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MANUAL DE MTODOS

MICROBIOLOGIA

DA FERMENTAO

CTC - CENTRO DE TECNOLOGIA CANAVIEIRA

LABORATRIO DE ANLISES

2007
LABORATRIO DE ANLISES
MANUAL DE MTODOS MICROBIOLOGIA DA FERMENTAO

ndice

1 Noes de Microbiologia .............................................................................................. 3

2 Meios de Cultura ............................................................................................................15

3 Desenvolvimento Microbiano.......................................................................................19

4 Infeco no Processo de Fermentao.....................................................................20

5 Tcnicas em Microbiologia .........................................................................................21

6 Controle Microbiolgico da Fermentao .................................................................26

7 Anlises Microscpicas - Viabilidade e Gram..........................................................42

8 Delta pH e Delta Acidez.................................................................................................52

9 Concentrao Mnima Inibitria...................................................................................52

10 Referncias Bibliogrficas ...........................................................................................55

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1 Noes de Microbiologia

1.1 Introduo

Microbiologia a cincia que estuda os microrganismos e suas atividades.

Este estudo engloba a preocupao com a forma, a estrutura, a reproduo, a fisiologia, o


metabolismo e a identificao dos seres microscpicos.

Est includo tambm nesta cincia o estudo da distribuio natural dos microrganismos, suas
relaes recprocas e com outros seres vivos, seus efeitos benficos e prejudiciais sobre os
homens e as alteraes fsicas e qumicas que provocam em seu meio ambiente.

Em sua maior parte, a microbiologia trata com organismos microscpicos unicelulares. Nas formas
superiores de vida, os organismos so compostos de muitas clulas, que constituem tecidos
altamente especializados e rgos destinados a exercer funes especficas. Nos indivduos
unicelulares, todos os processos vitais so realizados numa nica clula. Independentemente da
complexidade de um organismo, a clula , na realidade, a unidade bsica da vida.

Todas as clulas vivas so basicamente semelhantes (Figura 1.1). Compem-se de protoplasma


(do grego: a primeira substncia formada), um complexo orgnico coloidal constitudo,
principalmente, de protenas, lipdeos e cidos nucleicos; o conjunto circundado por membranas
limitantes ou parede celular, e todos contm um ncleo ou uma substncia nuclear equivalente.

Figura 1.1 - Esquema de uma Clula Tpica


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1.2 Classificao dos m icrorganism os

Fig 1.2 - Micrografia eletrnica de diferentes tipos de microrganismos.

Aps sua descoberta, os microrganismos foram classificados nos dois reinos ento existentes:
animal e vegetal. Os protozorios foram includos no reino animal, os fungos e bactrias no reino
vegetal. No entanto, essa classificao no era satisfatria, visto que entre os protozorios
existem alguns grupos capazes de realizar fotossntese, enquanto que os fungos e a maioria das
bactrias, apesar de classificadas no reino vegetal, no so fotossintticas.
Em 1986 modificou-se toda a classificao dos seres vivos quando o biologista E.H. Haeckel
props a criao de um terceiro reino, o reino protista, que incluiria todos os microrganismos com
exceo do vrus.

Os seres vivos podem ser separados em 2 grandes grupos.

Em um primeiro grupo teramos aqueles que s contm um tipo de cido nucleico (DNA ou RNA) e
seriam constitudos pelos vrus. Em um segundo grupo, teramos aquele, que contm dois tipos de
cidos nucleicos (DNA e RNA). Este grupo seria subdividido em dois subgrupos. O primeiro
incluiria organismos onde o material nuclear no envolvido por membrana e seria constitudo por
organismos procariticos: bactrias e algas cianofceas. O segundo seria constitudo por
organismos que possuem uma membrana envolvendo o material nuclear; nesse grupo teramos os
organismos que no tm a capacidade de formar tecidos, os eucariticos inferiores: fungos,
mixomicetos, algas superiores, protozorios e aqueles que tm capacidade de formar tecidos, os
eucariticos superiores: plantas e animais.

Segundo Haeckel, o reino protista seria subdividido em dois grandes grupos (Tabela 1.1).

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Tabela 1.1 - Classificao do Reino Protista

Reino Protista
Protistas Inferiores (Procariticos) Protistas Superiores (Eucariticos)
Algas superiores
Bactrias Mixomicetos
Algas cianofceas Fungos
Protozorios

Os protistas procariticos e eucariticos apresentam vrias diferenas com relao as estruturas


celulares. A organizao celular das clulas procariticas bem mais simples quando comparada
com as clulas eucariticas. Na Tabela 1.2 esto relacionadas as principais diferenas entre as
clulas procariticas e eucariticas.

Tabela 1.2 - Principais Diferenas entre Clulas Procariticas e Eucariticas

Clula Procaritica Clula Eucaritica


Ausncia de membrana Presena de membrana
Estrutura nuclear DNA circular DNA linear
No contm histona Contm histona
Ausncia de nuclolo Presena de nuclolo
DNA em organelas Ausente Presente
Mitocndrias Ausente Presente
Cloroplastos Ausente Presente s vezes
Retculo endoplasmtico Ausente Presente
Estrutura flagelar 9-2 Ausente Presente
Ribossomos citoplasmticos 70 S* 80 S
Estrutura de Golgi Ausente Presente
Movimento amebide Ausente Presente s vezes
Pinocitose Ausente Presente s vezes
Fagocitose Ausente Presente s vezes

S - Unidade Svedberg (coeficiente de sedimentao)

1.3 Morfologia e estrutura dos m icrorganism os

1.3.1 Bactrias

O tamanho de uma clula bacteriana caracteristicamente pequeno. O dimetro das bactrias


esfricas varia de 0,5 a 4 m, enquanto que o comprimento de bactrias cilndricas raramente
ultrapassa 10 m.

Quanto a forma, a maioria das bactrias pode ser classificada em trs tipos fundamentais:
bactrias esfricas, cilndricas e espiraladas (Figura 1.3).
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Bactrias esfricas - Denominam-se cocos e podem se apresentar em agrupamentos: diplococos


(pares) estreptococos (cadeias), estafilococos (cachos irregulares), tetragenos (grupos de
quatro) e sarcina (grupos cbicos); o cocos que permanecem isolados denominam-se
micrococos.

Bactrias cilndricas - Recebem o nome de bacilos as bactrias em forma de bastonetes. Podem


se apresentar em cadeias (estreptobaclos) ou isoladas.

Bactrias espiraladas - Denominam-se vibries, quando tm o corpo rgido e uma s volta de


espiral (parecem bacilos curvos); espirilos, quando tm o corpo rgido e vrias voltas de espiral;
espiroquetas quando tm corpo flexuoso e vrios espirais.

A reproduo nas bactrias feita, na grande maioria dos casos, pelo processo da diviso
binria simples, na qual uma clula adulta divide-se ao meio dando duas clulas-filhas iguais. Em
alguns casos a reproduo por brotamento, quando uma clula emite um broto menor que ela,
que se destaca constituindo a nova clula.

Figura 1.3 - Tipos Morfolgicos Fundamentais das Bactrias. 1-Coco Isolado, 2-Diplococo, 3-
Sarcina, 4-Estafilococos, 5-Estreptococos, 6-Bacilo, 7-Vibries, 8-Espiroqueta e 9-Espirilo.

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1.3.2 Fungos

Bolores

Do ponto de vista morfolgico, conveniente distinguir os fungos em dois grandes grupos: os


bolores e as leveduras.
Os bolores caracterizam-se por formarem um miclio, que um conjunto de estruturas
filamentosas denominadas hifas.
As hifas so estruturas cenocticas, isto , multinucleadas, mas no h separao entre clulas
(o citoplasma contnuo).
Em alguns bolores as hifas so septadas, mas tais septos so incompletos, persistindo, portanto,
a continuidade do citoplasma.
Os bolores podem se reproduzir de duas maneiras: assexuada e sexuada. No 1 caso o
processo normal a esporulao. No 2 caso os esporos so formados pela unio de duas
clulas e fuso de seus ncleos, seguida de diviso, o que produz um nmero varivel de
clulas.

Figura 1.4 - Hifas de Bolores: (A) No Septadas e Multinucleadas, (B) Septadas com Clulas
Mononucleadas, (C) Septadas com Clulas Multinucleadas.

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Fig 1.5 - Imagem de microscopia de varredura eletrnica (cores adicionadas) de miclio fngico com
as hifas (verde), esporngio (laranja) e esporos (azul), Penicillium sp. (aumento de 1560 x).

Leveduras

As leveduras so fungos geralmente unicelulares. Seu tamanho varia bastante, de 1-5 m de


dimetro a 5-30 m de comprimento. Sua forma tambm muito varivel, desde elementos
esfricos at clulas elpticas bastante alongadas. Suas clulas apresentam as caractersticas
dos seres eucariticos.

Tem membrana citoplasmtica lipoprotica, cuja principal funo regular as trocas com o meio
ambiente. Possuem, tambm, uma parede celular rgida, constituda principalmente de dois
polissacardeos: manana e glucana, alm disso, contm protenas e lipdeos.

No citoplasma encontram-se, alm dos componentes usuais em soluo, um ou mais vacolos,


delimitados por uma membrana, mitocndrias - estruturas membranosas relacionadas com
processo respiratrio; retculo citoplasmtico; ribossomos e, freqentemente, grnulos de material
de reserva - hidratos de carbono, gorduras ou protenas. O ncleo, tipicamente eucaritico,
envolvido por uma membrana nuclear.

Assim como os bolores, as leveduras podem se reproduzir assexuada e sexuadamente. No


primeiro caso o processo mais comum o brotamento, do qual resultam clulas-filhas inicialmente
menores que a clula-me.

Algumas leveduras reproduzem-se por diviso binria, semelhana das bactrias.

