Você está na página 1de 12

PEWARNAAN ALIZARIN RED

Oleh :
Nama : Nurul Isnaeni
NIM : B1J013047
Rombongan: IV
Kelompok : 6
Asisten : Mithun Sinaga

LAPORAN PRAKTIKUM PERKEMBANGAN HEWAN

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN


UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2014
I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Alizarin red merupakan suatu metode untuk mengetahui pembentukan tulang


pada embrio atau untuk mendeteksi proses kalsifikasi pada tulang embrio. Tulang
yang diwarnai oleh Alizarin red akan berwarna merah tua, yang menandakan bahwa
tulang tersebut telah mengalami kalsifikasi (Shabani et al., 2009). Warna merah tua
terbentuk karena zat warna yang diberikan terikat oleh kalsium pada matriks tulang
(Karyadi, 2008). Pewarnaan Alizarin red berprinsip pada afinitas Alizarin red untuk
mengikat kalsium dari tulang. Alizarin red membuat tulang berwarna merah.
Pewarna ini dulunya terbuat dari tanaman Madder (Ruba tinctorum), pertama kali
digunakan pada abad 18 dalam percobaan pada pertumbuhan tulang oleh John
Hunter dan lain-lain (Pramod et al., 2011).
Tulang merupakan penyusun sistem rangka yang berkembang dari skleretoma
yang merupakan derivat dari mesoderma dorsal, merupakan jaringan penyokong
sebagai bagian dari jaringan pengikat dalam arti luas. Tulang terbentuk melalui dua
cara, menurut Soeminto (2000), proses kalsifikasi atau terbentuknya tulang terjadi
dengan 2 cara yaitu melalui osifikasi intra membran dan osifikasi endokondral.
Proses pembentukan tulang dimana jaringan mesenkim menjadi jaringan tulang
disebut osifikasi intra membranosa dan sel-sel mesenkim yang terdiferensiasi terlebih
dahulu menjadi kartilago (tulang rawan) kemudian berubah menjadi jaringan tulang
yang disebut osifikasi endokondra. Osifikasi bermembran terjadi dalam tulang-tulang
tengkorak pipih dan klavikula (tulang selangka), sedangkan osifikasi endokondral
sebagian besar sisi kerangka tubuh (Jinzhang, 2006).
Perkembangan tulang mencakup pertumbuhan tulang diawali dari
penggantian jaringan tulang menjadi jaringan kartilago yang selanjutnya akan diganti
pula dengan jaringan tulang. Proses pertumbuhan dan perkembangan tulang sangat
bergantung pada mineralisasi ektrasel. Komponen matriks ekstrasel yang berperan
dalam pengerasan tulang adalah garam kalsium. Proses pengendapan garam-garam
kalsium terjadi secara berangsur-angsur sehingga tulang yang terbentuk secara intra
membran mengalami osifikasi lebih cepat dibandingkan dengan tulang yang
terbentuk secara endokondral (Jessop, 1988). Morfogenetik tulang protein (BMP)
merupakan anggota dari pertumbuhan mengubah faktor- (TGF-) dan memainkan
peran penting dalam diferensiasi osteoblas dan pematangan embrio (Hasegawa et al.,
2008).
Penggunaan ikan Nilem (Osteochillus hasselti) sebagai preparat pewarnaan
Alizarin red adalah karena lebih mudah dalam melakukan pengamatan struktur
tubuhnya saat dilakukan pergantian larutan. Alasan lain yaitu lebih praktis karena
tidak harus mencabuti bulu seperti saat menggunakan embrio ayam sebagai preparat
serta mudah dicari.
B. Tujuan

Tujuan dari praktikum pewarnaan Alizarin red adalah dapat mengerjakan


prosedur pewarnaan Alizarin dan menerangkan proses kalsifikasi tulang pada ikan
Nilem (Osteochillus hasselti).
II. MATERI DAN METODE

A. Materi

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum Alizarin red adalah 8 botol


sampel, kertas label, dan spuit injeksi tanpa jarum.
Bahan yang digunakan dalam praktikum Alizarin red adalah ikan Nilem
(Osteochillus hasselti), larutan alkohol 96%, larutan KOH 1%, larutan KOH 2%,
larutan pewarna Alizarin red, akuades, NaCl fisiologis dan larutan penjernih A, B dan
C, tissue.
B. Metode

