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Isolamento e cultivo de microalgas

Technical Report September 2013


DOI: 10.13140/2.1.3353.3767

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Juliana Wojciechowski
Universidade Federal do Paran
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ISOLAMENTO E CULTIVO DE
MICROALGAS
Sumrio
MICROALGAS.......................................................................................................................... 1
1. O que so microalgas?............................................................................................................ 2
2. Cultivo de microalgas............................................................................................................. 3
3. Produtos das microalgas em cultivo ....................................................................................... 4
3.1 Fixao de CO2.................................................................................................................. 4
3.2 Tratamento de efluentes .................................................................................................... 5
3.3 Produo de biocombustveis............................................................................................ 5
3.4 Produo de biossurfactantes de microalgas ..................................................................... 8
3.5 Alimentao ...................................................................................................................... 8
Principais grupos de microalgas ............................................................................................... 10
CIANOBACTRIAS ............................................................................................................... 11
1. Cianobactrias ...................................................................................................................... 12
1.1 Caractersticas gerais....................................................................................................... 12
1.2 Taxonomia do grupo ....................................................................................................... 13
1.3 Principais gneros de cianobactrias............................................................................... 14
1.4 Floraes de cianobactrias............................................................................................. 18
1.5 Toxinas produzidas por cianobactrias ........................................................................... 19
2. Por que isolar cianobactrias? .............................................................................................. 20
2.1 Spirulina platensis, uma cianobactria entre as microalgas mais cultivadas no mundo. 21
DINOFLAGELADOS .............................................................................................................. 23
1. Dinoflagelados...................................................................................................................... 24
1.1 Caractersticas gerais....................................................................................................... 24
1.2 Taxonomia do grupo ....................................................................................................... 25
1.3 Principais gneros de dinoflagelados de gua doce ........................................................ 26
DIATOMCEAS ..................................................................................................................... 30
1. Diatomceas.......................................................................................................................... 31
1.1 Caractersticas gerais....................................................................................................... 31
1.2 Taxonomia do grupo ....................................................................................................... 33
1.3 Reproduo...................................................................................................................... 34
1.4 Motilidade ....................................................................................................................... 35
1.5 Principais gneros de diatomceas de gua doce ............................................................ 36
Isolamento e cultivo de microalgas .......................................................................................... 37
1. Materiais necessrios............................................................................................................ 38
2. Equipamentos necessrios .................................................................................................... 39
3. Meio de cultura e condies laboratoriais ............................................................................ 39
3.1 Principais fatores que permitem o crescimento de microalgas em laboratorio............... 40
3.1.1 Luz ............................................................................................................................ 40
3.1.2 Temperatura .............................................................................................................. 41
3.1.3 Oxignio e gs carbnico.......................................................................................... 41
3.1.4 pH.............................................................................................................................. 42
3.1.5 Macronutrientes ........................................................................................................ 42
3.1.5.1 Nitrognio........................................................................................................... 42
3.1.5.2 Fsforo................................................................................................................ 43
3.1.5.3 Slica ................................................................................................................... 43
3.1.5.4 Outros macronutrientes....................................................................................... 44
3.1.6 Micronutrientes ......................................................................................................... 44
3.2 Preparo do meio de cultivo adequado ............................................................................. 45
3.2.1 Cuidados a serem tomados durante o preparo das solues ..................................... 46
3.3 Coleta de amostras de microalgas ................................................................................... 46
3.4 Isolamento de microalgas................................................................................................ 47
3.4.1 Tcnica de isolamento por capilaridade: .................................................................. 47
3.4.2 Diluio seriada ........................................................................................................ 48
3.4.3 Inoculao em placa de Petri .................................................................................... 49
3.4.4 Migrao fototxica .................................................................................................. 49
3.5 Manuteno das culturas ................................................................................................. 50
3.5.1 Condies gerais para a manuteno de microalgas em laboratrio ........................ 50
3.5.2 Tipos de culturas ....................................................................................................... 51
3.5.2.1 Culturas contnuas .............................................................................................. 52
3.5.2.2 Culturas no contnuas........................................................................................ 52
3.6 Uso da capela de fluxo laminar ....................................................................................... 53
3.7 Outros procedimentos de laboratrio .............................................................................. 54
3.7.1 Limpeza e esterilizao de vidraria .......................................................................... 54
3.7.2 Descartes de culturas................................................................................................. 54
3.7.3 Descontaminao de culturas de cianobactrias ....................................................... 55
3.7.3.1 Protocolo para descontaminao por outras microalgas..................................... 55
3.7.3.2 Protocolo para descontaminao por fungos e bactrias .................................... 56
ndices e clculos relacionados................................................................................................. 58
1. Curva de crescimento ........................................................................................................... 59
2. Medidas do crescimento ....................................................................................................... 60
2.1 Contagem de clulas de cianobactrias ........................................................................... 60
2.1.1 Contagem em cmara de Fuchs-Rosenthal ............................................................... 61
2.1.2 Contagem em cmara Sedgwick-Rafter.................................................................... 62
2.1.3 Contagem em cmara de sedimentao .................................................................... 63
2.1.4 Erro na contagem ...................................................................................................... 65
2.2 Clculo do biovolume ..................................................................................................... 65
2.3 Turbidez .......................................................................................................................... 66
2.4 Estimativa de peso seco................................................................................................... 68
2.5 Anlise de Clorofila ........................................................................................................ 68
2.5.1 Extrao de clorofila ................................................................................................. 69
2.5.2 Mtodos de quantificao de clorofila...................................................................... 69
3. Taxa de crescimento ............................................................................................................. 70
4. Duplicaes por dia .............................................................................................................. 71
5. Tempo de duplicao............................................................................................................ 71
6. Tempo de gerao................................................................................................................. 72
7. Q10......................................................................................................................................... 73
6. Ik ........................................................................................................................................... 74
ANEXOS .................................................................................................................................. 75
ANEXO 1 Protocolo de preparao do meio F/2 .................................................................. 76
ANEXO 2 Protocolo de preparao do meio ASM-1 ........................................................... 78
Glossrio de termos relacionados ............................................................................................. 80
Autores

Ma. Juliana Wojciechowski


Formada em Cincias Biolgicas (Licenciatura/Bacharel) pela
Universidade Federal do Paran - UFPR (2010). Mestre em Botnica pelo
Programa de Ps-graduao em Botnica da Universidade Federal do
Paran - UFPR (2013), ttulo da dissertao: Efeitos da temperatura,
fsforo e luz no crescimento da cianobactria Cylindrospermopsis
raciborskii Seenayya et Subba Raju do reservatrio de Alagados, Paran.
Atualmente doutoranda do Programa de Ps-graduao em Ecologia e
Conservao da Universidade Federal do Paran UFPR, ttulo da tese:
Fatores promotores das floraes de cianobactrias toxignicas.
pesquisadora do Laboratrio de Ficologia e do Laboratrio de Anlise e
Sntese em Biodiversidade (LASB), ambos na mesma universidade. Tem
pesquisado os gatilhos que levam s floraes de cianobactrias
potencialmente txicas em reservatrios, utilizando diferentes abordagens,
como experimentos laboratoriais, monitoramento em campo e meta-anlise.
Experincia em limnologia aplicada, ecologia e monitoramento do
fitoplncton em reservatrios destinados ao abastecimento pblico e
ecofisiologia de cianobactrias.

Bil. Arielli Straube


Formada em Cincias Biolgicas (Licenciatura/Bacharel) pela
Universidade Federal do Paran - UFPR (2011). Atualmente mestranda do
Programa de Ps-graduao em Botnica da Universidade Federal do
Paran - UFPR. Trabalha como pesquisadora do Laboratrio de Ficologia
da mesma universidade. Participa de projetos voltados a estudos
diatomolgicos nos ecossistemas aquticos paranaenses e outros estados
brasileiros. Experincia na rea de Botnica, com nfase em taxonomia de
diatomceas.
Me. Kaoli Pereira Cavalcante
Formado em Cincias Biolgicas (Bacharelado) pela Universidade
Estadual de Santa Cruz - UESC (2008). Mestre em Botnica pelo Programa
de Ps-graduao em Botnica da Universidade Federal do Paran - UFPR
(2011), ttulo da dissertao: Taxonomia da diatomcea potencialmente
txica Pseudo-nitzschia Peragallo (Bacillariophyceae) em reas de
maricultura de Santa Catarina. Atualmente doutorando do Programa de
Ps-graduao em Botnica pela Universidade Federal do Rio Grande do
Sul - UFRGS, ttulo da tese: "Dinoflagelados planctnicos em reservatrios
do estado do Paran: taxonomia e ecologia". Trabalha como pesquisador do
Laboratrio de Ficologia da Universidade Federal do Paran. Experincia
em taxonomia e ecologia de diatomceas e dinoflagelados.

Bil. Flvia Ehlke Miranda


Formada em Biologia (Bacharelado) pela Pontifcia Universidade
Catlica do Paran - PUC-PR (2006). Atualmente mestranda do Programa
de Ps Graduao em Botnica da Universidade Federal do Paran - UFPR.
Trabalha como pesquisadora do Laboratrio de Ficologia da mesma
universidade. Tem experincia na identificao de diatomceas. Participa de
projetos voltados ao cultivo e taxonomia de diatomceas marinhas.
MICROALGAS

1
1. O que so microalgas?
As algas compreendem um grupo artificial muito diverso de organismos
fotossintetizadores. Esses organismos so classificados como talfitos, isto , plantas
inferiores, por apresentarem uma estrutura simples, no vascularizada, sem raiz, caule e
folhas. As estruturas reprodutivas das microalgas so desprotegidas, produtoras de esporos e
desprovidas de sementes e flores (criptgamas).
As microalgas podem ser procariticas ou eucariticas, pluricelulares ou unicelulares,
e apresentam similaridade em muitos aspectos com as plantas superiores, como, por exemplo,
a composio de seus carboidratos de reserva, protenas e pigmentos fotossintticos. As algas
possuem clorofila a como seu pigmento fotossinttico primrio. Outros tipos de clorofila, bem
como carotenides (caroteno e fucoxantina), ficocianina e ficoeritrina apresentam uma
distribuio mais limitada nas algas, funcionando como pigmentos acessrios.
As algas apresentam uma ampla distribuio geogrfica, podendo ser encontradas em
praticamente todas as condies ambientais da Terra, desde solos frteis a desertos quentes e
frios. Entretanto, no ambiente aqutico, tanto marinho quanto em guas epicontinentais, que
encontramos maior prevalncia das microalgas. Nos ambientes aquticos as algas
desempenham um papel central na base da cadeia alimentar, na qual funcionam com
produtores primrios, produzindo matria orgnica e dixido de carbono, alm de servirem
como fonte de oxignio, necessrios para o metabolismo dos consumidores.
A tradicional classificao das microalgas tem sido baseada nos tipos de pigmentos,
natureza qumica dos produtos de reserva e constituintes da parede celular. Tambm tm sido
considerados aspectos citolgicos e morfolgicos nessa classificao, tais como a ocorrncia
de clulas flageladas, a estrutura dos flagelos, os processos de formao do ncleo e da
diviso celular, a presena e a caracterizao de envoltrio do(s) cloroplasto(s) e a possvel
conexo entre o retculo endoplasmtico e a membrana nuclear. Alm dessas caractersticas,
tcnicas de biologia molecular tm sido igualmente usadas.
As microalgas fazem parte de grupo muito heterogneo de organismos,
predominantemente aquticos e geralmente unicelulares microscpicos, podendo formar
colnias e apresentar pouca ou nenhuma diferenciao celular. A colorao desses
organismos variada e caracterstica, oportunizada pela presena de pigmentos e mecanismo
fotoautotrfico. Filogeneticamente, as microalgas so um grupo polifiltico, cujos

2
representantes so dispersos em pelo menos cinco das grandes linhagens eucariticas e um
importante grupo procaritico. O termo microalgas, portanto, no tem valor taxonmico,
uma vez que engloba micro-organismos com clorofila a e outros pigmentos fotossintticos
capazes de realizar a fotossntese oxignica.
Sob a denominao microalgas esto includos organismos com dois tipos de estrutura
celular: estrutura procaritica, com representantes nas Divises Cyanophyta (cianobactrias) e
Prochlorophyta; estrutura celular eucaritica, com representantes nas Divises Chlorophyta,
Euglenophyta, Rhodophyta, Haptophyta, Heterokontophyta (Bacillariophyceae,
Chrysophyceae, Xantophyceae etc.), Cryptophyta e Dinophyta, segundo Hoek et al. (1995).
As microalgas so caracterizadas como micro-organismos fotossintticos, que
combinam gua e dixido de carbono atmosfrico com luz solar para produzirem vrias
formas de energia para produzirem biomassa (polissacardeos, protenas, lipdios e
hidrocarbonetos), que pode ser utilizada na produo de biocombustveis e suplementos
alimentares, e tambm podem ser empregados na captura de dixido de carbono da atmosfera.
As microalgas produzem mais oxignio de que todas as plantas juntas existentes no mundo,
sendo responsveis por pelo menos 60% da produo primria da Terra.
A biomassa microalgal apresenta cerca de 50% de carbono na sua composio, assim
o fornecimento deste nutriente aos cultivos representa um importante componente dos custos
de produo, seja gasoso na forma de dixido de carbono, ou slido, principalmente na forma
de bicarbonato.

2. Cultivo de microalgas
Em razo de suas pequenas dimenses, muitos estudos com microalgas so
substancialmente favorecidos se elas so cultivadas. O cultivo de microalgas um sistema
biolgico eficiente na utilizao da energia solar para a produo de matria orgnica, o que
possibilita grandes rendimentos anuais de biomassa (alta produtividade). Alm disso, o
cultivo de microalgas apresenta algumas vantagens como a simplicidade de nutrientes
necessrios, a duplicao da biomassa em um curto perodo de tempo e a possibilidade de
manipular suas condies, de modo a aumentar a produo de um metablito especfico. Tais

3
compostos apresentam um elevado valor comercial, principalmente por serem produtos
naturais.
Algas e microalgas so fontes de molculas de alto valor agregado. A composio
bioqumica das clulas destes organismos possui caractersticas interessantes, uma vez que
apresenta significativas propores de protenas, lipdeos, carboidratos, pigmentos e minerais.
Esses produtos podem ser utilizados como ingrediente de alimentos destinados ao consumo
humano, alimentao animal, extrao de biomolculas e produo de biocombustveis.
O ciclo de vida da maioria das microalgas se completa em poucas horas, o que
favorece a seleo de cepas e o melhoramento gentico das espcies.
O cultivo de microalgas uma disciplina relativamente recente, mas vem alcanando
progressos notveis nas ltimas dcadas. Diversas aplicaes importantes podem ser feitas
por intermdio dos cultivos de microalgas.

3. Produtos das microalgas em cultivo

3.1 Fixao de CO2

A fotossntese a principal rota de fixao de carbono das microalgas, sendo a luz


solar sua principal fonte de energia. Por meio da fotossntese, as microalgas convertem os
nutrientes em matria orgnica celular e liberam oxignio. Os nutrientes necessrios para a
realizao da fotossntese so uma fonte de carbono, nitrognio, fsforo, potssio, ferro e
alguns outros oligoelementos.
A biofixao de dixido de carbono (CO2) por microalgas tem provado ser um mtodo
eficiente e econmico, principalmente devido alta capacidade fotossinttica desses micro-
organismos. As microalgas utilizam esse gs como fonte de nutrientes para o seu
desenvolvimento.
Cultivos de microalgas podem ser desenvolvidos para biofixar o CO2 proveniente de
indstrias, que so responsveis por 80% da queima de combustveis mundial. Esses
biofixadores tambm podem ser instalados em plantas de energia eltrica para biofixar o CO2

4
proveniente do gs de combusto do carvo e contribuir para a reduo do aquecimento
global.