A reproduo sexuada se faz pela formao de ascosporos, isto , esporo contido no interior de
um asco.
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Figura 1.6 - Morfologia de Diferentes Tipos de Levedura: (A) Sacharomyces cereviae,


(B) Sacharomyces ludw igii, (C) Geotrichum candidum e (D) Pichia membranaefaciens.

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Figura 1.7 - Esquema mostrando as estruturas de uma levedura tpi


Saccharomyces cerevisiae

Figura 1.7 Esquema mostrando as estruturas de uma levedura tpica, como as de


Sacharomyces cereviae

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Figura 1.8 Brotamento ou Gemulao

Figura 1.9 - Brotamento de uma clula de levedura Saccharomyces cerevisiae

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1.4 O Microscpio

Embora seja um equipamento relativamente simples, o microscpio desempenha um papel


fundamental nas anlises microbiolgicas e como tal torna-se necessrio o conhecimento de
conceitos bsicos para sua adequada utilizao.
Os Componentes principais so:

- P ou base
- Condensador
- Platina ou mesa
- Charriot
- Estativo ou coluna
- Ocular (mono ou bi)
- Revlver
- Objetivas
- Dispositivos macro e micromtrico

Na Figura 1.10 est mostrada a seo transversal de um microscpio simples, mostrando as


partes mais importantes.

1.4.1 Caractersticas de um bom m icroscpio

Para ser satisfatrio um microscpio deve dar um aumento adequado.


Ele deve aumentar o objeto de forma que os detalhes apaream separados o suficiente para que
sejam visveis. O aumento em geral vem marcado nas objetivas (10X, 45X, 100X) e nas oculares
(5X, 10X, 15X). Um microscpio deve tambm apresentar boa definio e alto poder de resoluo.
"Definio" sinnimo de contraste e depende da qualidade das lentes. As lentes comuns
(acromticas) tm defeitos: a aberrao esfrica e a aberrao cromtica, devido propriedade
dos raios de luz de diversas cores serem "refratados" em ngulos diferentes, sendo os de menor
comprimento de onda (azul, violeta) mais refratados que os de maior (vermelho, laranja).
possvel corrigir parcialmente estas aberraes usando vidros especiais, porm, estas lentes
comuns so normalmente usadas nos microscpios para trabalho de rotina. Por este motivo deve-
se tomar cuidado ao comparar observaes microscpicas do mesmo material em microscpios
diferentes.

E possvel melhorar o contraste, por exemplo, atravs do coramento (tingimento) do objeto (com
corantes prpura ou verde-azulados) ou atravs de campo escuro e contraste de fase.
"Poder de resoluo" a habilidade de produzir imagens separadas de partes do objeto que esto
muito prximas, isto , a habilidade de distinguir detalhes do objeto.

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1.4.2 Procedim entos para o uso do Microscpio

O Microscpio um instrumento de preciso feito com material valioso. Havendo cuidado por
parte de quem usa, ele durar longo tempo, mas um pouco de negligncia poder danific-lo.
Portanto, use-o com carinho e zelo.

Transportar com ambas as mos, apoiando numa delas a base do microscpio e segurando a
coluna do aparelho com a outra.
Quando o colocar sobre a mesa, mantenha-o distante da borda. Se houver alguma lmpada
ligada ao instrumento, cuidado com o fio. aconselhvel manter a mesa do laboratrio livre de
tudo o que no seja absolutamente necessrio.
Os microscpios devem ser colocados em superfcies isentas de vibraes e no so
recomendadas mudanas de localizao.
Evitar molhar o microscpio ao usar preparaes feitas com gua.
Nunca soprar as lentes para retirar a poeira, pois micropartculas de saliva podem se depositar
nas lentes.
Seguir rigorosamente as instrues do fabricante do equipamento quanto ao uso de solventes
para a limpeza.
Limpar o leo residual das objetivas ao final de cada uso com algodo hidrfilo, ou flanela
macia, umedecido em xilol ou em ter-acetona 1:1.
Nunca deixar os orifcios de conexo das objetivas e oculares abertos. Mant-los fechado por
plug de proteo adequado ou com as prprias oculares ou objetivas.
No tocar nas lentes com as mos.
Somente usar leo de imerso que atenda a especificao estabelecida pelo fabricante.
Nunca usar leo de imerso para trabalhos com objetivas que no sejam de imerso. Estes
leos danificam as substncias de montagem destas objetivas.
Quando acabar de usar o microscpio, encaixe a objetiva de menor aumento e cubra-o com
capa.

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Figura 1.10 - Microscpio

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2 Meios de Cultura

Sabe-se que alm das caractersticas prprias dos microrganismos (se so bactrias, leveduras,
fungos,...), vrios outros fatores influenciam na cintica de crescimento celular. Entre esses
fatores um dos mais importantes o meio de cultura onde os microrganismos so colocados.

O meio de cultura deve conter todos os elementos essenciais necessrios ao crescimento do


microrganismo, em propores similares s que ocorrem na clula. Entre estes elementos
costuma-se distinguir entre macronutrientes - C, H, N e O; mesonutrientes - Mg, P, S e
micronutrientes - Fe, Cu, Zn, Mo, Co, etc.

A Tabela 2.1 apresenta as composies mdias dos principais elementos que constituem as
clulas microbianas.

As formas pelas quais estes elementos devem ser fornecidos aos microorganismos so
extremamente variveis, dependendo do microrganismo e do que se deseja, porm, a maior parte
dos microrganismos crescem bem em meios compostos de substncias orgnicas complexas.

Tabela 2.1 - Componentes das Clulas Microbianas

Elementos Funo Fisiolgica % sobre o Peso Seco


Hidrognio Presente em compostos orgnicos e na gua 8
Oxignio Presente em compostos orgnicos e na gua 20
Carbono Presente nos compostos orgnicos 50
Nitrognio Presente nas protenas, cidos nuclicos mx. 14
e coenzimas min. 3
Enxofre Protenas e vrios coenzimas 1
Fsforo cidos nuclicos, fosfolipdios e coenzimas 3
Magnsio Cofator em vrias reaes enzimticas (ATP) 0,5
Mangans Cofator de vrias enzimas 0,1

Elementos Funo Fisiolgica % sobre o Peso Seco


Clcio Cofator de enzimas (proteases) 0,5
Ferro Citrocromos, algumas protenas, cofator de 0,2
enzimas
Cobalto Vitamina B12 0,03
Cobre
Zinco Presente em algumas enzimas 0,03
Molibdnio

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2.1 Classificao dos m eios

De uma forma geral os meios se classificam em:

Lquidos;
Semi-slidos (Pastosos: amido, gros modos, etc.);
Slidos (batata, cenoura ou Agar, gelatina).

Os meios ainda podem ser:

Sintticos (composio conhecida);


No sintticos (substncias orgnicas complexas).

Os meios mais usados em laboratrio para manuteno e isolamento de microrganismo o


saboraud (glicose - peptona - extrato de carne - agar).

Glicose : a fonte de carbono e energia.

Peptona : a fonte de nitrognio. um hidrolisado enzimtico de protenas. Contm fosfatos.

Extrato de carne: Preparado a partir de carne magra. Fornece substncias que ativam o
crescimento dos microrganismos.

Frmula:

Extrato de carne 0,9 g


Peptona 1,5 g
Glicose 3,0 g
Agar 8,0 g
H2O destilada 300 mL

Agar: Polissacardeo extrado com gua quente de algumas espcies de algas marinhas
(agarfitas): gelidium amansii.

Minerais : Em geral fornecidos pela gua e impurezas dos componentes do meio.

2.2 Classificao dos nutrientes

Os nutrientes necessrios ao crescimento tambm podem ser classificados como:

Elementos principais : C, H, N, O
Elementos acessrios : P, K, S, Mg
Vitaminas e hormnios
"Traos de elementos"
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Costuma-se tambm usar a expresso fatores de crescimento para designar certos nutrientes
orgnicos, tais como os aminocidos e vitaminas que so incorporados diretamente estrutura
celular.

Os microrganismos e clulas de tecidos foram inicialmente cultivados em meios "naturais", feitos


com extratos de plantas ou animais, por exemplo, suco de uva, leite, "corn steep liquor" (lquido
proveniente da extrao de glicose do milho), peptonas e soro de sangue de animais. Ainda hoje
estes meios apresentam alguma convenincia porque so fontes de todos os 4 grupos de
nutrientes, porm, eles so indefinidos e variveis quanto composio. Para que possamos
estudar a nutrio dos microrganismos temos que usar, na medida do possvel, meios
quimicamente definidos ou chamados "sintticos".

Um meio mnimo contm somente os nutrientes essenciais para o crescimento, enquanto que o
meio rico (completo) aquele no qual os nutrientes essenciais so complementados por fontes
alternativas de elementos, tais como aminocidos, vitaminas, precursores de cidos nucleicos e
outros intermedirios da sntese celular. O enriquecimento do meio de cultura pode aumentar a
velocidade de crescimento e alterar a composio enzimtica dos microrganismos. por este
fato que temos de definir o meio de cultura antes de estudar qualquer outra influncia sobre os
microrganismos.

As necessidades nutricionais de um organismo podem variar qualitativamente ou


quantitativamente de acordo com as condies de crescimento. Por exemplo, a temperatura pode
afetar as necessidades de fatores de crescimento, e o pH e a concentrao total de nutrientes
(osmolaridade) tambm afetam a nutrio dos microrganismos.

Em geral, para iniciar o crescimento usando um inoculo pequeno necessita-se de um meio mais
rico do que quando se inocula com grandes quantidades de clulas.

Fontes de nitrognio:

As fontes de nitrognio que podem ser utilizadas pelos diferentes microrganismos incluem a
maioria, sendo todas formas orgnicas do nitrognio.

O nitrognio utilizado pelas clulas para a sntese das protenas, cidos nucleicos e
polmeros da parede celular (3 a 14% do peso seco).

