ARN 2009

Procesamiento del ARN

Departamento de Qumica Biolgica

Expresin de genes
 Propiedades del ARN
Generalmente simple cadena (Alto grado de
plegamiento)
El azcar es ribosa: -OH en 2 (-H en deoxi)
AUGC (U reemplaza a T del ADN); pares A:U
El ADN es nuclear en eucariotas; protenas se
sintetizan en citoplasma; RNA INTERMEDIARIO

Experimentos de pulse chase usando 3H-U

Microscopia electrnica de la transcripcin de ARNr
 Procariotas
transcripcin y traduccin simultnea

Eucariotas
transcripcin en ncleo
traduccin en citoplasma
INTERVALO: Fase post transcripcional ???
 ARN en eucariotas

RNA Pol I: rRNA

RNA Pol II: mRNA
RNA Pol III: tRNAs y snRNAs
 genes eucariotas

intrones secuencias sin sentido

exones secuencias codificantes

Gen eucariota tpico
Procesamiento
 Details of processing:
5 Cap: m7Gppp
(guanyltransferase)
5Cap
3 PolyA (150-200)

AAUAAA: Signals Cleavage of

nascent transcript ca. 20 nt
downstream

Poly A polymerase adds 3 A

Splicing
 Pasos en el procesamiento
del ARN: co-transcripcionales

Capping: modifica el extremo 5

Clivaje y poliadenilacin: forma el extremo 3

Splicing: ocurre en el ncleo antes del

transporte
 Split Genes
Exp con SV40: los transcriptos no siempre corresponden a las secuencia
lineales del ADN
Confirmacin por tecnologa del ADN recombinante
Encontrado en mRNA, tRNA and rRNA
Gen de la Ovalbumina : Microscopia electrnica
Intron

Intron Exon

Exon
Secuencia completa de eventos del
procesamiento del ARN.
SPLICING ALTERNATIVO
Gran flexibilidad gentica
 Intrones en diferentes genes
ARNm (0 a 60)
ARNr
ARNt (0 o 1)

Genes en mitocondria
Genes en cloroplastos
ARNhn es el precursor del ARNm

HIBRIDIZACION ARN - ADN

Weissmann y col. 1978

 Splicing
los intrones son removidos
 Clases de intrones
Auto - splicing
Grupo I: genes nucleares, mitocondriales y
cloroplsticos que codifican para ARNr, ARNt y
ARNm, en Tetrahynena, Physarum, hongos y
phage T4
Grupo II: transcriptos primarios de ARNm
mitocondrial o cloroplstico en hongos, algas y
plantas
No auto - splicing
Splicing de transcripto primario de ARNm:
spliceosoma
Splicing de ARNt de levaduras
 Intrones no auto splicing
Transcriptos primarios de ARNm
Se forma el intermediario lazo
Requiere:
small nuclear ribonucleoproteins: snRNP
o snurps
small nuclear RNA: snRNA (U1, U2, U4,
U5, U6)
 Seales de splicing
exon GU-intrn-AG exn

secuencia consenso

5-AG GUAAGU-intrn-YNCURAC-YnNAG G-3

Y: U o C A R: purina
Yn: 9 pirimidinas N

en levaduras
5- GUAUGU-intrn-UACUAAC-YAG -3

Disturbios en secuencias consenso inhibe el splicing

normal
 Mecanismo de Splicing: las secuencias son claves

At the 3 splice site = AG

Other consensus elements further upstream
help define where these splice joints exist.
Small nuclear
RNAs (snRNAs)
act as guides in
the splicing
process: Forms
the splicosome

Most begin with GU end

with AG at the flanks

spliceosoma
Esquema del mecanismo de Splicing en 2 etapas
Reacciones de transesterificacin

1) - 2OH de un A interno ataca al

fosfodiester que une el extremo 5
del intrn al exn 1, produciendo el
LAZO y molculas 5 exn

2) - 3OH del exn 5 ataca al

fosfodiester que une el comienzo del
exon 2 y el extremo 3 del intrn,
ligado a los exones

