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UTN F r a

Caracterizacin y desarrollo de
microorganismos

Clasificacin de microorganismos por su forma y agrupamiento


Bacterias
Son microorganismos unicelulares tpicos, y podemos clasificarlas en dos grupos: por un lado Esquizomycetes
que son las bacterias en sentido amplio, y por otro lado las bacterias esquizofceas conocidas como
cianobacterias. Haremos referencia al primer grupo.
En cuanto a su morfologa, las bacterias segn su forma se clasifican en:
Cocos
Tienen forma redonda, y pueden agruparse formando diplococos (dos cocos), ttradas (cuatro), estreptococos
con forma de cadena, estafilococos formados por cocos apiados desordenadamente, y sarcinas que son
paquetes tridimensionales de cocos ordenados.
Entre las especies de cocos ms importantes encontramos: Streptococcus lactis, utilizada en industrias lcteas y
preparacin de verduras fermentadas; Streptococcus mesenteroides, que se aplica en la preparacin de
dextranos; Pediococcus es la sarcina de la cerveza, un gnero de bacterias del cido lctico Gram positivas,
infectan las fbricas de cerveza.
Bacilos
Tienen forma cilndrica o forma de bastoncillos y forman esporas. Su relacin longitud/dimetro es muy
variada, y su dimetro vara de 0,5 a 1 micrn. Pueden encontrarse aislados o estar agrupados de a dos, en
cadena o en paquete. Entre ellos, vale la pena destacar: Bacillus subtilis, son aerobios e infecciosos en las
fermentaciones de la penicilina, adems de aplicarse en la obtencin de glicerina, amilasas, penicilasas y
proteinasas. Clostridium acetobutylicum es un microorganismo anaerobio utilizado en la produccin de acetona
y butanol. Clostridium butyricum, que es anaerobio y se aplica en la produccin de cido butrico, ron, curador
del lino y del camo, y fijador de nitrgeno libre del suelo.
Tambin encontramos bacteroides, que son bacterias con forma similar a los bacilos pero que no forman
esporas. Entre ellos, resultan de inters las siguientes: el gnero Acetobacter, que se utiliza en la produccin de
vinagres, sorbosa para la sntesis de vitamina C, dihidroxiacetona como azcar para diabticos y cosmtica;
bacterias lcticas o lactobacterias para la obtencin de productos lcteos y cido lctico; bacterias propinicas
utilizadas en quesera y obtencin de vitamina B12, como Propionibacterium spp; Escherichia coli, presente en
la flora intestinal que su utiliza en determinacin de contaminacin en aguas; Aerobacter aerogenes en la
produccin de 2,3-butilenglicol; Rhizobium sp que se encargan de la fijacin de nitrgeno en los ndulos de las
races de las leguminosas; y Azotobacter sp que tambin son fijadores de nitrgeno pero viven libres en el
suelo.
Vibriones: tienen forma de coma.
Espirilos: tienen forma helicoidal con o sin flagelos.
Filamentosos
Las estructuras encontradas ms frecuentemente son en forma de bastn, formando filamentos ms parecidos a
los hongos. Forman abundantes micelios.

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Figura n1: Morfologa microbiana

Bacterias ms importantes de uso industrial


De los Esquizomicetes, las rdenes de bacterias ms importantes son los siguientes, siendo los de mayor
importancia industrial las eubacterias y los actinomicetos:
1) Pseudomonadales
Tienen uno o varios flagelos polares, todos insertados en un extremo de la clula. Entre los gneros de mayor
inters se destacan:
Pseudomonas: desde el punto de vista fisiolgico y metablico, se caracterizan por el amplio espectro de
sustratos orgnicos que utilizan. Se encuentran en suelos, aires, cuerpos de agua o aguas residuales. Presentan
actividad proteoltica y lipoltica. Por ejemplo, la Pseudomona fluorescens es una especie ampliamente
distribuida en suelos y aguas, capaz de oxidar un gran nmero de sustancias orgnicas, y que se aplica en la
obtencin de antibiticos y cido 2-cetoglucnico.
Acetobacter: este gnero es productor de cido actico, cido itacnico y vitamina C.

2) Eubacteriales
Cuentan con flagelos pertricos, varios flagelos insertados en diversos puntos de la clula. Hay varios gneros
de inters como:

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Staphylococcus: Comprende microorganismos que estn presentes en la mucosa y en la piel de los humanos y
de otros mamferos y aves. Algunas especies se asocian con frecuencia a enfermedades en humanos como es
el caso de Staphylococcus aureus, que produce desde infecciones cutneas con formacin de fornculos hasta
enfermedades graves como neumona.
Methanococcus: varias especies intervienen en la fermentacin metnica en la depuracin de residuos
cloacales.
Lactobacillus: gnero de bacterias Gram positivas anaerobias aerotolerantes (aerobios facultativos),
denominadas as debido a que la mayora de sus miembros convierte a la lactosa y a otros monosacridos en
cido lctico. Luego, participan en la fermentacin lctica y la formacin de dextranos.
Propionibacterium: en la elaboracin del queso, obtencin de vitamina B12 y cidos propinicos.
Escherichia: son bacterias Gram negativas, no formadoras de esporas, anaerobias facultativas. En aquellas
especies que hacen parte de la flora intestinal de los animales de sangre caliente, Escherichia provee una
porcin de su produccin de vitamina K para su husped. Quizs la especie ms conocida es la Escherichi
coli que produce infecciones intestinales en el hombre.
Aerobacter:
Salmonella: todas sus especies son patgenas. Producen salmonelosis.

