TRANFERENCIAY

MANIPULACIONDEGENES

Dr.SergioGutirrez
InstitutodeBiologaMoleculary
Biotecnologa
 Contenido
Recombinacion
Transformacin
Transduccin
Transposicin
Conjugacin
Clonamiento degenes:vectores,hospederosy
expresin
Clonamiento yexpresindegenesmamferos
 Recombinacin
IntercambiofsicodeDNAentreelementos
genticos.
Procesocomplejo(E.coli,aprox.25genes)
Recombinacinhomloga
Recombinacinhomloga
Deteccinderecombinacin
homloga
 Transformacinbacteriana

Griffith,1928:elprincipiotransformante

Averyetal.,1944:elADNes
elprincipiotransformante.
Hotchiss,1949.
HerscheyyChase,1952.

Desarrollodela
genticabacteriana
 17AA

41AA

R
NADHoxidase(Nox) (SSB) (DprA) (PP) B B/I

(~14genes)

Streptococcuspneumoniae
 DiferenciasconS.Pneumoniae

Faseestacionaria.
Endonucleasadeentrada
EndA
Cultivoscompetentesheterogneos(mesosomas).

Desarrollodelacompetencia:
ProtenasdeTranslocacin
fasedecrecimiento.
ComC;ComG17; ComF13;
ComE1
tiponutricional(glucosa;AA).
3;1 comC/cilC
tipocelular(C/NC) comG/cilD
comE/cilE

=comS

Bacillus subtilis
PenetracindelADNenbacteriaGrampositivo

EndA

ComG1
3
Fasesdelatransformacinnatural
Competencia
UninyentradadelADNexgenoalaclula
Fasedeeclipse
DestinodelADNexgeno(exogenote):
recombinacinconelendogenote.
FasedeEclipse
EspecificidaddelADN

Transformasoma(~12)
 Transformacin Artificial

Golpedecalor(42C)enpresenciadeCaCl2

Protoplastos(lizozima)enmediohipertnicoyPEG

Electropermeabilizacin/Electrotransformacin.
90
80
8 ms
70
FlujodeATP

60
50
40
30
20
10
0
0 6,4 6,7 7 7,3 7,5 7,8 8 8,5 9 9,5

E(Kv/cm)
Transduccin
 Transduccin
especializada

Esposiblehacerunlisado
conunaltottulodelfago
transductante
 TransduccionGeneralizada

Ej.FagoP1
Conjugacin
AlternativasdeFenlaclula
IntegracindeFenelcromosoma
DestinosdeF
TransferenciadecromosomamediadaporF(cepasHfr)
MapadelfactorF

OriV:replicacinbidireccional

OriS:replicacinunidireccional

OriS OriV
 Losgenestra seclasificandeacuerdoasufuncin

1. Sntesisyensamblajedelpili(traA,B,C,E,F,G,H,K,L,
Q,U,V,W).

2. Estabilizacindelparconjugante(traGyN)

3. MetabolismoconjugativodelDNA(traD,I,M,Y,Z)

4. Regulacindelatransferencia(traJ,finO,finP)

5. Exclusindesuperficie(traSyT)
MapadelfactorR
Movilizacindeplasmidios
noconjugativosatravsde
plasmidiosconjugativos
 ClonacinMolecular
Laclonacinconsisteenlaobtencindeunconjuntodeelementosgenticamente
igualesentresieigualesasuprecursor.
Manipulacindegenes
Estrategia general del proceso de clonacin

1. Aislamiento del ADN forneo

2. Unin del fragmento de ADN forneo a un vector

3.Introduccin del vector-DNA forneo en la clula hospedadora

4. Seleccin de los transformantes

5. Estabilidad de la informacin gentica

 Enzimasderestriccin
Endonucleasas (enzimas)derestriccin>Enzimasde
bacteriasquereconocensecuenciasdeDNAespecficasylo
cortanporelesqueletoazcarfosfato.

TipoIyIII:cortanelDNAenpuntosdistintosaldereconocimiento(al
azar)

TipoII:cortanjustoenlospuntosquereconocen,quesonrepeticiones
invertidasopalndromes.

