Métodos basicos de laboratorio en parasitologia médicaCatalogacion por la Bisoteca e ls OMS Mstodos béscos de aboraoro en parastologia mica 1. Parasilogia- manuals 6 aberatro (SBN 9249546101 (Clasifeacén NLM: WC 28) (© Organizacin Mundial dela Salud 1992 Ls Otganizasn Mira eS dra concern muy aonb la cas de uiean para ead 0 ‘reduc ineranent 0 en pave, ina dees pubscacnes. Ls sod yas ptr densa eben gra Ofer de Puicacones,Organiznn Mansa dela Sali, ner, Sua, gs le uno gio en separ oat ifamacon mds rere sore combos Iason a In ba lana ds ees y romps) fats ‘noe ya seponbiee © Organizacén Mune de a Sah 1982 Las pbleasoes de Orgnzain Mund doa Sad ella scolds al rleckn prvi potas ponent $b epodicin de ogres dl Poco 2 Convene Umer sob Buccs So Aa Mesrtos es De restos as cenorinasonos amieads on esta pbleacn yi forma an qu sprecenpresonados oe dle ae contre ro mates, pe pare dof Secretaria ce la Organzncbn Mandl deh ald, aon algae soe wean hoa Ge les tiaras, cues © zoe, o de ws avorsedeo, reaped ara dew rns o es a more de determina scdes morcanise ode nantes comets de crtos products ro implica qe ‘roanacicn Mina dei ated foe aru orem con poeencas tos andiogee, Soe ere U oma Ma oromincenes de prods palniados leaner is pubcarones def OS lea rc meyscus PRINTED IN SPAIN 91/8844-Gréticas Reuriaas-1800Indice Prefacio Relacién de colaboradores Introduceién Seguridad en el laboratorio Seccién 1. Técnicas de toma, preparacién y examen de muestras. Cuidado de! microscopio Ajuste de! microscopio para medir tamafios Muestras fecales Toma de muestras fecales Examen Examen macroscépico de tas heces Examen microscépico de preparaciones humedas Identificacién de pardsitos Técnicas suplementarias Técnica de concentracién Técnicas de tincién permanente Identiticacién de pardsitos en frotis tefiidos Frotis anales para la deteccién de oxiuros Frotis fecal, en capa gruesa con celofén para el diagnéstico de la esquistosomiasis intestinal (técnica de Kato-Katz) Envio de muestras al laboratorio de referencia Eliminacién de las muestras Control de la calidad en el examen de heces Toma de muestras Preparacién de reactivos Ejecucién de las técnicas Muestras de orina ‘Toma de orina para el diagnéstico de a infeccién por Shistosoma Examen de la orina Método de sedimentacién para la recogida de orina terminal de 24 horas Método de filtracion por jeringuilla Identificacién 10 10 "1 13 15 16 7 24 25 28 888 31 31 34 34 34 34 35 37me | HETOOUS BASICOS DE LABORATORIO EN PARASTOLOOIA MEDICA Muestras vaginales y uretrales 38 Toma de muestras 38 Examen directo de frotis vaginales y uretrales 38 Muestras de sangre y otras muestras 40 Extensiones de sangre tefidas a Toma de muestras at Tincién de extensiones de sangre con colorantes de Giemsa 44 Tincién de extensiones de sangre con colorantes de Field 45 Tincién de extensiones de sangre con hematoxilina de Delafield para detectar microfilarias 46 Examen 46 Control de la calidad en los examenes de sangre ar Técnicas especiales para plasmodios 48 Identificacién de pardsitos palidicos 48 Examen de la resistencia a la cloroquina en el Paludismo por P. falciparum 49 Técnicas especiales para Trypanosoma 50 Deteccién de tripanosomas en la sangre 50 Deteccién de tripanosomas en material aspirado de ‘ganglios linfaticos 55 Deteccién de tripanosomas en liquido cefalorraquideo «LcR) 87 Técnicas especiales para microfilarias 59 Toma de sangre para detectar microfilarias 59 Deteccién de microfilarias en la sangre periférica 59 Técnicas especiales para Leishmania 60 Muestras cutaneas 64 ‘Toma de muestras 64 Examen de las muestras 65 de especies parasitas 67 Seccién 2. Identifica Pardsitos intestinal 68 Helmintos. 