1. Ikan Nilem (Osteochillus hasselti) diletakkan di botol kecil.


2. Ikan Nilem (Osteochillus hasselti) dibersihkan dengan cara dimasukkan ke
dalam NaCl fisiologis selmaa 30 menit.
3. Ikan dimasukkan ke dalam alkohol 96% direndam selam 12 jam.
4. Larutan alkohol 96% diganti dengan akuades (selama 10 menit).
5. Larutan diganti dengan KOH 1% (selama 3 jam).
6. Larutan diganti dengan Pewarna Alizarin red (5 jam).
7. Larutan diganti dengan larutan penjernih A, B, dan C (masing-masing selama 1
jam).
8. Bagian tulang yang terwarnai dimati, diidentifikasikan.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN


A. Hasil

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

(g) (h)
(i)

(h)

Keterangan :
a. Gambar ikan sebelum perlakuan
b. Gambar ikan setelah dimasukkan NaCl fisiologis
c. Gambar ikan setelah dimasukkan Akuades
d. Gambar ikan setelah dimasukkan Alkohol 96%
e. Gambar ikan setelah dimasukkan KOH 1%
f. Gambar ikan setelah dimasukkan Alizarin red
g. Gambar ikan setelah dimasukkan Larutan Penjernih A
h. Gambar ikan setelah dimasukkan Larutan Penjernih B
i. Gambar ikan setelah dimasukkan Larutan Penjernih C
Tabel 2. Data Pengamatan Tulang yang Terkalsifikasi

Tulang yang terwarnai


No Kelompok
Sirip punggung, ekor, tengkorak, sirip dada,
1 I dan tulang belakang

Rongga mata, insang, tulang belakang, dan


2 II tulang tengkorak

Tulang tengkorak, tulang belakang, sirip ekor,


3 III sirip punggung, dan rongga mata

Tulang tengkorak, tulang belakang bagian


4 IV
posterior, dan bagian anterior
5 V Tulang belakang, dan rongga mata
6 VI Tulang tengkorak, ronga mata, sirip ekor,
tulang belakang, dan sirip punggung.
B. Pembahasan