3.2 Tratamento de efluentes

A composio dos efluentes pode variar de acordo com sua origem. Muitos efluentes
podem conter grande quantidade de matria orgnica ou, ainda, apresentar altas concentraes
de metais txicos, representando um grave problema para o meio ambiente.
A cultura de Spirulina em efluente suno demonstrou a possibilidade do seu uso na
remoo de DQO e fsforo, alm da produo de biomassa, podendo ser uma possvel
soluo para o impacto ambiental gerado pela descarga de efluentes em fontes naturais. A
biomassa produzida pode ser adicionada a raes de peixes.
Os estudos baseados em processos biolgicos para o tratamento de efluentes tm se
intensificado. A biossoro, que consiste na absoro de metais txicos por microrganismos,
pode ser uma alternativa sem efeitos deletrios ao ambiente. As principais vantagens da
biossoro so baixo custo e boa eficincia. Dentre os micro-organismos utilizados na
biossoro, as microalgas possuem destaque em funo da sua capacidade de reteno e
imobilizao de metais. Essa tecnologia promissora e est em expanso.

3.3 Produo de biocombustveis

Segundo pesquisas recentes, as reservas mundiais de leo estaro exauridas em 40


anos e as de gs em 60 anos. Este fato, associado ao aumento do efeito estufa e da
temperatura global, torna necessrio o desenvolvimento de tecnologias para a produo de
combustveis alternativos, como os biocombustveis.
Biocombustvel o nome dado a um combustvel alternativo produzido a partir de
recursos renovveis animais ou vegetais. O exemplo brasileiro e mundial mais conhecido o
lcool etlico produzido da cana de acar. No entanto, outros biocombustveis - como o
biodiesel - tambm so alternativas viveis e bem estabelecidas em alguns pases.

5
O biodiesel fabricado por meio de um processo qumico chamado transesterificao,
onde a gordura ou o leo vegetal so separados, gerando o glicerol e cidos graxos, os quais
so esterificados, geralmente utilizando metanol e catalisadores. Os steres produzidos nesse
processo (biodiesel) e glicerina (produto que pode ser aproveitado na indstria farmacutica e
de cosmticos) so livres de compostos sulfurados e aromticos e, at o momento, estudos
tm mostrado que so menos txicos que o diesel.

Tabela 1 - Vantagens do uso de microalgas na produo de biocombustveis.


Caracterstica Vantagem
Ciclo de vida curto Rpido crescimento e elevada concentrao
de lipdios;
Pode-se manipular geneticamente a fim de
aumentar a fotossntese e a concentrao de
triacilgliceris, a fim de direcionar a
biomassa para a produo de biodiesel.

Tamanho microscpico Sem requerimento por terras arveis, sem


conflito com a produo de alimentos.

Simplicidade de requerimentos Mecanismo fotossinttico similar ao das


plantas superiores convertendo CO2 em
carboidratos e lipdios;
Remoo de grandes quantidades de CO2 do
meio ambiente;
Podem ser produzidas a partir de resduos ou
efluentes.

Simplicidade de produo Emisso menor de dixido de enxofre, xido


ntrico e outros contaminantes em
comparao com diesel.

Vrias fontes de biomassa contendo triacilglicerdeos podem ser utilizadas para a


produo de biocombustveis. Atualmente, algas esto sendo investigadas para a produo
desses compostos. As microalgas podem ser utilizadas para a produo de biometano,
biodiesel, biohidrognio e bioetanol. O uso de microalgas para a produo de biocombustveis
, desta forma, vantajoso (Tabela 1) e uma alternativa aos combustveis fsseis.
O potencial bastante promissor se for considerado o baixo custo, ausncia de
competio com a agricultura e facilidade de manejo. Grandes avanos tm sido obtidos por
pesquisadores no mundo todo atravs de cultivos de diversas microalgas (Tabela 2) em
fotobiorreatores, capazes de aumentar a produtividade em biomassa.

6
Tabela 2 - Principais microalgas cultivadas para uso comercial e suas aplicaes.
Grupo Aplicaes Microalgas

Achnanthes
Amphora
Capartogramma
Biocombustveis Catenula
Nanotecnologia Chaetoceros
Diatomceas Medicina Coscinodiscus
Alimentao animal Eunotia
Bioindicao Fragilaria
Gomphonema
Thalassiosira
Skeletonema

Biocombustveis Dinophyceae
Dinoflagelados Alimentao humana Noctiluciphyceae
Bioindicao Syndiniophyceae

Biocombustveis Pediastrum
Alimentao humana Botryococcus
Algas Verdes Alimentao animal Chlorella
Bioindicao Chamydomonas
Biofertilizante Dunaliella
Scenedesmus

Biocombustveis
Despoluio e regenerao de solos
Tratamento de guas residuais
Remoo de metais pesados Spirulina
Cianobactrias Medicina Oscillatoria
Reduo do CO2 Cyanothece
Alimentao humana
Alimentao animal
Bioindicao

7
3.4 Produo de biossurfactantes de microalgas

Os biossurfactantes so compostos tensoativos que so produzidos extracelularmente


ou como parte da membrana celular de microrganismos como bactrias, fungos e leveduras.
Esses compostos apresentam as mesmas caractersticas dos surfactantes produzidos
sinteticamente, tais como diminuio da tenso superficial e alta capacidade emulsificante.
As caractersticas surfactantes das molculas so devidas a estrutura que contm uma
poro hidroflica, composta de aminocidos ou peptdeos nions ou ctions, mono, di ou
polissacardeos e uma poro hidrofbica, constituda de cidos saturados, insaturados e
cidos graxos hidroxilados ou lcoois graxos de cadeias longas.
O surfactante um agente tensoativo, o que significa que ele reduz acentuadamente a
tenso superficial da gua. Esses compostos so usados como aditivos de desempenho para
frmulas em vrios setores, como cuidados pessoais e produtos de limpeza, e em vrias
aplicaes industriais, como no tratamento de metal, limpeza industrial, extrao de petrleo,
agroqumicos, entre outros. Os surfactantes so utilizados no efeito de espuma, na
modificao de superfcies, purificao, emulso, proteo ambiental e proteo da sade.

3.5 Alimentao

Atualmente, as pesquisas em biotecnologia alimentar empregando microalgas vm


ganhando especial ateno. No entanto, a coleta e o cultivo para utilizao na alimentao
humana so realizados h sculos.
Vrias espcies so cultivadas comercialmente em alguns pases e a biomassa
produzida tem sido utilizada como fonte de produtos para aplicao na indstria de alimentos.
O mercado de alimentos funcionais, utilizando microalgas em massas, pes, iogurtes e
bebidas, apresenta rpido desenvolvimento em pases como Frana, Estados Unidos, China e
Tailndia.
Diversas microalgas tm sido cultivadas por sua capacidade de sintetizar compostos
considerados nutracuticos, tais como os cidos graxos poli-insaturados (cido araquidnico -
ARA, cido eicosapentaenico EPA e cido docosahexaenico DHA, por exemplo) e
pigmentos carotenides (astaxantina, betacaroteno, lutena, cantaxantina etc.), que apresentam

8
propriedades teraputicas. Atualmente, so comercializadas como alimento natural ou
suplemento alimentar e so encontradas formulaes em p, tabletes, cpsulas ou extratos.
So tambm incorporadas em massas, petiscos, doces, bebidas etc., tanto como suplemento
nutricional quanto como corantes naturais.
As microalgas so aplicadas tambm em aquicultura, para a alimentao direta ou
indireta de algumas espcies de peixes, moluscos, crustceos e de diversos organismos
forrageiros de interesse econmico.

9
Principais grupos
de microalgas

10
CIANOBACTRIAS

11
1. Cianobactrias

1.1 Caractersticas gerais

As cianobactrias so organismos procariontes, ou seja, no possuem ncleo


individualizado por membrana nem organelas membranosas intracelulares. A organizao
intracelular das cianobactrias simples e semelhante das bactrias gram negativas. Apesar
de no haver um ncleo individualizado, o material gentico fica protegido internamente no
citoplasma (hialoplasma) pelos tilacides que se localizam externamente prximos da
membrana (cromoplasma). Esses organismos so includos no grupo das algas por realizarem
fotossntese, mas podem ocorrer na maioria dos ecossistemas terrestres, inclusive em
ambientes considerados extremos, como fontes termais, salinas, neve e deserto.
Essa variedade de ambientes que podem ser habitados pelas cianobactrias deve-se
grande capacidade de adaptao do grupo, decorrente de sua longa histria evolutiva. O
registro fssil, encontrado em rochas sedimentares (estromatlitos) do noroeste australiano,
indica que o grupo teria aparecido no on Arcaico, estimando-se seu aparecimento h cerca
de 3,5 bilhes de anos. As cianobactrias foram, provavelmente, os primeiros seres vivos
autotrficos a liberar oxignio na atmosfera primitiva (h cerca de 1,2 mil milhes de anos),
permitindo o posterior aparecimento das plantas e dos animais.
Segundo a Teoria Endossimbitica, as cianobactrias estabeleceram associaes com
clulas de maiores dimenses e deram origem aos primeiros seres eucariontes fotossintticos.
Ainda hoje, as cianobactrias tm importantes funes nos processos funcionais dos
ecossistemas e no fluxo global de nutrientes na biosfera.

12
1.2 Taxonomia do grupo

As cianobactrias foram, por muito tempo, denominadas algas verdes-azuis, devido


colorao que apresentam. Atualmente, sabe-se que estes organismos no tm qualquer
relao filogentica com os grupos de algas.
A taxonomia do grupo est fundamentada na morfologia externa, organizao do talo,
medidas das clulas vegetativas e reprodutivas, tipo de colnia e disposio das clulas na
colnia, relao entre comprimento e largura ou largura e comprimento das clulas, relao
entre o dimetro e a distncia das espiras, estrutura dos tricomas, forma do pice dos tricomas,
entre outras caractersticas. Outras caractersticas importantes para o sucesso do grupo e que
so usadas na taxonomia so, por exemplo, a presena e espessura da bainha de mucilagem,
nmero, localizao e espaamento dos acinetos e hetercitos, presena de vesculas de gs e
grnulos de polifosfato.
A bainha de mucilagem composta de polissacardeos e auxilia na manuteno do
organismo na zona euftica (flutuabilidade) e na resistncia a herbivoria. Algumas espcies de
cianobactrias so diazotrficas, ou seja, podem fixar nitrognio atmosfrico a partir de uma
estrutura denominada hetercito. O hetercito uma clula especializada com paredes
espessas que impede a difuso de oxignio para o seu interior. A anoxia no interior dos
hetercitos permite o funcionamento da enzima nitrogenase que a responsvel pela fixao
no nitrognio. O acineto outro tipo de clula especializada com paredes espessadas e reserva
interna de nutrientes que funciona como uma estrutura de resistncia. Em condies
desfavorveis ao crescimento da cianobactria o acineto pode permanece dormente ate que as
condies voltem a ser adequadas. As vesculas de gs podem ser formadas no interior das
clulas e permitem o controle da posio vertical na coluna de gua. Algumas cianobactrias
podem tambm armazenar fsforo no interior das clulas em grnulos de polifosfato.
Mais recentemente, caractersticas como padres de diviso celular (orientao do eixo
de diviso celular) e morfologia ultraestrutural das lamelas tambm tm sido utilizadas para a
identificao das espcies. Os sistemas de classificao mais modernos tm incorporado no
somente as caractersticas morfolgicas e ultraestruturais, mas tambm a gentica molecular
para a identificao das espcies.
Algumas obras classicamente utilizadas na identificao de cianobactrias so:
Anagnostidis & Komark (1985, 1988, 1990), Komark & Anagnostidis (1986, 1989). De

13
acordo com esse sistema de classificao, a classe Cyanophyceae compreende quatro ordens
(Tabela 3).

Tabela 3 - Ordens da classe Cyanophyceae, forma do talo caracterstico de cada ordem e


exemplos de gneros que elas agrupam.
Ordem Forma do talo Principais gneros
Aphanocapsa
Unicelulares ou coloniais;
Chroococcus
Chroococcales reproduo por diviso celular,
Merismopedia
baeocitos ou exsporos.
Microcystis
Pseudoanabaena
Phormidium
Filamentosos homocitados;
Oscillatoria
Oscillatoriales reproduo por hormognios e
Lyngbya
hormocitos
Planktothrix
Spirulina
Stigonema
Filamentosos heterocitados, sem
Nostoc
ramificaes ou com ramificaes
Dolichospermum
Nostocales falsas;
Aphanizomenon
reproduo por hormognios e
Nodularia
hormocitos
Cylindrospermopsis
Filamentosos heterocitados, com
ramificaes verdadeiras;
Stigonematales Stigonema
reproduo por hormognios e
hormocitos

1.3 Principais gneros de cianobactrias

Planktothrix Anagnostidis et Komrek

Caractersticas:
Filamentos solitrios, raramente em pequenos fascculos irregulares (grupos) de fcil
desintegrao, mais ou menos retos ou ligeiramente ondulados, isopolares, vida livre,
geralmente sem bainha. Tricomas cilndricos, com clulas ligeiramente constritas nas paredes
transversais, certas vezes ligeiramente afilado nas extremidades. Clulas ligeiramente mais
curtas do que largas at isodiamtricas, raramente ligeiramente mais longas que largas, na
maioria das vezes com aertopos por todo o volume da clula. Clulas finais (quando

14
totalmente desenvolvido) amplamente arredondadas ou ligeiramente reduzidas, com parede
celular espessa ou com caliptra. Pode ocorrer falsa ramificao, hetercitos e acinetos
ausentes.

Figura 1 Tricomas de Planktothrix agardhii.

Microcystis Ktzing ex Lemmermann

Caractersticas:
Unicelular-colonial; colnias gelatinosas, livres flutuantes ou anexadas a substrato,
esfricas, discides ou irregulares. Podem tornar-se macroscpicas, amorfas, irregulares, com
clulas irregularmente distribudas dentro de um envelope comum, s vezes densamente
aglomeradas; mucilagem colonial incolor, geralmente homognea, fina, discreta, raramente
com a margem limitada. Clulas esfricas ou hemisfricas (aps a diviso), com contedo
homogneo, azul-verde, acinzentado ou amarelado, com vrios at numerosos aertopos.
Vrias cepas so txicas.

Figura 2 Colnia de Microcystis aeruginosa.

15
Dolichospermum Wacklin, Hoffmann et Komrek

Caractersticas:
Os tricomas so isopolares, metamricos com relao posio dos hetercitos, com
constries nas paredes transversais, sem bainhas firmes, s vezes com fina bainha
mucilaginosa, envelopes disfluentes. As clulas apicais so morfologicamente semelhantes s
clulas vegetativas, no se diferenciam e so capazes de se dividir. Vesculas de gs ocorrem
obrigatoriamente em clulas em fase vegetativa. Hetercitos aparecem intercalarmente,
solitrios (excepcionalmente em pares), e desenvolvem-se a partir de clulas vegetativas em
posio metamrica. Os acinetos podem desenvolvem-se paraheterociticamente, o que
significa que surgem ligados com os hetercitos, raramente ao lado do hetercito ou de ambos
os lados, mais comumente separado deles por vrias clulas, solitrios at 5 (6) em uma
fileira. Os acinetos maduros so, geralmente, trs ou mais vezes maior que as clulas
vegetativas. Todas as espcies (morfotipos) so planctnicas em estado vegetativo, nunca
formam tapetes ssseis sobre o substrato. Os filamentos vivem solitrios ou em pequenos
grupos.