Aminocidos:

Freqentemente os aminocidos so fatores de crescimento. Para a sntese de protenas e


para outros usos so necessrios as formas L, porm, algumas vezes necessita-se tambm
das formar D para a parede celular (isomeria), levando-se tambm em considerao que a
prpria clula pode promover a "racemizao" dos isomeros, de acordo com suas
necessidades.

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Aminocidos individuais representam entre 1 a 5% da protena celular.

Algumas vezes, pequenas cadeias de aminocidos (peptdeos) so mais eficientes como


fatores de crescimento do que isolados.

Resta ainda afirmar que para alguns microrganismos os aminocidos so inibidores de


crescimento, dependendo de sua concentrao.

Fontes de vitaminas e hormnios

O termo vitamina em geral empregado para designar os outros fatores de crescimento que
no aminocidos.

As vitaminas so classificadas em dois grupos lipossolveis e solveis em gua. Ao primeiro


grupo (gordura) pertencem as vitaminas A, D, E, K, ubiquinomia, colesterol e cidos graxos
insaturados (as vitaminas A, D, e E no tm importncia para os microrganismos).

As solveis em gua so: cido ascrbico (C), tiamina, riboflavina, cido pantotnico,
piridoxina, cido nicotnico, biotina, cido para-aminobenzico, cido flico, cobalamina, cido
mevalnico colina e meso-inositol (todos estes so importantes na nutrio de microrganismos,
exceo da vitamina C).

Num meio semi-sinttico costuma-se usar extrato de carne ou de leveduras como fonte de
vitaminas.

Uma ou vrias deficincias de vitaminas podem levar a efeitos marcantes sobre o metabolismo
dos microorganismos, por exemplo, fazendo acumular subprodutos no meio ou simplesmente
permitir o crescimento dos mesmos, apesar de todos os outros elementos estarem presentes
no meio.

Os hormnios so mais importantes no cultivo de clulas de mamferos e de plantas do que


para o cultivo de microrganismo.

Fontes de fsforo

Em geral suprido na forma de um fosfato inorgnico. incorporado (como fosfato) nos


cidos nucleicos, fosfolipdios e polmeros da parede celular. O contedo de fsforo aumenta
com o aumento da velocidade de crescimento e varia inversamente com a temperatura.

Fontes de Na e K

A maior parte de potssio celular parece estar ligado ao RNA sendo necessrio cerca de 60 g
de matria seca/gramas de potssio. Assim como o fsforo, as necessidades de potssio
variam com as variaes no RNA (temperaturas, velocidade de crescimento, etc.). Os ons de
potssio funcionam como enzimas.

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Quanto ao sdio ainda no foi quantificada a sua influncia, porm, em alguns microrganismos
existem grandes quantidades de Na e por isso so chamados de haloflicos.

Fontes de Mg

O fator de converso no Mg est em torno de 300 a 900 g de peso seco/g de magnsio e


inversamente proporcional ao RNA.

Fontes de S

Yx/enxofre = 300 g massa seca/g enxofre.

Em geral est presente na forma inorgnica como sulfato. utilizado na sntese de protenas.

Traos de elementos

Pequenas quantidades de um grande nmero de elementos tm grande importncia no


crescimento. Estes elementos esto entre os nmeros 4 (Be) e 74 (W) e quase todos entre 4 e
35 (Br). So supridos como impurezas nos outros componentes dos meios e na gua.

Os mais freqentes so: Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn.

3 Desenvolvim ento Microbiano

3.1 Im portncia da m edida quantitativa do crescim ento

Tomamos contato com os microrganismos praticamente em todos os instantes e locais onde nos
encontramos.

Sabemos que existem microrganismos no ar, pois muita das infeces a que somos sujeitos
provm da atividade de microrganismos que anteriormente estavam em suspenso no ar, assim
como existem microrganismos no solo, nos alimentos, etc.

Muitas vezes fcil verificar a atividade dos microrganismos, por exemplo na deteriorao dos
alimentos, na fermentao de bebidas que contm acar, na transformao do vinho em vinagre,
etc., porm quando estamos interessados em controlar a atividade destes microrganismos
necessrio quantificar o seu crescimento, atravs da medida da biomassa presente.

Na natureza esta quantificao extremamente difcil, pois esto presentes muitas espcies, o
meio onde os microrganismos se desenvolvem extremamente heterogneo, existindo muitas
substncias (substratos), que podem ser aproveitadas pelos microrganismos e existem ainda
alteraes entre as diversas espcies (ou seja, a maior ou menor quantidade de indivduos de
uma determinada espcie pode condicionar o nmero de indivduos de outras espcies).

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Mesmo nos processos industriais onde se procura trabalhar com culturas puras (um s
microrganismo), a variao de condies fsicas como a temperatura, pH, presso, existncia ou
no de iluminao, entre outras, pode afetar drasticamente o desenvolvimento dos MO =
microrganismos.

Portanto, a escolha do mtodo de medida uma das mais importantes decises que devem ser
tomadas para o estudo de qualquer fenmeno onde estejam presentes organismos vivos. Os
fatores que influenciam esta escolha so:

As propriedades da biomassa;
As propriedades do meio de cultura;
A preciso requerida;
A sensibilidade requerida;
A rapidez da medida.

3.2 Mtodos de m edida de desenvolvim ento m icrobiano

De uma forma geral os mtodos de medida do desenvolvimento microbiano podem ser divididos
em 4 grupos:

Contagem de microrganismos

Diretamente se faz atravs do uso de microscpio com metodologia e material padronizado.


Indiretamente se faz atravs de plaqueamento, contando as colnias crescidas em meios
padronizados para cada caso (cada clula deve dar origem a uma colnia).

Efeito que o microrganismo provoca no meio ambiente - baseia-se na medida de produtos


formados ou nutrientes consumidos pelo microrganismo. Ex.: gases, cidos, acares.

Medida de massa de clulas

Diretamente - determinao da concentrao de clulas em gramas (de matria seca) por


litro de suspenso.
Indiretamente - por turbidimetria.

Colorimetria - Baseia-se na adsoro de certos corantes por clulas de microrganismos.

4 Infeco no Processo de Ferm entao

O caldo de cana oferece condies naturais e altamente nutritivas, ricas em matria orgnica e
inorgnica, que so ideais para o crescimento de uma grande variedade de microrganismos. Por
isso, no surpresa encontrar tais microrganismos se desenvolvendo durante a extrao e o
processamento da cana, originrias do solo, os quais aderem-se aos colmos, s folhas; da
prpria flora epfita da cana; da gua de lavagem e de diluio, contaminantes do ar.

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Condies relativamente tpicas prevalecem em vrios estgios do processo, o que seleciona o


desenvolvimento de certos microrganismos; por exemplo, o pH do caldo favorece microrganismos
acidfilos como Leuconostoc e Lactobacillus, enquanto que as altas temperaturas, associada aos
valores de pH, favorecem o crescimento dos termoflicos como as espcies pertencentes ao
gnero Bacillus.

Um grande prejuzo est relacionado degradao da sacarose, que o principal nutriente


utilizado pela clula para o rpido desenvolvimento celular.

De acordo com os produtos resultantes do metabolismo celular as bactrias so denominadas


homofermentativas, quando o principal metablito o cido lctico e heterofermentativas, quando
alm do cido lctico tambm so formados quantidades apreciveis de outros cidos orgnicos,
bem como lcool e CO2. Tambm outros compostos de alto peso molecular podem aparecer com o
resultado do metabolismo microbiano, tais como o dextrneo e o levneo que so produzidos por
espcies de Leuconostoc e Bacillus, respectivamente.

Alm dos produtos do metabolismo como os cidos e as gomas, as bactrias tambm podem
interferir no processo fermentativo por utilizar o lcool como fonte de carbono, desdobrando-o em
cido actico. Assim, as bactrias alm de consumir o acar que poder ser fermentado, afetam
o

processo lanando substncias txicas que matam as leveduras ou ainda outras substncias
que fazem com que as leveduras floculem.

As bactrias contaminantes das fermentaes tm sido divididas por alguns autores em 3


categorias ou seja:

Espcies produtoras de goma;


Espcies aerbias produtoras de esporos;
Espcies aerbias no produtoras de esporos.

Essas bactrias podem ainda ser mesoflicas ou termoflicas, isto , aquelas que crescem em
temperaturas abaixo de 45C e as que suportam tempe raturas mais elevadas, acima de 45.

5 Tcnicas em Microbiologia

5.1 Introduo

Em um laboratrio onde se realizam anlises microbiolgicas deve-se obedecer a uma srie de


normas que visam eliminar ou minimizar os riscos de contaminao, no s das amostras a serem
analisadas como tambm dos manipuladores, visto que sempre existe a possibilidade de se estar
trabalhando com material contaminado, inclusive por microrganismos patognicos.

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J que o analista de microbiologia no seu dia-a-dia est permanentemente em contato com


microrganismos patognicos e no patognicos, a observao destas normas visa, tambm, alm
do acima exposto, assegurar a exatido dos resultados das anlises efetuadas.

5.2 Norm as de segurana e higiene pessoais

Usar guarda-p limpo.

Deixar fora do laboratrio abrigos, agasalhos, carteiras, pastas, livros, etc.

No participar do trabalho quando tiver feridas nas mos (procurar proteg-la com curativo e
luva).

No fumar, comer ou ingerir quaisquer espcie de lquidos no laboratrio.

Lavar as mos antes e depois do trabalho.

No tocar com as mos nos olhos, boca ou nariz.

No usar o guarda-p para limpar lminas, lamnulas ou quaisquer outros materiais.

Tratar imediatamente quaisquer ferimentos provocados durante o trabalho (cortes, arranhes,


etc.).

Comunicar imediatamente qualquer suspeita de haver se contaminado, indicando o material ou


cepa a qual estava trabalhando no momento.

5.3 Norm as gerais de trabalho

Planejar cada tarefa levando em considerao o tempo para execuo e leitura da mesma,
trabalhando sempre de forma metdica e ordenada.

Limpar e desinfetar a bancada de trabalho antes e aps terminar o trabalho.

