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Cpia no autorizada

SET 1996 NBR 13720


Alimentos cidos - Determinao da
causa de deteriorao microbiana
ABNT-Associao
Brasileira de
Normas Tcnicas

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Rio de Janeiro
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NORMATCNICA

Mtodo de ensaio
Origem: Projeto 13:007.01-014/1995
CB-13 - Comit Brasileiro de Alimentos e Bebidas
CE 13:007.01 - Comisso de Estudo de Anlises Microbiolgicas
NBR 13720 - Acid foods - Tests for cause of microbiological spoilage - Method
of test
Copyright 1996, Descriptor: Acid food
ABNTAssociao Brasileira Vlida a partir de 30.10.1996
de Normas Tcnicas
Printed in Brazil/
Impresso no Brasil Palavra-chave: Alimento cido 5 pginas
Todos os direitos reservados

1 Objetivo c) pipeta sorolgica graduada e de ponta cortada,


com 10 mL de capacidade, com bocal para algo-
Esta Norma prescreve o mtodo para a determinao da do, esterilizada;
causa de deteriorao microbiana de produtos aliment-
cios cidos, acondicionados em embalagens hermticas d) luvas cirrgicas;
que sofreram processo de esterilizao.
e) capela de fluxo laminar vertical;
2 Documentos complementares
f) pra de trs vias ou equivalente;
Na aplicao desta Norma necessrio consultar:
g) funil de vidro, esterilizado;
NBR 10203 - Preparo da amostra para exame mi-
crobiolgico - Procedimento h) estilete de metal de haste comprida, esterilizado;

NBR 11955 - Alimentos - Contagem de bolores e le- i) equipamentos para obteno de condies de
veduras em placas - Mtodo de ensaio anaerobiose;

NBR 12122 - Bactrias coliformes totais, coliformes j) aparelhagem usual de laboratrio microbiolgico.
fecais e Escherichia coli em alimentos - Determi-
nao do nmero mais provvel (NMP) - Mtodo de 4 Execuo do ensaio
ensaio
4.1 Meios de cultura e reagentes
3 Aparelhagem
Os meios de cultura e reagentes so os seguintes:
A aparelhagem necessria execuo do ensaio a se-
guinte: a) gar cido (gar thermoacidurans);

a) abridor bacteriolgico para latas (ver Figura), este- b) gar APT;


rilizado;
c) gar batata dextrose;
b) tubo de ensaio de 25 mm x 200 mm, com tampa de
baquelite rosquevel, esterilizado; d) gar dextrose triptona;
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2 NBR 13720/1996

e) caldo cido; i) reagentes para colorao de Gram;

f) caldo APT; j) soluo de lcool iodado;

g) caldo extrato de malte; l) soluo de perxido de hidrognio a 3% (10 vol);

h) reagentes para colorao de esporos; m) soluo saturada de bicarbonato de sdio.

Figura - Abridor bacteriolgico para latas

4.2 Preparo dos meios de cultura e reagentes f) carbonato de sdio p.a. (Na2CO3): 1,25 g;

4.2.1 gar cido (gar thermoacidurans) g) tiamina: 0,0001 g;

Dissolver os ingredientes abaixo em 1000 mL de gua h) dextrose: 10,0 g;


destilada, aquecer at a dissoluo completa, distribuir
em frascos ou tubos e esterilizar em autoclave a 121C, i) tween 80: 0,2 g;
por 15 min. O pH final deve ser 5,0.
j) sulfato de magnsio p.a. (MgSO4): 0,8 g;
a) proteose peptona: 5,0 g;
l) cloreto de mangans p.a. (MnCl2): 0,14 g;
b) extrato de levedura: 5,0 g;
m) sulfato ferroso p.a. (FeSO4): 0,04 g;
c) dextrose: 5,0 g;
n) gar: 15,0 g.
d) fosfato monopotssico p.a. (KH2PO4): 4,0 g;
4.2.3 gar batata dextrose
e) gar: 20,0 g.
De acordo com a NBR 11955.
4.2.2 gar APT