Figura 3 Filamentos de Dolichospermum com bainha de mucilagem.

Aphanizomenon Morren ex Bornet et Flahault

Caractersticas:
Filamentosas; filamentos de livre flutuao, solitrios, apenas em algumas espcies
unidos em colnias ou fascculo; Microscpicos ou colnias macroscpicas (at 2 cm de

16
comprimento) com tricomas paralelamente orientados; Tricomas retos, ligeiramente curvados
ou ligeiramente enrolados, cilndricos ao longo do comprimento ou acentuadamente ou
continuamente reduzidos em direo s extremidades, sem constrio nas paredes
transversais, sempre sem bainhas firmes, vrias espcies com envelope mucilaginoso muito
fino e incolor; Tricomas isopolares, com clulas distintamente alongadas e s vezes
vacuolizadas nas extremidades, sempre subsimtricos (deslocados para uma extremidade do
tricoma). Clulas vegetativas cilndricas ou em forma de barril, colorao azul-verde plido
ou azul-esverdeada, geralmente com aertopos. Hetercitos em forma de barril ou cilndricos
com extremidades arredondadas ou obtusas. Acinetos raramente esfricos ou ovais,
cilndricos com extremidades arredondadas, desenvolvendo solitariamente ou em linhas curtas
(de dois ou trs), geralmente em posio assimtrica no tricoma.

Figura 4 Tricoma de Aphanizomenon com hetercito.

Cylindrospermopsis Seenayya et Subba Raju

Caractersticas:
Filamentos de livre flutuao, solitrios, retos, curvos ou espiralados, em vrias
espcies afilados em direo as extremidades, sem bainha mucilaginosa. Tricomas isopolares
(heteropolares apenas em tricomas com apenas um hetercito), subsimtrico, com ou sem
constries nas paredes transversais. As clulas so cilndricas ou em forma de barril,
geralmente mais longas que largas, de colorao azul-esverdeado plido, amarelado ou verde-
oliva, facultativamente com aertopos; Clulas finais cnicas ou pontiagudas. Hetercitos
apenas terminal, oval, ovide ou cnico; Acinetos so elipsoidais ou cilndricos,

17
desenvolvem-se usualmente ligeiramente afastados dos hetercitos, raramente adjacentes aos
hetercitos apicais. Reproduo por fragmentao do tricomas e por acinetos.

Figura 5 Tricoma de Cylindrospermopsis com dois hetercitos terminais.

1.4 Floraes de cianobactrias

O crescimento acelerado de cianobactrias em ecossistemas aquticos denominado


florao (ou Bloom, do ingls). Muitas floraes j foram reportadas em corpos de gua
brasileiros, inclusive em reservatrios utilizados para o consumo humano. Entre as principais
espcies potenciais formadoras de floraes esto Microcystis, Cylindrospermopsis,
Dolichospermum (antiga Anabaena), Planktothrix, Aphanizomenon, entre outras.
As floraes podem interferir no equilbrio dos ecossistemas aquticos de diversas
maneiras. A dominncia de algumas espcies de cianobactrias diminui drasticamente a
diversidade do ecossistema. O crescimento acelerado de algumas espcies (por exemplo,
Microcystis) cria um biofilme superficial que altera a transparncia da gua, diminuindo a
disponibilidade de luz para os outros organismos fotossintetizantes e levando a dominncia da
cianobactria formadora da florao. Quando as floraes comeam a morrer, as clulas so
decompostas por bactrias que utilizam oxignio nesse processo, levando a anoxia (ausncia
de oxignio) no corpo de gua. Alm disso, as floraes representam um srio problema para
as estaes de tratamento de gua, pois podem causar perda de filtros, alterao no odor e no
sabor da gua tratada e formar compostos prejudiciais sade humana.
As floraes so muitas vezes atribudas a eutrofizao das guas, que constitui um
dos mais srios problemas de qualidade de gua na atualidade. A eutrofizao consiste no
excessivo enriquecimento das guas por nutrientes, principalmente fsforo e nitrognio,

18
compostos essenciais sobrevivncia e multiplicao das cianobactrias. As alteraes
naturais dos ecossistemas e as atividades humanas, como o uso recorrente de adubos e
fertilizantes, descargas sanitrias e explorao agrcola e agropecuria, tm contribudo para a
degradao da qualidade das guas e para o fenmeno da eutrofizao.
A ocorrncia de floraes em ecossistemas de gua doce atribuda a caractersticas
das cianobactrias como sua capacidade de regular a posio na coluna de gua, ajustar a
composio relativa dos pigmentos em funo da quantidade e intensidade luminosas, alta
afinidade e eficincia na absoro de fsforo, habilidade de fixar nitrognio atmosfrico, entre
outras. O estudo das floraes e o conhecimento de suas causas so essenciais para sua
preveno e manejo.

1.5 Toxinas produzidas por cianobactrias

A ocorrncia de floraes de cianobactrias nos corpos de gua utilizados para


abastecimento urbano pode representar um srio risco sade da populao, em razo da
capacidade de alguns desses organismos de produzir potentes toxinas. Nos ltimos anos, em
diversos locais do Brasil, tem ocorrido um aumento expressivo de floraes de cianobactrias
com presena de cianotoxinas e outros compostos.
Dentre os compostos causadores de gosto e odor, os mais conhecidos so a geosmina e
o metilisoborneol (MIB), que conferem um gosto de terra ou mofo gua.
Quanto aos mecanismos de toxicidade, as cianotoxinas podem ser dividas em
neurotxicas, hepatotxicas ou dermatotxicas (Tabela 4).
As neurotoxinas so compostos alcalides de ao rpida, produzidos por vrios
gneros de cianobactrias, cuja caracterstica o bloqueio neuromuscular. Toxinas desse
grupo provocam a morte de animais no intervalo de poucos minutos a poucas horas, devido
parada respiratria. Alguns exemplos de neurotoxinas so: anatoxina-a, anatoxina-a(s) e
saxitoxina.
As hepatotoxinas receberam maior ateno por serem as causadoras mais comuns de
intoxicaes. Essas toxinas apresentam ao mais lenta, causando a morte entre poucas horas
e poucos dias, em decorrncia de hemorragia heptica e choque hipovolmico. Alguns
exemplos de hepatotoxinas so: microcistina, nodularina e cilindrospermopsina.

19
Tabela 4 Cianotoxinas classificadas com relao ao mecanismo
de ao e seus gneros potenciais produtores.
Mecanismos
Toxina Gneros
de toxicidade
Neurotxicas Anatoxina-a Dolichospermum
Anatoxina-a(s) Cylindrospermopsis
Saxitoxina Aphanizomenon
Lyngbya
Planktothrix
Hepatotxicas Microcistina Microcystis
Nodularina Nodularia
Cilindrospermopsina Cylindrospermopsis
Oscillatoria
Aphanocapsa
Dermatotxicas Lipopolissacardeos Todas
(LPS)

Os lipopolissacardeos (LPS) so componentes da membrana celular das


cianobactrias e so endotoxinas pirognicas capazes de produzir irritaes na pele e alergias.
Esses compostos so importantes causadores de dermatites em locais destinados
balneabilidade.
As cianotoxinas so, em sua maioria, endotoxinas, pois so liberadas para o meio
externo somente atravs do rompimento da parede celular, o que acontece por senescncia das
clulas ou pela ao de fatores ambientais. Outras cianotoxinas, como a cilindrospermopsina,
podem ser excretadas pela clula em condies fisiolgicas normais.
A razo pela qual as cianotoxinas so produzidas ainda no est clara, embora alguns
autores acreditem que possa estar relacionada proteo contra herbivoria e a alelopatia.

2. Por que isolar cianobactrias?


O isolamento das cianobactrias fundamental tanto para alguns estudos taxonmicos
quanto ecofisiolgicos e de toxicidade. Atualmente, h interesse tambm para a gerao de
biomassa para alimentao e de produtos de interesse biotecnolgico e industrial, bem como o
desenvolvimento de combustveis biolgicos. Nos ltimos anos houve um importante
aumento das atividades, processos e aplicaes que envolvem estes microrganismos. Esse fato
se deve s diversas substncias com alto valor econmico sintetizadas pelas algas, como

20
cidos graxos poli-insaturados, carotenides, ficobilinas, polissacardeos, vitaminas, esteris e
diversos compostos bioativos naturais.
Algumas espcies de cianobactrias tm a taxonomia baseada, por exemplo, no modo
de reproduo, medida das clulas reprodutivas, nmero, localizao e espaamento dos
acinetos e hetercitos, padres de diviso celular (orientao do eixo de diviso celular), entre
outros. Essas caractersticas so mais facilmente observadas mantendo as espcies em cultivo.
O isolamento e cultivo das cianobactrias facilitam as observaes dos indivduos em
microscpio tico, eletrnico e de transmisso, pois a manuteno em laboratrio permite o
aumento do nmero de indivduos nas amostras e a probabilidade de encontrar as estruturas
necessrias para a identificao.
A toxicidade em concentrao de toxina produzida por clula de cianobactria pode
ser determinada com relativa confiana a partir da quantificao de toxina produzidas por
cepas mantidas em laboratrio. Alem disso, alguns parmetros ambientais podem ser variados
a fim de determinar se a produo da toxina influenciada pelo meio.
A ecofisiologia das cianobactrias pode ser estuda em laboratrio a partir de
parmetros ambientais isolados, o que pode fornecer resultados conclusivos sobre o
comportamento das espcies frente s caractersticas ambientais.

2.1 Spirulina platensis, uma cianobactria entre as


microalgas mais cultivadas no mundo
O gnero Spirulina compreende cianobactrias filamentosas com elevado teor de
protenas. A principal caracterstica morfolgica do gnero a disposio dos tricomas
multicelulares cilndricos em uma hlice esquerda aberta ao longo de todo o comprimento.
Esse grupo compreende micro-organismos planctnicos que habitam corpos de gua tropicais
e subtropicais caracterizados por elevados nveis de carbonato e bicarbonato e pH elevado (at
11). Essas cianobactrias tm sido encontradas nos mais diferentes ambientes, como guas
salobras, mar, piscinas de mar, lagoas salinas, em guas sub-rticas, lagoas tropicais e fontes
de guas termais.
Todos os membros do gnero Spirulina so fotoautotrficos e realizam fotossntese.
Espcies desse gnero no so capazes de fixar nitrognio atmosfrico. So microrganismos
com requerimentos nutricionais relativamente simples e cuja biomassa pode ser empregada

21
para obteno de biocompostos com aplicaes nutricionais e de sade. Ainda, tem sido
relatada a aplicao do gnero em tratamento de efluentes, processos de biossoro e na
produo de biocombustveis.

22
DINOFLAGELADOS

23
1. Dinoflagelados

1.1 Caractersticas gerais

Os dinoflagelados so organismos eucariticos predominantemente unicelulares,


unidos por um conjunto de caractersticas nicas, tais quais a presena de dois flagelos
distintos entre si: um longitudinal, inserido na regio posterior da clula, e um flagelo
transversal helicoidal, que circunda a clula; presena de organelas exclusivas, como psulas
e tricocistos, alm de um ncleo celular tpico, com cromossomos permanentemente
condensados, pouca ou nenhuma histona associada ao DNA e mitose atpica. Possuem cerca
de 50% de seus membros fotossinttica, e a outra metade no fotossinttica, de forma que
foram historicamente estudados ora por ficlogos (como algas), ora por protozologos (como
zooflagelados), e regidos de maneira independente por ambos os cdigos de nomenclatura
(Zoologia e Botnica), apesar de estarem includos naturalmente num mesmo grupo biolgico.
Dinoflagelados um grupo bastante diverso em forma, nutrio e hbitat. Esses
organismos podem ser encontrados em diversos ambientes aquticos, marinhos, estuarinos ou
de gua doce, geralmente, dominantes no vero. H espcies crifilas, coletadas nas camadas
de gelo durante o inverno nas regies polares. A maioria das espcies planctnica, mas h
representantes caractersticos de hbitats bnticos marinhos (ex. Prorocentrum, Ostreopsis,
Gambierdiscus) e epicontinentais (ex. Tetradinium, Cystodinium, Cystodinedria). H espcies
parasitas em sarcodnios, ciliados, invertebrados, alguns poucos vertebrados ou at mesmo
outros dinoflagelados de vida livre. E, ainda, h grupos simbiontes, especialmente associados
a invertebrados marinhos, com destaque para as zooxantelas, responsveis pela alta
produtividade em sistemas de recifes de corais.
So conhecidas cerca de 2.000 espcies de dinoflagelados at o momento. Destas,
250-300 espcies so exclusivas de guas epicontinentais, sendo que a maior diversidade
deste grupo ocorre em ambientes marinhos.
Dinoflagelados so um dos membros mais comuns do fitoplncton em ecossistemas
marinhos e epicontinentais e representam um componente importante da cadeia trfica destes
ambientes.

24
1.2 Taxonomia do grupo

A taxonomia de dinoflagelados tradicionalmente fundamentada na morfologia


externa da clula e caractersticas citolgicas.
Em relao morfologia externa, dinoflagelados, assim como outros alveolados,
possuem vesculas perifricas imediatamente sob a membrana plasmtica (alvolos), nas quais
podem se depositar polmeros de celulose, formando placas rgidas por toda a superfcie da
clula. O conjunto justaposto destas placas, em forma de mosaico, constitui a teca. Grupos de
dinoflagelados tecados possuem tecas bem desenvolvidas, enquanto grupos atecados possuem
pouca ou nenhuma deposio de celulose em suas vesculas. Para dinoflagelados tecados, o
nmero, a forma e a disposio das placas tecais so os principais caracteres utilizados para
classificao, cada gnero possuindo uma tabulao tecal caracterstica. Ainda sobre
morfologia externa, para ambos os grupos (tecados e atecados), a posio de insero dos
flagelos transversal e longitudinal so consideradas caractersticas taxonmicas importantes.
Para dinoflagelados atecados, alm da forma da clula, caractersticas citolgicas so
fundamentais para diferenciar grupos, tais quais a presena, nmero e disposio de
cloroplastos, localizao do ncleo, presena de estigma e de corpsculos de reserva.
Recentemente, com avano de tcnicas moleculares combinadas com anlises
refinadas de ultraestrutura, grandes revises foram realizadas, clarificando o conhecimento
evolutivo e as relaes filogenticas entre os txons de dinoflagelados. A classificao do
grupo ainda est em ebulio.
Algumas obras classicamente utilizadas na identificao de dinoflagelados so:
Schiller (1937), Taylor (1976), Balech (1988), Steidinger & Tangen (1997), para espcies
marinhas, e Huber-Pestalozzi (1950), Bourrely (1970) e Popovsk & Pfiester (1990) e Carty
(2003) para os grupos epicontinentais.

