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productos microbianos.
Adrio JL , AL Demain .
Fuente
Departamento de Biotecnologa, Puleva Biotech, SA, Granada, Espaa. jladrio@pulevabiotech.es
Aunque los microorganismos son muy buenos en presentarnos con una increble variedad de
productos de valor, por lo general los producen nicamente en las cantidades que se necesitan
para su propio beneficio, por lo que tienden a no producir en exceso sus metabolitos. En los
programas de mejora de tensin, una cepa que produce un alto ttulo es generalmente el objetivo
deseado. La gentica ha tenido una larga historia de contribuir a la produccin de productos
microbianos. Los enormes aumentos en la productividad de la fermentacin y la disminucin de
costes resultantes han surgido principalmente por mutagnesis y anlisis / seleccin para mayores
cepas microbianas productoras y la aplicacin de tecnologa de ADN recombinante.
introduccin
Los microorganismos pueden generar nuevos caracteres genticos ('genotipos') por twomeans:
mutacin y recombinacin gentica. En mutacin, un gen se modifica ya sea unintentially
('mutacin espontnea') o intentially ("mutacin inducida ').
Fue una suerte que el desarrollo intensivo de la gentica microbiana se inici en la dcada de 1940
cuando la produccin fermentativa de la penicilina se convirti en una necesidad internacional. Los
primeros estudios en gentica bsica se concentr en la produccin de mutantes y sus
propiedades. La facilidad con que "permanentes" ofmicroorganisms caractersticas se podra
cambiar por mutacin y la simplicidad de las tcnicas de mutacin tenan un gran atractivo para los
microbilogos. As comenz la cooperativa de tensin seleccin "programa entre los trabajadores
en los EE.UU. Departamento de Agricultura de los laboratorios en Peoria, de la Carnegie Institution,
Universidad de Stanford y la Universidad de Wisconsin, seguido por los amplios programas
individuales que todava existen hoy en da en los laboratorios industriales en todo el mundo . Es
evidente que la mutacin ha sido el principal factor implicado en la cien a mil veces los aumentos
obtenidos en la produccin de metabolitos microbianos y que la capacidad para modificar
genticamente un cultivo microbiano a una mayor productividad ha sido el factor ms importante
para mantener la industria de la fermentacin en su estado viable, sano.
Aplicaciones de la mutacin
La mutacin ha mejorado la productividad de los cultivos industriales (Vinci
y Byng, 1999;. Parekh et al, 2000). Tambin se ha utilizado para cambiar la
proporcin de los metabolitos producidos en un caldo de fermentacin a
una distribucin ms favorable, elucidar las rutas del metabolismo
secundario, proporcionando compuestos nuevos, y para otras funciones. El
ms comn
mtodo utilizado para obtener altos rendimientos mutantes es tratar a una
poblacin con un agente mutagnico hasta una cierta 'deseado'
matar se obtiene placa a los sobrevivientes y probar cada colonia resultante
o un grupo seleccionado al azar de colonias para la formacin de producto
en frascos. Los mutgenos ms tiles incluyen nitrosoguanidina (NTG), 4-
nitroquinolone-1-xido, sulfonato methylmethane (MMS),
etilmetanosulfonato (EMS), hidroxilamina (HA) y la luz ultravioleta
(UV). El nivel ptimo de matar para aumentar la produccin de antibiticos
se cree que es en el rango de 70-95% (Simpson & Caten, 1979), aunque
algunos programas industriales utilizan niveles mucho ms altos, por
ejemplo, hasta 99,99%. Es incorrecto condenar un procedimiento de
mutacin y seleccin, ya que, en promedio, se reduce la capacidad de
produccin y, de hecho, este es el caso para la mutagnesis con xito. Uno
slo debe estar interesado en la frecuencia de mutantes mejorados.
Aunque las clulas individuales o esporas se prefieren para la mutagnesis,
no formadoras de esporas organismos filamentosos han sido
mutado con xito por mutagnesis de micelios, los protoplastos y la
regeneracin de la preparacin en medio slido (Keller,
1983). La sonicacin se utiliza a veces para romper Streptomyces micelio
despus de la mutagnesis y antes de la deteccin de
mutantes mejorados (Takebe et al., 1989). Mal esporulantes organismos
filamentosos pueden ser mutagenizado despus de la fragmentacin o la
formacin de protoplastos (Kim et al, 1983;.. Kurzatkowski et al, 1986).
Informacin ms detallada se puede encontrar en varias revisiones
authorative sobre gentica y especialmente en la mutacin en
actinomicetos (Baltz, 1986, 1995, 1998, 1999; Hopwood, 1999).
