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FURB - Fundação Universidade Regional de Blumenau C.C.S. - Centro de Ciências da Saúde D.C.F. - Departamento de Ciências Farmacêuticas Disciplina: Toxicologia Clínica Professor: Marco Aurélio Gomes Mendonça

RELATÓRIO PRÁTICO:

TESTES COLORIMÉTRICOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE MEDICAMENTOS

Março – 2017

Daniela Fiamoncini Daniela Franz Felipe Reichert

1 INTRODUÇÃO

Paracetamol ou acetaminofeno (Tylenol®) é um fármaco com propriedades analgésicas e antipiréticas, sem propriedades antiinflamatórias clinicamente significativas. Atua por inibição da cascata do ácido araquidônico, impedindo a síntese das prostaglandinas, mediadores celulares pró-inflamatórios, responsáveis pelas várias manifestações da inflamação, como o aparecimento da dor. Já o ácido acetilsalicílico (AAS) é uma substância ativa utilizada como antiinflamatório, antipirético, analgésico e inibidor da agregação plaquetária sanguínea. Um dos medicamentos mais famosos à base de ácido acetilsalicílico é a Aspirina. A ingestão de comprimidos de ácido acetilsalicílico é a causa mais frequente de envenenamento com salicilatos. Já o paracetamol possui um metabólito ativo tóxico, e quando usado indevidamente, ultrapassando as doses terapêuticas recomendadas, se torna bastante tóxico. É possível identificar medicamentos em fluidos como a urina através de testes colorimétricos. Colorimetria é a medição da intensidade de luz transmitida por uma solução. Esta medição é então utilizada para a determinação quantitativa de uma substância dissolvida em uma solução. A substância deve ser colorida (absorver luz) ou convertida em um composto colorido. Os testes de cor são bastante utilizados por toxicólogos e analistas de drogas como uma das primeiras ferramentas para a presunção e identificação de drogas e venenos. Esses testes colorimétricos são mais úteis para produtos farmacêuticos e resíduos de cenários, em menor grau a fluidos biológicos, tais como conteúdo do estômago, urina. Eles são usados para identificar o desconhecido em uma classe específica de compostos ou para eliminar as categorias ou classes de compostos. A presença de salicilatos pode ser identificada pela adição de solução de cloreto férrico a urina do paciente. Os polifenóis, quando em presença do ferro, podem ter os oxigênios de suas hidroxilas oxidados ou formar complexos com aquele elemento. Esses produtos apresentam coloração que varia do azul ao violeta, por terem maior número de ligações duplas conjugadas que o seu precursor. Como o ácido acetilsalicílico não possui hidroxila fenólica disponível, somente o ácido salicílico é capaz de formar complexos com sais de ferro. Esta reação não é especifica, vale como triagem para todos os compostos fenólicos. O paracetamol é em sua maior parte metabolizado

por conjugação com ácido glicurônico previamente a excreção urinária. A hidrólise do conjugado glicurônico se dá por tratamento com ácido clorídrico concentrado, resultando em p-aminofenol. Este se conjuga com solução de fenol e hidróxido de amônio, dando um teste qualitativo sensível, apresentando a cor azul em 10 minutos, o que indica a presença de fenacetina ou paracetamol. Esses ensaios não são confirmatórios, mas sim eliminátórios, já que várias subâstncias podem apresentar grupos funcionais em comum. Os testes coloridos permanecem populares por muitas razões, sendo que a grande vantagem da utilização desse teste justifica-se na sua simplicidade, pois não exige a utilização de equipamentos de alta precisão, nem de reagentes de uso restrito aos laboratórios, ou seja, são testes simples de executar, usa-se reagentes baratos, com resultados que são perceptíveis a olho nu, sejam com a mudança de cor (formação de produto colorido ou desaparecimento de cor do analito ou reagente), formação de precipitado ou produção de gás. Outra vantagem é a possibilidade de, dependendo da seletividade da reação, serem aplicados à identificação de fármacos, tanto de matérias-primas, quanto em medicamentos (produto acabado). Apelam particularmente em partes do mundo em desenvolvimento onde as instalações de laboratório tendem a ser muito limitadas. A desvantagem é que esses testes apresentam menor sensibilidade e o fato de que não são aplicáveis a mistura de fármacos com grupos comuns. Os testes de cor apenas indicam a presença de um composto ou classe de compostos, por isso todos os testes devem ser confirmados por métodos mais específicos, especialmente importante em casos forenses.

2 DESENVOLVIMENTO

As amostras destinadas a realização do teste foram nomeadas como Amostra 01 e Amostra 02. Além disso, havia também o controle negativo. Para dar início ao teste, foi escolhida uma amostra dentre duas presentes, que foi a Amostra 01. Todos os testes foram realizados, tanto com a amostra, quanto com o controle negativo.

Com relação a pesquisa de paracetamol, adicionou-se, em um tubo de ensaio, 1,0 mL de

urina e 1,0 mL de HCl concentrado, que foi levado ao banho de água fervente por 20 minutos

e resfriado a temperatura ambiente. Foi recolhido uma alíquota de 200 µL, onde foi

adicionado 5 mL de fenol 1,0 % e 3,0 mL de NH4OH 4,0 M. O paracetamol, em sua maioria, é metabolizado por conjugação com ácido glicurônico e a hidrólise do conjugado glicurônico ocorre com a adição de ácido clorídrico concentrado, obtendo p-aminofenol. O mesmo, sofre conjugação com a solução de hidróxido de amônio e fenol, ocorrendo o desenvolvimento de uma coloração azul, indicando a presença de fenacetina ou paracetamol. Posteriormente, foi adicionado a um tubo de ensaio, novamente, 1,0 mL de urina, 2 gotas de HCl 10 %, onde a solução foi resfriada em banho de gelo. Depois disso, a amostra foi retirada, adicionando à ela 2 gotas de nitrito de sódio a 1 % e 2 gotas de α-naftol 1,0 % preparado em solução de NaOH 10 %. Quando presente na amostra, o acetaminofeno (n-acetil-p-aminofenol) reage com nitrito de sódio, formando 2,4-nitro-4-acetaminofenol, que assume coloração amarela a vermelho em meio alcalino. A intensidade dessa coloração é proporcional à concentração do acetaminofeno, que pode ser quantificado em espectrofotômetro no comprimento de onda de 430 nm.