25
1.3 Principais gneros de dinoflagelados de gua
doce

Ceratium Schrank

Caractersticas:
Tecado; nico gnero com 1-3 cornos antiapicais formados pela projeo das placas
ps-cingulares e/ou antiapicais e um corno apical formado pelas placas apicais e poro apical.
Placas fortemente ornamentadas. Mixotrfico, protoplasma amarelo a marrom, sem estigma.
Frmula de placas: 4, 5, 5, 2.
Espcies conhecidas para o Brasil: C. furcoides, C. hirundinella.

Figura 6 Ceratium hirundinella. Foto: K. Cavalcante

Gymnodinium Stein

Caractersticas:
Atecado, cngulo geralmente equatorial, dividindo a clula em duas partes iguais.
Algumas espcies fotossintticas, verdes, amareladas, marrons ou azul-esverdeadas. Outras
espcies sem plastos. O sulco extende-se em forma de fenda ao pice da clula, formando um
gancho no sentido anti-horrio. Estigma presente ou ausente.
Espcies conhecidas para o Brasil: G. aeruginosum, G. biciliatum, G. fuscum, G.
simplex, G. uberrimum.

26
Figura 7 Gymnodinium fuscum. Foto: K. Cavalcante

Parvodinium Carty

Caractersticas:
Clulas pequenas e ovoides, placas delicadas. Presena de poro apical. Maioria
fotossinttica, protoplasma amarelo-ouro a marrom. Espinhos podem ocorrer na regio
antiapical. Frmula de placas: 4, 2a, 7,C6, S5, 5, 2.
Espcies conhecidas para o Brasil: P. africanum, P. inconspicuum, P. umbonatum.

Figura 8 Parvodinium umbonatum. Foto: K. Cavalcante

Peridiniopsis Lemmermann

Caractersticas:
Pacas delicadas a moderadamente espessas, algumas espcies com ornamentao de
placas conspcua. Poro apical presente. Espcies fotossintticas, protoplasma amarelo a

27
marrom, outras espcies heterotrficas. Ampla variao de padro de placas, este gnero
necessita reviso. Frmula de placas: 3-5, 0-1a, 6-7, 5, 2
Espcies conhecidas para o Brasil: P. amazonica, P. cunningtonii.

Figura 9 Peridiniopsis cunningtonii. Foto: K. Cavalcante

Peridinium Ehrenberg

Caractersticas:
Clulas relativamente grandes, em geral esfricas a ovais. Placas fortemente
ornamentadas. Poro apical presente ou ausente. Fotossintetizantes, protoplasma amarelo a
marrom. Frmula de placas: 4, 2-3a, 7, 5, 2.
Espcies conhecidas para o Brasil: P. gatunense, P. gutwinskii, P. willei, P. volzii.

Figura 10 Peridinium gatunense. Foto: K. Cavalcante

28
Prosoaulax Calado et Moestrup

Caractersticas:
Atecado. Epiteca bastante reduzida. Geralmente sem cloroplastos (registros de
espcies com cleptoplastos). Estigma presente ou ausente.
Espcies conhecidas para o Brasil: P. lacustris.

Figura 11 Prosoaulax lacustris. Fonte: Calado et al. (1998)

29
DIATOMCEAS

30
1. Diatomceas

1.1 Caractersticas gerais

Diatomceas so microrganismos eucariontes unicelulares que ocorrem nos mais


diversos ambientes midos e aquticos, suspensos na coluna de gua ou aderidos a diversos
substratos: macrfitas (epifticas), rochas (epilticas), animais (epizicas), gros de areia
(epismicas), sedimento (epiplicas). As diatomceas so fotossintetizantes, possuindo
clorofilas do tipo a e c, mas algumas poucas espcies so capazes de resistir
heterotroficamente a condies de pouca luz e de baixa disponibilidade de matria orgnica
(Figura 12).

Figura 12 Valvas de diatomceas marinhas em lmina


confeccionada pelo espanhol Muoz Moraton (coleo do Prof.
Hermes Moreira-Filho).

A principal caracterstica morfolgica das diatomceas a parede celular impregnada


de slica (SIO2.nH2O), envolvida por uma fina camada de matria orgnica, conhecida como

31
frstula. A frstula altamente diferenciada, ornamentada por diferentes tipos de estruturas,
e sempre dividida em duas unidades chamadas tecas, as quais se encaixam como duas placas
de petri (Figura 13). A teca maior conhecida como epiteca (sempre originada da clula
me), enquanto a menor chamada hipoteca. Cada uma das tecas composta pela valva e
pelo cngulo. As valvas so localizadas nas extremidades da clula e se unem por vrias
unidades silceas delicadas, as bandas do cngulo. Cada valva composta por superfcie e
manto. Uma variedade de estruturas e projees ornamentam as frstulas, as quais so a base
da taxonomia das diatomceas.

Figura 13 Estrutura da frstula de diatomceas. Ilustrao de K. Cavalcante

Vrias diatomceas secretam polissacardeos atravs de estruturas especializadas da


valva (fultoprtulas, rimoprtulas, ocelos etc.), possibilitando s clulas a formao de
cadeias, adeso a substratos e motilidade sobre superfcies. Tais secrees, quando hidratadas
no meio, podem ocorrer em forma de tubos de mucilagem, almofadas ou pednculos de
mucilagem.

32
1.2 Taxonomia do grupo

A identificao do grupo baseada nas caractersticas morfolgicas da frstula. Dentre


elas destacam-se:
- formato da valva (e.g., lanceolada, linear, rmbica, elptica);
- extremidades da valva (e.g., capitadas, rmbicas, arredondadas, capitadas, atenuadas);
- comprimento em m;
- largura em m;
- nmero de estrias e arolas em 10 m;
- caractersticas das estrias (e.g., unisseriadas, bisseriadas ou multisseriadas; radiadas,
paralelas) e das arolas (e.g., arredondadas, alongadas verticalmente ou horizontalmente,
lineoladas, em forma de c);
- presena ou ausncia de estruturas como: rimoprtula, fultoprtula, fscia, estauro, fbulas,
canpio, canais aliformes, estigma, estigmide;
- formato da rea central e do esterno da rafe;
- caractersticas do manto da valva (presena de estrias, quantidade);

Figura 14 Variao populacional em Nitzschia


frustulum. Foto: K. Cavalcante

33
1.3 Reproduo

As diatomceas tambm possuem uma forma peculiar de reproduo assexuada, que


conduz reduo gradativa da dimenso celular. Para restaurar o tamanho original da espcie,
ocorre a formao de clulas zigticas especiais, durante a reproduo sexuada. O ciclo de
vida do tipo haplobionte diplonte, no qual os indivduos adultos so diplides (2n) e a
meiose ocorre para formao dos gametas (meiose gamtica). Na reproduo assexuada, as
clulas adultas (2n) dividem-se, formando duas clulas-filhas. Cada uma destas herda da
clula-me uma teca e a outra teca formada durante o processo de diviso celular. A teca
herdada da clula-me sempre ser a epiteca, enquanto a teca formada no processo de
diviso, a hipoteca, ser menor. Consequentemente, a clula-filha que herdou a epiteca da
clula-me possuir o mesmo tamanho da original, mas a outra sofrer reduo de tamanho,
em relao primeira (Figura 15).

Figura 15 Modelo esquemtico de reproduo assexuada em diatomceas. Ilustrao: K.


Cavalcante

Aps sucessivas geraes, o resultado deste processo ser a reduo do tamanho das
clulas de uma parte da populao (aquelas que herdaram as hipovalvas das clulas-mes,
Figura 15). Quando atingido um limite, diferente para cada espcie, as diatomceas entram
em reproduo sexuada , restabelecendo o tamanho original das clulas, da seguinte forma:
clulas adultas (2n) produzem gametas (n) por meio de meiose . Aps a fuso de gametas
(plasmogamia, mas sem a fuso de ncleos), uma clula desenvolve-se e se expande em
volume o auxsporo e ento, ocorre a fuso dos ncleos (cariogamia) e a formao do
zigoto (2n), antes da formao da nova frstula. via auxsporo que o tamanho original da
espcie restabelecido, aps as sucessivas divises assexuadas.

34
1.4 Motilidade

A motilidade das clulas das diatomceas ocorre particularmente nos gametas


uniflagelados das cntricas (nicas clulas mveis de todo o grupo) e nas formas penadas que
possuem sistema de rafe. Entretanto, h registros de movimento em algumas diatomceas
arrafdeas e de movimento rotacional nas cntricas. O movimento de deslizamento realizado
pelas diatomceas rafdeas bem estudado e explicado pela secreo de material
mucilaginoso atravs da rafe (Figura 16). O movimento direcional, seguindo o mesmo plano
da rafe movimentos retos, curvados ou sigmides so relativos s rafes retas, curvadas ou
sigmides, respectivamente com alternantes aceleraes, podendo ocorrer movimento de
volta. importante entender que a motilidade das clulas s ocorre sobre um substrato slido.
O mecanismo intracelular que origina o movimento detalhado a seguir.

Figura 16 Esquema de mecanismo de motilidade nas diatomceas com rafe. Ilustrao:


Kaoli Cavalcante

35
Basicamente, mucopolissacardeos so secretados no interior da clula e atravessam a
membrana celular, alcanando o meio externo via fenda da rafe. No interior da clula,
filamentos de actina (protena contrtil) estabelecem ligao com as protenas transmembrana,
que por sua vez ligam-se s molculas de mucopolissacardeo. No contato com o meio, estas
estruturas hidratam e se fixam ao substrato. Elas esto, portanto, livres no interior da clula e
na fissura da rafe, mas fixadas ao substrato. So os movimentos dos filamentos de actina
presentes na periferia da clula, movimentando o contedo citoplasmtico, em interao com
as estruturas proticas transmembranas, que fazem com que a diatomcea movimente-se em
relao ao substrato. Na regio distal da rafe, a mucilagem destaca-se da clula na
helictoglossa, deixando um rastro mucoso e efmero.
Motilidade uma estratgia ecolgica importante para as diatomceas perifticas que,
com limitada disperso, podem buscar microhabitats com melhores condies para o
crescimento, especialmente de luz e de nutrientes.

1.5 Principais gneros de diatomceas de gua doce

Existem muitos gneros no grupo, dentre os mais representativos se encontram:


Navicula Bory, Aulacoseira Thwaites, Cyclotella (Ktzing) Brbisson, Fragilaria Lyngbye,
Cocconeis Ehrenberg, Diadesmis Ktzing, Encyonema Ktzing, Gomphonema Ehrenberg.
Para informaes sobre esses e outros gneros: Round et al., (1990) e Bicudo & Menezes,
(2006).

36
Isolamento e
cultivo de
microalgas

37
1. Materiais necessrios
A lista de materiais necessrios para o isolamento de algas est disponvel na Tabela 5.

Tabela 5 Materiais necessrios para o isolamento e cultivo de microalgas.


Material Finalidade
Becker vrios tamanhos
Capilares de pipeta Pasteur
Pisseta gua destilada
Isolamento
Fluconazol
Mini pras
Papel higinico
Tubo de ensaio
Lminas de microscopia Isolamento de filamentosas
Pipetas Pasteur
Agar-agar Merck
Ala microbiolgica
Isolamento de no filamentosas
Rodinho para plaqueamento
Placas de Petri
Caixas plsticas 10 L
Escovo
Extran
Filme plstico PVC
Preparo da vidraria
Fita crepe
Papel Alumnio
Papel/plstico para autoclave
Fita para autoclave
Algodo
Barbante Confeco de tampes para erlenmeyers
Gaze
Qumicos do meio de cultivo (ver receita)
Proveta de 1 L, 100 mL e 10 mL
Bailarina
Pega-bailarina
Balo volumtrico 4 L e outros tamanhos
Preparo de meio de cultivo
NaOH
HCl
Pipetas eppendorf
Filtro GF-5
Ponteiras para pipetas eppendorf
Bandejas Transporte de material
Bico de Bunsen/Lamparina
Etanol
Pisseta etanol
Isqueiro
Manipulao e manuteno dos cultivos
Luvas vinil
Erlenmeyers
Lamnulas
Tubos eppendorf
Cmera de Fuchs-Rosenthal Contagem de clulas

38
2. Equipamentos necessrios
O laboratrio utilizado para o isolamento e cultivo de microalgas deve possuir, no
mnimo, os equipamentos listados na Tabela 6.

Tabela 6 Equipamentos bsicos utilizados durante o


isolamento e cultivo de microalgas e sua principal
finalidade.
Material Finalidade
Balana de preciso Preparo do meio de cultivo
Agitador magntico
Autoclave
Geladeira
pHmetro
Fluxo laminar Manuteno dos cultivos
Incubadora
Microscpio

3. Meio de cultura e condies laboratoriais


Um meio de cultura uma preparao qumica que possui em sua formulao as
condies necessrias para a sobrevivncia, crescimento, transporte e estocagem dos
organismos. Os meios de cultura so classificados em lquidos, slidos ou semi-slidos. O
crescimento de microalgas, em geral, realizado em meio lquido (ex. de exceo:
Microcystis pode ser mantida em gar, um tipo de meio slido).
No existe um meio de cultura universal para o cultivo de microalgas. Normalmente,
baseia-se no ambiente natural como modelo de composio para o preparo do meio de cultivo,
pois os requerimentos nutricionais dos microrganismos refletem o tipo de ambiente onde ele
encontrado. Para obter sucesso no cultivo desses microrganismos necessrio conhecer suas
exigncias nutricionais, para que os nutrientes sejam fornecidos na forma e proporo
adequadas.
As microalgas crescem autotroficamente utilizando luz e dixido de carbono. Para o
crescimento bem sucedido das algas em um sistema de cultivo, o ambiente deve ser
condicionado para atender o maior nmero possvel de exigncias intrnsecas desses

39
organismos, fornecendo as condies e os nutrientes necessrios para o crescimento e a
sntese celular.
No ambiente natural, assim como nos cultivos, o crescimento de uma populao
microalgal resultado da interao entre fatores biolgicos, fsicos e qumicos. Os fatores
biolgicos esto relacionados s prprias taxas metablicas da espcie cultivada, bem como
com a possvel influncia de outros organismos sobre o desenvolvimento algal. Os
requerimentos de fatores fsico-qumicos referem-se principalmente a iluminao,
temperatura, oxignio e disponibilidade de micro e macronutrientes. Os principais
requerimentos nutricionais das algas so: fonte de carbono, nitrognio, fsforo, magnsio,
sdio, sulfato, potssio e outros microelementos. Muitos meios de cultura tm sido
desenvolvidos para diferentes espcies de algas, baseados nos requerimentos especficos de
cada uma delas.

3.1 Principais fatores que permitem o crescimento de


microalgas em laboratorio
As espcies do fitoplncton apresentam um conjunto de adaptaes s condies
abiticas e biticas do ambiente aqutico, de modo a viabilizar sua sobrevivncia e
crescimento. As atividades metablicas das microalgas podem ser intensamente afetadas pelas
condies qumicas e fsicas do ambiente. H vrios fatores que podem tornar-se limitantes do
crescimento algal em laboratrio, principalmente luz e temperatura.

3.1.1 Luz

As caractersticas mais importantes da luz para as algas so a intensidade luminosa


(quantidade de ftons incidindo sobre uma determinada rea) e a qualidade do espectro
luminoso (proporo de diferentes comprimentos de onda no espectro luminoso). Alguns
comprimentos de onda so danosos ao aparelho fotossinttico das algas, como o ultravioleta
(UV e, principalmente, UVb), mas eles so em grande parte absorvidos pelo oznio (O3)
atmosfrico.