3) Actynomicetales
Las estructuras encontradas ms frecuentemente tienen forma de bastn. Son filamentosos, tienen gran
parecido con los hongos, y forman abundantes micelios.
Entre los microorganismos de uso industrial, los actinomicetos son bacterias filamentosas Gram positivas, de
gran inters econmico como productores de antibiticos.
Streptomyces es el gnero ms extenso de actinomicetos, que se caracterizan por tener un metabolismo
secundario que lleva a la produccin de ciertos antibiticos. Entre sus especies de mayor inters encontramos:
Streptomyces spp, sintetiza estreptomicina y vitamina B12, sntesis de colorantes, y en su presencia se puede
sentir olor a tierra debido a la mineralizacin del nitrgeno en el suelo. Streptomyces griseus que tambin
produce estreptomicina, Streptomyces aureofaciens que produce clorotetraciclina, y Streptomyces rimosus
que sintetiza oxitetraciclina.
Nocardia es un gnero que tambin cuenta con especies productoras de antibiticos, como es el caso de
Nocardia mediterranei que sintetiza rifamicina.
Mycobacterium tambin es un gnero de actinomicetos, y se destaca la especie Mycobacterium tuberculosis,
bacteria responsable de la mayor cantidad de casos de tuberculosis del mundo.

Hongos ms importantes de uso industrial


Los eumicetes comprenden cuatro tipos de hongos, algunos de los cuales son de importancia industrial. La
clasificacin de los eumicetes se basa en los mtodos de formacin de esporas y caractersticas de los mismos.

1) Ficomycetes
Tambin conocidos como hongos inferiores, tienen talo filamentoso sin tabique ya carecen de septos y sus hifas
estn muy ramificadas. La mayora de ellos forma esporas en el interior de los esporangios.
Entre los gneros ms usado encontramos:
Rhizopus: una de sus especies produce cido fumrico a partir de glucosa.
Mucor: como el moho blanco que se desarrolla en el pan hmedo por producir sustancias amilceas.
Muchas especies de ficomicetos, cuyas hifas no poseen septos, como Rhizopus nigricans, Rhizopus oryae,
Rhizopus delemar, Mucor racemosus y Mucor mucedo, son apropiados para la obtencin de cido fumrico y
cido D-lctico. Otras como Mucor javanicus y Mucor rouxil para la produccin de amilasas.

2) Ascomycetes
Cuentan con un talo unicelular (levaduras) o pluricelular (filamentosos). Es caracterstico de los mismos la
posesin de un micelio septado o tabicado formado por entrecruzamiento de filamentos ramificados, y la
formacin de conidisporas. No presentan clulas flageladas.

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Es la clase ms nmeros y de mayor diferenciacin morfolgica. Por un lado, incluye microorganismos
unicelulares como algunas levaduras, y en otro extremo encontramos especies con hifas bien diferenciadas.
La denominacin de ascomicetos se debe a la formacin tubular caracterstica del grupo, el asca (bolsa). Es un
elemento de esporulacin de origen sexual. Se reproducen por ascosporas y nacen en pequeos nmeros (4-8)
en su interior.
Desde el punto de vista industrial, hay tres familias importantes:

Familia Endomycetaceae
Corresponde a las levaduras verdaderas y est formada por 17 gneros, entre los que se destacan:
Saccharomyces: son levaduras esporogneas, y la especie principal es Saccharomyces cerevisieae cuyas
distintas cepas se utilizan en la fermentacin para la produccin de cerveza, vino, aguardientes, y para la
masa de panadera.

Familia Ashbiacene
Es intermedia entre hongos verdaderos y levaduras. La especie de mayor inters es Ashbya gossypii, productora
de vitamina B12.

Familia Aspergillaceae
Son hongos filamentosos llamados hongos verdaderos. Dentro de esta familia estn los gneros ms
importantes en la industria de la fermentacin, por su aplicacin en la sntesis de antibiticos y vitaminas.
Su estructura es compleja, pueden ser pluricelulares y presentan esporos de reproduccin. Forman filamentos
que consisten en hifas formadas por muchas clulas en hilera de forma cilndrica.
Se distinguen por la forma de sus conidios. Los conidiforos terminan en una abultada cabeza a cuyo alrededor
nacen hileras de conidios.
Entre los gneros de mayor inters encontramos:
Penicillium: se desarrolla como un moho verde en el pan hmedo, mermelada, cuero viejo. Se compone de un
micelio formado de filamentos tabicados y ramificados en la superficie de la materia orgnica de la cual se
nutre. Se emplea en la fabricacin de quesos como el roquefort, con el fin de acelerar su madurez. Entre las
especies ms importantes de este gnero encontramos: Penicillium roqueforti usado en la produccin de
quesos azules, Penicillium camembert usado en la produccin de queso Brie y Camembert, Penicillium
chrysogenum y Penicillium notatum en la obtencin de penicilina. Otras especies se aplican en la obtencin
de cido ctrico, fumrico, oxlico, glucnico y glico.

Figura n2: Distintas especies de inters del gnero Penicillium

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Aspergillum: resultan de inters industrial especies como Aspergillus terreus usado en la obtencin de cido
itacnico; Aspergillus niger utilizado en la produccin de cido ctrico, glucnico, amilasas, glucosaoxidasas
y pectinasas; Aspergillus orizae en la obtencin de salsa de soja, proteinasas y amilasas. En Japn, ciertas
bebidas alcohlicas como el Sake y el Kohi se obtienen de ciertas especies de este gnero.

Figura n3: Especies de inters del gnero Aspergillum

Figura n4: Ciclo de vida de los Ascomicetos, combinan reproduccin sexual y asexual

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Figura n5: Ciclo parasexual del Penicillium chrysogenum

3) Basidiomycetes
Consisten en un talo formado por filamentos tabicados que se reproducen por esporas que nacen en nmero
constante en la superficie de clulas llamadas basidio.
Entre los basidiomicetos, tienen importancia econmica las especies comestibles de setas silvestres, y otros que
pueden ser cultivados con fines alimenticios como el champin.
Los gneros Merulius, Boletus y Polyborus tienen importancia como destructores de madera, ya que adems de
la celulosa atacan a la lignina.
No se encuentran especies de aplicacin industrial.

4) Deuteromycetes (hongos imperfectos)


Agrupa a todos aquellos hongos que han perdido la facultad de producir esporas de origen sexual. Son
importantes los siguientes gneros: Brettanomyces, Mycoderma, Cndida y Monilias que son patgenas, y
Torulopsis.
Se utilizan en la transformacin de desechos industriales y agrcolas en protenas por su capacidad de asimilar
hexosas y pentosas.
Las torulas tienen un valor excepcional para utilizar en piensos por su contenido en la mayora de los
aminocidos indispensables y vitaminas del complejo B.
La mayora de las levaduras de importancia industrial se reproducen asexualmente por gemacin. Los tiempos
de generacin son bastante mayores a las bacterias, alrededor de 2 horas.