Anotar:

Identificao:
Tipo de amostra;
Data e hora da tomada da amostra;
Data e hora da chegada ao laboratrio;
Qualquer outra observao que se fizer necessria.

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No esquecer os dados da anlise propriamente dita, isto :

Mtodo utilizado;
Meios de cultura empregados;
Resultados obtidos, etc.

Em caso de derramar qualquer material suspeito, desinfetar e/ou esterilizar imediatamente o


local e/ou material atingido.

O material contaminado deve ser colocado em recipientes especiais para posterior


esterilizao.

Todo o material utilizado na anlise, tais como lminas, pipetas, etc., devem ser colocados em
recipientes contendo soluo desinfetante.

Todo material utilizado deve seguir preferencialmente a seqncia de tratamento abaixo:

1) Esterilizao (autoclave);
2) Lavar;
3) Secar;
4) Envolver em papel ou colocar em latas de inox apropriadas;
5) Esterilizar;
6) Armazenar.

Ao sair do laboratrio verificar se esto fechados registros de gs e gua. Deixar todo o


laboratrio limpo e ordenado para o dia seguinte.

5.4 Esterilizao e desinfeco assepsia

Esterilizao:

De uma maneira geral, o termo esterilizao implica no uso de agentes fsicos e/ou qumicos ou
mecnicos para eliminar totalmente os organismos vivos de um material. Em contrapartida o termo
desinfeco se entende pelo uso de agentes qumicos germicidas para destruio da
infecciosidade potencial de um dado material, no implicando, portanto, na eliminao total dos
organismos vivos.

Assepsia o conjunto de meios usados para impedir a presena de germes em local que no os
contenha.

5.5 Tcnicas de esterilizao

Os agentes mais comuns utilizados para esterilizao so:

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5.5.1 Agentes fsicos

Calor mido:

a tcnica preferencial para esterilizao de todo material. Recomenda-se o uso da autoclave


temperatura de 121C por 15 minutos.

Os meios de cultura devero estar em frascos erlenmeyer ou tubos de ensaio tampados com
algodo e cobertos por papel de embrulho (kraft).

Os frascos vazios devero estar tampados e cobertos com papel alumnio ou papel kraft.

Calor seco:

A esterilizao segura pelo calor seco requer uma temperatura de 170C por 2 horas em
estufa de esterilizao ou forno Pasteur.

A esterilizao por calor seco normalmente usada para vidraria (placas de petri, pipetas) e
metais, os quais devero estar devidamente acondicionados em caixas ou latas de inox
apropriadas.

Radiao ultravioleta:

O efeito bactericida muito conhecido da luz solar se deve na realidade s irradiaes


ultravioletas. Quanto menor o comprimento de onda maior ser sua ao bactericida. Este tipo
de esterilizao normalmente usado para ambientes (cmara assptica) durante
aproximadamente 2 horas.

5.5.2 Agente m ecnico

Filtrao

uma tcnica de esterilizao utilizada para reagentes instveis a altas temperaturas


(antibiticos como cloranfenicol clorotetraciclina, penicilina e actidione). Esta filtrao feita em
filtro de membrana de porosidade 0,45 m (Millipore).

Todo dispositivo de filtrao mais a membrana devem ser esterilizados em autoclave antes do
uso.

5.5.3 Agentes qum icos

No uso de agentes qumicos ou desinfetantes podemos distinguir os mecanismos principais a


saber:

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Dissoluo dos lipdios da membrana celular (mediante o uso de detergentes


lipossolubilizantes).

Alteraes irreversveis das protenas (mediante o uso de desnaturalizantes, oxidantes,


etc.).

Os diferentes agentes qumicos chamados germicidas, quando contidos nas preparaes


qumicas podem produzir:

5.5.3.1 Ao bactericida

O agente qumico tem a propriedade de matar as bactrias, uma ao irreversvel porque mesmo
que o agente qumico seja removido, a bactria morta no mais capaz de se reproduzir.

5.5.3.2 Ao bacteriosttica

O agente qumico tem a propriedade de inibir a multiplicao das bactrias, mas quando o agente
qumico removido a multiplicao retomada.

Os principais germicidas usados so:

Metanol-etanol;
Compostos fenlicos;
Glutaraldedo;
Iodforos;

lcoois;
Quaternrio de amnio;
Composto de cloro;
Formaldedo gs;
Beta propielatone;
xido de etileno;
Organo sulfuroso.

Os desinfetantes acima mencionados tm finalidades de aplicao especficas para diferentes


tipos de contaminao.

5.6 Tcnicas de am ostragem

Para a amostragem de lquidos pode-se mergulhar o frasco (previamente esterilizado)


diretamente no fludo, se estiver ao alcance das mos.

Em locais de difcil acesso a amostragem deve ser auxiliada por um recipiente provido de cabo
ou cordo para atingir o produto, sendo que a primeira amostragem seria para "lavar" o frasco
coletor e a segunda seria coletada no frasco estril.
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Para a amostragem dos lquidos das tubulaes deve-se utilizar os dispositivos


especialmente construdos como "plugs", torneiras e outros locais de acesso. Neste caso, as
primeiras pores do lquido devem ser desprezadas (30 seg.), recolhendo em seguida a
amostra diretamente do frasco.

5.7 Acionam ento e transporte das am ostras

As amostras de diferentes produtos lquidos podem ser acondicionadas em frascos de vidro com
tampas autoclveis e com volume de aproximadamente 500 mL.

Para facilitar a homogeneizao, o volume coletado no deve ser superior metade do frasco.

Os frascos devem ser previamente esterilizados em autoclave 121C por 15 minutos tende a
regio da tampa coberta por papel alumnio ou papel Kraft.

Em caso de transporte, os frascos de amostras devem ser acondicionados em caixas de


isopor e envoltos com gelo picado.

Nestas condies, amostras podem ser mantidas por algumas horas sem o perigo de alterao
sensvel nas contagens microbianas.

6 Controle Microbiolgico da Ferm entao

6.1 Pontos de am ostragem

Para acompanhamento microbiolgico da usina, os seguintes pontos so destacados para a


retirada de amostra:

gua de lavagem de cana

Quando a lavagem de cana feita por um sistema aberto, a amostragem deve ser feita antes e
depois do lavador. No sistema fechado a diferena da qualidade microbiolgica da gua, antes
e depois do lavador, reduzida. A amostragem convenientemente feita depois do lavador.

Caldo m isto

Amostras de caldo misto podero ser recolhidas antes ou depois do cush-cush. Para
amostragem homognea recomendado retirar as amostras na sada da caixa.

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Caldo antes de sulfitao ou calagem

Calagem, sulfitao e tratamento trmico so operaes que reduzem a flora microbiana do


caldo. A determinao da populao microbiana antes desses tratamentos aconselhvel
para avaliar o aspecto microbiolgico das instalaes de manejo de caldo, aps a sua
extrao.

Mosto

O grau de contaminao microbiana no mosto depende dos componentes que formam esse
produto. Propores e condies microbiolgicas de caldo, xarope, melao e outros
ingredientes so essenciais na composio da flora do mosto. Quando a sua contagem
microbiana estiver

elevada, desejvel proceder a contagem dos componentes do mosto a fim de localizar a sua
fonte.

P-de-cuba

Uma das amostragens mais importantes para acompanhamento do processo fermentativo a


anlise das condies microbiolgicas do p-de-cuba. A qualidade de fermentao depende
essencialmente da qualidade do p-de-cuba. As amostras so obtidas do p-de-cuba pronto
para ser adicionado nas dornas.

Dornas em ferm entao

As amostras das dornas em fermentao, durante diferentes etapas do ciclo, nos permitem
acompanhar o processo.

Dornas m ortas

So amostras de vinho fermento durante a centrifugao.

Leite de leveduras

Amostras do leite podem ser retiradas na sada da centrfuga ou na entrada dos tanques de
levedura.

Vinho centrifugado

Amostras do vinho centrifugado podem ser retiradas na sada da centrfuga.

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gua de diluio

Amostras da gua utilizada para preparo no mosto podem ser obtidas em qualquer ponto de
adio desse ingrediente: dornas, tanque de preparo do p-de-cuba, etc.

Caldo clarificado

Essa amostra pode ser obtida logo aps o clarificador.

6.2 Materiais e m todos

6.2.1 Aparelhos e utenslios

rea de trabalho

Balco com tampa de superfcie plana, ampla e limpa. Sala bem iluminada, com boa ventilao,
mas sem poeira e sem corrente de ar . A densidade microbiana do ar deve ser inferior a 15
colnias por placa, aps exposio por 15 minutos.

Autoclave

Pode ser horizontal ou vertical devendo ter boa exausto do ar e permitir a operao a 121C.

Balana semi-analtica

Pode-se usar qualquer tipo com capacidade para 1 a 2 kg e preciso de pelo menos 0,1g.
Para pesagem dos antibiticos seria desejvel uma preciso de 0,01g.

Potencimetro para pH

Os diversos tipos existentes no mercado so satisfatrios. Aparelho com leitura at segunda


casa decimal desejvel. Exemplo: pH = 4,05.

Estufa para esterilizao

De tamanho suficiente para evitar superlotao nas operaes de esterilizao das vidrarias.
Aconselha-se operar com mximo de 50 a 75% da capacidade para aquela de convico
natural e 90% para a de convico mecnica forada.

Incubador

O incubador deve ser adequadamente construdo para que a temperatura no varie alm de
1C daquela ajustada. O tamanho deve ser suficiente para permitir um espao maior que 2,5
cm entre as camadas adjacentes das placas, e destas parede interna do incubador.

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Incubador refrigerado

necessrio para operar a temperatura de incubao de 25C. As mesmas caractersticas


acima (item F) devem ser observadas para o presente caso.

Lupa ou microscpio, estereoscpio, Micronal ou Bausch & Lomb.

Contador de colnias

O aparelho padro o contador quebec de campo escuro. Qualquer outro aparelho de


eficincia equivalente aceitvel.