A
A
B
B
C
C

Figura 1 - A. Estrutura química do paracetamol. B. Estrutura química do p-aminofenol. C. Estrutura química da fenacetina.

Com relação à pesquisa de salicilatos, primeiramente, adicionou-se a um tubo de ensaio, 1,0 mL de urina e 0,5 mL de cloreto férrico 1 %. Em seguida, ferveu-se 2,0 mL de urina em tubo de ensaio sem tampa durante 2 minutos.

A amostra foi resfriada a temperatura ambiente. Depois disso, foi adicionado cloreto férrico

10 %.

Os salicilatos quando presentes na amostra, resultam em uma coloração violeta, onde a concentração do ácido salicílico (produto de biotransformação do ácido acetilsalicílico) está diretamente relacionada à intensidade da coloração violeta do complexo formado entre o salicilato e o íon férrico oriundo do reagente cromogênico, o cloreto férrico. Isso ocorre porque os polifenóis, quando em presença do elemento ferro, podem ter os oxigênios de suas hidroxilas oxidados ou formar complexos com aquele elemento. Como o ácido acetilsalicílico não possui hidroxila fenólica disponível, somente o ácido salicílico é capaz de formar complexos com sais de ferro. O aquecimento da amostra elimina corpos cetônicos que podem causar interferência no resultado da análise, já que derivados fenólicos também possuem a capacidade de gerar essa reação.

também possuem a capacidade de gerar essa reação. Figura 2. Equação química da reação de complexação

Figura 2. Equação química da reação de complexação do Fe3+ com o ânion slicilato.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A amostra escolhida pelo grupo, denominada Amostra 01, passou por todos os testes para identificação de paracetamol e ácido acetilsalicílico. Com relação à pesquisa de paracetamol, a amostra apresentou-se igual ao controle negativo nos dois procedimentos realizados, sendo que, no primeiro experimento ambos os tubos permaneceram incolores, enquanto que, na segunda etapa, ambos os tubos apresentaram coloração amarelo esverdeada. Desta forma, o resultado indica a ausência de paracetamol na Amostra 01, já que as colorações das amostras após a adição dos reagentes deveriam ser azul, na primeira etapa, e

amarelo a vermelho na segunda etapa, resultados esses apresentados pela equipe que analisou a Amostra 02, onde foi identificado a presença de paracetamol, através das mudanças de coloração provenientes da adição dos reagentes, resultando na coloração azul para a primeira etapa e alaranjado para a segunda etapa. Com relação à pesquisa de salicilatos, no primeiro procedimento realizado, o tubo do controle negativo apresentou-se com coloração amarelada, e o tubo da amostra ficou marrom, indicando a presença de salicilatos (Figura 3 - A). Ao fazer o segundo procedimento, o controle negativo apresentou coloração esbranquiçada, enquanto que a amostra assumiu coloração roxa (Figura 3 - B). Como citado anteriormente, a amostra adquire coloração roxa na presença dos salicilatos através da formação do complexo entre o salicilato e o íon férrico oriundo do reagente cromogênico, o cloreto férrico. Isso ocorre porque, os polifenóis, quando em presença do elemento ferro, podem ter os oxigênios de suas hidroxilas oxidados ou formar complexos com aquele elemento.

A B
A
B

Figura 3 - A. Reação com cloreto férrico 1%. B. Reação com cloreto férrico 10%

Os testes realizados mostraram a presença de salicilato na amostra 01, por estarem dentro da escala de cor que a literatura nos garante positividade nos testes. É possível que haja uma variação de cores, onde a concentração do ácido salicílico (produto de biotransformação do ácido acetilsalicílico) está diretamente relacionada à intensidade da coloração violeta do complexo formado entre o salicilato e o cloreto férrico.

4 CONCLUSÃO

De acordo com os resultados dos testes que realizamos com a amostra 01, podemos

afirmar que não há presença de paracetamol na urina, já que não ocorreram as mudanças na

coloração que estão descritas na bibliografia. Em relação à pesquisa de salicilatos, os testes

realizados se mostraram positivos, a amostra mudou de cor conforme as referências

bibliográficas.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ARAÚJO, Ana Cláudia Macedo; BITTENCOURT, Maysa Alves; BRITO, Aline Sousa. Paracetamol, uma visão farmacológica e toxicológica. Trindade (GO), 2013. Disponível em: <https://pt.slideshare.net/DanielaBatista4/paracetamol-uma-visao-farmacologica-e- toxicologica >. Acesso em: 01 mar 2017.

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MOFFAT, A.C. (ed). Clarke’s isolation and identification of drugs. London:

Pharmaceutical Press, 2004.

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SEBBEN, Viviane Cristina; LUGOCH, Rosemeri de Wallau; SCHILINKER, Cristina Simões; ARBO, Marcelo Dutra; VIANNA, Renata Loureiro. Validação de metodologia analítica e estudo de estabilidade para quantificação sérica de paracetamol. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial, Porto Alegre (RS), v. 46, n. 2, p. 143-148, 2010. D i s p o n í v e l e m : < http://www.scielo.br/scielo.php? script=sci_arttext&pid=S1676-24442010000200012>. Acesso em 01 mar 2017.