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SECRETARIA DE EDUCACIN

PBLICA
TECNOLGICO NACIONAL DE
MXICO

INSTITUTO TECNOLGICO DE ROQUE


H

INGENIERA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

MICROBIOLOGA I

1er PARCIAL
ESTERILIZACIN DE MATERIALES
Y MEDIOS DE CULTIVO
PRACTICA 1

PRESENTA
ARREOLA CEBALLOS FRANCISCO FORTINO
FLORES TORRES MARIAM
JIMNEZ OLALDE NICOLS
OLVERA ALMANZA SERGIO

GRADO: 4 GRUPO: A

REVISOR
VIOLETA HERRERA ENCISO.

ROQUE, CELAYA, GTO.


9 DE FEBRERO DE 2017.
NDICE

OBJETIVOS 3

INTRODUCCIN 3

MARCO TERICO 4

MATERIALES Y REACTIVOS 8

PROCEDIMIENTOS 9
RESULTADOS 12

CONCLUSIN 14

BIBLIOGRAFA 15

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OBJETIVOS

Conocer los principios generales de la preparacin y tcnicas de


esterilizacin de diversos materiales y medios de cultivo de uso comn en
Microbiologa.
Conocer el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la
contaminacin microbiana en el laboratorio.

INTRODUCCIN

La esterilizacin es un mtodo de eliminacin total de todo tipo de organismo que


asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente. Una esterilizacin
deficiente o manipulacin incorrecta de materiales y medios de cultivo conlleva a
contaminaciones, resultados errneos o prdida del material biolgico. Por ello, se
requieren buenas prcticas de laboratorio para su adecuado manejo.
La esterilizacin por calor seco o hmedo son los mtodos que se utilizan con
mayor frecuencia en el Laboratorio de Microbiologa. El calor seco destruye a los
microorganismos por oxidacin, por ejemplo, al exponerlos directamente a la flama
de un mechero o en horno a 150-180C durante 2 horas. Estos mtodos se
aplican en la esterilizacin de asas de inoculacin y para todo tipo de material de
vidrio y quirrgico.
Los procesos con calor hmedo afectan la estabilidad de estructuras celulares y
protenas; se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones termoestables,
materiales de vidrio y cultivos bacterianos que se desechan.
El equipo de uso comn es la autoclave, que utiliza vapor de agua a presin (15
lb/in2); con esta presin el material alcanza una temperatura de 121 C y si se
mantiene durante 15 minutos se asegurar la inactivacin de endosporas, que son
las estructuras bacterianas ms resistentes al calor.

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MARCO TERICO

AGAR
El agar, o agar -agar, es un polisacrido que se obtiene de algas del gnero
Gelidium, algas que se han utilizado en la cocina tradicional japonesa, por sus
propiedades gelificantes, desde hace muchos siglos. Tambin se obtiene de otras
algas, entre ellas especies de los gneros Gracillaria , de las que procede
actualmente la mayora del agar, y de Gelidiella y Pterocladia, que aportan
pequeas cantidades. El agar de mejor calidad de obtiene de Gelidium, aunque en
los ltimos aos se ha extendido mucho la obtencin a partir de cultivos marinos
de Gracillaria, que son ahora la fuente principal de este polisacrido. En Espaa
se obtiene sobre todo de Gelidium corneum. En el listado de aditivos alimentarios
de la Unin Europea, el agar es el E-406.
El agar se considera formado por la mezcla de dos tipos de polisacridos, la
agarosa y la agaropectina. La agarosa es el componente principal, representando
alrededor del 70% del total. Tanto la agarosa como la agaropectina tienen la
misma estructura bsica.
El agar es un polisacrido no digerible, que desde el punto de vista nutricional
forma parte de la "fibra". Las enzimas capaces de degradar el agar son
extraordinariamente raras, incluso entre los microorganismos. Por eso el agar es
tambin un valioso medio de cultivo en bacteriologa.

AGAR DEXTROSA PAPA (PDA)


USO:
El agar dextrosa papa es un medio para hongos y levaduras.
PRINCIPIO:
El agar dextrosa papa es un medio de los Mtodos Estndar utilizado en el
aislamiento , cultivo y recuento de hongos y levaduras, de muestras lcteas y otros
alimentos. Otro de sus usos es el mantenimiento de cultivos. La Dextrosa y la
infusin de patata favorecen el crecimiento de hongos y levaduras, que se ve
favorecido por la ligera inhibicin del crecimiento bacteriano al tener un pH cido
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de 5,6. Es un medio que favorece la esporulacin y permite visualizar las
caractersticas morfolgicas de las colonias.