68 Clave de identificacién de los huevos 69 Larvas de gusanos 72 Protozoos 73 Trofozoitos amebianos 73Quistes amebianos Flagelados Balantidium coti Isospora belli y Cryptosporidium Toxoplasma gondii Problemas de identificacién Pardsitos sanguineos Paludismo Identificacién de pardsitos en extensiones sanguineas finas Identificacion de parésitos palidicos en preparaciones de sangre en gota gruesa Elementos que pueden confundirse con pardsitos Paliidicos Tripanosomas Microfilarias Bibliogratia ‘Anexo 1. Equipo y material para el diagnéstico parasitolégico en laboratorios de centros de salud y hospitales de distrito ‘Anexo 2. Reactivos y soluciones: preparacién ‘Anexo 3. Preparacién de medios de cultivo ‘Anexo 4. Limpieza y conservacién de portaobjetos Indice alfabético, 75 78 79 80 80 81 83 83 83 83 1 92 92 95 96 99 110 112 113,Prefacio Este manual pretende ser una guia prictica para el personal que trabaja en los la boratorios de centros de salud y hospitales del primer nivel de envio de casos. Los métodos de diagnéstico se limitan al microscopio, si bien el serodiagnéstico puede requeris el envio de muestras de referencia, El contenido de este manual se basa en la informacién que se halla en el material docente y los manuales producidos por el Hospital de Enfermedades Tropicales de Londres (Inglaterra); el Departamento de Formacién en Parasitologia, de Ia Divi- sidn de Formacién y Consultas en Materia de Laboratorio, Oficina de Programa de Laboratorios, Centros de Lucha contra las Enfermedades, Atlanta, Georgia (EB.UU.); la Organizaci6n Mundial de la Salud, Ginebra (Suiza); y la Organizacion Panamericana de la Salud, Washington, DC (EE.UU.). En particular, se tomaron, varias ilustraciones de las publicaciones siguientes: Brooke, M.M. y Melvin, D.M. Morphology of diognestc stages of intestinal parasites of bumans, 2 ed., Atlanta, GA, Depar- tamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., 1984 (HHS Publication No. (CDC) 84-8116); Melvin, D.M. y Brooke, M.M., Laboratory procedures for the diagnasis of intestinal parasites, 3 ed., Atlanta GA, Departamento de Salud y Servicios Huma- ‘nos de los EE.UU., 1982 (HHS Publication No. (CDC) 82-8282). viiRelacion de colaboradores Las siguientes personas han colaborado en la preparacién de la presente obra: De. P. L. Chiodini, Consultor en Parasitologia, Hospital de Enfermedades Tropi- cales, Londres (Inglatetra); Dr. K. Engback, Departamento de Microbiologia Clinica, Hospital del Condado de Copenhague, Herlev (Dinamarca); Dr. C. C. Heuck, Tecnologia de Laboratorio de Salud y Seguridad Hematol6gica, ‘OMS, Ginebra (Suiza); Dr. L Houang, Annemasse (Francia); Dr. R. C. Mahajan, Departamento de Parasitologia, Instituto Superior de Ensefian- as ¢ Investigaciones Médicas, Chandigath (India); Dr. M. A. Melvin, Atlanta, Georgia (BE.UU,); De. L. Monjout, Parasitologia y Micologia, Enfermedades Tropicales y Parasitarias, Groupe Hospitalier Pitié-Salpétriére, Pavillon Lavercan, Paris (Francia). Dr. J.C. Petithory, Control Nacional de la Calidad en Parasitologia, Departamento de Biologia Médica, Centre Hospitalier, Gonesse (Francia); Dr. J. Vandepitte, Departamento de Microbiologia Clinica, Hospital Universitario de San Rafael, Lovaina (Bélgica). villIntroduccién Las enfermedades parasitarias causan una elevada morbilidad y numerosas defun- ciones en todo el mundo y a menudo cursan con sintomas y signos inespecificos. La mayorfa de esas enfermedades no pueden diagnosticarse slo mediante un re- conocimiento fisico, sino que exigen un estudio en el laboratorio para determinar si el paciente esté infectado 0 no por un parisito y, en caso afirmativo, la especie 1 la que pertencce ese parisito. As{ pues, el laboratorio desempefia un papel im- portante en el diagnéstico de las parasitosis y por ello constituye la clave en la se- leccién de los firmacos més apropiados para el tratamiento, Las pruebas de labo- ratorio deben ser precisas y flables si se desea que los resultados sean iitiles para el médico y beneficien al paciente. El presente manual es una guia para