Factores de clasificacin de un microorganismo


Los factores que se tienen en cuenta para clasificar un microorganismo son su morfologa individual y de
colonias, reacciones de coloracin, hbitat y condiciones ptimas de multiplicacin, necesidades nutricionales,
formas de reproduccin, composicin qumica, y antgenos superficiales.

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Morfologa individual y colonial
Se debe prestar atencin a caractersticas de los microorganismos como forma, tamao, color, aspecto, forma
de elevacin sobre la superficie, caractersticas del borde y de la estructura interna, consistencia y movilidad.
Adems del aspecto morfolgico de los microorganismos en su estado individual vistos al microscopio, otra
forma de distinguirlos es su aspecto macroscpico cuando se cultivan en medios slidos formando
agrupaciones llamadas colonias. El medio slido a utilizar vara segn las necesidades nutricionales del
microorganismo, pero se usa como solidificante universal el agar, que es un polmero de galactosa esterificado
con cido sulfrico que se extrae de las algas marinas. Adems se agregan otras sustancias requeridas por el
microorganismo. En el caso de anaerobios para el cultivo se usa una puncin en un tubo vertical y sellado con
parafina.
En las colonias aerobias en medio slido podemos ver las siguientes caractersticas:
Forma: puntiforme circular, filamentosa, irregular
Elevacin: chatas, elevadas, convexas, cncavas
Borde: entero, ondulado, dentado, ciliado
Color: blanco, gris, verde, rojo, naranja, amarillo, negro
Aspecto ptico: opaco, brillante, aterciopelado
Consistencia: dura, viscosa
Superficie: lisa, rugosa, espinas, pelos
Mientras que en las colonias anaerobias se caracterizan por su aspecto arborescente, puntiforme, erizo, difuso.
En la siguiente figura se pueden observar estas caractersticas:

Figura n6: Morfologa colonial

Caractersticas fisiolgicas de la colonia


Comprenden distintos aspectos, como los requerimientos generales de la multiplicacin y el crecimiento:
Temperaturas ptima, mnima y mxima de crecimiento.
Intervalo de pH para el crecimiento.

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Relaciones con el oxgeno del medio, es decir, si el microorganismo es aerobio, anaerobio, facultativo,
microaerobio.
Requerimientos de luz.
Requerimiento de sales a altas concentraciones.
Utilizacin de sustancias carbonadas y nitrogenadas para el crecimiento, y su transformacin en
determinados productos por oxidacin parcial o por fermentacin, capacidad de multiplicacin en
medios especiales.
Tolerancia a sustancias txicas.
Produccin de antibiticos o antimetabolitos.

Formas de reproduccin de microorganismos


Existen dos tipos fundamentales de reproduccin: sexual y asexual. Cuando el microorganismo presenta ambos
tipos de reproduccin, una a continuacin de la otra en forma alternada, se dice que tiene reproduccin
alternante o mixta.

Reproduccin asexual
Sin fecundacin el microorganismo produce partes u rganos que darn lugar a nuevos individuos. Por ello esta
forma de reproduccin suele llamarse vegetativa. Existen distintas formas de reproduccin asexual que se
observan en los microorganismos:
a) Divisin celular o biparticin
Tiene lugar en bacterias y en levaduras. Por simple divisin de la clula madre se forman dos clulas hijas. El
citoplasma y el material gentico se reparten equitativamente entre los dos nuevos individuos.
En la imagen podemos ver que en primer lugar el ADN circular se adhiere a la membrana por medio del
mesosoma para su replicacin. Luego, se forma un mesosoma nuevo y se forman septos de separacin,
concluyendo en la formacin de dos nuevas clulas.

Figura n7: Biparticin

b) Gemacin
Tambin es una forma de reproduccin de bacterias y levaduras. Se forma una nueva clula a partir de una
excrecencia de la clula madre. Las nuevas clulas se pueden separar de la clula madre y formar nuevas

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clulas o quedar adheridas a la clula madre formando colonias. A las clulas que se forman por gemacin se
las conoce como blastosporos.

Figura n8: Levadura de gemacin

c) Esporas vegetativas
El tipo de esporulacin ms simple es el desarrollo de la espora a partir del micelio vegetativo, y se denomina
talosporo. Se han observado tres tipos de talosporos:
Blastosporos: se obtienen por gemacin simple, en las cuales las clulas hijas se separan de una clula madre
o se forman lateralmente a partir de un micelio o pseumicelio como en el caso del gnero Candida.
Clamidosporos: esporos en reposo de paredes gruesas, resistentes, producidos por un agrandamiento de las
clulas terminales de las hifas, como es el caso de Candida albicans y Fusarium.
Artrosporos: son el resultado del tipo ms simple de esporulacin en el cual las hifas vegetativas se
fragmentan en esporas cilndricas o en forma de barril de paredes gruesas.

Figura n9: blastosporos, clamidosporos y artrosporos

En el caso de los eumicetos, los esporos tienen la funcin de conservacin y difusin de la especie. Se
presentan en muy diversas formas y cantidades segn la especie, en lo cual se basa su clasificacin.

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Cuando el esporo se encuentra en condiciones ambientales favorables, germina emitiendo un tubo o varios
tubos germinativos que se transforman en clulas vegetativas.