5GGATCC 3

3CCTAGG 5
EcoRI:E.Coli
BamHI:Bacillus amyloliquefaciens
Productos generados por enzimas de restriccin

extremos cohesivos

EcoRI 5GAATTC3 5G AATTC3

3CTTAAG5 3CTTAA G5

PstI 5CTGCAG3 5CTGCA G3

3GACGTC5 3G ACGTC5

extremos romos

HaeIII 5GGCC3 5GG CC3

3CCGG5 3CC GG5
 Vectoresdeclonacin
VehculosdeDNAcapacesdealmacenarDNA
forneoyreplicarlo.
Caractersticasprincipales
Replicacinautnoma(origendereplicacin)
Presenciaderegionesnoesencialesparasu
multiplicacinyestabilidad
Creacin de molculas de DNA Recombinante in
vitro

5 ...GAATTC... ...GAATTC... 3
3 ...CTTAAG... ...CTTAAG... 5

Eco RI Eco RI
Separation of restriction fragments
-OH -OH (P) (P)
5 G 5 G AATTC 3 AATTC 3
anneal anneal
3 CTTAA 3 CTTAA G 5 G 5
(P) (P) OH OH

DNA Ligase

5 GAATTC
Recombinant DNA
3 CTTAAG
 Introduccin del vector-DNA forneo en la
clula hospedadora

Transformacin(plsmidos)
Transduccin
Conjugacin
SELECCIN
Resistencia a antibiticos
Genes marcadores (gen -galactosidasa)
GFP (green fluorescent protein)
Hibridacin de colonias
Enresumen
Vectoresdeexpresin
 REQUISITOSPARAUNABUENAEXPRESION

Elnmerodecopiasdelgenporclula(altovsvectoresde
integracin)

Regulacinyeficienciadelpromotor.Ej.lac,trp,tac,PL, 10
(reconocidoporlaRNApolimerasadelfagoT7).

Iniciacindelatraduccin

Usodecodones

Estabilidaddelaprotena.
Protenasdefusin.
Protenassecretadas
UNVECTORDEEXPRESION
Lasclulasquellevaneste
plasmidiosininsertoenlacZ
formarncoloniasazulesenplacas
XgalIPTGenpresenciadel
fragmentolacZ (huspeddebe
serlacZM15;lacZ,ylacIq;
complementacin)
 SistemadeexpresinpT77/pGP12

452
bla Lambda:
Cla I 35711
Hinc II
Hind III Lambda: 35259/
PLSma I Sac I
Pst I T7:3106
2760
pT7-7 Sal I
Xba I
T7
Gen 1
EcoR I
Pla
BamH I (RNA c
Orige 2473 pb Sma I polimerasa)
n
EcoR I
cI-857
Col EI
Bgl Nde
I
pGP1-2
II
rbs ATG 1050
T7:5847
10 Xba
I BamH I
7140 bp
Pst I
Promotor T7
T7:2285
7 Hind III
CGATTCGAACTTCTCGATTCGAACTTCGATAGACTTCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGA

met ala arg ile

Sma I Xho I
CCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAT ATG GCT AGA ATT Kan
rsb
Nde I EcoR I

arg ala arg gly ser ser arg val asp leu gln pro lys leu ile ile asp... 2900
CGC GCC CGG GGA TCC TCT AGA GTC GAC CTG CAG CCC AAG CTT ATC ATC CAT... T7:
22972
Sma I BamH I Xba I Sal I Pst I Hind III Cla I
 E. coli K-38pGp1-2/pT7-7 E. coli K-38pGp1-2/p157

E. coli K-38pGp1-2/pT7-7 E. coli K-38pGp1-2/p157

T S P T S P M T S P T S P M T MI ME M T MI ME

A B

Expresin de la protena de la inmunidad desde p157. La flecha Localizacin de la protena de la inmunidad en la

indica la banda correspondiente a la protena de inmunidad.
(A), PAGE-SDS-16% de los extractos obtenidos. (B),
Autorradiografa de PAGE-SDS mostrado en A. T, fraccin total;
S, fraccin soluble; P, fraccin particulada; M, marcadores de
peso molecular.
membrana interna. PAGE-SDS-14% de los
extractos obtenidos. La flecha indica la banda
correspondiente a la protena de inmunidad. T,
fraccin total; MI, fraccin de membrana
interna; ME, fraccin de membrana externa; M,
marcadores de peso molecular.