El intrn se libera como lazo

El N de fosfodisteres se
conserva!!!!
El splicing puede estudiarse in vitro

Hicks y col. Methods (2005) 37: 306

 ME: Suero control
DO: antisuero anti RNA-prot

PAGE 4%

PAGE 10%
Sharp y col, 1984
Anlisis de los productos de la reaccin de splicing
in vitro
 Cintica del Splicing In vitro.
Extracto nuclear de Hela

Pre - radioactively labeled

precursor RNA

The splicing reactions were

separated by gel electrophoresis.
Notice that the intron and intron-
exon RNAs have an unusually
reduced mobility in these
polyacrylamide-urea gels.
Es este ARN atpico producto del splicing?

Sharp y col, 1984

 Mecanismo de splicing en 2
etapas: predicciones
intrn spl tiene un grupo 3 OH
exn P exn
sitio spl 3downstream

intrn spl y exn 2+intrn

nt ramificado (2, 3 y 5 OH unidos a nt)

extremo 5 del intrn en la
ramificacin
Mecanismo de la RNasa T1 y
T2
 La ramificacin involucra el extremo
5 del intrn unido a un sitio dentro del
intrn

Conclusin
Los RNAm nucleares sufren splicing va un intermediario
ramificado o tipo lazo
Sharp y col.
 Como ensayamos el splicing?

Comparamos la secuencia del

RT-PCR
ADN con la del ARNm maduro
Sntesis de la sonda para el ensayo de proteccin de la
ribonucleasa (RPA)
 Seal de ramificacin
A dentro de regin especial del intrn
WT
Splicing

Mutante 1
No splicing

Mutante 2
Splicing
aberrante

Mutante 3
Splicing aberrante

Secuencia Langford y Gallwitz,

UACUAAC Gen: actina de levaduras 1983
 RESUMEN
Los precursores de los ARNm sufren splicing
Se forma el intermediario lazo
Requiere:
Secuencias consenso en los extremos 5 y 3 de los
intrones
Secuencias consenso en el punto de ramificacin
En levaduras: UACUAAC y determina cual AG
downstream es el sitio 3 de splicing
En eucariotas superiores: UNCURAC
El nt del BP is la A final
Spliceosomas: intermediarios unidos a
partculas
Spliceosoma humano

levaduras
 snRNAs y snRNPs
Small nuclear RNAs
son los agentes que reconocen las
seales de splicing
Actan acoplados a protenas

Small nuclear ribonuclear proteins

snurps
Se unen al spliceosoma y juegan roles
crticos
RNA que esta siendo sintetizado

U1, U2, U4, U5 y U6

snARN son abundantes en el ncleo
 Reconocimiento de los sitios de
splicing
sitio donor 5 sitio de ramificacin sitio aceptor 3

Y: C o U N: cualquier nt
snRNA U1 reconoce la secuencia en el sitio donor
interaccin por apareamiento de bases
snRNA U2 se une al sitio de ramificacin
interaccin por apareamiento de bases
Splicing en los transcriptos
primarios de ARNm
Spliceosoma: ensamblaje de la
maquinaria de splicing
Spliceosoma: ensamblaje de la
maquinaria de splicing
Spliceosoma: los grupos reactivos
entran en estrecha proximidad

U5 funciona como puente

Formacin del spliceosoma
U1snRNP Adenovirus E1A

13S
12S
9S
Apareamiento de bases entre U1 snRNA y el sitio 5 de
splicing es necesario pero no suficiente

Porque cambios en U1 fallan en compensar cambios de bases en el

sitio 5 spl?
Es necesario protena/s que reconozca la secuencia en 5????
 U6snRNP
S: exn -(4tioU) intrn-
exn + extracto spl
UV cross-linking
4tioU a ARN
Electroforesis

Conclusiones
U6 se une al nt 2 del intrn

Evidencia por reversin del crosslinking

U6 se asocia a S antes de
formacin lazo
U6 precursor, U6 lazoy U6-
U2

Steitz, 1991
 Doble reconocimiento
U1 y U6

Sitio 5
Prueba de lectura para mejorar la
especificidad del splicing