Reproduccin sexual
En este proceso tiene lugar la fecundacin, donde se produce la fusin de dos clulas de distintos gneros para
formar un ncleo, adquiriendo ste material gentico de ambos progenitores.
Cada uno de los ncleos de las clulas sexuales contiene un nmero n de cromosomas caracterstico de la
especie (haploide). Por lo tanto, el ncleo de la clula formada durante la fusin de las clulas sexuales o
cigoto, contiene 2n cromosomas (diploide).
El organismo formado a partir del cigoto, contiene en sus clulas vegetativas ncleos con 2n cromosomas, o
sea es diploide, pero las clulas sexuales o gametos que el organismo forma durante alguna poca de su vida
son haploides.
La variacin de diploide a haploide se realiza durante la meiosis.
a) Meiosis
La meiosis es un proceso por el cual una clula con 2n cromosomas (y dos cromtidas por cada uno) origina
cuatro clulas con n cromosomas de una cromtida.
Consiste en dos divisiones celulares o mitosis sucesivas, en cada una de las cuales se pueden distinguir las
siguientes etapas: profase, metafase, anafase y telofase.
En el comienzo de la meiosis los cromosomas homlogos se asocian forman un bivalente, en cada uno de los
cuales hay cuatro cromtidas.

Figura n10: 1 par de cromosomas homlogos asociados en forma bivalente (un bivalente tiene dos cromosomas y cuatro cromtidas)

Se produce el intercambio de trozos homlogos de cromosomas, lo cual se conoce como recombinacin.


A continuacin se describen los distintos pasos que siguen las dos divisiones de la meiosis, tal como puede
verse en la siguiente figura:
MEIOSIS I
Profase I: cada cromosoma se asocia con su homlogo formando un bivalente. En cada bivalente hay cuatro
cromtidas (2n).
Metafase I: el bivalente se ubica en el plano ecuatorial de la clula (2n).
Anafase I: cada cromosoma completo se dirige hacia un polo celular (2n).
Telofase I: se forman dos clulas hijas. Cada ncleo hijo tiene n cromosomas, dos cromtidas (n).

MEIOSIS II
Profase II: hay dos clulas hijas con n cromosomas, cada uno con dos cromtidas.
Metafase II: el cromosoma se ubica en el plano ecuatorial (n).
Anafase II: las dos cromtidas de cada cromosoma se separan y se dirigen a los polos (n).

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Telofase II: las clulas se dividen y se forman cuatro clulas con n cromosomas, pero cada uno con una
cromtida.

Figura n11: Meiosis I y meiosis II

Figura n12: Comparacin mitosis y meiosis

La fase diploide puede tener una duracin ms o menos larga, pero en algn momento tiene lugar la fase
haploide. Es decir, puede haber un cambio continuo de la fase diploide a haploide. Este proceso se ha
observado en hongos filamentosos y en las levaduras, inicindose con la formacin de ascosporas.
Por ejemplo, el gnero Saccharomyces de levaduras, son unicelulares y forman normalmente esporas diploides
(clulas sexuales). El proceso sexual comienza a partir de las ascosporas, llamndose as al asco que contiene
los esporos en su interior, pudindose formar 2, 4, 6 o ms esporos. Los esporos formados durante la
reproduccin sexual son generalmente ms resistentes a la desecacin, el fro y el calor que la forma
vegetativa.

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Medios de cultivo y condiciones de crecimiento
El crecimiento de los microorganismos va ligado a la presencia de sustancias disueltas en el agua a partir de las
cuales obtienen energa y los elementos necesarios para formar su material celular.
Los medios de cultivo son disoluciones acuosas, relativamente diluidas, que contienen los elementos qumicos
necesarios para las clulas que se van a cultivar, combinados en compuestos que pueden ser asimilados por
tales clulas. Un medio de cultivo debe suministrar al microorganismo los siguientes nutrientes:

Macronutrientes
Entre ellos estn el carbono, hidrgeno, oxgeno, fsforo, azufre, nitrgeno, magnesio y potasio. Estos son los
elementos requeridos en concentraciones mayores que otros, tales como el hierro, calcio, molibdeno y sodio.
El hidrgeno y el oxgeno forman parte del agua, cuyo requerimiento depende del tipo de microorganismo. En
hongos el requerimiento de agua en el sustrato es del 12%, mientras que en bacterias es mayor al 20%. Estos
elementos adems, forman parte de compuestos orgnicos que se agregan al medio para servir como fuente de
carbono y energa. El oxgeno tambin puede obtenerse del aire. La seleccin de la fuente apropiada de
carbono y nitrgeno constituye generalmente la clave de la preparacin de los medios de cultivo.
El fsforo, azufre, magnesio y potasio suelen suministrarse como fosfato de potasio y sulfato de magnesio. El
fosfato contribuye a mantener el pH apropiado para el cultivo de la mayora de los microorganismos por su
efecto buffer.
Un medio conteniendo sales minerales, sulfatos o cloruro de amonio como fuente de nitrgeno, y sin
compuestos orgnicos que aporten carbono, slo puede permitir la multiplicacin de aquellos microorganismos
capaces de fijar el dixido de carbono de la atmsfera.
La glucosa y el sulfato de amonio son fuentes simples de carbono y nitrgeno, respectivamente, pero algunos
microorganismos requieren el carbono y el nitrgeno bajo la forma de compuestos orgnicos muy complejos.
Estos medios son requeridos por microbios que no tienen la capacidad de sintetizar sus componentes celulares
a partir de compuestos simples. Muchos organismos que viven como parsitos de otros organismos tienen por
lo general estos requerimientos complejos cuando se desea cultivarlos en laboratorio.

Microelementos
Estos son: Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni, V, B, Cl, Si, Se, W.
La mayora de estos elementos se encuentran en forma de trazas o impurezas en las sales de los
macroelementos.

Factores de crecimiento
Generalmente, ciertos aminocidos, vitaminas y cidos nucleicos son requeridos por los microorganismos para
su crecimiento en un medio dado.

Tipos de medios de cultivo


Los medios de cultivos se pueden clasificar:
Segn su origen, en naturales y artificiales o sintticos. Los medios de cultivo naturales resultan de gran
complejidad ya que se desconoce su composicin exacta lo cual dificulta su reproduccin. Los medios de
cultivo artificiales estn compuestos por sustancias qumicas definidas en naturaleza y cantidad.
Segn su tensin de oxgeno, encontramos medios de cultivo aerobios, anaerobios, o facultativos.