el agente de laboratorio, En la seccién 1 se presentan las técnicas de examen de heces, sangre, orina y otros materiales para la deteccién de parisitos. Se indican los inconvenientes y los errores que pueden co- rmeterse con cada técnica, as{ como los medios de evitarlos, También se examinan las medidas de control de la calidad. El agente de laboratorio debe tener presente que sélo la cuidadosa observancia de las téenicas adecuadas en Ia toma y Ja mani pulacién de las muestras permitici observar claramente los parisitas en el microsco- pio. En Ia secci6n 2 del manual se describen los etiterios morfoldgicos utilizados para identificar a los pardsitos. También se examinan los artefactos y los problemas de identificacién. En los cuatro anexos se ofece informacién sobre el equipo y los reactivos necesa ios. Fn el anexo 1 se enumeran los materiales y el equipo necesarios en los labo- ratorios de centros de salud y hospitales en el nivel de atencién primaria; en el anexo 2 se dan las formulas y las instrucciones para preparar los reactivos; el anexo 3 contiene las formulas ¢ instrucciones para preparar medios de cultivo, y en el anexo 4 se describe el procedimiento de limpieza y conservacién de portaobjetos destinados a la preparacién de extensiones sanguineas.Seguridad en el laboratorio Principios generales 1, En todo laboratorio debe existit un manual de seguridad en el laboratorio cu- {os principios deben aplicarse en todo momento. 2. El laboratorio debe disponer de un botiquin de primeros auxilios y se debe de- signar entre el personal un encargado de los primeros auxilios 3. No debe permitirse Ia entrada de personal ajeno al laboratorio en la zona de trabajo del mismo. 4. Se prohibird comer, beber, fumar y aplicarse cosméticos en el laboratorio. 5. El personal del laboratorio debe llevar indumentaria protectors, que se quitari cuando abandone la zona de laboratorio, BI personal del laboratorio debe limpiar los mostradores con una solucién de- texgente (abn) y desinfectar Ia superficie después de Ia jornada laboral, cuan- do se haya derramado material infeccioso, Los desinfectantes mas comunes son: — etanol 0 isopropanol al 96 9 (irritante para la piel) — solucién de fenol al 1% (corrosiva, caustics) — solucién de hipoclorito al 0,5 %-1 % (céustica corrosiva) (la solucisa alea- lina de hipoclorito es més fuerte que la solucién neutsa), — solucién de foraldehido al 1% o de glutaraldehido al 2% (téxica irtitan- te para la piel) Las soluciones de aldehidos y fenoles mantienen su actividad durante mis tiem- po. Es aconsejable limpias las zonas de trabajo con un paiio empapado en so- ucién desinfectante en lugar de utilizar un nebulfsador. HI personal siempre debe lavarse las manos antes de abandonar el laboratorio, Manipulacién de muestras Es preciso manejar con gran cuidado todas las muestras de laboratorio y utilizar siempre guantes de goma. ‘Mustras de sangre. Todas las muestras de sangre deben considerarse potencialmente infecciosas. Como la sangre puede transmitic agentes patdgenos sumamente peli .gros0s (por ejemplo, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o el de Ia he- patitis B), es preciso proceder con gran cuidado en la toma y la manipulacién de ‘muestras. En particular. los riesgos son: 42) Pinchazos o cortes: conviene ir desechando las agujas o las lancetas usadas en un recipiente que pueda después incinerarse o introducirse en otz0 recipiente de muestras desechable tras sumergirlo en una solucién desinfectante. Las lan- cetas usadas no deben volver a utilizarse ni dejarse sin zecoger. No deben usar- se utensilios de vidrio que presenten grietas 0 estén mellados. 