40
A luz permite a realizao da fotossntese pelas algas. Uma estreita faixa de
comprimento de onda (400-700 nm) utilizada e conhecida como radiao
fotossinteticamente ativa (RFA ou PAR em ingls).

3.1.2 Temperatura

A temperatura um importante fator de regulao das taxas das reaes qumicas dos
processos biolgicos, como a fotossntese e a respirao, por exemplo. A velocidade de
crescimento do fitoplncton, portanto, tambm tende a aumentar com o aumento proporcional
da temperatura (at 35 ou 40C). A temperatura pode tambm alterar a morfologia das
clulas. Por exemplo, algumas espcies cenobiais ou filamentosas (Stichococcus,
Scenedesmus) podem desagregar-se em clulas solitrias sob temperaturas elevadas e outras
podem alterar as dimenses das clulas (Synechococcus, desmdeas).

3.1.3 Oxignio e gs carbnico

O oxignio e o gs carbnico esto intimamente relacionados pelos processos de


fotossntese e respirao. O oxignio participa em vrias reaes qumicas e biolgicas
importantes, sendo continuamente produzido na fotossntese quando o fornecimento de luz e
nutrientes adequado. A gua contm pouco oxignio devido combinao de uma baixa
presso parcial na atmosfera e sua baixa solubilidade.
As concentraes de CO2 na gua normalmente mostram relao inversa s de O2.
Embora sua concentrao atmosfrica (presso parcial) seja bem menor que a do O2, o CO2
trinta vezes mais solvel, e por isso mais abundante na gua. Alm da difuso atmosfrica,
o CO2 tambm adicionado gua como produto da respirao por animais e plantas e a
maior fonte de carbono para a fotossntese. O CO2 dissolve na gua e produz cido carbnico
(H2CO3), que se dissolve em vrias fraes (CO2, HCO3-, CO3--) dependendo do pH.
O fator ambiental mais importante na regulao de O2 e CO2 na gua a temperatura,
mas outros componentes como fotossntese, respirao, oxidaes qumicas, presso
atmosfrica e altitude tambm interferem em suas concentraes.

41
3.1.4 pH

O pH uma medida da quantidade de ons H+ tomando-se como base o logaritmo


negativo e pode ser considerado cido (0 6,5), neutro (6,5 7,5) ou alcalino (7 14). A
maior parte dos ambientes aquticos apresenta pH entre 6 e 9. As variaes no pH modificam
o estado qumico de vrias substncias importantes para as algas, como o CO2, fosfato,
amnia, ferro e metais-trao. Alm disso, o pH interfere diretamente no metabolismo algal,
pois, juntamente com outros fatores, atua na permeabilidade da membrana, no transporte
inico e na velocidade das reaes enzimticas.

3.1.5 Macronutrientes

As fontes nutricionais das microalgas podem vir de macro ou micronutrientes. Os


macronutrientes so necessrios em grande quantidade e tm papel importante na estrutura e
metabolismo das microalgas. Os micronutrientes so necessrios em quantidades mnimas e
tm funes enzimticas e estruturais nas biomolculas.

3.1.5.1 Nitrognio

O nitrognio um elemento importante no metabolismo algal, sendo necessrio em


maior quantidade depois do carbono, cerca de 12 %. Esse nutriente participa da composio
molecular de protenas e enzimas, das quais dependem as reaes qumicas celulares, e dos
cidos nuclicos, que compem o DNA. Alm disso, o nitrognio compe muitas molculas
orgnicas (aminocidos, peptdeos) e inorgnicas (NH3, NO3-, N2).
Nos ecossistemas aquticos o nitrognio ocorre em vrias formas: nitrognio
molecular (N2, dominante), nitrato (NO3), nitrito (NO2), amnia (NH4, NH3, NH4OH), xido
nitroso (N2O), nitrognio orgnico dissolvido (NOD) como uria, purinas, etc. e nitrognio
orgnico particulado (NOP), representado por organismos e detritos.
As suas principais fontes naturais so: guas das chuvas, matrias orgnica e
inorgnica alctone lixiviada ou carreada do solo e de rios e fixao de N2 no lago. Das
formas citadas, o nitrato e a amnia se constituem nas mais importantes fontes de nitrognio
para os produtores primrios, pois so abundantes e preferencialmente absorvidos pelas

42
clulas, devido rapidez de reaes associadas ao baixo consumo de energia. Na escassez
destes dois compostos, vrias espcies do fitoplncton passam a utilizar o nitrito e/ou matria
orgnica dissolvida, o qual a frao mais abundante depois do N2, e suas principais fontes
so a lise celular (morte ou herbivoria), decomposio e excreo pelo fitoplncton e
macrfitas.
Quando o nitrognio est presente em baixas concentraes esse elemento torna-se
limitante da produo primria do fitoplncton. J as cianobactrias so capazes de fixar N2 e
no so desfavorecidas pela falta de nitrognio dissolvido na gua.

3.1.5.2 Fsforo

O fsforo essencial para os organismos, pois est envolvido nos processos de


armazenamento/liberao de energia (como ATP/ADP), das ligaes estruturais do DNA e
RNA e compe a membrana plasmtica (como fosfolipdeos). Embora ocorra em baixas
concentraes e uma pequena quantidade seja requerida pelos organismos (relao N:P
16:1), esse elemento o principal limitante da produtividade primria em guas continentais
de maneira geral.
As formas de fsforo presentes nas guas doces encontram-se como fosfato (fosfato
orgnico e inorgnico e fosfato solvel particulado). As algas absorvem principalmente a
forma solvel (dissolvida), ortofosfato ou fosfato reativo (PO4-).

3.1.5.3 Slica

Na gua h trs formas principais de slica (solvel, coloidal e particulada) e somente


a slica solvel biologicamente importante. Esse elemento responsvel pelo sucesso
evolutivo de alguns grupos de algas, principalmente das diatomceas. Essas microalgas
depositam slica na parede celular, que pode representar 90% de sua composio qumica.
Algumas crisofceas e heliozorios tambm utilizam slica na impregnao da parede
celulsica. Quando utilizada pela alga, a slica hidratada para formar slica amorfa
(SiO2nH2O).

43
3.1.5.4 Outros macronutrientes

Os outros nutrientes constituem uma grande variedade de elementos qumicos e


molculas simples que, normalmente, no so limitantes para as algas, pois ocorrem em
concentraes acima daquelas requeridas por elas. Apesar disso, sua importncia vital.
O clcio participa da composio da membrana celular e permite a agregao de
clulas algais em colnias. Alm disso, sua dinmica de formas (CaCO- e CaCO3) influencia
na reciclagem de fosfato e no equilbrio do pH.
O magnsio faz parte da molcula de clorofila, ligando-a aos nitrognios e
possibilitando a transferncia de fosfato nas reaes do ATP. Esse elemento tambm participa
de outros processos metablicos, como o do nitrognio e contribui para a estabilidade dos
ribossomos.
O sdio, potssio e cloreto controlam os processos osmticos da clula, expulsando ou
permitindo a entrada de ons. A tolerncia de vrias algas salinidade em esturios de rios
depende deste mecanismo.
O enxofre compe protenas e enzimas, dando-lhes forma tridimensional. Esse
elemento responsvel pela estabilidade de aminocidos e componente de muitas vitaminas
O sulfeto de hidrognio (H2S) pode reagir com oxignio e originar cidos ou combinar-se
com o ferro e precipitar como FeS. Portanto, ele interfere na concentrao de oxignio (O2) e
acidez na gua.
O ferro importantssimo para as algas, pois participa de vrias reaes enzimticas e
na estrutura das molculas dos citocromos, responsveis pelos saltos de eltrons na
fotossntese liberao de energia para formar ATP e NADPH.

3.1.6 Micronutrientes

Quantidades muito pequenas (traos) de micronutrientes so necessrios na


composio de um meio de cultura. Entre eles Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B. Nem sempre a adio
de micronutrientes necessria (como em meios de cultivo preparados com gua do local). J
os meios sintticos, preparados com compostos de alto grau de pureza e gua ultra pura,
podem apresentar deficincias desses elementos.

44
3.2 Preparo do meio de cultivo adequado

O primeiro passo para o isolamento de uma microalga a escolha do meio de cultivo.


Diferentes componentes adicionais so encontrados em meios especficos para determinados
grupos de algas (Tabela 7). O meio de cultivo F/2 tem sido amplamente utilizado no
isolamento e manuteno de espcies de algas, pois tem se mostrado eficiente para inmeras
espcies e diferentes grupos do fitoplncton. A composio do meio de cultivo F/2 pode ser
consultada no Anexo 1. O meio de cultivo mais utilizado para cianobactrias o ASM-1
(Anexo 2).

Tabela 7 - Principais grupos de algas, necessidades especficas de cada grupo e alguns


exemplos de meios de cultivo recomendados para o seu isolamento e manuteno.
Grupo de algas Necessidades especficas Meios de cultivo
Cianobactrias pH AA/4
cloreto de amnio ASM-1
BGN
BG-11
ASM-1
Z8

Diatomceas Silicato F/2


AMA
ASM-1

Clorfitas Vitaminas F/2


CHU10
LC
MC
DM
NPK

Dinoflagelados Vitaminas F/2


Fonte de carbono adicional (Heterotrficos) L2
L2/2
N2
P2
K

Todos os nutrientes do meio nutritivo selecionado so preparados como solues stock


concentradas, que devem ser armazenadas sob refrigerao por tempo determinado e em
alguns casos no escuro. O preparo das solues stock realizado mediante a pesagem dos sais
componentes que devem ser posteriormente diludos em quantidade especfica de gua

45
destilada ou deionizada. Todas as solues stock so esterilizadas por autoclavagem ou
filtrao.
O meio de cultivo preparado alguns dias antes do isolamento das microalgas atravs
da adio de uma determinada quantidade de cada soluo stock a gua destilada ou
deionizada estril. Na maioria dos casos o pH deve ser regulado atravs da adio de HCl ou
NaOH 1N. A autoclavagem normalmente realizada aps esses procedimentos. A
metodologia de preparo depende do meio de cultivo utilizado.
Os meios de cultivo usados no isolamento e manuteno de microalgas so
normalmente compostos de uma soluo stock rica em nitrognio, uma rica em fsforo, uma
soluo de ferro (soluo de Fe-EDTA) e uma de micronutrientes. As solues stock so
adicionadas em propores determinadas gua destilada ou deionizada.

3.2.1 Cuidados a serem tomados durante o preparo das solues

Alguns cuidados devem ser tomados durante o preparo das solues stock e do meio
de cultivo. Entre eles, listamos os principais:
Reao; Certos metais traos devem ser preparados separadamente, pois reagem uns
com os outros.
Manuteno do pH; A esterilizao do meio de cultivo comumente realizada por
autoclavagem, o que pode causar mudanas no pH da soluo. Para a manuteno do
pH pode-se adicionar um tampo orgnico, como TRIS (hidroximetil amino-metano).
Adio de vitaminas; A autoclavagem pode causar a desnaturao de certas vitaminas.
As vitaminas, em geral, so adicionadas aps a autoclavagem do meio, em capela de
fluxo laminar.

3.3 Coleta de amostras de microalgas

A coleta deve ser realizada em local propicio ao desenvolvimento das algas de


interesse, com rede de plncton com abertura de malha adequada. As amostras devem ser
acondicionadas em recipiente de grande volume para evitar aquecimento excessivo e
esgotamento de oxignio.

46
A amostra de gua bruta pode ser filtrada para separar as diferentes fraes do
plncton (como o fitoplncton do zooplncton, por exemplo). A amostra de fitoplncton pode
ser enriquecida e armazenada durante algumas semanas.

3.4 Isolamento de microalgas

Existem diversos mtodos de isolamento de microalgas. O mtodo deve ser escolhido


de acordo com o tipo de espcie que se quer isolar (flagelado, ciliado, diatomcea) e das
condies da amostra a ser utilizada (muito ou pouco material). Se h pouco material na
amostra, uma alternativa pode ser enriquecer uma subamostra que contem a alga de interesse
e aguardar um aumento populacional significativo, o que pode facilitar o isolamento. Essa
tcnica funciona para algas de crescimento rpido.
O isolamento pode ser realizado por tcnicas como: isolamento por capilaridade
(coleta com capilar de vidro, item 3.4.1); por diluio seriada (item 3.4.2); inoculao em
placa de Petri com agar (item 3.4.3) e migrao fotoltica (item 3.4.4).

3.4.1 Tcnica de isolamento por capilaridade:

As espcies filamentosas (indicado para clulas ou cadeias maiores que 30 m) podem


ser isoladas por capilaridade. O capilar de isolamento pode ser confeccionado com pipeta de
Pasteur de vidro ou capilares de vidro (Figura 17a). Uma alquota da amostra contendo a alga
de interesse colocada em lmina de microscopia. Em outra lmina, posicionada
paralelamente anterior, coloca-se pelo menos 5 gotas de meio de cultivo. As lminas usadas
no isolamento devem ser armazenadas em um frasco fechado com etanol. Com o auxlio do
capilar, indivduos da espcie de interesse so coletados. O indivduo coletado deve ser lavado
nas 5 gotas de meio, passando de uma a uma. Os isolados podem ser mantidos em tubo de
ensaio ou em placas de cultura celular (Figura 17b) com meio de cultivo. Os recipientes
contendo as clulas isoladas devem ser incubados em temperatura e intensidade luminosa
medianas para as espcies em questo. Algumas espcies podem demorar a crescer devido ao
longo tempo de adaptao ao meio de cultivo, frasco e condies do laboratrio. Outras
espcies podem necessitar de meio de cultivo mais diludo durante o isolamento para evitar

47
choque de composio de nutrientes. Nesse caso deve-se realizar uma aclimatao gradual da
espcie ao meio de cultivo.

Figura 17 Materiais utilizados na tcnica de isolamento de microalgas por


capilaridade. a) Capilares de isolamento, pipeta Pasteur de vidro e pra; b)
Placa de cultivo celular.

3.4.2 Diluio seriada

Figura 18 Esquema de processos de diluio de amostras contaminadas de culturas de


microalgas. a) Diluio de culturas em tubos de ensaio; b) diluio em placas de Petri.

Diluir significa acrescentar um solvente a uma soluo, mantendo a concentrao de


soluto inalterada. Aplicada ao reisolamento da microalga de interesse, essa metodologia
consiste em diluir a amostra de microalgas at obter uma amostra unialgal da alga de interesse
(Figura 18a). O procedimento realizado pipetando 1 mL (ou outro volume, dependendo da
magnitude da contaminao) da amostra original em um tubo de ensaio contendo 9 mL de

48
meio de cultivo estril (Figura 18a diluio 1/10). Dessa primeira diluio, pipeta-se 1 mL
em outro tubo de ensaio contendo 9 mL de meio de cultivo estril (Figura 18a diluio
1/100) e assim por diante. As amostras diludas devem ser incubadas e monitoradas. Esse
procedimento recomendado para espcies filamentosas. Para espcies no filamentosas,
recomenda-se que a diluio seja realizada da mesma maneira em placas de Petri contendo
meio slido (Figura 18b).

3.4.3 Inoculao em placa de Petri


Essa tcnica consiste em inocular amostras contendo a alga de interesse em placas de
Petri (Figura 19a) contendo o meio de cultivo e gar (meio slido). As placas devem ser
incubadas e, em alguns dias, as colnias se tornam visveis (Figura 19b). As colnias visveis
podem ser facilmente coletadas e ressuspendidas em meio de cultivo lquido estril.
Essa metodologia utilizada para cianobactrias unicelulares coloniais com clulas
pequenas (< 10 m; por exemplo, Microcystis).