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Segn su estado fsico, tenemos medio slidos o lquidos. Para obtener medios de cultivo slidos se aade a
los caldos de cultivo alguna sustancia gelificante que da a la disolucin acuosa una consistencia gelatinosa.
Un solidificante casi ideal fue descubierto en 1883 por Hesse, quien introdujo el agar en la tcnica
bacteriolgica. El agar es un polisacrido extrado de algas marinas, intensamente ramificado. Se aade a
soluciones acuosas en una concentracin de 15-20 g/L. Es atacado slo por pocas bacterias. Cuando se
necesitan medios sin componentes orgnicos, se utiliza gel de slice como solidificante.
Segn su composicin, pueden ser comunes, especiales, o selectivos. Los selectivos se refieren por ejemplo,
al agregado de un antibitico al medio de cultivo con el fin de que slo prosperen aquellos microorganismos
que presentan resistencia al mismo.
Condiciones de crecimiento
An presentes todas las sustancias nutritivas, se requieren otras condiciones para el desarrollo de los
microorganismos: pH, temperatura, presin osmtica y tensin de oxgeno.
pH
Los iones H+ y OH- tienen gran movilidad, luego, pequeas modificaciones en su concentracin tienen grandes
consecuencias. El establecimiento de un pH inicial ptimo y el mantenimiento del mismo durante el
crecimiento es por lo tanto de gran importancia. La mayora de los microorganismos se desarrolla ptimamente
cuando el pH=7, o sea cuando [H+] y [OH-] son iguales, y se los llama neutrfilos.
En pH ms elevados se desarrollan bacterias nitrificantes, actinomicetos, y bacterias descomponedoras de la
urea, son llamados alcalfilos.
En pH ms bajos pueden desarrollarse microorganismos acidfilos como bacterias del cido lctico o del
gnero Acetobacter.
Para los hongos el pH ptimo es 5, mientras que para la mayora de las bacterias el pH ptimo es 8. Luego, esto
puede tenerse en cuenta si se quiere evitar la proliferacin de determinados microorganismos frente al
crecimiento de otros.
El mantenimiento del pH se logra con soluciones buffer de fosfatos inorgnicos de pH >7,2. Existen
microorganismos que son productores de cidos pero que no lo toleran por encima de cierto nivel como
muchas pseudomonas y lactobacilos. En este caso, superado el lmite de tolerancia se agregan carbonatos
(bicarbonato de sodio).

Temperatura de cultivo
Los microorganismos tienen un rango de temperaturas en el cual pueden crecer. Este rango est limitado por la
temperatura mxima de crecimiento, a partir de la cual no pueden vivir e incluso mueren; la temperatura
mnima, por debajo de la cual no pueden crecer quedando generalmente en estado de latencia; y la temperatura
ptima, que es aquella a la cual registran el mximo crecimiento.

Figura n13: Temperatura ptima de crecimiento

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Segn su temperatura ptima de crecimiento, las bacterias se clasifican como:
Psicrfilas: T ptima < 20 C, por ejemplo bacterias marinas o bacterias del hierro
Mesfilas: T ptima 20-45 C, por ejemplo bacterias del agua y del suelo
Termfilas: T ptima > 45 C, formadores de esporas

Presin osmtica
La mayora de las bacterias son tolerantes a la presin osmtica del medio. Muchas crecen en soluciones donde
la concentracin de sales es del 0,1 al 10%.
Si la clula se encuentra en una solucin hipotnica, es decir que la concentracin de sales en el interior de la
clula es mayor que en el exterior, se producira el ingreso de agua a la clula, la cual podra explotar. Esto
no ocurre gracias a la presencia de la pared celular. Lo contrario ocurre si la clula se encuentra en una solucin
hipertnica, en cuyo caso se produce la salida de agua de la clula (reversible).
Las bacterias marinas requieren un 3,5% de sales.

Tensin de oxgeno
Las bacterias aerobias necesitan oxgeno O 2 como aceptor de electrones. En el caso de que su cultivo se realice
en capas profundas es necesaria la aireacin, ya que las bacterias utilizarn el oxgeno disuelto.
La concentracin de oxgeno disuelto no deber ser inferior a un contenido mnimo determinado para cada
especie, para no perjudicar su respiracin celular. A esta concentracin se la denomina concentracin crtica de
oxgeno.
La velocidad de disolucin de oxgeno se incrementa usando grandes superficies de contacto entre las fases
gaseosas y lquidas, y aumentando la presin parcial de oxgeno en la fase gaseosa.
Para obtener gran superficie de contacto entre las fases se usan distintos procedimientos:
1) Cultivo en superficies planas.
2) Agitacin del medio.
3) Rotacin del recipiente alrededor de su eje vertical.
4) Circulacin de aire a presin.

En el caso del cultivo de bacterias anaerobias, sus soluciones nutritivas se acondicionan al vaco con bombas
de vaco, en frascos cerrados sin burbujas de aire, cubriendo el medio de cultivo con una capa de vaselina
lquida.

Mtodos de aislamiento y purificacin


En los diversos campos de aplicacin que encuentra la biotecnologa, como por ejemplo medicina, tecnologa
de los alimentos y fermentaciones, es de gran importancia determinar qu especies microbianas intervienen en
cada fenmeno biolgico que tiene lugar.
Los microorganismos se presentan en la naturaleza formando poblaciones heterogneas de distintas especies,
en medios muy variados como son barros, aguas contaminadas, productos biolgicos fermentados o en

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putrefaccin. Estas agrupaciones de microorganismos se denominan microflora. En ella prepondera, segn el
caso, una especie o unas pocas de ellas sobre las dems, lo cual puede deberse a:
Es la especie o las especies ms abundantes por naturaleza.
Es la especie que goza de mayor vitalidad respectos de las dems especies presentes en el medio.
Existe algn factor selectivo externo, ya sea fsico, qumico o biolgico en el medio que favorece a la
especie que abunda en l.
Ser tarea del microbilogo lograr la obtencin de un cultivo puro del microorganismo de inters, separndolo
del resto de la microflora que lo acompaa mediante un intenso y cuidadoso trabajo.

