquido nodular restante, retirando previamente los restos vegetales. Fijamos la
preparacin por calor a la llama del mechero y finalmente teimos con el colorante
azul de toluidina durante 5 minutos, transcurridos los cuales lavaremos con agua y
dejaremos secar al aire antes de la observacin al microscopio bajo el objetivo de
inmersin en aceite.

Los bacteroides tienen una morfologa muy variada, si bien las formas ms
caractersticas son:

EQUIS MAZA MARTILLO Y

2.3.- Otros grupos significativos de microorganismos del suelo.

Ayudndonos de las pinzas tomamos un poco de tierra (aproximadamente 2 3 g) y la

depositamos, en condiciones de esterilidad, en un tubo de ensayo con suero fisiolgico
estril. Agitamos vigorosamente para conseguir que se homogenice y dejamos
sedimentar durante unos minutos. Transcurrido este tiempo tomamos del lquido
sobrenadante alcuotas de 0,1 ml con una pipeta estril o micropipeta e inoculamos los
siguientes medios:

a) AM, para la deteccin de microorganismos amilolticos. Se trata de un medio

mineral con almidn como nica fuente de carbono y energa. En l podremos
detectar la presencia en el suelo de microorganismos capaces de hidrolizar el
almidn.
b) AZ, para aislar microorganismos fijadores de nitrgeno en vida libre (Ej: Familia
Azotobacteriaceae). Medio mineral carente de nitrgeno y por tanto, selectivo
para aquellos microorganismos que puedan fijarlo en vida libre. Este medio
contiene sales de Fe y Mo que actan como cofactores de la nitrogenasa.
c) AC, medio de almidn y casena para el crecimiento de actinomicetos. Es un
medio mineral con almidn como fuente de carbono y casena como fuente de
nitrgeno. No es un medio selectivo, ya que adems de los actinomicetos,
podrn crecer en l otros muchos microorganismos.
d) NA, para aislamiento de microorganismos formadores de endosporas. Una vez
realizadas las siembras anteriores, calentamos el tubo que contiene la tierra
durante 5 minutos a 80C aproximadamente (ATENCIN!: DURANTE EL
CALENTAMIENTO MANTENDREMOS EL TUBO DESTAPADO EVITANDO EL
CONTACTO FIJO CON LA LLAMA). Con este tratamiento por calor habremos
eliminado todas las formas vegetativas de vida y slo quedarn viables las
endosporas de los microorganismos formadores de tales estructuras. Tras el
tratamiento y una vez que la tierra haya sedimentado nuevamente tomaremos
con una pipeta estril o una micropipeta 0,1 ml del sobrenadante y
sembraremos en csped una placa de agar nutritivo (NA). Si incubamos el
inoculo en aerobiosis estaremos seleccionando las especies del gnero Bacillus,
mientras que si la incubacin es en condiciones anaerobias seleccionaremos
tambin especies del gnero Clostridium.
TODOS LOS MEDIOS INOCULADOS SEGN LO DESCRITO ARRIBA, SERN
INCUBADOS A 37C EN AEROBIOSIS.

3.- LECTURA DE LOS RESULTADOS

De cada uno de los diferentes medios de cultivo anotamos: abundancia y
morfologa de las colonias, pigmentacin de las colonias o del sustrato y
cualquier otro rasgo que merezca observacin. A continuacin procedemos a
hacer una tincin de Gram de las colonias ms representativas.
AM, medio para el crecimiento de microorganismos amilolticos. Para testar el
crecimiento de este tipo de microorganismos cubrimos el medio con lugol (ser
suficiente con unas cuantas gotas). El lugol es una solucin del I 2 y IK que al
introducirse en la red de amilosa y amilopectina del almidn da coloracin azul
oscura. Las colonias productoras de amilasas extracelulares mostrarn a su
alrededor un halo sin coloracin como consecuencia de la hidrlisis de almidn
por la accin de las citadas enzimas.
AZ, medio para la seleccin de microorganismos fijadores de nitrgeno en vida
libre. Ej: familia Azotobacteriaceae. Los microorganismos de esta familia son
Gram negativos, hetertrofos, aerobios y fijan nitrgeno en vida libre. Las
clulas son de gran tamao, con forma oval o de bastones, la mayora con
cpsulas. Las colonias son mucosas o muy mucosas. Casi todas las especies son
mviles, con flagelos polares o peritricos y algunas especies forman cistos.
Entre los gneros que podemos encontrar estn:
Azotobacter y Azomonas, ambos se caracterizan por sus clulas grandes y
ovoides, a veces con cpsula. En ocasiones adems son visibles los cistos.
Beijerinckia y Derxia, que son pequeos bacilos.
 Clulas vegetativas