Los mutantes que producen quantites aumento de metabolitos gentica ha
tenido una larga historia de contribuir a la produccin de productos
microbianos. Los enormes aumentos en la productividad de fermentacin y
los consiguientes descensos en los costos han surgido principalmente por
mutagnesis y seleccin de mayores tensiones producingmicrobial. Al
menos cinco diferentes clases de genes controlar la produccin de
metabolito (Malik, 1979): (i) los genes estructurales que codifican sintasas
de producto, (ii) genes reguladores que determinan el inicio y la expresin
de genes estructurales, (iii) los genes de resistencia que determinan la
resistencia de la productor a su propio antibitico, (iv) los genes que
regulan la permeabilidad de entrada,
la exclusin y la eliminacin del producto, y (v) los genes reguladores que
controlan las vas que proporcionan los precursores y cofactores. La
sobreproduccin de metabolitos microbianos se efecta por (i) el aumento
de piscinas precursoras, (ii) la adicin, modificacin o eliminacin de genes
reguladores, (iii) modificacin de promotor, terminador y / o secuencias
reguladoras, (iv) el aumento de nmero de copias de genes que codifican
enzimas que catalizan cuello de botella reacciones, y (v) la eliminacin de la
competencia vas innecesarias (Strohl, 2001). Hace ya ms de 60 aos
desde el primer mutante penicillinproducing superior, Penicillium
chrysogenum X-1612, se aisl afer de rayos X mutagnesis. Esto anunci el
comienzo de una larga y exitosa relacin entre la mutacin gentica y la
microbiologa industrial (Hersbach et al., 1984).
La mejora de la produccin de penicilina por una mejora de tensin
convencional result tanto del gen mejorada
expresin y de amplificacin gnica (Barredo et al, 1989;.. Smith et al,
1989). Los niveles aumentados de ARNm correspondiente a los tres
enzimas de la biosntesis de la penicilina G se encontr en alta penicilina
producir cepas de P. chrysogenum en comparacin con cepas de tipo
salvaje (Smith et al., 1990). De alta produccin cepas contenan una regin
amplificada; una regin 106-kb amplificado cinco a seis veces como
repeticiones en tndem se detect en una cepa de alta produccin,
mientras que de tipo salvaje P. chrysogenum y cepa original de Fleming de
P. notatum slo contena un nico copia (Fierro et al., 1995). Mejora cepa ha
sido el principal factor implicado en la consecucin de ttulos
impresionantes de metabolitos industriales. El ttulo de produccin de
tetraciclina ya en 1979 se inform de que ms de 20 g L_1 (Podojil et al.,
1984), principalmente debido a la tensin mejora. Ms tarde, los ttulos de
30-35 g L_1 se lleg a la clortetraciclina y la tetraciclina. El ttulo de
produccin de la penicilina es 70 g L_1 y que de cefalosporina C durante 30
g L_1 (Elander, 2003). El ttulo de la produccin de tilosina se ha informado
de que ms de 15 g L_1 (Chen et al., 2004) y el de salinomicina es 60 g L_1
(Liu, 1982).
Mutantes morfolgicos y pigmento
Aunque casi nada se sabe acerca de los mecanismos que causan una mayor produccin en
superiores mutantes aleatorios o morfolgicas, es probable que muchas de estas
mutaciones implican genes reguladores, especialmente como mutantes reguladores bsicos
obtenidos en los estudios genticos se encuentran a veces a ser alterado en la morfologa
colonial. Por lo tanto, morphologicalmutants han sido muy importantes en la mejora de la
tensin. Estos incluyen mutantes afectados en la formacin de micelios, que producen
colonias con una apariencia modificada o un nuevo color. Los cambios de color han sido
tambin importante para los productores de pigmentos (Tabla 1).
Mutantes auxotrficos
Muy temprano en el desarrollo de los conceptos de regulacin, los genetistas se dio cuenta
de que el producto final de una ruta biosinttica de un control estricto de metabolitos
primarios ejercicios sobre la cantidad de un compuesto intermedio acumulado por un
mutante auxotrfico de esa va. Slo en una concentracin growthlimiting del producto final
sera una gran acumulacin del sustrato de la enzima deficiente se producen.