Por aislamiento entendemos separar un microorganismo de inters de una poblacin microbiana mixta. Si el
microorganismo en cuestin ser aislado de fuentes naturales como agua, suelo, plantas y desechos, los
mtodos para el aislamiento del mismo son diversos. En este procedimiento se debe tener en cuenta que la
composicin qumica de la muestra a partir del cual se va a realizar el aislamiento comienza a variar a partir del
momento en que es tomada, por lo tanto sta se debe procesar rpidamente, tratando de evitar alteraciones que
afecten al microorganismo que interesa.

Aislamiento directo: Se logra a partir de una muestra, cuando el o los microorganismos de inters estn
en una cantidad adecuada, tal que estos microorganismos aparecen en forma tan evidente que pueden ser
aislados directamente. Es el caso de algunos microorganismos formadores de colonias, agrupaciones
destacables o que pueden alterar el medio en que se encuentran.

Aislamiento por enriquecimiento: Cuando el microorganismo que se desea aislar se encuentra en baja
proporcin se utilizan cultivos de enriquecimiento.
En este mtodo se busca favorecer el crecimiento de un tipo dado de microorganismos mediante condiciones de
cultivo adecuadas al mismo, luego se establecen condiciones ambientales para el enriquecimiento, mediante la
fijacin de cierto nmero de factores como la fuente de energa, fuente de carbono, fuente de nitrgeno, aceptor
de hidrgeno, atmsfera, luz, temperatura, pH. Entonces se inocula al medio con una poblacin mixta de
microorganismos.
En la solucin de enriquecimiento se impondr el microorganismo mejor dotado o adaptado, ya que su
crecimiento superar al de los dems. Se realizan transferencias repetidas del cultivo a la misma solucin
nutritiva, y se la extiende en un medio de cultivo slido de igual composicin para aislar la cepa enriquecida.

Cultivo puro

Entendemos por cultivo puro a la descendencia de una sola clula. Para el aislamiento de un cultivo puro
podemos proceder mediante:
- Separacin de medios slidos
- Separacin mediante cultivo unicelulares
- Separacin segn mtodos especiales
Luego, entre las tcnicas para la obtencin de un cultivo puro encontramos:
1.- Mtodos de extensin
Consiste en la distribucin de la muestra sobre un sustrato nutritivo solidificado, se aplica para aislar bacterias,
y no sirve para contarlas. Las muestras diluidas de microorganismos se siembran directamente en la
superficie de la placa que contiene agar, extendindolas con ayuda de un asa de Digralsky de
cristal estril

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Figura n14: Extensin estril con asa de Digralsky

2.- Mtodo de las placas y recuento vital


Sirve para recuento de hongos filamentosos, levaduras y bacterias.

3.- Separacin en medios slidos por estras sucesivas


Si tenemos una suspensin bacteriana en un medio de cultivo lquido, con ayuda de un ansa esterilizada se
hacen estras sucesivas sobre agar contenida en una placa de Petri.
Se observa que al final del estriado hay una menor densidad de colonias y que corresponden probablemente a
una misma especie de bacteria. Se repite el pasaje a otra placa, o sea se realiza repique de esta colonia hasta
que suponemos que hemos aislado un cultivo puro, es decir, sin contaminantes.
Para corroborarlo hacemos las pruebas bioqumicas correspondientes junto con observaciones microscpicas.

4.- Mtodos unicelulares


Consisten en el aislamiento de una nica clula. Se utiliza un micromanipulador, que es un aparato que controla
manualmente el movimiento de una delgada aguja de vidrio con gran precisin, y es observada bajo el
microscopio. Con esta aguja se puede tomar clulas aisladas y transportarlas a una gota de cultivo nutritivo
estril.

5.- Mtodos de distribucin de poblaciones mixtas en placas


Ms modernos y ms rpidos que los anteriores. Consiste en ensayar las propiedades de una poblacin mixta,
sin aislamiento preliminar, de un muestreo de suelo, agua u otro medio. Es una nueva alternativa, ya que la
tendencia actual es que los cultivos puros no son representativos de las condiciones naturales en las que los
microorganismos se encuentran en la naturaleza.

Por ejemplo, la bsqueda de microorganismos productores de antibiticos se realiza actualmente aplicando


algunas de las tcnicas desarrolladas por este mtodo, como es el mtodo de las estras cruzadas.

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Figura n15: Mtodo de estras cruzadas

ste consiste en realizar el extendido del material aislado bajo la forma de estras sobre la superficie de un
medio nutritivo slido adecuado. Adems, en un sector de la misma placa de Petri, se siembran en estras
paralelas varios cultivos de grmenes testigos, dispuestos en estras perpendiculares a las del material aislado.
La placa inoculada se coloca en estufa a la temperatura ptima para el crecimiento del los grmenes testigos.
La inhibicin de crecimiento de estos grmenes debido a la presencia del antibitico producido por los
microorganismos de inters, es representada por las zonas claras ms o menos importantes donde se cruzan las
estras. Esto demuestra la actividad antibitica de la muestra de microorganismos estudiada.

Figura n16: Sensibilidad de una cepa bacteriana a diferentes antibiticos. Se observa una zona de inhibicin alrededor de cinco de los discos, lo cual
muestra que la cepa es sensible a los antibiticos que se impregnaron en estos discos. Y ninguna inhibicin alreded or del disco superior izquierdo, luego
la bacteria es resistente al antibitico impregnado en l

Tcnicas para la identificacin de microorganismos


Una vez finalizada la obtencin del cultivo puro de microorganismos, se procede a su identificacin. Los
ensayos para identificarlos pueden agruparse en:
1.- Observacin al microscopio.
2.- Observacin de colonias microbianas (macroscpica).

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3.- Ensayos bioqumicos.

1.- Tcnicas de observacin microscpicas


Mediante el empleo de un microscopio se observan preparaciones hmedas o secas de clulas.
a.- Preparaciones hmedas
Permiten observar la movilidad de los microorganismos, los cambios citolgicos durante el proceso de divisin
celular, formacin de esporos y otros fenmenos fisiolgicos y bioqumicos caractersticos de su vitalidad.

b.- Extensiones o frotis


Las muestras son secadas, fijadas y teidas mediante tincin simple o tincin diferencial.