Figura 19 Tcnica de inoculao de cianobactrias


em placas de Petri. a) Inoculao da amostra de
cianobactria na placa de Petri; b) placas depois de
incubadas contendo colnias visveis de
cianobactrias.

3.4.4 Migrao fototxica

Organismos fototxicos so aqueles que respondem a um estmulo luminoso.


Microalgas desse tipo podem ser concentradas em um ponto luminoso e meio de cultivo
slido, facilitando o isolamento por capilaridade (item 3.5.1). Essa metodologia utilizada
para microalgas flageladas, que so difceis de isolar devido a constante movimentao.

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Nesse procedimento, as amostras contendo as microalgas de interesse so inoculadas
em placa de Petri com meio de cultivo e gar (meio slido). Uma fonte luminosa colocada
prxima ao gar, a fim de concentrar os indivduos fototticos em um ponto. Dessa maneira,
os indivduos de interesse so previamente separados das outras microalgas. Aps alguns
minutos, o isolamento pode ser realizado facilmente por capilaridade.

3.5 Manuteno das culturas

3.5.1 Condies gerais para a manuteno de microalgas em


laboratrio
As microalgas possuem algumas exigncias para o crescimento, como temperatura e
luz adequadas. Para a manuteno do crescimento das microalgas em laboratrio, esses
parmetros precisam estar presentes de maneira controlada nos cultivos. Na tabela 8 so
apresentados alguns parmetros e as condies adequadas para o crescimento de microalgas
em geral no laboratrio. Deve-se atentar para o fato de que os diferentes grupos de microalgas
possuem necessidades especficas de crescimento e isso deve ser levado em conta na
determinao das condies de cultivo dos isolados.

Tabela 8 Condies gerais para a manuteno de cultivo de microalgas em


laboratrio.
Parmetro Faixa adequada timo de crescimento
Temperatura (C) 16 27 18 24
Intensidade luminosa (Lux) 1000 10000 2500 5000
Fotoperodo (horas) 12:12 16:8 16:8
pH 79 8,2 8,7

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3.5.2 Tipos de culturas

Os sistemas comumente empregados para o cultivo de microalgas so classificados em


sistemas abertos e fechados.
Os sistemas abertos so pouco sofisticados, uma vez que so desenvolvidos em
tanques a cu aberto, sob condies naturais de iluminao e temperatura (Figura 20). Os
tanques so geralmente rasos, construdos em concreto, fibra de vidro, policarbonato, com
fundo de terra ou revestidos com material plstico.

Figura 20 Exemplo de um sistema aberto de cultivo de microalgas.


(Sistema de cultivo da empresa Cyanotech, no Hawaii)

Os cultivos em sistemas fechados so desenvolvidos em equipamentos especficos,


como os fotobiorreatores ou quimiostatos. Esses equipamentos visam alcanar elevadas
biomassas. Nos sistemas fechados possvel controlar as condies de cultivo (quantidade de
nutrientes, temperatura, luz, etc.). Isso implica em elevada produtividade, viabilizando a
produo comercial de uma srie de compostos de elevado valor comercial.
As cepas isoladas podem ser mantidas no laboratrio atravs de dois tipos de culturas:
culturas contnuas e no contnuas.

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3.5.2.1 Culturas contnuas

A manuteno de microalgas em culturas contnuas realizada a partir do


fornecimento ininterrupto de gua e nutrientes atravs de um circuito de abastecimento. Ao
final do circuito as algas so colhidas e a biomassa pode ser utilizada para a extrao de
compostos, produo de biogs e combustveis.
Os cultivos contnuos so normalmente realizados em biorreatores (Figura 21a) ou
quimiostatos (Figura 21b). Esses equipamentos so circuitos que promovem o crescimento
das microalgas em um ambiente fechado com suprimento adequado de nutrientes, temperatura
e luz. Os biorreatores e quimiostatos aumentam a produtividade e diminuem as chances de
contaminao.

Figura 21 Esquema do funcionamento de um biorreator (a) e um quimiostato (b) para o


cultivo contnuo de microalgas.

3.5.2.2 Culturas no contnuas

A manuteno de microalgas em culturas no contnuas realizada por meio de


repicagens. Nesse processo, uma subamostra (inculo) de aproximadamente 10% do volume
total do cultivo adicionada em 1/3 do volume total em um novo recipiente. A repicagem
para um meio de cultivo estril com volume maior permite que as condies continuem
favorveis ao crescimento algal: maior disponibilidade de nutrientes, luz, etc. A repicagem
deve ser feita durante a fase exponencial (ver ndices e clculos relacionados: Curva de
crescimento) de crescimento da cultura. As curvas de crescimento e, consequentemente, o
tempo at o incio da fase de maior crescimento algal depende da espcie e das condies de

52
cultivo a que est submetida. Sendo assim, imprescindvel a realizao da curva de
crescimento para cada espcie isolada. O tempo entre repicagens, em geral, fica em torno de
15 dias.

3.6 Uso da capela de fluxo laminar

A capela de fluxo laminar um equipamento projetado para criar uma rea de trabalho
estril, que permite a manipulao de materiais sem contaminao. Esse equipamento um
gabinete de proteo, tipo bancada, com laterais e teto de vidro para melhor visualizao dos
trabalhos. A capela funciona como uma cmara quase isolada, onde o ar filtrado injetado em
uma s direo na rea de trabalho, garantindo um ambiente renovado e limpo (Figura 22).

Figura 22 Esquema do funcionamento da capela de


fluxo laminar. a) capela de fluxo laminar vista de
frente; b) vista lateral.

O uso correto da capela de fluxo laminar garante a eficincia do equipamento. O


procedimento correto iniciar os trabalhos limpando, de dentro para fora, toda a capela com
lcool 70%. Todo o material que ser utilizado na capela de fluxo laminar deve ser
autoclavado previamente e esterilizada com lcool 70% antes de ser colocado sob o fluxo para
evitar contaminao. Aps colocar todo o material a ser utilizado dentro do fluxo, inclusive as
culturas de microalgas, a lmpada de luz UV deve ser ligada por 30 minutos antes de comear

53
a trabalhar. A lmpada UV deve ser desligada antes de iniciar as atividades. O uso de luvas
no obrigatrio, mas preciso lavar as mos e braos com sabonete e aplicar lcool 70%
antes de trabalhar sob a capela. Dentro do fluxo, deve-se trabalhar prximo a chama do bico
de Bunsen ou da lamparina. Devido cuidado deve ser tomado para no obstruir as perfuraes
da capela por onde passa o fluxo de ar. Evitar movimentos bruscos que podem causar
queimaduras com a chama. As pipetas no devem tocar os Erlenmeyers ou tubos com os
cultivos, nem qualquer outro tipo de vidraria. Usar um bquer como lixo de cultivo e
posicionar a uma distncia segura do bico de Bunsen.

3.7 Outros procedimentos de laboratrio

3.7.1 Limpeza e esterilizao de vidraria

Toda a vidraria utilizada no isolamento e cultivo de microalgas deve ser pr-lavada


com gua, Extran 5% e escovo. Aps a lavagem inicial, a vidraria deve ser submergida em
Extran 5% e permanecer por pelo menos 12h. Uma segunda lavagem deve ser realizada com
gua, Extran 5% e escovo.
Aps o procedimento de lavagem, toda a vidraria a ser utilizada deve permanecer em
soluo de HCL 10% por no mnimo 2 horas. Aps a retirada do HCl, a vidraria pode ser
enxaguada com gua destilada 3 vezes e recomenda-se que deixe secar em estufa fechada.
Todo o material usado para a manipulao dos cultivos deve ser autoclavado. Para
realizar a autoclavagem deve-se usar plstico ou papel para esterilizao.

3.7.2 Descartes de culturas

Culturas no contnuas resultam em grandes volumes de resduos. Esses resduos


devem ser armazenados e descartados da forma correta, principalmente quando se tratam de
cultivos de cianobactrias, que muitas vezes podem estar produzindo toxinas.

54
O procedimento correto , a cada repicagem, manter pelo menos 3 back ups dos
cultivos anteriores. Portanto, considerando uma repicagem por ms, as culturas devem ser
descartadas apenas aps 4 meses da inoculao.
O descarte das culturas em desuso deve ser realizado em galo com volume de
aproximadamente 5 L contendo 1 L de gua sanitria. Quando o contedo do galo de
resduos estiver entre amarelo e branco, este pode ser descartado na pia.

3.7.3 Descontaminao de culturas de cianobactrias

O isolamento de cianobactrias pode ser dificultado pela contaminao das amostras


por outras microalgas ou, mais comumente, por fungos e bactrias. Alguns protocolos so
utilizados na descontaminao dessas amostras:

3.7.3.1 Protocolo para descontaminao por outras microalgas

Uma alternativa para a descontaminao de amostras contendo a microalga isolada e


contaminao por outras microalgas o reisolamento. Nesse caso, as tcnicas recomendadas
para o isolamento (descritas no item 3.5) podem ser aplicadas novamente diretamente na
amostra contaminada a fim de reisolar a alga de interesse.
Algumas contaminaes por outras microalgas (muitas clorfitas, nanoflagelados e at
mesmo outras cianobactrias menores) ficam presas mucilagem da alga de interesse. Se esse
for o caso, pode-se centrifugar a amostra contendo a alga de interesse a baixa rotao ou usar
um equipamento tipo vortex, a fim de separar as clulas da microalga da mucilagem que as
envolve. O procedimento correto isolar apenas uma clula da colnia e inocular em outro
recipiente contendo meio de cultivo estril.
Outra alternativa a diluio seriada da amostra contaminada (conforme descrito no
item 3.5.2) at obter-se uma cultura unialgal da microalga de interesse.

55
3.7.3.2 Protocolo para descontaminao por fungos e bactrias

Antifngico Fluconazol

O fluconazol um frmaco utilizado como antimictico, pertencente classe dos


antifngicos triazlicos. Esse frmaco um potente inibidor da sntese de esterol dos
organismos suscetveis. O fluconazol pode ser encontrado em farmcias e apresentado na
forma de cpsulas. Cada cpsula de fluconazol contm: fluconazol 150 mg desse frmaco e
excipientes (amido, dixido de silcio, estearato de magnsio, lactose monoidratada,
laurilsulfato de sdio, silicato de magnsio).
O protocolo para o uso de fluconazol em culturas de cianobactrias diluir 1 cpsula
de fluconazol em 150 mL de gua Milli-Q autoclavada. Essa soluo deve ser filtrada em
filtro com abertura de poro de 0,2 m. O frasco contendo a soluo filtrada deve ser envolto
em alumnio e armazenado sob refrigerao. Adicionar 20 g/mL do preparado de fluconazol
nas culturas de cianobactrias contaminadas por fungos (Ex. para a Descontaminao de 15
mL de cultura de cianobactrias, adicionar 300 L da soluo preparada de fluconazol).

Antibitico Penicilina

Uma contaminao moderada por bactrias pode ser resolvida atravs do uso de
antibiticos como a Penicilina. Nesse caso, uma alquota da cultura contaminada transferida
para meio estril contendo um nvel tolervel de antibitico. Deve-se atentar para o fato de
que cianobactrias so semelhantes s bactrias e podem ser afetadas tambm pelo
antibitico. A repicagem deve ser realizada algumas vezes (o quanto for conveniente) da
mesma forma. Ento, diversas alquotas da cultura devem ser pipetadas em tubos menores
contendo meio de cultivo sem antibitico. Por diluio, alguns tubos devem conter apenas
algas, sem bactrias.
A soluo de antibitico pode ser preparada dissolvendo 100 mg de Penicilina G (sal
de sdio ou potssio), 25 mg de sulfato dihidroestreptomicina e 25 mg de sulfato gentamicina
em 10 mL de gua destilada ou deionizada. Essa soluo deve ser filtrada em membrana de
filtrao e mantida congelada at o uso. A dose recomendada de 0,5 mL da soluo de
antibitico para cada 50 mL de cultura contaminada.

56
Luz UV

O sucesso desse processo depende do grupo de alga que se est cultivando, das
bactrias presentes e da resposta dos organismos a luz UV. Porm, o uso constante da luz UV
reduz significativamente a ocorrncia de contaminaes durante a manuteno dos cultivos. O
recomendado manter as culturas sob luz UV, durante 20 minutos, antes de cada repicagem.

57
ndices e clculos
relacionados

58
1. Curva de crescimento
Quando uma cultura no contnua de cianobactrias desenvolvida em um sistema
fechado, o seu crescimento pode ser representado por uma curva de crescimento. Esta curva
dividida em diferentes fases de crescimento: Fase lag, log, estacionria e de declnio (Figura
23).
A fase lag a fase inicial de crescimento, um perodo varivel, onde no h aumento
significativo da populao de microalgas. A fase lag corresponde ao perodo de adaptao das
clulas ao novo meio de cultivo, absoro de coenzimas essenciais, preparao do complexo
enzimtico e outros constituintes celulares necessrios absoro dos nutrientes presentes no
meio. A fase lag tambm observada quando as clulas sofrem traumas fsicos (choque
trmico, radiaes) ou qumicos (produtos txicos), ou at mesmo quando so transferidas de
um meio para outro de composio diferente, devido necessidade de sntese de vrias
enzimas especficas. nesse perodo que realizada a reparao das clulas que sofreram
danos. Assim, durante este perodo observa-se um aumento na quantidade de protenas, no
peso seco e no tamanho celular.
A fase log ou exponencial corresponde etapa em que as clulas esto plenamente
adaptadas, absorvendo nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando.
Neste momento, a quantidade de produtos finais de metabolismo ainda pequena. A taxa de
crescimento exponencial varivel, de acordo com o tempo de gerao do organismo.
Geralmente, procariticos crescem mais rapidamente que eucariticos. Nesta fase so
realizadas as medidas de tempo de gerao. Por ser a fase mais saudvel das clulas, onde
todas esto se dividindo, nesse momento que deve ser realizada a repicagem da cultura.
Durante a fase estacionria os nutrientes esto entrando em escassez e os produtos
txicos esto se tornando mais abundantes. Nesta etapa no h crescimento lquido da
populao, ou seja, o nmero de clulas que se divide equivalente ao nmero de clulas que
morrem. nessa fase em que vrios metablitos secundrios so sintetizados, incluindo as
cianotoxinas, e em que aparecem os acinetos.
Na fase de declnio ou morte a maioria das clulas est em processo de morte,
embora outras ainda estejam se dividindo e a densidade de clulas viveis cai lentamente. Em
alguns casos h a lise celular. Culturas descontnuas tendem a sofrer mutaes que podem
repercutir na populao como um todo. As prprias condies ambientais tendem a promover

59
variaes de carter fenotpico (reversvel) nas culturas. nessa fase que essas mutaes so
particularmente visveis.

Figura 23 Fases do crescimento de culturas no contnuas de cianobactrias.