AGAR CUENTA ESTNDAR


El Agar Mtodos Estandar es un medio utilizado para el recuento de bacterias
aerbicas a partir de agua, aguas residuales, alimentos y productos lcteos. Este
medio tambin es conocido como Agar Cuenta Estandar.

El Agar Mtodos Estandar fue desarrollado por Buchbinder Baris and Goldstein en
1953 como un requerimiento de la American Public Health Association. Este medio
se formula con los ingredientes originales. El extracto de levadura y la peptona de
casena han sido utilizados en medios diseados para estudiar la presencia de
microorganismos termoflicos en productos lcteos desde 1928.

La peptona de gelatina y el extracto de levadura proporcionan la fuente de


carbono y nitrgeno. La dextrosa es el carbohidrato fermentable y el agar es
adicionado como agente solidificante.

BILLIS ROJO VIOLETA

Este es un medio selectivo para la investigacin presuntiva y recuento de


coliformes en alimentos, productos lcteos y otros materiales de importancia
sanitaria.

En el madio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes


necesarios para el crecimiento bacteriano, las sales biliares y el cristal vioeta
inhiben el desarrollo de la flora Gram positiva, la lactosa es el hidrato de carbono
fermentable, y el rojo neutro es el indicador de pH. El agar es el agente
solidificante.

Los coliformes son bacterias que fermentan la lactosa, acidifican el medio y


producen un viraje del indicador de pH al color rojo intenso. Debido a esto, se
observan como colonias de color rojo prpura, de 1 a 2 mm de dametro, rodeadas
generalmente, de una zona rojiza de bilis precipitada.
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INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

BACTERIAS QUE FERMENTAN LA LACTOSA: colonias rojo prpura, rodeadas


por un halo de precipitacin rojizo.

BACTERIAS QUE NO FERMENTAN LA LACTOSA: colonias del color del medio,


incoloras.

Morfologa y crecimiento de colonias


El desarrollo de colonias sobre superficies de agar permite al microbilogo
identificar las bacterias porque las especies forman a menudo colonias con una
forma y aspecto caracterstico (Figura 5.11). Cuando se ha sembrado una
poblacin heterognea de clulas microbianas, es posible a veces identificar la
colonia deseada por su aspecto general y utilizarla para obtener un cultivo puro.

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La estructura de las colonias
bacterianas se ha examinado
tambin con el microscopio
electrnico de barrido. La
estructura microscpica de las
colonias es a menudo tan
variable como su aspecto visual
(Figura 5.12).

En la naturaleza, las bacterias y muchos otros microorganismos crecen con


frecuencia formando biofilms. Sin embargo, a veces forman discretas colonias. En
consecuencia, el conocimiento del crecimiento de las colonias es fundamental
para los eclogos microbianos, por lo que el crecimiento de colonias sobre medios
con agar se ha estudiado con inters. En general, el crecimiento celular ms
rpido se produce en el extremo de la colonia. El crecimiento es ms lento en las
partes centrales ms antiguas de las colonias y, en algunos casos, se llega a
producir una autolisis celular en dicha zona. Parece que estas diferencias en el
crecimiento se deben a gradientes de oxgeno, nutrientes y productos txicos
dentro de la colonia. En el extremo de sta, el oxgeno y los nutrientes son
abundantes. El centro de la colonia es, por supuesto, ms grueso que el extremo.
Por ello, el oxgeno y los nutrientes no difunden tan fcilmente en el centro, los
metabolitos txicos no pueden eliminarse rpidamente y el crecimiento en esta
zona es ms lento o est detenido. Debido a estas variaciones ambientales dentro
de una colonia, las clulas de la periferia crecen a un nivel mximo, mientras que
las del centro, mueren.
Resulta evidente de la Figura 5.11 que algunas bacterias se multiplican sobre
superficies slidas como el agar formando complejas e intrincadas colonias. Estos
patrones varan dependiendo de la disponibilidad de nutrientes y de la dureza del
agar. Sin embargo, an no est claro por qu se desarrollan las peculiares
caractersticas morfolgicas de las colonias. La difusin de nutr ientes y su
disponibilidad, la quimio taxia bacteriana, y la presencia de lquido sobre la
superficie del agar pueden jugar algn papel en los morfo tipos observados.