Contador manual

til como auxiliar na contagem de colnias e determinao de viabilidade celular.

Banho de gua termostatizado

necessrio para manter o meio derretido entre 44 a 46C.

Pipeta de transferncia

As pipetas sorolgicas usadas para a transferncia de suspenso bacteriana devem ter


paredes retas, pontas polidas ou acabadas a fogo. Evite uso de pipetas com pontas
danificadas.

Para calibrao verifique as seguintes tolerncias:


Capacidade Tolerncia Tempo de Esgotamento
1 mL 0,025 mL 2a3s
2 mL 0,025 mL 2a3s
10 mL 0,2 mL 3a4s

Porta-pipetas

Construdas de metal no oxidvel, cilndrica ou paralelepipdica, de comprimento suficiente


para permitir a acomodao fcil das pipetas.

Tubos de diluio

Tubos de 16 mm de dimetro de 150 mm de largura (capacidade aprox. 30 mL) com tampa de


plstico autoclave e assento de borracha especial, ou outro material equivalente para impedir o
vazamento.

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Porta-tubos

Construdo em arame galvanizado ou revestido por plstico para 32 ou 34 tubos de dimetro de


18 mm.

Placas de petri

Base de dimetro superior a 87 mm e profundidade de 12 mm, com superfcie plana e sem


bolhas, riscos ou defeitos.

Porta-placas

Construdo de material no oxidvel para proteg-las no intervalo entre as esterilizaes.

Dispositivo de filtrao a vcuo

Dispositivo de membrana filtrante bacteriolgica de porosidade inferior a 0,45 m acoplado


bomba de vcuo de palheta para 400 a 600 mm de mercrio.

Outras vidrarias e utenslios

Balo volumtrico, cap. 100, 200, 500 e 1.000 mL


Frasco erlenmeyer, cap. 250, 500 e 1.000 mL
Copos becker, cap. 150, 600 e 1.000 mL
Provetas, cap. 100, 250, 500 e 1.000 mL
Bico de Bunsen
Trips e tela com amianto
Frasco de Kitassato
Termmetro de mercrio
Bureta de capacidade de 25 e 50 mL
Porta bureta
Tesoura, faca, esptula, pina, ala de platina e outros pequenos utenslios
Algodo hidrfobo

6.2.2 Reagentes e m eios de cultura

A - Agar de batata e glicose (PDA) (para contagem de leveduras e mofo)

Composio
Infuso de Batatas : 4,0 g
D (+) - glicose : 20,0 g
Agar : 20,0 g
gua destilada : 1.000 mL

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pH final deve ser de 5,6 0,1 a 21C

Antes do uso deve-se adicionar soluo de cido tartrico, utilizar 1 mL de soluo de cido
tartrico para cada 100 mL de meio de cultura. O cido usado para inibir bactrias.

B - Soluo de cido tartrico

cido tartrico : 5,0 g


Glicose : 50,0 g
gua destilada : 45,0 mL

C - Meio de melao/sacarose slido (MSS) (para contagem total de bactrias)

Melao : 50,0 g
Sacarose (acar branco) : 75,0 g
Peptona : 1,0 g
Extrato de levedura : 1,0 g
K2HPO4 : 1,0 g
(NH4)2S4 : 1,0 g
Agar : 20,0 g
gua destilada : 1.000 mL

pH final deve ser de 6,8 0,1 a 21C

Deve-se adicionar (100 ppm) de actidione ao meio, ou seja, prepara-se uma soluo de 0,1g
de actidione + 9,9 mL de gua destilada estril, de onde se transfere 1 mL para cada 100 mL
de meio derretido e resfriado a 45C, pouco antes d e colocar nas placas.

O actidione utilizado como inibidor de leveduras.

D - Meio de melao / sacarose slido (MSS) + CaCO3 (para contagem de bactrias produtoras de
cido)

Deve-se adicionar 100 ppm de actidione e 10,0 mL de soluo de CaCO3 10% para cada 90,0
mL de meio.

O CaCO3 solubilizado pelo cido produzido pela bactria, formando-se um halo claro em
torno da mesma.

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E - Meio TBY (para bactrias produtoras de goma)

Composio

Triptona : 10,0 g
Extrato de levedura : 5,0 g
Sacarose : 100,0 g
Glicose : 10,0 g
Agar : 20,0 g
gua destilada : 1.000 mL

pH final deve ser de 5,5 0,1 a 21C

Deve-se adicionar 100 ppm de actidione e 1,0 mL de soluo de azida sdica 1% para cada
100 mL de meio.

A azida sdica utilizada para inibir bactrias gram negativas.

F - Meio Lactobacilli MRS Agar (para contagem total de bactrias)

Preparo agregando 2 % de Agar-Agar no Lactobacilli MRS Broth com a seguinte composio:

Proteose peptona n 3 : 10,0 g


Extrato de carne bovina : 10,0 g
Extrato de levedura : 5,0 g
Glicose : 20,0 g
Tw een 80 : 1,0 g
Citrato de amnio : 2,0 g
Acetato de sdio : 5,0 g
Sulfato de magnsio : 0,1 g
Sulfato de mangans 0,05 g
Fosfato dissdico 2,0 g
gua destilada 1.000 mL

O pH final aps a esterilizao deve ser 6,5 a 25C

Deve-se agregar 100 mg/l de actidiona no meio derretido e resfriado a 45C, pouco antes da
colocao nas placas.

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G - Meio WLN (Meio diferencial para contagem total de leveduras)

Meio bsico para leveduras, que evidencia as diferentes morfologias das colnias e a
produo de cido pelas mesmas, atravs da viragem do indicador verde de Bromocresol.
cido nalidxico: Inibe sntese de DNA de bactrias.
Ampicilina: Inibe sntese de parede celular.
Composio

Quantidades para 100 mL:

Glicose 5,0000 g
KH2PO4 0,0550 g (a)
KCl 0,0425 g (b)
CaCl2 2H2O 0,0125 g (c)
MgSO4 7H2O 0,0125 g (d)
FeCl2 6H2O 0,2500 mg (e)
MnSO4 4H2O 0,2500 mg (f)
Casena hidrolisada enzimaticamente 0,5000 g
Extrato de levedura 0,4000 g
Agar 2,0000 g
Verde de Bromocresol 0,0022 g (g)
cido nalidxico 5,0000 mg (h)
Ampicilina 5,0000 mg (i)

pH = 5,5 (HCl 1N)

Obs.: Os componentes a, b, c, d, e, f, g, h, i sero adicionados na forma de soluo.

Soluo de KH2PO4 - 5,5 g/100 mL. Usar 1 mL para 100 mL de meio.


Soluo de KCl - 4,25 g/100 mL. Usar 1 mL para 100 mL de meio.
Soluo de CaCl2 . 2H2O - 1,25 g/100 mL. Usar 1 mL para cada 100 mL de meio.
Soluo de MgSO4 . 7H2O - 1,25 g/100 mL. Usar 1 mL para cada 100 mL de meio.
Soluo de FeCl2 . 6H2O - 0,5 g/200 mL. Usar 0,1 mL para cada 100 mL de meio (2,5
mg/mL ou 0,15 mL de soluo com 1,625 mg/mL para cada 100 mL de meio).
Soluo de MnSO4 . 4H2O - 0,5 g/200 mL. Usar 0,1mL para cada 100 mL de meio.
Verde de bromocresol 200 mg/100mL. Dissolver em 5 mL de lcool e completar para 100
mL com gua. Usar 1 mL para cada 100 mL de meio.

Procedimento

Pesar a glicose em um becker. Acrescentar 10 mL de gua. Dissolver. Transferir para um tubo.


Etiquetar (glicose 5 g/10 mL para 100 mL de WLN). Fechar e esterilizar.
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Coletar 83,8 mL de gua destilada em um becker, acrescentar a caseina, extrato de levedura e


as solues. Dissolver em banho-maria, medir o pH e ajustar com HCl 1N, se necessrio.
Acrescentar o agar e voltar ao banho-maria. Aps dissoluo, transferir para erlenmeyer 250
mL e etiquetar WLN sem glicose. Fechar com algodo e folha de alumnio. Esterilizar 10 min a 1
atmosfera.

Uso de antibiticos e preparao das solues

Para inibir o crescimento bacteriano que prejudicaria os resultados, o meio WLN sofre a adio
dos antibiticos, cido nalidxico e ampicilina.

Preparo da soluo com ampicilina (soluo i)

Triturar um comprimento de 500 mg de ampicilina (farmacutica) em almofariz. Dissolver em


gua destilada, completando o volume a 100 mL. Usar 1 mL para 100 mL de meio, de forma
a obter a concentrao final de 50 ppm (50 microgramas/mililitro). Pode ser autoclavado.

A ampicilina se decompe a partir de 202, sendo, p ortanto, autoclavvel. Guardar em


geladeira.

Preparo da soluo de cido nalidxico (soluo h)

Triturar um comprimento de 500 mg de cido nalidxico farmacutico em almofariz. Dissolver


a soluo de NaOH 0,05N completando o volume a 100 mL. Guardar em geladeira.

Usar 1 mL para cada 100 mL de meio de forma a obter 50 ppm (50 microgramas/mililitro). A
soluo de cido nalidxico autoclavvel, podendo ser acrescentada ao meio antes da
esterilizao.

6.2.3 Preparo e esterilizao de material e meios de cultura

Esterilizao por ar quente

Todo material seco, exceto material contendo plstico (placas de petri, pipetas, esptulas),
pode ser esterilizado em estufa temperatura de 170C. Antes de colocar em estufa, esse
material deve ser protegido contra a recontaminao utilizando-se porta-pipetas, porta-placas,
papel de embrulho ou outro mecanismo protetor. Para assegurar a completa esterilizao
deve-se deixar pelo menos 2 horas na temperatura de 170C.