4) Contaminacién de pequefias heridas 0 de las mucosas: cibrase todo corte con un apésito impermeable. Evitense las salpicaduras de sangre en la piel o las mu- cosas. Debe prohibirse terminantemente pipetear material con la boca. Si sal- pica sangre sobre la piel, lévese de inmediato la zona afectada con agua y ja ‘bon; sila sangre entra en los ojos, lévense éstos con agua abundante, La sangre que se haya derramado sobre las superficies de trabajo debe empaparse con so- lucién de hipoctorito y a continuacién limpiarse con un paflo impregnado con solucién de hipoclorito. Muestras de bees. Debe evitarse el contacto con la piel. Una ver terminado el trabajo con las muestras, éstas se deben a) incinerar o b) empapar en solucién desinfectan- te y enterrar después en recipientes de muestras desechables. 2SEQURIOAD EN EL LABORATORIO ‘Muestras de orina. Debe evitarse el contacto con la piel. Las muestras pueden dese- charse por el sistema de desagie. Eliminacién de portaobjetos usados Los portaobjetos usados deben colocarse en una vasija que contenga solucién de hi- poclorito al 19 y a continuacién enterrarse en un recipiente desechable, « menos {que vayan a limpiarse pare utilizatios de nuevo.Seccion 1 Técnicas de toma, preparacién y examen de muestrasCuidado del microscopio Lo que debe hacerse: 1. Manténgase el microscopio cubierto con una funda limpia de plistico o de tela mientras ao se esté utilizando. 2. Procirese en especial proteger el microscopio del polvo durante los periodos de calor seco. 3. Téngase especial cuidado de proteger las lentes y los prismas de! microscopio de la proliferacin de hongos durante los perfodos calurosos y himedos. Esto puede hacerse de varios modos: — mantener el microscopio en un cuarto con aire acondicionado, ° — mantener el microscopio en un cuarto especial deshumificado mediante un aparato eléctrico, que cuesta aproximadamente la mitad que un aparato de sire acondicionado, ° — conectar vasias bombillas de 15 6 25 vatios dentzo de un armario cuyas puer- tas cierren bien, = colocar una bombilla de 15 vatios en la caja del microscopio, para que haga las veces de armario climatizado, ° — en las zonas que carecen de electricidad, colocar un estante para la caja del ‘microscopio que se encuentre 2 uno 30 em sobre la campana de humos del refrigerador o el congelador a gas 0 queroseno; una holsa hermética y sili- ccagel en estado seco (indicado por su color azul) mantendrén el microsco- pio lo bastante seco como para proteger las lentes de los hongos. 4. Limpiese el aceite del objetivo de inmersién todos los dias, utilicese un pafto suave humedecido con etanol/éter (3 ml/7 ml) o bencina/etanol /éter (2 ml/2 ‘ml/1 ml) y séquese con un pao limpio sin pelo. 5, Limpiense los oculazes con un pao suave sin pelo; también puede usarse una ‘gamuza para gafas o servilletas para la cara. 6. Utilicese el tomillo de sujecién del microscopio que se encuentra en la base de la caja para evitar dafos al instrumento cuando se transporta de un lado a otro, 7. Conviene citar el némero de modelo y, de ser posible, el nimero de instru- ‘mento y de pieza cuando se pidan piezas de repuesto. Lo que no debe hacerse 1. No utilizar el mismo tejido © pafo para limpiar el objetivo de inmersién y los, 2. No utilizar alcohol para limpiar las partes del microscopio que van pintadas, 3, Nunca se debe desmontar ni intentar limpiar partes del microscopio de dificil acceso a menos que se haya aprendido a hacerlo. 4. No deben dejarse vacios los orificios de las lentes utilice la tapa apropiada 0 tun poco de masilla para tapar el orifico. 5. No intercambie las lentes de microscopios de distinto fabricante; incluso algu- rnos modelos del mismo fabricante tienen diferentes especificaciones.Ajuste del microscopio para medir tamafos El temafio es un criterio importante para la identificacién de numerosos pardsitos, ‘en particular en el caso de los quistes y los huevos. El tamafio puede determinarse utilizando una cémara de recuento de células sanguineas (Neubauer), 0 un micré- metro ocular, Con este diltimo instrumento, el procedimiento que debe seguirse es cl siguiente: 1. La escala graduada del ocular esté dividida en 100 divisiones pequefias. 