Entre las ventajas de las extensiones o frotis para la identificacin de microorganismos, podemos decir que con
esta tcnica las clulas se ven con mayor claridad. Adems pueden mostrarse las diferencias entre clulas de
distintas especies mediante soluciones colorantes, mediante una tincin diferencial o tincin de Gram,
observando una coloracin violeta en presencia de Gram positivas y roja para Gram negativas.

2.- Observacin de colonias


Para las colonias microbianas desarrolladas sobre sustratos nutritivos slidos en caja de Petri, la observacin
para su identificacin puede ser directa o con algn aumento.
Los datos y caractersticas a los que se presta atencin al observar colonias son su tamao, forma, color y
consistencia. Interesa tambin el aspecto de los bordes, si son lisos o rugosos. Adems debe observarse la
propagacin del color al sustrato, ya que si es soluble en agua, se difundir en el medio, pero si es insoluble
colorear nicamente a la colonia.
Estas propiedades pueden observarse en colonias de eubacterias, levaduras y hongos. En este ltimo caso,
cuando se han formado los esporos de reproduccin (parasporos), se observa que en conjunto dan a la colonia
un color determinado como por ejemplo blanco, gris, amarillo, verde. Los parasporos tienen diferentes
nombres segn la especie de hongos, por ejemplo conidios, son especies de fructificaciones minsculas de la
plntula microscpica del hongo, formada por un talo, diversas ramificaciones y el esporo o fruto (o semillas).

3.- Ensayos bioqumicos


Son pruebas que permiten la identificacin de microorganismos al estudiar propiedades fisiolgicas de los
mismos.

a) Ensayos de fermentacin
Consisten en la determinacin del poder fermentativo de los microorganismos sobre distintos azcares, con la
medicin del gas desprendido (CO2). Los azcares utilizados con ms frecuencia son glucosa, galactosa,
sacarosa, lactosa, maltosa y rafinosa.
El ensayo de Durham es cualitativo, mientras que el de Einhorn puede ser cuantitativo.

Ensayo de Durham
Se efecta en un tubo de ensayo comn (160 x 16 mm) en cuyo interior se coloca un tubito de hemlisis
invertido. El tubo de ensayo se carga con el medio de cultivo denominado medio basal, el azcar fermentable
y el indicador apropiado, y se esteriliza de acuerdo con las caractersticas del medio y del azcar. El medio
basal puede estar constituido por 5 g de NaCl, 10 g de peptona, agua destilada hasta 1000 ml.
Se agrega un indicador, como solucin prpura de bromocresol al 1,6 % u otro.

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Se siembra el microorganismo que se investiga, se incuba de 24 a 48 horas a la temperatura apropiada, y se
observa si el tubo de hemlisis contiene gas. Si hubo produccin de gas, se confirma la actividad fermentativa
del microorganismo sobre el azcar ensayado.

Ensayo de Einhorn
Utiliza un tubo en U, denominado tubo de Einhorn. Se carga con el medio basal, el indicador y el azcar que
generalmente debe encontrarse al 1%. Se esteriliza todo el sistema y luego se agrega la colonia microbiana. Si
la rama cerrada del tubo en U est graduada, el ensayo resulta cuantitativo, al poder determinar la cantidad de
gas producto de la actividad fermentativa.

Un ejemplo de aplicacin del ensayo de Einhorn es la identificacin de levaduras de cerveza. Encontramos dos
tipos de levaduras de cerveza segn la forma de fermentacin: levaduras de fondo o de baja, que son aquellas
que se desarrollan en el fondo del recipiente de fermentacin, y las levaduras de superficie o de alta que van
hacia la superficie durante la fermentacin, como es el caso de Saccharomyces cerevisiae. La levadura de
superficie desprende un tercio del volumen de gas desprendido por la levadura de fondo, lo cual se debe al
sistema enzimtico que contiene cada tipo. Luego, pueden diferenciarse por el ensayo de Einhorn cuantitativo,
utilizando rafinosa como azcar fermentable.
b) Ensayo de tincin de eumicetes muertos
Se trata de uno de los pocos mtodos que se aplican a levaduras y hongos filamentosos con colorantes.
La membrana celular tiene un papel selectivo en lo que respecta a las sustancias que pueden ingresar a la
clula. Muchos colorantes, tanto cidos como bsicos, pueden penetrar, pero su comportamiento es variado.
Algunos colorantes bsicos vitales como el azul de metileno, rojo neutro, azul de Nilo, atraviesan la membrana,
pero al llegar al protoplasma se transforman por reduccin en la leucobase incolora, de manera que no la tien.
Aqu interviene el poder reductor del complejo enzimtico de la zimasa, especficamente la deshidrogenasa
reducida o sea el DPN.H2, cuyo ncleo piridnico est reducido. El colorante que ha penetrado a travs de la
membrana es el sustrato que utiliza el DPN.H2, de acuerdo con la siguiente ecuacin:
Colorante bsico + DPN.H2 Leucobase + DPN
(reducido) (incolora) (oxidado)

Si la clula muere, el colorante que se encuentra reducido en el citoplasma vuelve a oxidarse, y tie el
citoplasma y ncleo. Esta reaccin se emplea en la industria de la fermentacin de levaduras para determinar
si el microorganismo est vivo o muerto. Se puede inferir que la desorganizacin celular que sigue a la muerte
de la clula es la causa de la prdida del poder reductor del citoplasma. Generalmente se utiliza el azul de
metileno debido a su baja toxicidad.
Los colorantes cidos no penetran o penetran con mucha dificultad cuando la clula est viva. Cuando sta
muere, tien con preferencia al citoplasma, mientras que los colorantes bsicos tien mejor al ncleo debido a
la presencia de cidos nucleicos.

c) Esporognesis de levaduras y hongos


Las formas esporuladas de las levaduras fueron observadas por Seynes (1868) y Hansen (1882/3). Este ltimo
realiz los primeros ensayos de esporognesis en forma sistemtica, que lo llevaron a la identificacin segura
del grupo de los sacaromicetos. Sus resultados constituyen la base para la clasificacin de las especies de
levaduras.
Un tpico ensayo de esporognesis es el mtodo del bloque de yeso.