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Esterilizao por vapor

Os meios de cultivo, a gua de diluio e outros lquidos estveis ao calor devem ser
esterilizados na autoclave a 121C (1 Atm.) por 15 minutos no mnimo. Para preparo dos meios
de cultivo os ingredientes so adicionados gua destilada e aquecidos temperatura de
ebulio em bico de gs, agitando-se freqentemente. Aps a completa solubilizao, restitui-
se o volume evaporado e distribui-se em recipientes apropriados (frascos erlenmeyer de 250
ou 500 mL), em quantidades nunca superiores a 150 mL cada. Fecha-se com tampo de
algodo e cobre-se com papel de embrulho antes de esterilizar na autoclave.

Se os meios forem usados imediatamente aps a esterilizao, colocam-se no banho a 44 -


46C at obter temperatura de equilbrio. Se necess itar de armazenamento dos meios por um
perodo maior que 3 ou 4 horas, estes devem ser esfriados e conservados em lugar fresco,
preferivelmente na geladeira. Antes do uso devem ser aquecidos em banho-maria at completa
liquefao, e em seguida resfriados a 44 - 46C no banho termostatizado.

Para esterilizao da gua de diluio, faz-se a distribuio de 9,3 mL do tampo diludo em


cada um dos tubos (16 x 150 mm), e as tampas plsticas so colocadas frouxamente para
permitir a expulso de ar durante a autoclavagem. Logo aps a esterilizao e resfriamento
aperte as tampas firmemente para evitar a evaporao e recontaminao.

Esterilizao por filtrao

Os antibiticos actidione so instveis a altas temperaturas. A esterilizao conduzida por


filtrao em filtro de membrana de porosidade 0,45 ou menos. O funil, o filtro, o frasco de
Kitassato, e o tubo para recolhimento do filtrado devem ser previamente esterilizados por
autoclavagem.

6.2.4 Diluio das am ostras

Antes de iniciar a tarefa de diluio agite bem os frascos das amostras especialmente as de leite,
p-de-cuba e das dornas em fermentao, para que se tenha uma perfeita homogeneizao.
Cuidado especial deve ser tomado para aquelas com leveduras ativas por causa do aumento da
presso interna por agitao. Nestes casos deve-se intercalar a agitao com afrouxamento da
tampa para aliviar a presso.

A transferncia da amostra para tubos de diluio feita com pipeta de 1 mL tomando os devidos
cuidados de assepsia. Algumas amostras, como leite e p-de-cuba, podem apresentar dificuldade
na transferncia, devido evoluo de gs e viscosidade. Nestes casos, deve-se pipetar ou
pesar 1g da amostra e transferir para o tubo de diluio. Para facilitar essa pesagem
assepticamente, recomenda-se pesar o tubo com gua de diluio, e agregar quantidade
suficiente da amostra sem retirar o tubo da balana semi-analtica o que facilita sobremaneira
essa operao.

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Aps a colocao das amostras, os tubos devem ser agitados vigorosamente para obter
completa homogeneizao. A diluio decimal maior preparada transferindo-se 1 mL dessa
amostra diluda em um outro tubo de diluio, agitando-se em seguida.

Repetindo-se a operao tem-se nova diluio, e assim sucessivamente. O nmero de diluies


necessrio vai depender da concentrao de microrganismos presentes na amostra. (Figura
6.2.1)

Numa diluio adequada obtm-se, aps plaqueamento, entre 30 e 300 colnias por placa.

Figura 6.2.1 - Diluio das Amostras

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6.2.5 Inoculao

6.2.5.1 Plaqueam ento e contagem de colnias

Liquefao do meio

Derrete-se a quantidade necessria do meio (especfico para cada determinao) rapidamente


no banho-maria, evitando a exposio prolongada temperatura alta desnecessria, durante e
aps a liquefao. Se o meio for derretido em dois ou mais lotes, use totalmente o meio de
cada lote na ordem de liquefao, desde que o contedo dos outros recipientes permanea
constantemente derretido.

O meio que foi mantido lquido por mais de trs horas deve ser eliminado. A reesterilizao do
meio pode causar precipitao parcial dos ingredientes e deve ser evitada.

Resfrie o meio derretido imediatamente a 45C e man tenha temperatura de 44 - 46C no


banho termostatizado at o uso. Coloca-se o termmetro em um outro recipiente similar ao
usado para o meio e expe-se s mesmas condies no meio a fim de estabelecer o controle
de temperatura.

Colocao e agitao do agar

Selecione as amostras a serem semeadas em placas em uma srie, de modo que o tempo
decorrido entre a diluio da primeira amostra e a colocao da ltima placa da srie seja
menos de 20 minutos. (Quando necessitar de semeadura contnua por meio de um grupo de
operadores, deve-se planejar o trabalho de modo que o tempo entre a colocao da amostra
no primeiro diluente; ou diretamente em placa, e a colocao na ltima placa daquela amostra
no seja superior a 20 minutos). Introduz-se 12 a 15 mL do meio derretido e resfriado a 44 -
46C em cada placa levantando-se cuidadosamente a t ampa da placa de petri o suficiente para
a introduo da pipeta ou colocao do meio. Cuidadosamente evite o espalhamento do meio
para fora da placa ou na parte interna da tampa. Logo aps a colocao do meio nas placas,
misture bem o meio com a amostra na placa (tomando-se cuidado para no borrifar o contedo
nas paredes) por meio de rotao do mesmo, primeiro em um sentido e em seguida em sentido
contrrio, ou por meio de rotao e inclinao das placas ou pelo uso de agitador mecnico
adequado. Tendo assim distribudo a mistura uniformemente na base da placa, deixe o meio se
solidificar (dentro de 5 a 10 minutos) numa superfcie plana. Aps a solidificao as placas
so invertidas e colocadas prontamente no incubador.

Incubao

Incube as placas a 32C 1C por 48 horas, 3 horas para a contagem de bact rias totais e
contagem de bactrias produtoras de cido.

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A temperatura do ar um ndice pouco confivel da temperatura do agar. Portanto, o bulbo do


termmetro deve ser inserido em um frasco pequeno e bem fechado, e envolvido
completamente por gua ou outro lquido. Como a temperatura nas proximidades do topo do
incubador geralmente incorreta em relao ao restante da cmara, deve-se usar dois ou
mais termmetros. Coloque um na estante superior e um na estante inferior, e outros
termmetros nos pontos intermedirios onde as placas so incubadas.

Registre as leituras de temperatura (pela manh e no final do expediente) em reas usadas


para incubao de placas, especialmente quando tais temperaturas possam variar.

Evite o excesso de umidade no incubador para reduzir a tendncia de formar colnias


espalhadas. A secagem excessiva tambm deve ser evitada recirculando parte do ar para
manter a umidade relativa controlada. As placas de agar no devem perder o peso de mais de
15% durante 48 horas de incubao.

Para contagem de fungos e leveduras as placas devem ser incubadas a 25C 1C por
perodo de 3 a 5 dias. No geral, as contagens so bastantes prximas de modo que para
anlise de rotina pode-se usar apenas s contagens aps 3 dias de incubao. O meio usado
para essa contagem o meio PDA acrescido de 1% de soluo de cido tartrico.

Controle de esterilizao de vidraria, meios e diluies

Certifique-se da esterilidade da gua de diluio e meio, semeando as placas controle para


cada lote esterilizado. As placas controle devem ser feitas para cada srie de amostra, se o
perodo entre as sries for muito grande. Como o nmero de amostras de uma srie pode
variar consideravelmente, essa recomendao aplicada para um mnimo de uma placa
controle, para amostras da manh e outra, para amostras da tarde. Se houver formao de
colnias nas placas controle, testa-se tambm a contaminao do meio, da gua de diluio,
das placas ou pipetas e do ar.

A limpeza de rea de plaqueamento com toalha umedecida em gua ou soluo diluda de


desinfetante, antes do uso, embora no seja indispensvel, uma boa prtica.

Dispositivos auxiliares na contagem de colnias

Conte as colnias com auxlio de lente de aumento, sob iluminao uniforme e adequadamente
controlada. Rotineiramente, use o contador de colnias tipo quebec, de preferncia o modelo
de campo escuro, equipado com uma placa guia quadriculada em 1 cm2, ou outros dispositivos
que ofeream condies equivalentes de iluminao. Conte o total de colnias usando o
contador manual. Evite o erro de contar as partculas insolveis do meio ou material precipitado
na placa com colnias puntiformes.

Examine os objetivos duvidosos cuidadosamente, usando aumentos maiores quando desejado,


para distinguir as colnias e outros materiais estranhos (lupa ou microscpio estereoscpio).
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Seleo e contagem de placas

Conte todas as colnias das placas selecionadas aps a incubao. Se for impossvel contar
prontamente, armazene as placas (aps o perodo de incubao necessrio) temperatura de
aproximadamente 5C por um perodo nunca superior a 24 horas, mas evite isso na prtica
rotineira. Quando contar colnias nas placas de amostras individuais, observe as
recomendaes abaixo. Tambm registre no relatrio de cada lote os resultados do teste de
esterilizao dos materiais (gua de diluio, meio de cultivo e placas) feitos na ocasio do
plaqueamento. Anote estes eventos para o grupo de placas, como descrito acima.

I) Uma placa com 30 a 300 colnias

Selecione as placas sem espalhamento com 30 a 300 colnias. Conte todas as colnias,
incluindo aquelas puntiformes, registre a diluio usada, e relate o nmero de colnias.

II) Placas em duplicata

(1) Se mais de uma placa de uma certa diluio for preparada, mas somente uma placa
contm 30 a 300 colnias, conte tambm a outra placa duplicata, a no ser que seja
excluda pelos itens (IV) e (VII) e considere a mdia aritmtica. (2) Quando uma ou mais
placas repetidas de diluies decimais consecutivas forem contadas, determina-se a
contagem mdia das diluies antes de proceder como no item (III).