Pewarnaan Alizarin red digunakan untuk mendeteksi proses kalsifikasi pada


tulang Ikan Nilem, tulang yang pertama terwarnai adalah tulang tengkorak (tulang
kepala), tulang tengkorak merupakan tulang yang dibentuk dengan cara osifikasi
intra membran. Proses ini berasal dari seat kolagen dimasuki zat ossin (protein
tulang), kemudian fibroblast pembentuk mengalami transformasi menjadi osteoblast
dan osteoclast. Osteoblast pembentuk tulang, osteoclast peresap zat yang akan
dirombak menjadi tulang (Huether, 1961).
Hasil pengamatan pada Tabel 2 mengenai tulang yang terwarnai didapatkan
hasil pada kelompok I ialah ikan yang terwarnai yaitu bagian sirip punggung, ekor,
tengkorak, sirip dada, dan tulang belakang. Kelompok II hasil yang didapatkan
adalah tulang yang terwarnai pada bagian rongga mata, insang, tulang belakang, dan
tulang tengkorak. Kelompok III diperoleh hasil tulang yang terwarnai adalah tulang
belakang, tulang tengkorak, sirip ekor, sirip punggung dan rongga mata. Pada
kelompok IV diperoleh hasil tulang ikan yang terwarnai tulang tengkorak, tulang
belakang bagian posterior dan bagian anterior. Kelompok 5 yaitu, tulang belakang
dan rongga mata sedangkan kelompok 6 yaitu, tulang tengkorak, rongga mata, sirip
ekor, tulang belakang dan sirip punggung.
Berdasarkan hasil praktikum, terlihat adanya perbedaan hasil antar
kelompok yakni terdapat hasil tulang ikan yang terwarnai dan yang tidak terwarnai.
Hal ini bisa disebabkan karena beberapa faktor, misalnya kondisi fisiologis ikan yang
berbeda dan lamanya waktu yang digunakan dalam perendaman yang berbeda, dan
umur embrio yang masih muda (Junqueira, 1982). Tulang-tulang yang telah
mengalami kalsifikasi akan berwarna merah tua. Tulang yang tidak terwarnai akan
berwarna transparan. Tulang yang tidak terwarnai belum tentu tidak mengalami
kalsifikasi, mungkin pada saat diwarnai larutan belum terserap ke seluruh bagian
(Kalthoff, 1996). Berdasarkan hasil di atas terdapat perbedaan pada tulang yang
terbentuk pada ikan. Mahanthesha et al., (2009) menjelaskan bahwa perbedaan
dalam perkembangan terjadi karena dalam ikan beberapa dari tulang-tulang itu
diendapakan dalam mesenkim yang belum terdeferensiasi (pembentukan tulang intra
membran), sedangkan dibagian lain dari tubuh terjadi pembentukan tulang yang
didahului oleh sistem tulang rawan penumpu yang sementara (pembentukan tulang
endokondral). Perbedaan antara kedua proses itu terletak dalam kenyataan bahwa
pada osifikasi endrokondral tiap spikul diendapkan sekeliling pecahan matriks tulang
rawan yang telah mengapur, sedangkan pada spikul tulang intramembran tidak
terdapat kerangka semacam itu.
Larutan yang digunakan dalam pewarnaan Alizarin red adalah larutan alkohol
96%, larutan KOH 1%, larutan pewarna alizarin red, larutan penjernih A, B, C dan
larutan NaCl fisiologis. Larutan alkohol 96% berfungsi sebagai fiksatif, setelah
diberi larutan ini bagian perut ada yang berwarna merah dan lunak, dan sisiknya ada
yang terkelupas sedikit. Larutan ini digunakan untuk merendam ikan selama 12 jam.
Setelah itu, ikan diberi akuades yang berfungsi untuk menghilangkan efek dari
alkohol, larutan ini digunakan untuk merendam ikan selama kurang lebih 10 menit,
warna ikan menjadi tidak pucat lagi. Ikan diberi larutan KOH 1% selama 3 jam,
digunakan untuk mentransparansi otot pada ikan dan skeletonnya terlihat jelas.
Larutan Alizarin red digunakan setelah KOH 1% untuk merendam ikan selama 5
jam. Terlihat bagian ikan yang terwarnai yaitu tulang tengkorak dan rongga mata,
larutan menjadi bau asem. Selanjutnya ikan direndam pada Larutan penjernih A,
warna ikan transparan dan warna larutan sedikit keruh. Ikan di rendam dengan
larutan penjernih B, warna larutan ikan berubah menjadi keunguan, tubuh ikan
berwarna ungu muda (pink). Langkah terakhir direndam menggunakan larutan
penjernih C, warna larutan putih bening (jernih), ikan tetap transparan, dan tulangnya
terlihat. Ikan dalam larutan ini direndam selama masing-masing 1 jam.
Alizarin red adalah suatu metode mikroteknik untuk mengetahui
pembentukan tulang pada ikan atau untuk mendeteksi proses kalsifikasi pada tulang
ikan. Tulang yang diwarnai dengan Alizarin red akan berwarna merah tua apabila
tulang tersebut telah mengalami kalsifikasi. Warna ini muncul karena zat warna yang
diberikan terikat oleh kalsium pada matriks tulang. Pembentukan sistem rangka
dimulai pada inkubasi hari ke 5 ditandai dengan kondensasi mesenkim prekartilago.
Kondrifikasi dimulai pada hari ke 8 sedangkan osifikasi dimulai pada hari ke 9
(Soeminto, 2000).
Pewarnaan Alizarin red digunakan untuk mendeteksi proses klasifikasi pada
tulang ikan, tulang yang pertama terwarnai adalah tulang tengkorak (tulang kepala),
tulang tengkorak merupakan tulang yang dibentuk dengan cara osifikasi intra
membran. Proses ini berasal dari seat kolagen dimasuki zat ossin (protein tulang),
kemudian fibroblast pembentuk mengalami transformasi menjadi osteoblast dan
osteoclast. Osteoblast pembentuk tulang, osteoclast peresap zat yang akan dirombak
menjadi tulang (Huether, 1961).
Faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan perwarnaan Alizarin red
menurut Junqueira (1982), yaitu:
1. Nutrisi, Tulang peka terhadap beberapa faktor nutrisional. Ketidakcukupan protein
dalam makanan menyebabkan defisiensi asam amino dan vitamin C yang
diperlukan untuk sintesa kolagen oleh osteoblas.
2. Umur, Ikan yang masih terlalu muda belum tampak adanya kalsium sehingga
pewarnaan belum dapat diidentifikasi.
3. Lama waktu, interval waktu yang dibutuhkan untuk perendaman ikan terhadap
alizarin red sangat berpengaruh terhadap identifikasi tulang embrio.
4. Cadangan kalsium, Defisiensi kalsium menyebabkan tidak sempurnanya
kalsifikasi matriks organik tulang, oleh karena itu pewarna alizarin red tidak dapat
mengikat adanya kalsium jika kebutuhan kalsiumnya kurang.
IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan sebelumnya dapat diambil kesimpulan