Este principio de la disminucin de la concentracin de un producto final inhibidor o
represor para eludir la inhibicin por retroalimentacin o represin se llev a cabo mejor por
el uso de mutantes auxotrficos. En efecto, la mutacin auxotrfica ha sido un factor
importante en la produccin industrial de productos primarios, tales como aminocidos y
nucletidos (Tabla 1). La produccin de productos secundarios tales como los antibiticos
tambin es notablemente afectado por la mutacin auxotrfica, incluso cuando auxotrofos
se cultivan en medios nutricionalmente completos y complejos incluso. Aunque el cambio
en la formacin del producto es por lo general en la direccin negativa, mayor productoras
de auxotrofos se obtienen de los productores de antibiticos.
Cuando varios metabolitos primarios son producidos por una sola va ramificada mutacin,
en una rama de la
va a menudo conduce a la sobreproduccin del producto de la otra rama. Los ejemplos
incluyen la sobreproduccin de
fenilalanina por tirosina auxtrofos y viceversa, y la sobreproduccin de lisina por
auxotrofos requieren treonina y metionina. En el caso de vas ramificadas que conducen a
un metabolito primario y un secundario de metabolitos, mutantes auxotrficos que
requieren el metabolito primario veces sobreproducir el metabolito secundario (Tabla 1).
Reversin de un auxtrofo a prototrofa a veces conduce a prototrofos nuevos que poseen
una mayor actividad de la enzima
que presente en el original 'abuelo' prototroph. Tal aumento de la actividad enzimtica fue
probablemente el resultado de una
mutacin del gen estructural de la produccin de una enzima ms activo o una enzima
menos sujeta a la inhibicin por retroalimentacin (Tabla 1).
Mutantes de permeabilidad
Excrecin del producto en cepas superproductoras a menudo se produce cuando la
captacin y / o catabolismo se ve perjudicada. As, gentica
lesiones eliminando captacin activa puede ser utilizada para mejorar especficamente la
excrecin de metabolitos (Tabla 1). A menudo es de beneficio para aislar mutantes
incapaces de crecer en el producto deseado en forma de carbono nica o fuente de energa.
Tal
mutantes a menudo estn daados en su capacidad de recogida del producto y contienen
bajos niveles intracelulares de la
producto, disminuyendo as la regulacin feedback. En ciertos mutantes mejorados, hay un
aumento en la sensibilidad
a desoxicolato y la lisozima, que indica un cambio en la permeabilidad.
Los mutantes que muestran cambios cualitativos en los productos offermentation themix
Como muchos organismos producen metabolitos secundarios como mezclas de una familia
qumica o de varias familias qumicas, la mutacin se ha utilizado para eliminar los
productos no deseados en tales fermentaciones. Un ejemplo es el de Nakatsukasa y Mabe
(Nakatsukasa y Mabe, 1978), quienes encontraron que en estras, una sola colonia aislado
natural de Streptomyces aureofaciens (que produce la narasina politer y el enteromycin
antibitico de amplio espectro) en galactosa llev a sectorizacin amarillo y negro . El
efecto era especfico para la galactosa. De los cuatro tipos de colonias obtenidas, una
producida solo narasina y dos produjeron slo enteromycin.
Streptomyces griseus ssp. cryophilus hace cuatro R3_ sulfatados y no sulfatados R3_ cuatro
carbapenems. Las formas sulfatados son menos activas que las formas no sulfatados. Para
eliminar completamente las formas sulfatados R3, mutantes de sulfato de transporte se
obtuvieron. Estos eran de dos tipos: (i) auxtrofos para tiosulfato o cistena, y (ii) los
mutantes resistentes a selenato. Cada tipo producido formas completamente no sulfatado y
los ttulos fueron equivalentes a la titulacin total de la matriz (Kitano et al., 1985).
Ocho avermectinas son producidos por Streptomyces avermitilis, de los cuales slo un
pequeo nmero son deseables. Un mutante nonmethylating producido slo cuatro de los
compuestos y un mutante que no lograron el sustituyente 25-isopropilo (de valina) produjo
una mezcla de diferentes componentes. Por fusin de protoplastos, una cepa hbrida que se
obtuvo hecho solamente dos componentes, B2a y B1a (Omura et al., 1991). Stutzman-
Engwall y colegas (. Stutzman-Engwall et al, 2003) introdujeron mutaciones aleatorias por
PCR en el gen aveC y obtenido un mutante que produce una avermectina B1: B2 relacin de
2,5, mejorado mucho sobre la relacin de 0,6 de la matriz S. avermitilis colar.
La mutacin fue utilizado para eliminar el sulochrin polictidos indeseable y cido asterric a
partir de caldos de la lovastatina
productor, Aspergillus terreus (Vinci et al., 1991). Los mutantes tambin se han empleado
para eliminar coproductos no deseados de la fermentacin monensina (Pospisil et al., 1984).