III)Diluies consecutivas (30 a 300 colnias)

Se as placas de duas diluies decimais consecutivas tiverem 30 a 300 colnias cada,


calcule a contagem por mL para cada diluio e multiplique as colnias das placas de
diluio usada e registre a mdia aritmtica como a contagem por mL, a no ser que a
diferena entre os valores calculados seja maior que as duas vezes. Nesse ltimo caso
use a contagem inferior como contagem de placas por mL.

IV)Espalhamento

Se aparecerem colnias espalhadas na placa selecionada, somente conte as colnias das


pores representativas da mesma quando: (1) h colnias bem distribudas na rea sem o
espalhamento e (2) a rea coberta por colnias espalhadas, incluindo a rea prejudicada
por causa dessas colnias, inferior metade da placa. Quando a rea prejudicada
exceder a um quarto do total da rea, registra-se o teste como descrito no item (VII).

V) Sem placas com 30 a 300 colnias

Se no tiver placas com 30 a 300 colnias e uma ou mais placas com mais de 300 colnias,
use a placa contendo o nmero mais prximo de 300 colnias, conte e avalie o nmero de
colnias por placa como indicado no item (III).

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VI)Todas as placas com menos de 30 colnias

Se as placas de todas as diluies tiverem menos de 30 colnias cada, registre o nmero


real de colnias de menor diluio, a no ser que seja excludo pelos itens (IV) e (VII), mas
registre o resultado da contagem como "menos de 30", multiplicando pela diluio
correspondente. Por exemplo, se a diluio 1:100 for usada, e se o resultado da contagem
for inferior a 30, registre: "< 3.000/mL".

VII)Acidentes de laboratrio, inibidores de crescimento de bactrias, etc.

Se todas as placas de uma determinada amostra: (1) mostrarem ausncia de colnias; (2)
tiverem excesso de colnias espalhadas; (3) apresentarem contaminao ou (4) no forem
satisfatrias, relate da seguinte forma: "sem colnias" (SC); "espalhamento" (Esp.);
"acidente de laboratrio", (AL) ou "inibidores de crescimento" (IC). Nas placas que no
houver crescimento ou que mostrar proporcionalmente menos crescimento em diluies
menores, o analista dever suspeitar da presena de materiais inibidores na amostra
examinada, mas tais resultados no devem ser interpretados como evidncia da presena
de inibidores. A presena de inibidores deve ser determinada por um teste apropriado
designado especialmente para detectar tais agentes.

VIII)Clculo e apresentao dos resultados

Para calcular a contagem por mL, multiplica-se o total de colnias, ou a mdia, ou o nmero
avaliado pela recproca da diluio usada. Quando apresentar os resultados, no use mais
que os dois primeiros dgitos.

Contagem de colnias espalhadas

Quando a contagem de colnias espalhadas for inevitvel conte cada um dos 3 tipos distintos
como uma colnia. O primeiro a cadeia de colnias, no distintamente separadas, que parece
resultar da desintegrao de um aglomerado de bactrias quando a placa agitada para
misturar o agar com gua de diluio. Se houver apenas uma dessas cadeias, conta-se como
uma nica colnia. Se uma ou mais cadeias parecem ser oriundas de fontes separadas conte
cada fonte como uma colnia. No conte cada ponto dessas cadeias como colnias
separadas.

O segundo tipo o espalhamento que se desenvolve no filme de gua entre o agar e o fundo
da placa. O terceiro tipo aquele que forma no filme da gua, nos cantos sobre a superfcie de
agar.

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Os dois ltimos tipos aparecem por causa do acmulo de umidade no ponto onde se origina o
espalhamento. Quando a gua de diluio for inferiormente distribuda, a bactria raramente
forma colnias espalhadas. Qualquer laboratrio com 5% das placas com mais de 1/4 coberto
por colnias espalhadas deve tomar providncia imediata para eliminar esse problema. Quando
o espalhamento cobrir mais da metade da placa considerar para registros dos resultados como
acidentes de laboratrio.

Erros pessoais

Evite a contagem imprecisa resultante do descuido, viso deficiente, ou falha no


reconhecimento das colnias. Os tcnicos de laboratrio que no possam duplicar os seus
prprios resultados de uma determinada placa dentro de 5% e a contagem de outro analista
dentro de 10% devem descobrir a causa e corrigir tais defeitos.

6.2.6 Interpretao dos resultados

Para facilitar a anlise dos resultados de contagem microbiana conveniente dividir a anlise em
dois setores: (1) setor da extrao e tratamento de caldo e (2) setor de fermentao e destilao.

6.2.6.1 Setor de extrao de caldo

Os microrganismos de importncia nesse setor so essencialmente aqueles oriundos do solo e


vegetais. Dentre esses, os fungos, as leveduras e as bactrias lcticas e esporogneas
desempenham papel de importncia em um ou mais pontos da usina. No processo utilizado no
Brasil (extrao mecnica) as bactrias esporogneas tm uma importncia relativa, mas as
bactrias so extremamente importantes. Os fungos e leveduras tambm desempenham papel de
relativa importncia na fabricao do acar. As bactrias do cido actico (acetobacter) tm
alguma importncia no setor de moendas e das peneiras removedoras de bagacilho.

O nmero de microrganismos presentes nas amostras de caldo, mosto, leite e outro material na
usina variam em torno de alguns milhes a bilhes de indivduos por mililitro ou por grama do
produto.

Os resultados das contagens variam muito, de acordo com as condies da matria-prima, dos
equipamentos e processos utilizados na usina. Assim sendo, os limites tolerveis s sero
perfeitamente vlidos se forem estabelecidos para cada caso particular.

6.2.6.2 Setor de ferm entao e destilao

Neste setor os microrganismos de importncia so essencialmente (1) as leveduras que so as


promotoras de fermentao alcolica e (2) as bactrias lcticas que so as principais promotoras
de fermentao indesejvel.

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Os mtodos do tratamento do p-de-cuba, da higienizao das dornas e do preparo do mosto


visam reduzir a incidncia de bactrias lcticas e promover a atividade das leveduras.

A concentrao de leveduras vivas nas diferentes etapas de fermentao varia de acordo com a
adequao s condies de fermentao. Tambm, a concentrao de bactrias lcticas varia
consideravelmente de acordo com o grau de infeco.

7 Anlises Microscpicas

7.1 Viabilidade

O mtodo proposto uma modificao daquele tradicionalmente utilizado, uma vez que padroniza
a concentrao de corante, o pH, o meio e o tempo de "tingimento" das clulas e leveduras,
visando melhorar o controle da fermentao.

Pontos de moagem

Devem ser amostrados os seguintes pontos:

Dornas no final de fermentao (dorna morta);


P-de-cuba;
Leite de levedura.

Mtodo de amostragem

As amostras devem ser coletadas em frascos limpos e secos, mergulhando estes diretamente
com as mos. Deve-se evitar a anlise aps 1 hora da coleta.

Material :

Tubos de ensaio de 25 mL;


Pipetas graduadas, cap. 10 mL;
Pipeta graduada, cap. 1 mL;
Balo volumtrico, cap. 1.000 mL;
Pipeta de Pasteur;
Becker, cap. 50 e 250 mL;
Suporte para tubo de ensaio;
Cmara de Neubauer;
Microscpio.

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Reagentes:

Para 1.000 mL de soluo pesar:

Azul de metileno 0,25 g


NaCl 9,0 g
KCl 0,42 g
CaCl2 2H2O 0,48 g
NaHCO3 0,2 g
Glicose 10 g

Manter em agitao por 6 horas, filtrar em papel de filtro e armazenar.

Tcnica:

Colocar em um tubo de ensaio limpo 0,5 mL da suspenso de levedura (vinho) e 9,5 mL da


soluo corante, para atingir um teor de fermento em torno de 0,5% (vol.).
Fechar o tubo de ensaio e agitar intensamente por 30 segundos.
Deixar o tubo no suporte por mais um minuto.
Preparar a cmara de Neubauer colocando a lamnula sobre o reticulado. Agitar novamente
o tubo.
Com a pipeta de Pasteur transferir uma gota para a margem da lamnula. O excesso de
lquido ser drenado para periferia do reticulado.
Colocar a lmina sobre a platina do microscpio e observar com um aumento de 400 a
600x.
Contar no mnimo 300 clulas na cmara de Neubauer.
Proceder a contagem nos quatro quadrados mdios dos cantos e no central.
Anotar o nmero de clulas por quadrado mdio seguindo o boletim anexo.

Exemplo:

Nmero total de clulas contadas : 316


Nmero de clulas no coradas : 298
Nmero de brotos no corados : 101
% clulas viveis : 94,3
% clulas mortas : 5,2
Brotamento : 31,9%

Observaes:

Podemos utilizar como critrio para distinguirmos uma clula de um broto o tamanho do
broto, admitindo que um broto seja menor que a metade do tamanho da clula-me.

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Quanto diluio da amostra, esta deve ser feita com a soluo corante visando conseguir
uma mdia de 40 - 100 clulas por campo, indiferente da origem da amostra (vinho, leite, p-
de-cuba, etc).
Bactrias: Os bastonetes podem ser contados simultaneamente s leveduras, porm com
uma preciso menor.

Cmara de contagem Neubauer (Figura 7.3)

Uma cmara de contagem tpica consiste de uma depresso central de superfcie conhecida,
permitindo determinar a concentrao celular da amostra.

Assim, a cmara de contagem consiste de uma lmina espessa de vidro, de forma retangular,
atravessada transversalmente por 4 sulcos e um central (formando um H central) que
delimitam 3 reas de nveis diferentes. A plataforma central, que dividida transversalmente
por um sulco, possui uma rea reticulada em cada lado e exatamente 0,1 mm mais baixa que
as duas plataformas laterais, onde se apia a lamnula, deixando, portanto, um espao com 0,1
mm de profundidade.

A cmara de contagem e a lamnula so polidas para garantir o bom contacto entre ambas e
devem ser limpas com gua, lcool ou sabo neutro e secas com papel para lentes (sem
silicone).