4.2.4 gar dextrose triptona


Dissolver os ingredientes abaixo em 1000 mL de gua
destilada, aquecer at a dissoluo completa do meio e
esterilizar em autoclave a 121C, por 15 min. Distribuir, Dissolver os ingredientes abaixo em 1000 mL de gua
assepticamente, pores de 15 mL em placas de Petri destilada, aquecer at a dissoluo completa do meio e
esterilizadas. Deixar solidificar, armazenar sob refrige- esterilizar em autoclave a 121C, por 15 min. Distribuir,
rao e secar antes de sua utilizao. O pH final deve ser assepticamente, pores de 15 mL em placas de Petri
(6,7 0,2). esterilizadas. Deixar solidificar, armazenar sob refrige-
rao e secar antes de sua utilizao. O pH final deve ser
a) tripticase, peptona ou triptona: 10,0 g; (6,7 0,2).

b) extrato de levedura: 7,5 g; a) triptona: 10,0 g;

c) fosfato dipotssico p.a. (K2HPO4): 5,0 g; b) dextrose: 5,0 g;

d) cloreto de sdio p.a. (NaCl): 5,0 g; c) prpura de bromocresol: 0,04 g;

e) citrato de sdio p.a.: 5,0 g; d) gar: 15,0 g.


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4.2.5 Caldo cido 4.2.10 Soluo de lcool iodado

Dissolver os ingredientes abaixo em 1000 mL de gua De acordo com a NBR 10203.


destilada, distribuir pores de 10 mL em tubos de ensaio
com tampa de baquelite rosquevel e esterilizar em auto- 4.3 Preparo da amostra
clave a 121C, por 15 min. O pH final deve ser 5,0. Antes
da utilizao, o meio deve ser desaerado em banho- 4.3.1 Com as amostras em temperatura ambiente, obser-
maria, em ebulio, por 15 min, e resfriado imediata- var se h evidncias de vazamento, corroso, estufa-
mente em gua fria. mento e outras alteraes externas na embalagem. Con-
servar as amostras estufadas sob refrigerao at o mo-
a) proteose peptona: 5,0 g;
mento da abertura.
b) extrato de levedura: 5,0 g;
4.3.2 Lavar as embalagens com escova e sabo, enxa-
c) dextrose: 5,0 g; guar em gua corrente para limpeza completa e secar.

d) fosfato dipotssico p.a. (K2HPO4): 4,0 g. 4.3.3 Desinfetar a parte onde se pretende realizar a aber-
tura da embalagem, com soluo de lcool iodado. No
4.2.6 Caldo APT flambar embalagens estufadas.
Dissolver os ingredientes abaixo em 1000 mL de gua
4.3.4 Usando luvas cirrgicas e em condies asspticas,
destilada, distribuir pores de 10 mL em tubos de ensaio
com tampa de baquelite rosquevel e esterilizar em com auxlio de estilete e funil de vidro invertido, furar a
autoclave a 121C, por 15 min. O pH final deve ser embalagem colocada sobre uma bandeja, para elimi-
(6,7 0,2). nao de gases, e abrir, com o auxlio de um abridor
bacteriolgico. Proceder do mesmo modo com emba-
a) tripticase, peptona ou triptona: 10,0 g; lagens de abertura do tipo easy open, abrindo do lado
oposto.
b) extrato de levedura: 7,5 g;
Nota: No caso de contaminao acidental, limpar imediatamente
c) fosfato dipotssico p.a. (K2HPO4): 5,0 g; o local, usando soluo saturada de bicarbonato de sdio
para inativar toxina botulnica, caso esteja presente.
d) cloreto de sdio p.a. (NaCl): 5,0 g;
4.4 Inoculao dos tubos
e) citrato de sdio p.a.: 5,0 g;
4.4.1 Retirar pores de aproximadamente 2 g da amostra,
f) carbonato de sdio p.a. (Na2CO3): 1,25 g;
do centro da embalagem, ou 2 mL, se a amostra for lquida,
g) tiamina: 0,0001 g; e inocular em quatro tubos de ensaio contendo caldo
cido, em dois tubos de ensaio contendo caldo extrato de
h) dextrose: 10,0 g; malte e em dois tubos de ensaio contendo caldo APT.