Mtodo del bloque de yeso


Se coloca el bloque de yeso en un dispositivo estril, y sobre l se deja una muestra de levaduras jvenes y bien
alimentadas, con abundante acceso de aire y a una temperatura adecuada de 2530 C. Al cabo de cierto tiempo
las levaduras que estaban en estado vegetativo pasan al estado esporulado, fenmeno que se denomina

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esporognesis. El tiempo y la temperatura de esporognesis, junto con la estructura que presenta la clula
esporulada son los elementos fundamentales para establecer la especie que se tiene.
La esporognesis comienza con la formacin de algunas concreciones citoplasmticas redondeadas, que son
los esbozos de los esporos. En un desarrollo posterior se rodean de una pared, que resalta con mayor o menor
claridad en las distintas especies. En general, se observa un nmero determinado de esporos por clulas, que es
una caracterstica de la especie, pueden ser dos o cuatro, a veces ocho. Los esporos se encuentran en un saco
llamado asco o asca, generalmente de forma ovoidal, que no es otra cosa que la clula vegetativa cuya pared
externa se ha engrosado enormemente, por lo cual se denomina ascosporos a estas clulas.
Las especies de sacaromicetos producen cuatro esporos por clulas, la especie Schizosaccharomycetes forma
ocho esporos. En ambos casos, estos son casi esfricos y de superficie lisa. En cambio la especie Willis
anmala produce esporos con forma de sombrero.

d) Los auxogramas
Del griego auxo = aumentar y gramma = escrito. Este ensayo permite conocer las sustancias que asimila un
microorganismo para su desarrollo.
Consiste en sembrar al microorganismo con un medio basal slido privado de la sustancia a ensayar, y agregar
dicha sustancia nicamente en un determinado sector de la superficie del medio. Por lo tanto, si esta sustancia
es asimilada por el microorganismo, ste desarrollar una colonia solamente en el lugar donde se deposit. Por
ejemplo, para auxogramas donde se estudia la asimilacin de azcares se utiliza como medio basal uno carente
de glcidos, y para el nitrgeno uno carente de compuestos nitrogenados.
La tcnica consiste en sembrar al microorganismo en un medio basal slido en una caja de Petri. Demarcar
varios sectores en el fondo y por fuera de la caja sembrada, y anotar el azcar que se agregar en cada sector, si
lo que se estudia es por ejemplo la asimilacin de azcares. El microorganismo sembrado previamente sobre el
cultivo slido se desarrollar en el sector que contiene azcar que pueda asimilar, el cual se vuelve opaco.
Es de importancia hacer notar que un microorganismo puede asimilar un glcido determinado y no responder a
los ensayos de fermentacin ya que no desprende gas. Es decir, da un auxograma positivo y un ensayo de
Durham negativo. A veces el auxograma es muy lento, pudiendo requerirse hasta 20 das.

e) Ensayo de las amilasas


El ensayo de la capacidad de sintetizar estas enzimas tiene importancia industrial en los hongos.
Consiste en la siembra del hongo en una caja de Petri con un medio de cultivo slido comn, ms el agregado
de almidn soluble al 1 %. Ya formadas las colonias se agrega solucin yodo-iodurada, observndose una
coloracin azul en la placa debido a la formacin del complejo yodo- almidn. Si los hongos han producido
amilasa, aparecer alrededor de las colonias una zona clara que se destaca del resto azul, debido a la
degradacin del almidn por estas enzimas.

Mtodos de conservacin de microorganismos


Los microorganismos aislados se conservan en cepas por alguno de los siguientes mtodos:
1) Cultivos slidos bajo capas parafnicas
Se desarrolla el microorganismo sobre agar nutritivo inclinado, y luego se cubre con una capa de vaselina
lquida esterilizada. El microorganismo se conserva varios aos (2 a 3 aos), guardando en heladera a + 5 C.

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2) Liofilizacin
Se lleva rpidamente a -20 C un pequeo volumen de microorganismos en suspensin colocado en un tubo de
vidrio, para secarlos bajo vaco de 0,05 mm Hg, condensando el vapor de agua en un recipiente enfriado con
aire lquido o nieve carbnica. El tubo de vidrio sometido a liofilizacin se cierra, manteniendo el vaco, y se
conserva en heladera.
Entre las ventajas del mtodo podemos sealar que reduce al mnimo la destruccin de protenas y enzimas de
los microorganismos, la conservacin es al vaco por privacin de oxgeno en la atmsfera del tubo, y el tiempo
de conservacin es prolongado (hasta 20 aos). Por otro lado, la principal desventaja que presenta la
liofilizacin es que el nmero de sobrevivientes es bajo, del 5-30 % del inicial.

3) Estabilizacin sobre tierra


Este mtodo se aplica en la conservacin de bacterias del gnero Streptomyces y de ciertos hongos esporulados.
Se utiliza una mezcla de tierra de jardn, con 20 % de arena y 1-2 % de CaCO3, que despus de tamizada se
esteriliza en autoclave a 130 C durante 8-15 horas, y finalmente se conserva en heladera.

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Cuestionario

1) Qu son los medios de cultivos? Cmo se clasifican?


2) Describir macronutrientes y micronutrientes requeridos en un medio de cultivo.
3) Cmo influyen las condiciones de crecimiento en el desarrollo de los microorganismos?
4) A qu nos referimos con temperatura ptima de un microorganismo?
5) Qu es un cultivo puro? Cules son las tcnicas para su obtencin?
6) Cules mtodos de conservacin conoce? Describirlos y dar ventajas y desventajas de los mismos.
7) Para que se utilizan los ensayos bioqumicos? Pueden ser cuantitativos adems de cualitativos?
Ejemplificar.
8) Explicar el fenmeno por el cual se tien las levaduras. Existe algn ensayo en el cual se aplique
su tincin?
9) Describir el proceso utilizado para la bsqueda de microorganismos productores de antibiticos.
Ejemplificar.
10) Qu son los auxogramas? Dar un ejemplo de aplicacin.
11) Qu mtodos de enriquecimiento conoce? Qu hay que tener en cuenta? Cmo se asegura que
tiene un cultivo puro?
12) En qu consiste la esporognesis? Ejemplificar.

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