A rea reticulada consiste de 3 mm x 3 mm ou 9 mm2. Esta rea dividida em 9 quadrados


grandes de 1 mm de lado ou superfcie 1 mm2, sendo novamente subdivididos, os 8 externos
em 16 quadrados mdios de 0,25 mm de lado ou superfcie 0,0625 mm2 e o central, em 400
quadradinhos de 0,05 mm de lado ou superfcie 0,0025 mm2.

No modelo moderno aqui descrito (Neubauer), h linhas separatrias que dividem o quadrado
central em 5 grupos de quadrados mdios, de 0,2 mm de lado ou superfcie 0,04 mm2. Estes
quadrados mdios subdividem-se, cada um, em 16 quadradinhos de 0,0025 mm2 de superfcie
cada, sendo os quadrados mdios separados por linhas trplices, chegando-se assim, aos 400
quadradinhos. Ver esquema na Figura 7.4.

A cmara acompanhada de lamnulas planas especiais, que se adaptam perfeitamente sobre


as plataformas laterais, deixando um espao de 0,1 mm entre ela e a plataforma central.
Portanto, cada um dos quadradinhos possui um volume de 0,00025 mm3 e o total de 400
quadradinhos de 0,1 mm3.

Para evitar contar as clulas duas vezes devemos usar como regra a contagem das clulas
que esto sobre as linhas, apenas aquelas do lado esquerdo e no topo. Tambm para evitar
parcialidade do operador na escolha dos quadradinhos a contar devemos fixar como regra a
contagem das clulas somente nos 4 quadrados dos cantos e no central do reticulado.

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A Figura 7.2 mostra uma planilha de clculo dos ndices mais importantes que deve ser usada
para tornar os critrios homogneos. Observar que nesta planilha existe um "gabarito" para
identificao dos objetos a serem contados.

Fig 7.1- Determinao da viabilidade celular de leveduras com soluo de Azul de Metileno.
As clulas incolores so clulas viveis e as clulas coradas de azul so clulas mortas.

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RI (razo de infeco)= contagem de bastonetes totais x 100


contagem de Leveduras totais
Figura 7.2 - Planilha de Clculo

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Figura 7.3 - Cmara de Neubauer

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Figura 7.4 - Esquema da Cmara de Neubauer

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7.2 Colorao de Gram

7.2.1 Introduo

O mtodo de Gram se baseia no fato de que quando certas bactrias so coradas pelo cristal
violeta e depois tratadas pelo iodo (lugol), forma-se um composto entre o corante e o iodo, o qual
to fortemente retido pela clula bacteriana que no removido pelo tratamento subsequente
com lcool: so as bactrias Gram positivas, que se coram de azul roxeado. As bactrias Gram
negativas se deixam descorar facilmente pelo lcool.

Portanto, se aps o tratamento com lcool fizermos uma colorao de fundo com safranina, as
bactrias Gram negativas aparecero vermelhas. O mecanismo da colorao de Gram ainda ,
at hoje , bastante discutido, mas sabe-se sem dvida que est relacionado com as diferenas de
permeabilidade da parede celular.

A camada de peptoglicano mais grossa nas bactrias Gram positivas, permitindo a reteno do
corante cristal - violeta e corando-se assim de azul roxeado. As bactrias Gram negativas no
retm esse corante e assim exibem a colorao vermelha do contracorante safranina. Alm
disso, a concentrao de lipdeos nas bactrias Gram negativas maior que nas Gram positivas.

Fig 7.5 As paredes celulares bacterianas e a colorao de Gram

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7.2.2 Metodologia

7.2.2.1 Preparo de corantes

A) Soluo A (Cristal Violeta)

Soluo 1:
Cristal violeta - 2,0 g
Etanol 95% - 20,0 mL

Soluo 2:
Oxalato de amnio - 0,8 g
gua destilada - 80,0 mL

Misturar 1 e 2. Estocar 24 horas antes de usar e filtrar com papel de filtro num frasco de
estoque.

B) Soluo de Lugol: Misturar 1,0 g de iodo metlico com 2,0 g de iodeto de potssio e transferir
para um Graal. Adicionar alguns mL de gua e moer. Adicionar + gua at completa dissoluo
(at 300 mL). Transferir a soluo para um frasco mbar.

C) Soluo de lavagem : Misturar lcool 95% + acetona na proporo 1:1.

D) Soluo de Safranina: A safranina pode ser preparada na concentrao de 250 mg/100


mL. Primeiro faa uma soluo de safranina (estoque) pesando 2,5 g de safranina e dissolvendo
em 100 mL de etanol.

Para colorao, prepare previamente uma diluio tomando 10 mL da soluo estoque e


completando o volume a 100 mL com gua destilada.

7.2.2.2 Procedim ento

Faa uma suspenso celular (no muito espessa) e faa um esfregao na lmina.
Fixar no calor da chama do bico de bunsen ( tomando cuidado para no aquecer
demasiadamente ). Esfriar.
Cobrir o material com o corante cristal violeta (soluo 1 e 2) durante 1 minuto.
Lavar em gua corrente para retirar o excesso de corante.
Cobrir o material com a mistura I2 e KI (Lugol) durante 1 minuto.
Lavar em gua corrente e descolorir com a mistura lcool - acetona at retirar todo o excesso
de corante, isto , at que o solvente permanea incolor (30 minutos).
Lavar em gua corrente.
Cobrir com safranina por 10 segundos.
Lavar em gua, inclinar a lmina para escorrer o excesso de gua e deixar secar ao ar.
Examine ao microscpio sob imerso.

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Resultado :

Organismos Gram positivos coram em azul.


Organismos Gram negativos coram em vermelho.

Fig 7.6 - Bastonetes Gram positivo

Fig 7.7 - Bastonetes Gram negativo

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8 Determ inao de pH e Acidez

Material:

Bquer de 250 mL
Proveta de 100 mL
Banho-maria
Bureta
pHmetro

Reagente:

NaOH 1N
H3PO4

Tcnica:

Transferir 100 mL da amostra para um bquer de 250 mL;


Ajustar o pH a 5,5 e determinar a acidez sulfrica;
Incubar a 37,0 0,5 C por 4 horas, no banho-maria;
Determinar o pH e acidez sulfrica (descrito no Manual de Controle Qumico da Fermentao);
Calcular o pH a acidez (inicial - final).

Resultado:

O aumento da acidez ou queda de pH indica contaminao da amostra por microrganismos


produtores de cido. Dentre estes microrganismos esto as bactrias lcticas, bactrias acticas
e leveduras.

Quanto menor for o pH ou maior a acidez de uma amostra, maior ser seu grau de contaminao.

9 Determ inao do MIC (Concentrao Mnim a Inibitria) para Uso de Antibiticos em


Ferm entao - Mtodo Sim plificado

Os problemas de contaminao na fermentao alcolica, como a floculao, por exemplo,


normalmente tm como causa principal a contaminao de bactrias como os Lactobacillus. Esta
tcnica foi desenvolvida visando determinar o tipo de antibitico a ser utilizado, bem como a
dosagem ideal necessria para combater essas bactrias.

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9.1 Preparo de m eio

Meio A

Glicose 40 g/l
Etanol 40 g/l (colocar depois de estril)
Extrato de levedura 5 g/l
pH 5,0 (com H2SO4)

Colocar 1 mL de soluo de Verde de Bromocresol (0,22 g/100 mL) para cada 100 mL do meio.

Esterilizar a 121C por 15 min.

9.2 Procedim ento para anlise

Esterilizar 11 tubos de ensaio com tampa rosquevel e colocar 4 mL do meio A em cada tubo.
Preparar a amostra (vinho) a ser analisada:

Bater por 2 horas (agitao); deixar decantar por 2 horas ou mais; centrifugar o sobrenadante
por 2 a 4 minutos a 4.000 rpm.

Acertar o pH do sobrenadante para 5,0 (verificar se no existe levedura, deve conter apenas
bactrias).

Colocar 1 mL do sobrenadante (inculo) em cada tubo com 4 mL do meio A + a dosagem de


antibitico a ser pesquisado (ideal de 0 "branco ou testemunha" a 3 ppm).

Encubar em estufa a 37C por 18 a 24 horas.

A viragem do indicador do meio de verde para verde claro ou amarelo indica o crescimento de
bactrias.

A menor dosagem onde no houve viragem de colorao a dosagem ideal de antibitico ou


MIC. Quando a viragem no ocorrer claramente verifica-se o resultado pela queda do pH, ou
seja, a menor dosagem onde no houve queda de pH a dosagem ideal do produto.

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Fig 9.1 -Teste de MIC

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10 Referncias Bibliogrficas

SUSSMAN, A. S. Microorganismos: crescimento, nutrio e interao. EDART, 1970.

LEHNINGER, A. L. Bioqumica; traduo de J. R. Magalhes e outros. 2. ed. So Paulo: Edgard


Blucher, 1976. 4 v.

CARPENTER, P. C. Microbiology. 4. ed. W.B. Sanches, 1977.

MERCK. Manual de Microbiologia de Alimentos.

ABNT. Normas tcnicas.

CADERNOS COPERSUCAR SRIE INDUSTRIAL, n. 5, mar. 1983.

COOPERATIVA DE PRODUTORES DE CANA, ACAR E LCOOL DO ESTADO DE SO PAULO


LTDA. Fermentao. Piracicaba: Centro de Tecnologia Copersucar / Diviso Industrial, 1987.
434 p. il.

BIER, O. Bacteriologia e imunologia.

AZEVEDO, Joo Lcio de. Gentica de microorganismos: em biotecnologia e engenharia gentica.


Piracicaba: FEALQ, 1985. 173 p.

LIMA, Urgel de Almeida; AQUARONE, Eugnio; BORZANI, Walter. Tecnologia das fermentaes.
So Paulo: Edgard Blucher, 1975. 285 p. (Biotecnologia, 1).

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