2. Medidas do crescimento
O crescimento dos microrganismos pode ser mensurado por diferentes tcnicas,
adaptveis a diferentes grupos ou situaes. As medidas de crescimento podem ser avaliaes
diretas e indiretas. Dentre as avaliaes diretas podemos citar a contagem de clulas sob
microscpio e o clculo do biovolume celular. Dentre as avaliaes indiretas esto a medida
da turbidez da amostra, de clorofila-a e peso seco.
Dentre as diferentes tcnicas utilizadas, descreveremos alguns exemplos:

2.1 Contagem de clulas de cianobactrias

A contagem total de clulas uma metodologia que envolve a contagem direta das
clulas de cianobactrias em uma amostra de cultivo sob microscpio, utilizando cmaras de
contagem. A contagem direta uma tcnica rpida, mas tem como principais limitaes a

60
impossibilidade de distino entre clulas vivas e mortas e possveis erros de contagem
devido s pequenas dimenses de algumas clulas ou pela formao de agregados celulares.
Para a contagem de cianobactrias coloniais, como Microcystis, por exemplo,
recomenda-se realizar a digesto da mucilagem (pode-se usar hidrxido de potssio) antes de
iniciar a contagem de clulas.

2.1.1 Contagem em cmara de Fuchs-Rosenthal

Cmaras de contagem so instrumentos de preciso confeccionados em vidro ptico


especial. Esses instrumentos so utilizados para a contagem de clulas sob microscpio. A
cmara de Fuchs-Rosenthal (Figura 24) tem profundidade de 0,2 mm. O sistema de contagem
formado por uma grande rea, de 16 mm, que contm 16 reas menores, de 1 mm. Cada
uma dessas reas menores subdividida em 16 mini-reas (256 mini-reas) com 0,25 mm de
lado e rea de 0,0625 mm. A contagem das clulas realizada nos quadrantes localizados na
rea central da cmara (Figura 24). Todas as reas tm uma borda tripla em cada lado. A linha
central da borda tripla o limite que determina se uma clula deve ser includa na contagem
ou no.

Figura 24 Cmara de Fuchs-Rosenthal (a) e ampliao dos quadrantes utilizados para a


contagem de clulas (b).

61
Recomenda-se contar 4 reas na diagonal em cada metade e fazer uma mdia dessas
contagens. A diferena entre o nmero de clulas contadas em uma metade e na outra no
deve ultrapassar 10%.
O clculo para determinao do nmero de clulas :
rea da cmara = 16 mm2
Profundidade = 0,2 mm
Volume = 3,2 mm3

Regra de trs (para contagem da cmara toda):

3,2 mm3 nmero de clulas contadas


1 mm3 x clulas/mm3

2.1.2 Contagem em cmara Sedgwick-Rafter

Figura 25 Cmara de Sedgwick-Rafter (a) e detalhe da grade presente na base da cmara (b).

A cmara de Sedgwick-Rafter consiste de uma lmina de vidro equipada com um


retngulo em alto relevo com 50 mm de comprimento, 20 mm de largura e 1 mm de altura
(Figura 25a). Fechado por lamnula, a cmara comporta um volume de amostra de exatamente
1 mL. A base da cmara marcada com uma grade de 1000 quadrculas (Figura 25b). Cada

62
quadrcula corresponde a 1 L de amostra. Este mtodo empregado na anlise de amostras
onde existe grande quantidade de organismos.

2.1.3 Contagem em cmara de sedimentao

Para microalgas maiores (entre 3-50 m) pode-se utilizar o mtodo de Utermhl


(1958) que consiste na utilizao de cmaras especiais de sedimentao para contagem em
microscpio invertido. A vantagem desse mtodo que evita o manuseio excessivo da
amostra, preservando a integridade dos organismos presentes.
As cmaras de sedimentao so lminas especiais com uma regio que permite o
acmulo de um determinado volume da amostra (2 a 100 mL). As amostras devem ser
previamente fixadas com lugol actico ou formol 0,5% para preservar as clulas e facilitar a
sedimentao. O volume a ser sedimentado depende do ambiente e do tipo de gua: amostras
menos concentradas requerem maior volume para a sedimentao enquanto que amostras
mais concentradas requerem menor volume de sedimentao.
Aps o tempo de sedimentao recomendado (dependente do volume de amostra e da
quantidade de fixador, Tabela 9) todos os organismos presentes no volume de gua
sedimentado esto presentes na lmina no fundo da cuba. Esses organismos podem, ento, ser
contados sob microscpio invertido. O microscpio invertido permite a utilizao dessas
cmaras de sedimentao, pois, como o prprio nome sugere, as objetivas so dispostas de
baixo para cima, ou seja, ficam em baixo da lmina. A luz emitida pela prpria objetiva e h
um kit de filtros (de luz) que se pode aplicar de acordo com a necessidade de visualizao dos
microorganismos e da objetiva que est sendo usada.

Tabela 9 - Tempo de sedimentao recomendado para


cada volume (mL) de amostra e tipo de fixador utilizado
(segundo Edler, 1979).
Volume da amostra Fixador
(mL) Lugol Formol
2 3 horas 12 horas
10 8 horas 24 horas
50 24 horas 48 horas
100 48 horas 96 horas

A contagem das microalgas pode ser realizada por metodologias como de campos
aleatrios (ou semi-aleatrios), transeces (uma determinada faixa dentro da cmara) ou total

63
(cuba toda). Para realizar a contagem das microalgas deve-se levar em considerao o nmero
mnimo de organismos a ser contado, para garantir uma margem de erro satisfatria (ver item
2.1.4). A distribuio dos organismos na cmara deve ser homognea.
Recomenda-se contar as espcies maiores (> 50 m) em objetiva de menor aumento
(5x ou 10x), em toda a cmara. As espcies de tamanho mdio (10 - 50 m) podem ser
contadas em objetiva intermediria (10x, 20x), em uma rea menor (faixas ou campos) de
acordo com a concentrao da amostra.
A contagem a partir da metodologia de campos aleatrios bem aceita, pois possibilita
verificar o coeficiente de variao (CV) a partir do valor mdio (m) e o desvio padro (DP)
obtido entre os campos para os organismos mais abundantes:

CV = DP * 100/m

Para tal, dispem-se os campos semi-aleatoreamente (Figura 26), cobrindo de forma


representativa o fundo de toda a cmara.

Figura 26 Esquema dos campos contados a partir do mtodo de contagem por campos
aleatrios ou semi-aleatrios.

Os organismos menores (< 10 m) devem ser contados no maior aumento disponvel


(mnimo de 40x) em campos dispostos semi-aleatoreamente.
Ao final da contagem, obtm-se, o valor do nmero de organismos/ml da amostra,
multiplicando o nmero de organismos contados pelo fator de converso correspondente

64
rea de visualizao da objetiva usada, o nmero de faixas ou campos contados, a rea da
cmara de sedimentao e o volume de amostra sedimentado. Esse fator varia de acordo com
o microscpio utilizado e normalmente j vem junto com o equipamento em forma de tabela.

2.1.4 Erro na contagem

O objetivo da contagem das microalgas assegurar que o nmero quantificado


represente, o mais prximo possvel, o tamanho da populao. A probabilidade de que o valor
medido se encontre, dentro de certos limites, em torno do valor verdadeiro pode ser avaliada.
Para um limite de confiana de 95%, o erro de contagem expresso em porcentagem pode ser
estimado pela frmula:

Onde N corresponde ao nmero de unidades contadas.

Existe um limite de confiana de 95 20% quando se conta 100 organismos da


espcie predominante. Este erro pode cair para 10% quando se conta 400 indivduos da
espcie predominante (A.P.H.A., 1998). A determinao do modo de realizao da contagem
depende do nmero de clulas no material que est sendo analisado.

2.2 Clculo do biovolume

O biovolume uma estimativa de biomassa algal. No clculo do biovolume celular,


contam-se as clulas das microalgas e o resultado multiplicado pelo volume celular mdio
de cada espcie. O volume mdio determinado com base na figura geomtrica mais prxima
do formato da microalga (Tabela 10; pode ser consultada na ntegra em Hillebrand, 1999), por
exemplo, esferas para clulas esfricas e cilindros para filamentos. Dependendo da
variabilidade, 10 a 30 clulas da microalga devem ser medidas.

65
Tabela 10 Principais gneros de cianobactrias, formas geomtricas que normalmente
assumem e frmulas utilizadas para o clculo do biovolume.
Gneros Forma geomtrica Frmula
Microcystis Esfera
Dolichospermum
Chroococcus

Aphanizomenon Cilindro + 2 cones


Cylindrospermopsis

Oscillatoria Cilindro + 2 meias esferas


Lyngbya
Planktothrix

Exemplo: Ao medir 20 clulas de Microcystis, foi estimado um dimetro mdio de 5 m.


Assumindo que a forma da clula aproxima-se de uma esfera, cujo volume 4/3r3 = 65,4
m3, ento, 1 milho de clulas de Microcystis por mL correspondem ao biovolume de 65,4 x
106 m3/mL.

2.3 Turbidez

A turbidez uma propriedade fsica dos fluidos que se traduz na reduo da


transparncia devido presena de materiais em suspenso. Esses materiais suspensos
interferem na passagem da luz atravs do fluido. A medida da turbidez , portanto, a
dificuldade de um feixe de luz atravessar uma certa quantidade de gua.
Essa medio realizada em espectrofotmetro, turbidmetro ou nefelmetro. Esses
equipamentos comparam o espalhamento de um feixe de luz ao passar pela amostra com o de
um feixe de igual intensidade ao passar por uma suspenso padro. Quanto maior o
espalhamento maior a turbidez, segundo o Lei de Lambert-Beer.

66
O espectrofotmetro permite selecionar o comprimento de onda adequado anlise de
um determinado componente. A medida da intensidade do feixe de luz que atravessa a
amostra convertida em um sinal de absorbncia para o comprimento de onda da anlise.
A turbidez medida a 750 nm pode ser usada como uma inferncia do nmero de
clulas que uma amostra contm. Primeiro medida a absorbncia do meio de cultivo sem a
inoculao de microalgas (Figura 27A), esse o branco e a turbidez do meio de cultivo com
microalgas vai ser medida a partir da. As clulas dispersam a luz e quanto maior o nmero de
clulas mais turva a amostra (Figura 27B), consequentemente, menos luz atravessa o tubo.
Os dados de absorbncia podem ser correlacionados com dados de medidas diretas do
crescimento, atravs de uma curva de calibrao (regresso linear).

Figura 27 Esquema do mecanismo que mede a turbidez das amostras em


espectrofotmetro. A) Leitura do branco: um feixe de luz incide na
amostra contendo apenas meio de cultivo. Quanto mais transparente a
amostra mais luz medida pelo sensor (menor turbidez); B) Leitura da
turbidez de uma amostra contendo microalgas: as microalgas refletem a luz
e quanto mais organismos menos luz atravessa o tubo (maior turbidez).

67
2.4 Estimativa de peso seco

A estimativa de peso seco pode ser usada para determinar a quantidade de algas em
uma amostra. Para isso, deve ser realizada a separao mecnica das algas presentes num
volume conhecido de meio de cultivo. Esse procedimento realizado por centrifugao,
floculao ou filtrao e a escolha do mtodo dependente do grupo de algas que se quer
separar. A determinao do peso seco e feita, normalmente, por gravimetria e a secagem do
material em estufa ou por liofilizao (Figura 28). Da mesma maneira que para a absorbncia,
uma curva de calibrao (regresso linear) com dados de medidas diretas de crescimento pode
ser construda.

Figura 28 Esquema do processo para a medida do peso seco como


estimativa do crescimento algal.

2.5 Anlise de Clorofila

A anlise da clorofila um importante indicador da biomassa fitoplanctnica. Alguns


mtodos so bem estabelecidos para a anlise de clorofila (utilizados pela E.P.A.
Environmental Protection Agency): o mtodo espectrofotomtrico, fluorimtrico e
cromatogrfico. Pode haver uma srie variaes entre mtodos, principalmente, entre os tipos
de solventes e membranas utilizados.

68
2.5.1 Extrao de clorofila

O fitoplncton contido em um volume conhecido de amostra concentrado por


filtrao a vcuo de baixa intensidade em um filtro de fibra de vidro. Os pigmentos das
microalgas so extrados em acetona 90%. O filtro ento centrifugado para clarificar a
soluo.

2.5.2 Mtodos de quantificao de clorofila

A clorofila pode ser quantificada por espectrofotometria, fluorimetria ou


cromatografia. No mtodo por espectrofotometria, uma alquota do sobrenadante da extrao
transferida para uma cubeta de vidro e a absorbncia determinada em espectrofotmetro
segundo Tabela 11.

Tabela 11 Comprimentos de onda


utilizados para a determinao de cada tipo
de clorofila.
Comprimento de Tipo de
onda (nm) clorofila
664 a
647 b
630 c1 + c2

Os valores de absorbncia so utilizados em equaes que fornecem a concentrao de


pigmentos na soluo. As concentraes dos pigmentos so reportadas em g/L.
A partir do mtodo da fluorimetria, uma alquota do sobrenadante da extrao usada
para medir a fluorescncia da amostra. A leitura fornece valores de clorofila e feofitina na
amostra extrada. A concentrao de pigmentos na amostra de gua tambm reportada em
g/L.
No mtodo cromatogrfico, uma alquota do sobrenadante da extrao filtrada em
seringa e injetada em uma coluna de fase reversa. A separao feita usando um gradiente
ternrio. O HPLC calibrado com soluo de clorofila a e clorofila b que podem ser
espectrofotometricamente quantificada de acordo com o mtodo cromatogrfico. As
concentraes so reportadas em g/L (ppb) ou mg/L (ppm).

69
3. Taxa de crescimento
No cultivo de microalgas, o termo crescimento refere-se ao aumento do nmero de
clulas ou das dimenses celulares. O crescimento populacional de microalgas , portanto,
definido como o aumento do nmero ou da massa de clulas.
Uma forma tradicional de calcular o crescimento exponencial de microalgas em
cultivo considera que durante o crescimento exponencial a taxa de aumento de clulas por
unidade de tempo proporcional ao nmero de clulas presentes na cultura no instante de
tempo inicial, segundo a seguinte equao:

Cuja soluo dada pela equao:

Onde N0 a condio inicial para o tamanho da populao, Nt o tamanho da populao no


final do intervalo de tempo e r a taxa proporcional de variao, tambm chamada de taxa
intrnseca de crescimento, cujas unidades so sempre expressas pelo tempo (t-1). Isolando esse
termo da equao, chega-se a:

Onde t o intervalo de tempo (tf t0) considerado, estando t0 representando o instante de


tempo inicial e tf o instante de tempo final do intervalo. Quando a mortalidade m zero, a
equao acima equivalente a equao de crescimento clssico, com r igual taxa de
crescimento especfico , ou:

70
Ao final do experimento uma reta pode ser ajustada aos dados da curva de crescimento
da espcie (medida de crescimento em escala logartmica versus o tempo de cultivo). Esse
ajuste permite encontrar a taxa de crescimento intrnseca do cultivo (.dia-1) dada pela
inclinao da curva (a). Sendo a equao geral da reta:

4. Duplicaes por dia


Expressando o termo tempo t em dias nas equaes acima, a taxa instantnea de
crescimento r pode ser utilizada para calcular o nmero de duplicaes por dia (k), dividindo r
pelo logaritmo natural de 2.