i) tween 80: 0,2 g; 4.4.2 Estratificar dois tubos contendo o caldo cido com
uma camada de aproximadamente 1,5 cm a 2,0 cm de
j) sulfato de magnsio p.a. (MgSO4): 0,8 g; gar selo.
l) cloreto de mangans p.a. (MnCl2): 0,14 g;
4.4.3 Preparar a lmina de microscopia da amostra, para
m) sulfato ferroso p.a. (FeSO4): 0,04 g. exame direto, em microscpio de contraste de fase ou
atravs da colorao de Gram e descrever as caracte-
4.2.7 Caldo extrato de malte rsticas dos microrganismos observados.

Dissolver 15,0 g de extrato de malte em 1000 mL de gua Notas: a)Retirar 10 g ou 10 mL da amostra e transferir para tubo
destilada, distribuir pores de 10 mL em tubos de ensaio de ensaio de 25 mm x 200 mm, com tampa de baquelite
com tampa de baquelite rosquevel e esterilizar em rosquevel. Conservar sob refrigrao para uso
autoclave a 121C, por 15 min. O pH final deve ser 4,7. posterior, se necessrio.

4.2.8 Reagentes para colorao de esporos b) Retirar uma poro da amostra para verificao do
pH.
4.2.8.1 Soluo de verde malaquita
c) Conservar a embalagem para exames fsicos, caso
Dissolver 5,0 g de verde malaquita em 100 mL de gua necessrio.
destilada e armazenar em frasco mbar.
4.5 Incubao dos tubos inoculados
4.2.8.2 Soluo de safranina
4.5.1 Incubar dois tubos contendo caldo APT e dois tubos
Dissolver 0,5 g de safranina O em 100 mL de gua desti-
lada e armazenar em frasco mbar. contendo caldo extrato de malte, temperatura de 30C,
por 96 h.
4.2.9 Reagentes para colorao de Gram
4.5.2 Incubar dois tubos contendo caldo cido tem-
De acordo com a NBR 12122. peratura de 55C, por 48 h.
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4 NBR 13720/1996

4.5.3 Incubar os tubos contendo caldo cido estratificado 4.7.2 Caldo cido incubado a 35oC e a 55oC
temperatura de 35C, por cinco dias, no mximo.
De cada tubo suspeito, transferir uma alada, com auxlio
de ala de platina ou nquel-cromo, semear, por estrias,
4.6 Leitura dos tubos
em duas placas contendo gar dextrose triptona. Incubar
a 35C e a 55C por at 72 h.
4.6.1 Com o auxlio de ala de platina ou nquel-cromo,
transferir uma alada do material de cada cultura para l- 4.8 Colorao de esporos
mina de microscopia e proceder colorao de Gram ou
efetuar o exame microscpico direto em contraste de fase. 4.8.1 A partir das colnias isoladas, com ala de platina
ou nquel-cromo, transferir o material para uma lmina
4.6.1.1 Na ocorrncia de microbiota mista ou cultura de de microscopia e preparar o esfregao, fixando por aque-
cocos, bastonetes Gram negativos, bolores ou leveduras, cimento.
as anlises microbiolgicas podem ser finalizadas e a
4.8.2 Cobrir o esfregao com soluo de verde malaquita,
embalagem vazia, sanificada, submetida a exames
aquecer delicadamente chama, at a emisso de va-
fsicos.
pores, por trs a quatro vezes, em 30 s. Resfriar.