Cistos

Azotobacter

AC, medio para el cultivo de actinomicetos. Los actinomicetos son

microorganismos Gram positivos que crecen formando un micelio vegetativo difcil de
fragmentar. Para su reproduccin, los extremos de las hifas se tabican hasta generar
esporas que constituirn los llamados micelios areos. Las colonias de los
actinomicetos se caracterizan por su aspecto coriceo y seco, en ocasiones se trata de
colonias pigmentadas. Adems, los actinomicetos son los responsables del olor
caracterstico del suelo a tierra hmeda. Un gnero caracterstico de este grupo de
microorganismos es Streptomyces.

Micelio vegetativo de Streptomyces (tincin de Gram)

NA, aislamiento de microorganismos formadores de endosporas del gnero Bacillus. Se

trata de bacilos Gram positivos. Algunas especies generan colonias de gran tamao y
aspecto algodonoso, otras semejan gotas de cera (Bacillus cereus).

YMA, medio para el cultivo de Rhizobium. Rhizobium forma colonias mucosas y

brillantes. Son bacilos Gram negativos pequeos y pleomrficos.
 APNDICE

1.- Composicin de los medios de cultivo

1.1.- AM: cultivo de microorganismos amilolticos

Componente Cantidad/litro
Almidn 2,0 g
K2HPO4 2,0 g
KH2PO4 2,0 g
MgSO4.7H2O 0,4 g
Oligoelementos A 0,5 ml
Oligoelementos B 0,5 ml
Agar 12,0 g
Agua destilada Hasta 1 L

1.2.- AZ: para la seleccin de fijadores de nitrgeno en vida libre

Componente Cantidad/litro
Glucosa 10,0 g
K2HPO4 0,5 g
MgSO4.7H2O 0,2 g
CaCO3 0,01 g
NaCl 0,2 g
FeSO4.7H2O 0,05 g
NaMoO4.2H2O 0,05 g
Agar 20,0 g
Agua destilada Hasta 1 L

1.3.- AC: para el crecimiento de actinomicetos

Componente Cantidad/litro
Almidn 10,0 g
Casena 0,3 g
KNO3 2,0 g
NaCl 2,0 g
K2HPO4 2,0 g
MgSO4.7H2O 0,05 g
CaCO3 0,02 g
FeSO4.7H2O 0,01 g
Agar 12,0 g
Agua destilada Hasta 1 L
1.4.- NA: medio complejo
Componente Cantidad/litro
Extracto de carne 3,0 g
Peptona 5,0 g
Agar 15,0 g
Agua destilada Hasta 1 L

1.5.- YMA: para el cultivo de Rhizobium

Componente Cantidad/litro
Manitol 10,0 g
Extracto de levadura 10,0 g
NaCl 0,1 g
K2HPO4 0,5 g
MgSO4.7H2O 0,2 g
CaCO3 3,0 g
Agar 15,0 g
Agua destilada Hasta 1 L

2.- Material a utilizar

Cada pareja dispondr del siguiente material:
- Una placa de Petri con alcohol 70%.
- Una placa de Petri con agua destilada estril.
- Una placa con cada uno de los medios de cultivo citados anteriormente
(AM, AZ, AC, NA, YMA).
- Un tubo con suero fisiolgico estril.
- Asas de siembra (de platino y de vidro).
- Placa de Petri con etanol absoluto
- Mechero.
- Microscopio.
- Protaobjetos.

Adems, compartir con el resto de compaeros de mesa:

- Pinzas.
- Azul de toluidina.
- Lugol.
- Etanol.
- Colorantes necesarios para la tincin de Gram.
- Colorantes necesarios para la tincin de esporas.