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Complementando la clasificacin es por su consistencia:
- Color
- Viscosidad
- Membranosa
- Dura
- Seca
- Cremosa
- Mucos

Tambin se puede inclus por sus caractersticas pticas:


- Opacas
- Lucidas
- Sin permitir la completa visivilidad

MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales por equipo Equipo Medios y Reactivos

4 tubos de cultivo con rosca Autoclave Agar bilis rojo violeta


4 tubos de cultivo sin rosca Incubadora Agar papa dextrosa (PDA)
6 cajas Petri Balanzas Agar bacteriolgico(cuenta
analticas estndar)
2 pipetas de 1.0 mL
2 pipetas de 10 mL
3 matraces Erlenmeyer de 500
mL
2 vasos de precipitados de
100 mL
1 probeta de 250 mL
Parrillas de calentamiento con
agitacin
Agitadores magnticos
Mecheros Fisher
Papel estraza para envolver
Algodn y gasa
PROCEDIMIENTOS

A) Preparacin del material de vidrio y medios de cultivo

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1. Lavar en forma respectiva el material de vidrio y enjuagar
con abundante agua corriente.
2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con
agua destilada. Dejar escurrir el material sobre una toalla o
papel de envolver.
3. Preparar 200 mL de agar bilis rojo violeta en un matraz
Erlenmeyer de 500 ml. Vaciar 5 mL en dos tubos de cultivo
con tapn de rosca que se cerrarn sin llegar al tope.
4. Calentar el medio en una parrilla con agitacin constante
hasta ebullicin (cuidar que no se proyecte) y vaciar 5 mL de medio en 2 tubos con
tapn de rosca. Enjuagar de inmediato la pipeta para evitar que se solidifique el
agar.
5. Preparar 200 mL de medio de cultivo PDA en un matraz Erlenmeyer de 500 mL,
ajustar el pH del medio a 5.6. Colocar un agitador magntico y calentar hasta
ebullicin, cuidando que no se proyecte o derrame. Vaciar 5 mL de medio en
cuatro tubos sin rosca que se taparn con tapn de algodn y gasa.
6. Preparar 200 mL de medio de cultivo cuenta estndar en un matraz Erlenmeyer
de 500 mL. Colocar un agitador magntico y calentar hasta ebullicin.

B) Esterilizacin de materiales y medios de cultivo

1. Las cajas Petri y pipetas envueltas con papel estraza


se colocarn en un horno a 150C durante 2 horas.
Despus de sacarlas, dejar enfriar y abrir los paquetes
nicamente en rea asptica (cerca del mechero).
2. Los medios de cultivo se esterilizarn en autoclave de
acuerdo con las siguientes instrucciones:
a. Revisar que el agua en la autoclave est limpia y el
nivel coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario cambiar o
aadir agua destilada.
b. Conectarla y poner la perilla de control en calentamiento mximo. Con el uso de
guantes de asbesto, acomodar los medios y materiales en la canasta de la
autoclave y colocarla dentro.

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c. Cerrar la tapa, apretar las manijas de dos en dos en posicin encontrada y
esperar a que salga el vapor por el orificio de purga, despus cerrarlo con la
vlvula.
d. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121C o 15 lbs /in 2 de presin
y mantener estas condiciones durante 15 minutos. Revisar continuamente el
manmetro y regular el control de temperatura a valor medio o mnimo.
e. Apagar la autoclave y dejar que la presin baje al valor de cero. Quitar la vlvula
y con la ayuda de guantes de asbesto, abrir cuidadosamente la tapa, desde la
parte trasera para evitar que el vapor caliente cause quemaduras.

C) Vertido de los medios en cajas Petri y solidificacin.

1. Cerrar los tubos con tapn de rosca, los que


contienen agar se colocarn en una superficie
inclinada para que el medio solidifique a una
distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del tubo.

2. Enfriar los medios de cultivo de los matraces hasta una


temperatura aproximada de 45-50C, que coincide con la
posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano
sin quemarse.
3. Limpiar la mesa con solucin de alcohol al 70% (v/v),
encender mecheros y colocarlos a una distancia de 50 cm.
Verter entre 20 y 25 mL de cada uno de los medios en tres
cajas Petri en esta zona asptica. Dejar que los medios
solidifiquen.