bahwa :
1. Pewarnaan Alizarin red digunakan untuk mendeteksi proses kalsifikasi pada
tulang ikan Nilem (Osteochillus hasselti). Prosedur urutan pewarnaan alizarin
red pada embrio ikan dimulai dari penambahan Larutan NaCl fisiologis selama
30 menit, alkohol 96% selama 12 jam, KOH 1% selama 3 jam, Alizarin Red
selama 5 jam, kemudian dengan larutan penjernih A, B dan C dengan masing-
masing waktu 1 jam.
2. Proses kalsifikasi atau terbentuknya tulang terjadi dengan 2 cara yaitu melalui
osifikasi intra membran dan osifikasi endokondral.
B. Saran

Pergantian larutan harus dilakukan dengan hati-hati agar perut ikan tidak
terkena suntikan injeksi, pengamatan harus dilakukan dengan teliti sehingga tahu
kapan waktu pergantian larutan dilakukakn, dan jangan salah memasukan ke dalam
larutan supaya percobaan tidak gagal, serta melakukan perhitungan waktu dengan
cermat dan tepat agar percobaan yang dilakukan berhasil.
DAFTAR REFERENSI

Hasegawa, Yasunori, Koichi Shimada, Naoto Suzuki, Tadahiro Takayama, Takashi


Kato, Tetsuya Iizuka, Shuichi Sato and Koichi Ito. 2008. The in vitro
osteogenetic characteristics of primary osteoblastic cells from a rabbit
calvarium. Journal of Oral Science, 50 (4) : 427-434.
Huettner, A.F. 1961. Comparative Embryology of the Vertebrates. Macmillan
Company : NewYork.
Jessop, N. M. 1988. Theory and Problem of Zoology. B & JO Enterprise Pte Ltd,
Singapore.
Jinzhang G., L. Yan,Y. A. Wu, B.O. Lili, Y.U. Jie, P.U. Lumei. 2006. Application of
the Multi-Electrode in the Degradation of Alizarin red Induced by Glow
Discharge Plasma. College of Chemistry and Chemical Engineering,
Northwest Normal University, Lanzhou 730070, China. Plasma Science &
Technology, 8(2).
Junqueira, L. C and Carneiro, J. 1982. Histologi Dasar Edisi 3. Penerbit Buku
Kedokteran EGC, Jakarta.
Kalthoff, K. 1996. Analysis of Biological Development. McGraw-Hill Inc, New
York.
Karyadi, B. 2008. Pemberian Rasio Kalsium dan Fosfor Terhadap Osifikasi Tulang
Embrio Puyuh. UNIB. General Zoology. Mc. Graw-Hill Publishing
Company, New York.
Mahanthesha, K. R. B.E., K. Swamy, U. Chandra, Y.D. Bodke, K.V. K. Pai and B.S
Sherigara. 2009. Cyclic Voltammetric Investigations of Alizarin at Carbon
Paste Electrode using Surfactants. Int. Journal Electrochem. Sci., (4) : 1237
1247.
Pramod, K. L., V.R. Vasmani, S. Bindhu. 2011. Museum Preservation Of Skeleton Of
Fetus & Small Vertebrates. Yenepoya Medical College, Yenepoya University.
3(2) : 54-58.
Shabani, H.A.M., Dadfarnia, S., and Moosavinejad, T. 2009. On-line
Preconcentration System Using a Microcolumn Packed with Alizarin Red s-
Modified Alumina for Zinc Determination by Flame Atomic Absorption
Spectrometry. Quim. Nova, 32 (5) : 1202-1205.
Soeminto, 2000. Embriologi Vertebrata. Fakultas Biologi Unsoed, Purwokerto.