Ou alternativamente pela equao:

5. Tempo de duplicao
A partir das equaes de taxa de crescimento tambm possvel calcular as
duplicaes por unidade de tempo (dias ou fraes de dias). O tempo de duplicao (T2) da
cultura pode ser calculado a partir de uma estimativa de r, com o resultado expresso na
mesma unidade de tempo, conforme equao a seguir:

71
6. Tempo de gerao
O tempo de gerao (g) uma medida de crescimento que se refere ao intervalo de
tempo necessrio para que uma clula de cianobactria se duplique. O tempo de gerao
especfico dos organismos e pode divergir bastante mesmo entre as espcies de
cianobactrias. Por no tratar-se de um parmetro absoluto, uma vez que dependente de
fatores genticos e nutricionais, o tempo de gerao pode indicar o estado fisiolgico da
cultura.
O tempo de gerao calculado para a cultura, quando essa se encontra em fase
exponencial de crescimento (Figura 29). O procedimento para o clculo do tempo de gerao
:
Calcular o nmero de geraes (n) a partir da frmula:

Onde N corresponde ao nmero final de clulas, No ao nmero inicial de clulas e n ao


nmero de geraes.
Calcular o tempo de gerao (g) a partir da frmula:

Onde g corresponde ao tempo de gerao, t ao tempo de crescimento e n ao nmero de


geraes determinado acima.

72
Figura 29 Exemplo uma cultura com 1 gerao
e tempo de gerao de 2 dias.

importante notar as diferenas conceituais que fundamentam os termos taxa de crescimento, duplicaes
por dia e tempo de duplicao. Intuitivamente, pode parecer que uma diviso por dia seria equivalente a uma
taxa de crescimento de 1 d-1, porm, isso no verdade. A natureza contnua do crescimento exponencial
significa que uma cultura que cresce a uma taxa k de uma diviso por dia, tem um tempo de duplicao T2 de um
dia e uma taxa de crescimento r de 0,69 d-1.

7. Q10
O coeficiente de temperatura (Q10) representa o fator de aumento de uma reao a cada
elevao de 10C na temperatura. Esse coeficiente foi calculado a partir da equao:

Q10 = (R2/R1)^(10/T2-T1)

Onde T1 representa a temperatura mais baixa na qual a cepa foi cultivada, T2 a temperatura
mais alta, R1 representa a taxa de crescimento da cepa quando submetida a temperatura mais
baixa e R2 a taxa de crescimento da cepa quando submetida a temperatura mais alta.

73
6. Ik
O lk um coeficiente que representa o valor de intensidade luminosa que se aproxima
da saturao do crescimento algal. Esse valor nos d uma ideia do requerimento de luz que a
microalga tem para crescer. Valores baixos de lk so tpicos de gneros de cianobactrias
formadoras de floraes dispersivas e adaptadas a baixas intensidades luminosas, como
Cylindrospermopsis, Planktothrix e Limnothrix. Valores altos so tpicos de gneros de
cianobactrias formadoras de floraes acumulativas, como Microcystis, por exemplo.
O valor do Ik obtido a partir de um ajuste de modelo (recomendado por Jassby e
Platt, 1976). Para encontrar esse valor preciso calcular a taxa de crescimento da espcie de
cianobactria isolada em diferentes intensidades luminosas e plotar esses valores em um
grfico. Uma curva ajustada, ento, as taxas de crescimento. O valor de Ik est no encontro
da taxa de crescimento mxima da espcie isolada e uma reta traada com a mesma inclinao
da curva ajustada.

74
ANEXOS

75
ANEXO 1 Protocolo de preparao do meio F/2

Solues primrias
Composto: Quantidade (g) para 1 L:
NaNO3 75
Na2HPO4 5

Solues de metais trao


Composto: Quantidade (g) para 1 L:
Na2.EDTA 1,86
FeCl3.6 H2O 3,15
Soluo bsica de metais 1 (de cada uma das 5 solues)

Soluo bsica de metais (separadas)


Composto: Quantidade (g) para 100 mL:
MnCL2.4H2O 1,8
NaMoO4.2H2O 0,63
ZnSO4.7H2O 2,2
CoCl2.6H2O 1
CuSO4.5H2O 1

Soluo de Vitaminas
Composto: Quantidade (g) para 1 L:
Biotina 10
B12 1
Tiamina HCl 0,2

Para 950 mL de gua do local filtrada ou gua destilada/deionizada adicionar:


1 mL de soluo de NaNO3
1 mL de soluo de Na2HPO4
1 mL de soluo de metais trao
0,5 mL de soluo de vitaminas

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As solues de vitaminas devem ser mantidas no escuro. As solues primrias e as solues
bsicas de metais trao devem ser feitas separadamente (uma para cada metal). Para usar gua
do local, essa deve ser filtrada em filtro com abertura de malha de 0,2 m e armazenada na
geladeira.

77
ANEXO 2 Protocolo de preparao do meio ASM-1

Soluo Estoque A
Composto: Quantidade (g) para 1 L:
NaNO3 8,5
MgCl2.6H2O 2,05
MgSO4.7H2O 2,45
CaCl2.2H2O 1,45

Soluo Estoque B
Composto: Quantidade (g) para 100 mL:
KH2PO4.3H2O 0,87
Na2HPO4.12H2O 1,78

Soluo Estoque C
Composto: Quantidade (g) para 100 mL:
H3BO3 2,48
MnCL2.4H2O 1,39
FeCl3.6H2O 0,65
ZnCl2 0,335
CoCl2.6H2O 0,019
CuCl 0,0014

Soluo Stock D
Composto: Quantidade (g) para 100 mL:
Na2.EDTA.2H2O 1,86

Para 1 litro de meio ASM-1 adicionar:


20,0 mL da soluo estoque A
2,0 mL de soluo estoque B
0,1 mL de soluo estoque C
0,4 mL de soluo estoque D

78
O meio pode ser preparado com gua do local filtrada em filtro com abertura de poro de 0,2
m, gua destilada ou Milli-Q. As solues estoque devem ser guardadas sob refrigerao.
Para a preparao do meio ASM-1, as solues estoque devem ser retiradas da geladeira com
antecedncia (tempo suficiente para atingir a temperatura ambiente). O pH deve ser ajustado
(entre 7,6 e 7,8) com NaOH e HCl 1 M antes da autoclavagem. Autoclavar o meio de cultivo
a 120C por 20 minutos.

79
Glossrio de termos relacionados

Acinetos: Clulas vegetativas diferenciadas que aumentam de tamanho, com parede


espessada e contedo celular densamente granulado, constituindo-se em esporos de
resistncia.

Aertopos: Grupos de vesculas de gs relacionadas com a flutuao. Vistos ao microscpio


tico como corpos irregulares e refringentes rosados, negros ou incolores. Ocorrem
especialmente em cianobactrias planctnicas.

Auttrofo: Ser vivo capaz de produzir matria orgnica a partir de material inorgnico e
energia luminosa ou qumica.

Back up: Cultura de microalgas que no mais utilizada aps repicagem, mas mantida sob
condies adequadas de crescimento em laboratrio. O back up funciona como uma garantia
de manuteno das cepas isoladas caso ocorra algum imprevisto com a cultura estoque em
uso.

Bainha de mucilagem: Camada mucilagenosa que envolve clulas ou tricomas, formada por
polissacardeos excretados pelas clulas. Nas cianobactrias coloniais frequentemente
chamada de envelope mucilagenoso (fechado), enquanto que nas filamentosas de bainha
(aberta).

Biomassa: Refere-se ao peso da matria viva (organismo, populao ou comunidade),


normalmente expressa em peso seco ou peso fresco. Quantidade de material vivo que pode ser
expressa em peso, volume ou rea.

Biovolume: Volume ocupado pela clula ou organismo, considerando o volume da forma


geomtrica mais prxima do indivduo considerado.

80
Cmara de Sedgwick-Rafter: Cmara utilizada para quantificao de organismos em
microscpio tico comum, com capacidade de 1 ml e dimenses de 20 mm de largura, 50 mm
de comprimento por 1 mm de altura.

Cmara de Utermhl: Cmaras usadas para a sedimentao e contagem do fitoplncton (ver


Tcnica de Utermhl).

Cianotoxinas: Toxinas produzidas por cianobactrias que causam efeitos adversos sade do
homem e outros animais.

Cocide: Organismos com forma esfrica.

Cosmopolita: Diz-se do organismo que ocorre em todos os continentes ou guas ocenicas.

Endotoxina: Toxinas que esto presentes no interior das clulas e que somente so liberadas
para o meio aps o rompimento da parede celular. Isso pode ocorrer devido ao
envelhecimento da clula ou utilizao de compostos qumicos que atuem sobre essa parede.

Envelope de mucilagem: (ver Bainha de mucilagem).

Epilmnio: Em limnologia chama-se a camada de gua superior termoclina.

Escuma: Tambm denominada de nata ou espuma superficial, originada pelo acmulo de


indivduos de uma florao de cianobactrias, depositando-se geralmente nas margens, sob
efeito do vento dominante e em locais protegidos. O gnero de cianobactria Microcystis,
caracteristicamente, forma esse tipo de florao (florao acumulativa).

Espessamento: Aumento na espessura da parede celular. Ocorre em clulas especializadas.

Eutrfico: Ambiente com alta concentrao de nutrientes, especialmente nitrognio e fsforo


(ver Eutrofizao). Esse processo pode ocorrer devido a processos naturais ou a despejos
de esgotos domsticos e/ou industriais e pela lavagem de solos ricos em nutrientes (adubo).

81
Eutrofizao: Processo de enriquecimento das guas de ecossistemas aquticos por meio do
aumento da concentrao de nutrientes, especialmente nitrognio e fsforo. Pode ser um
processo natural, devido falta de mistura entre as camadas superficiais e profundas de um
ecossistema aqutico, ou artificial, com o aporte de efluentes agrcolas, urbanos ou industriais
nos corpos de gua. Este enriquecimento produz mudanas na qualidade da gua, como a
reduo do oxignio dissolvido, pode causar morte de peixes e decrscimo da diversidade de
espcies das diferentes comunidades. A eutrofizao normalmente acompanhada de
aumento de biomassa vegetal e multiplicao excessiva de cianobactrias.

Filamento: Conjunto constitudo pela bainha mucilagenosa e pela fileira de clulas (ver
Tricoma).

Fisso binria: Diviso da clula em duas clulas-filhas que atingem o tamanho da clula
me antes da prxima diviso. Tipo de reproduo caracterstico de Cianobactrias.

Fitoplncton: Constitudo pelos organismos aquticos microscpicos fotossintetizantes do


plncton que no tm movimento ativo suficiente para vencer os movimentos da gua.
responsvel pela base da cadeia trfica em ambientes aquticos, por meio da fotossntese.

Floraes: Proliferao excessiva de uma ou algumas espcies fitoplanctnicas, normalmente


conferindo colorao esverdeada, amarelada ou avermelhada gua. O grupo que mais forma
floraes em ecossistemas de gua doce o das Cianobactrias.

Florao acumulativa: Proliferao de algas fitoplanctnicas que se acumulam na superfcie


da gua (ver Escuma).

Florao dispersiva: Proliferao de algas fitoplanctnicas que se dispersam por toda a


coluna de gua. Esse tipo de florao especialmente problemtico para as empresas
responsveis pelo abastecimento pblico de gua.

Fotossntese: Processo de converso de dixido de carbono em carbono orgnico


(carboidrato) que ocorre ao nvel dos cloroplastos. O processo ocorre pela ao da energia
luminosa absorvida pelos pigmentos fotossintetizantes, especialmente clorofila.

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Frstula: Parede celular silicosa das diatomceas, constituda por duas partes que se
assemelham s partes superior e inferior de uma caixa perfeitamente ajustada. Essas partes
so chamadas de valvas ou epiteca e hipoteca.

Grnulos: Incluses no protoplasma de algumas algas, que so visveis ao microscpio tico


como corpos arredondados (regulares), escuros. Essas estruturas armazenam substncias de
diferentes tipos ou carotenides.

Heterocitados: Tricomas constitudos por tipos diferentes de clulas: as clulas vegetativas e


clulas diferenciadas, como os hetercitos e acinetos.

Hetercitos: Clulas vegetativas diferenciadas onde ocorre a fixao de nitrognio


atmosfrico. Essas clulas apresentam parede espessada, contedo celular frequentemente
verde-amarelado e ndulos polares na zona de contato com as clulas vizinhas.

Homocitados: Tricomas constitudos somente por clulas vegetativas.

Hormocistos: Hormognios (ver Hormognios) envolvidos por bainha mucilaginosa.


Essas estruturas funcionam como forma de resistncia. Sob condies ideias, os hormocistos
crescem atravs de divises celulares formando novos tricomas.

Hormognios: Pedaos de tricomas resultantes de fragmentao, geralmente constitudos por


poucas clulas, com funo de reproduo. Os hormognios crescem atravs de divises
celulares formando novos tricomas.

Lntico: Em limnologia o termo refere-se a ambientes de gua com baixa vazo, como lagos
e reservatrios.

Lise: Dissoluo ou destruio da clula, com rompimento da membrana celular e liberao


do contedo citoplasmtico.

Ltico: Em limnologia o termo refere-se a ambientes de gua corrente (com alta vazo), como
rios, crregos e riachos.

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Metalmnio: Em limnologia chama-se a zona de um corpo de gua ocupada pela termoclina
(ver Termoclina) e situada entre o hipolmnio e epilmnio.

Monitoramento: Observao, medio e avaliao contnua ou repetida do ambiente para


propsitos definidos, considerando a variao espacial e temporal, utilizando mtodos
comparveis para a coleta e medio de dados.

Montante: Em limnologia o local que se situa antes de um ponto referencial qualquer de um


curso de gua. Por exemplo: a nascente o ponto de um rio mais a montante.

Necrdios: Clulas mortas que auxiliam a fragmentao do tricoma para a formao de


hormognios, hormocitos e ramificaes.

Oligotrfico: Em limnologia refere-se ao ambiente aqutico com teor muito baixo de


nutrientes, principalmente nitrognio e fsforo.

Plncton: Comunidade de organismos microscpicos, que vivem em suspenso na coluna de


gua, flutuando livremente ou com movimentos fracos, mas sem capacidade de
movimentao ativa contra correntes.

Procarionte: Organismo que no possuem membrana envolvendo o ncleo e o plasto, cujo


DNA e tilacides esto livres no citoplasma.

Ramificaes falsas: Ramificaes produzidas sem mudana no plano de diviso celular em


relao ao eixo principal do tricoma.

Ramificaes verdadeiras: Ramificaes produzidas com mudana no plano de diviso


celular, passando a ser ortogonal ao eixo principal do tricoma.

Retculo de Whipple: Retculo usado para contagem de clulas em uma das oculares do
microscpio tico. O retculo apresenta-se dividido em 100 quadrados, sendo que o quadrado
central apresenta 25 subdivises.

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Tcnica de Utermhl: Tcnica utilizada para a sedimentao e contagem de fitoplncton. Os
organismos so concentrados diretamente em cmaras de sedimentao (ver Cmara de
Utermhl) e so observadas e contadas no microscpico invertido.

Tempo de Residncia: Em limnologia refere-se ao tempo mdio que a massa de gua fica
retida em um compartimento antes de ser transportada para o compartimento adjacente. O
tempo de residncia constitui um indicador importante do comportamento ecolgico e da
capacidade de auto-limpeza de ecossistemas aquticos.

Termoclina: Gradiente brusco de temperatura em uma determinada profundidade de um


corpo de gua.

Tricoma: Fileira de clulas que se comunicam entre si.

Utermhl: (ver Tcnica de Utermhl).

Zona ftica: Em limnologia refere-se a camada de um corpo de gua onde a luz pode penetrar
o suficiente para a realizao da fotossntese.

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