C) Prueba de esterilidad de materiales

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1. Abrir una caja Petri de CE, BRV y PDA, as como un tubo de CE,
BRV y PDA, durante 1 minuto en zonas no aspticas (patio, aulas,
comedor) y etiquetarlas.
2. Abrir una caja Petri de CE, BRV y PDA, as como un tubo de CE,
BRV y PDA, durante 1 minuto en zona asptica (cerca del mechero) y
etiquetarlas.
3. Colocar los tubos y las cajas Petri en una incubadora ajustada a
30C durante 24-48 horas. Las cajas Petri se colocarn con la
tapa hacia abajo.
4. Revisar los tubos y cajas Petri para detectar la presencia de
contaminantes, por la aparicin de turbidez, nata superficial y/o
depsito de material en el fondo de los tubos con medio lquido, as como la
formacin de colonias microbianas en la superficie de los medios slidos.

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RESULTADOS

FIGURA 1.
EN ESTA IMAGEN SE MUESTRA LAS CAJAS CON CULTIVO LAS CUALES FUERON
ABIERTAS EN NUESTRA ZONA ACEPTICA.

AGRA PDA: crecimiento --


AGAR CE: crecimiento +
AGAR BRV: crecimiento

FIGURA 2.
EN ESTA IMAGEN SE MUESTRA LAS CAJAS CON CULTIVO LAS CUALES FUERON
ABIERTAS EN ZONAS NO ASPTICAS.

AGRA PDA (kiosco) : crecimiento + +


AGAR CE( Cafetera atrs ): crecimiento + + +
AGAR BRV(Cafetera frente) : crecimiento +

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Descripcin morfolgica

BRV PDA CE
Tiempo de
incubacin 24 hrs. 210 hrs. 24 hrs. 210 hrs. 24 hrs. 210 hrs.
Circular Circular
Circula Puntiform Puntiform filamentos filamentos
Forma r Irregular e e a a
Ondulad Entero Entero
Margen Entero o Entero Entero filamentos filamentos
Elevada convexa convexa
Elevacin Plana convexa Plana Convexa Plana Plana
Translucid
ptica Opaca Opaca Opaco Opaca a
Consistenci Cremosa Cremosa Cremosa
a Dura viscosa Dura mucosa Dura-seca Dura-seca

UFC 2 2 16 23 26 27

CONCLUSIN

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Con esta prctica pudimos conocer los principios de la microbiologa, as mismo,
como realizar de forma correcta la esterilizacin de material y nuestro medio de
cultivo (agar). Conocer la dilucin en placa y para qu sirve este mtodo, conocer
la temperatura general de incubacin para el desarrollo de microorganismos y
poder dar una descripcin morfolgica de nuestro desarrollo microbiano.

De acuerdo a nuestros resultados obtenidos en nuestras placas abiertas en la


zona asptica nos pudimos dar cuenta que hubo un crecimiento muy pequeo en
una de las cajas, lo cual nos indica, que nuestra zona no estaba completamente
asptica, pudindose debe a: factores del ambiente, factores del personal y
factores fsicos como un poco fuego en nuestra zona.

Obtuvimos un buen desarrollo de la prctica ya que en nuestras cajas abierta en


zona no asptica si encontramos desarrollo microbiano lo cual nos permiti
realizar descripcin morfolgica de las colonias y poder seguir haciendo siembras
para una mejor clasificacin de lo desarrollado en nuestras placas de agar.

BIBLIOGRAFA

15
Prescott, L.M. Harley, J.P. y Klein, D.A. 2004. Microbiologa. Madrid,
Espaa. 5a edicin. Mc Graw-Hill Interamericana.

http://es.slideshare.net/pauledreha/agar-de-dextrosa-y-papa

http://ssfe.itorizaba.edu.mx/ntec13/webext/secure/hoja/GUSTAVO%20A
%20COMPLETO/MSDS%20AGAR%20ESTANDAR%20GA.pdf

http://www.britanialab.com/productos/B02143%20REV%2001-VIOLETA
%20ROJO%20Y%20BILIS%20AGAR.pdf

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10
_GlucosaBilisRojoVioleta.pdf

http://electronic-systems.com.mx/pdf/AGAR%20BILIS%20ROJO
%20VIOLETA..pdf

http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/azucares/agar.html

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