4.6.1.2 Na ocorrncia de cultura pura de bastonetes Gram 4.8.3 Lavar, cuidadosamente, a lmina em gua corrente.
positivos em algum dos tubos incubados, a presena de
esporos mesfilos e/ou termfilos deve ser confirmada 4.8.4 Cobrir o esfregao com soluo de safranina, aguar-
como em 4.7. dar 3 s, lavar a lmina em gua corrente, secar e observar
no microscpio sob imerso. Os esporos coram-se de
verde e as clulas vegetativas, de vermelho.
4.6.2 A presena de gs e odor butrico nos tubos con-
tendo caldo cido estratificado, incubados a 35oC, indi- 4.9 Teste de catalase
cativa do desenvolvimento de bactrias anaerbias do
grupo butrico. A partir das colnias isoladas, com auxlio de ala de pla-
tina ou nquel-cromo, transferir o material para uma lmina
4.7 Isolamento em placas de microscopia ou para uma placa de Petri vazia. Adi-
cionar uma gota de soluo de perxido de hidrognio a
4.7.1 Caldo APT e caldo extrato de malte incubados a 30C 3% e observar se h formao de bolhas, pela liberao
de gases durante a hidrlise da soluo na presena da
enzima.
De cada tubo suspeito transferir uma alada, com auxlio
de ala de platina ou nquel-cromo, e semear, por estrias, 5 Resultados
em placa contendo gar batata dextrose acidificado e em
placa contendo gar APT. Incubar a 30C por at cinco Os resultados podem ser interpretados de acordo com a
dias. Tabela.
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Tabela -Tabela orientativa para o diagnstico de causa mais provvel de deteriorao de produtos alimentcios cidos, acondicionados em embalagens
hermticas que sofreram processamento trmico

Condio Odor Aparncia pH Exame Cultura Diagnstico


da do produto microscpico
lata

Estufada (com Normal Normal ou Normal Negativo ou Negativa Corroso: deve-se confirmar a
corroso (metlico) espumosa microrganismos presena de H2 (+ 20%)
interna) escassos

Estufada cido Espumosa ou Abaixo do Cultura pura ou mista de Crescimento em aerobiose a 30C Subprocessamento grosseiro
salmoura normal bastonetes, cocos ou e/ou em anaerobiose a 35C e ou vazamento
viscosa leveduras possivelmente a 55C

Estufada Normal ou Espumosa Normal ou Bastonetes, usualmente Crescimento em anaerobiose com Resfriamento inadequado ou
cido "de ligeiramente com aspecto granular gs a 55C e possivelmente lento estocagem temperatura
queijo" abaixo do a 35C. Cultura negativa: termfilos elevada (termfilos anaerbios)
normal anaerbios freqentemente
auto-esterilizam-se

Estufada Butrico Espumosa com Bastante Bastonetes, colorao Crescimento em anaerobiose com Subprocessamento trmico
bastante gs abaixo do bipolar, provveis gs a 35C. Odor butrico (anaerbios do grupo butrico)
normal esporos

Estufada cido Espumosa Abaixo do Bastonetes Gram Crescimento em aerobiose a 30C Subprocessamento grosseiro
normal positivos no e/ou anaerobiose a 35C, com (Lactobacillus sp)
esporognicos produo de cido e gs.
Crescimento possvel a 55C.
Catalase negativa

Normal (com cido ou Normal Pouco ou Bastonetes Gram Crescimento com produo de cido Subprocessamento (Bacillus
ou sem vcuo) "medicinal" bastante abaixo positivos no e sem gs a 55C, e possivelmente a coagulans, usualmente em
do normal esporognicos 30C e/ou 35C, em meio com pH 5,0. derivados de tomate)
Catalase positiva

Normal (com Normal Normal ou Pouco ou Cultura pura ou mista Crescimento em aerobiose a 30C e/ou Vazamento ou subprocessamento
ou sem vcuo) ou cido salmoura bastante abaixo de bastonetes cocos ou anaerobiose a 35C, e possivelmente grosseiro
viscosa do normal bolores a 55C

Sem vcuo Normal Normal Normal ou Negativo ou Negativa Exausto insuficiente. Branqueamento
e/ou deformada ligeiramente microrganismos insuficiente. Resfriamento inadequado
abaixo escassos Sobreenchimento.
Deteriorao incipiente