2. Laescala graduada del micsémetro del portaobjetos consta de 1 mm dividido cen porciones de 0,1 mm, a su vez divididas en otras de 0,01 mm. 3, Insértese la escala del ocular (un disco de vidrio) en el ocular reticando la len- te superior y colocando la escala en el limitador del campo visual. 4, Inséztese el ocular en el microscopic. Coléquese el micrémetzo del portachjetos sobre la platina 6. Enféquese el objetivo de menor aumento sobre la escala graduada de Ia plati- “Ajstense las escalas graduadas de la platina y del ocular hasta que queden pa- ralelas. 8 Anétese el mimero de divisiones del ocular y su medida correspondiente en Ia platina, por ejemplo, 50 divisiones del ocular = 0,75 mm; 10 divisiones del ocular = 0,15 mm. 9. A partir de esta lectura, calcilese el valor de una divisién del ocular, por ejem- plo: 50 divisiones del ocular = 0,75 mm 1 divisién del ocular = 0,75/50 = 0,015 mm ° 10 divisiones del ocular = 0,15 mm 1 divisi6n del ocular = 0,15/10= 0,015 mm. 10. Conviértase el valor de la medida de min a jim (1 mm = 1000 Him), por ejem- plo, 0,015 mm = 15 wm. 11, Repftase la operacién para todos los objetivos y anétese la lectura obtenida en cada caso. 12, Basta con calibrar cada microscopio una sola vexMuestras fecales Las muestras fecales se examinan para detectar la presencia de protozoos y larvas © huevos de helmintos. Bn las heces, los protozoos suelen encontrarse en Ia fase de trofozoito y de quiste. ‘Los helmintos aparecen habitualmente en forma de huevos y de Iaevas, aunque @ veces también pueden observarse gusanos adultos enteros 0 en segmentos, Pot lo general, las tenias adultas y sus segmentos resultan visibles a simple vista, pero los hhuevos, las larvas, los trofozoitos y los quistes s6lo pueden verse al microscopio. La observaci6n de esas estructuras exige Ia preparacién y el examen correctos del material Toma de muestras fecales Dada la fragilidad de muchos parisitos intestinales y la necesidad de preservar su morfologia para identificarlos con exactitud, no puede hacerse un diagnéstico fia- ble al microscopio a menos que Ja toma de las heces se haga debidamente. 1, Entréguese al paciente lo siguiente: — una caja de cartén encerado cuya tapa cubta los bordes por el exterior, © un recipiente o caja de plistico cuya tapa encaje bien, y — dos varillas aplicadoras. Si no se dispone de cajas enceradas ni de recipientes de pléstico, también sit- ven las cajas de hojalata o los recipientes de vidrio, Las hojas de bananero y las cajas de cerillas no son recipientes adecuados pars la toma y el almacena- miento de muestras de heces. En los programas de lucha basta 2 menudo el examen de una sola muestra, pero en el caso de los pacientes suelen necesitarse tres muestras obtenidas a in- tervalos de tres dias, a fin de detectar todas las parasitosis. Diversas sustancias pueden interferir con el examen de las heces en busca de parisitos (por cjem- plo, los laxantes, los antiécidos, los medios de contraste y ciertos antibisticos). 2. Pidase al paciente que defeque directamente en el recipiente, 0 que lo haga en tun trozo de papel y utilice las varillas aplicadoras para introducir Ia muestra en el recipiente. Si no se dispone de papel, puede defecarse en una hoja grande y limpia, por ejemplo de bananero. De todos modos, e] exeremento debe rans- friseinmediatamente al recipiene indicade, No debe dejarse sobre la hoja ni llevarse al laboratorio envuelto en ella, 3. Algunos microorganismos, especialmente los trofozoites amebianos, comien- zan 2 desintegrarse o alterarse al poco tiempo de ser excretados y se vuelven irreconocibles. Las temperaturas clevadas aceleran esos cambios. Asi pues, las muestras deben llegar al laboratorio tan pronto como sea posible (por ejemplo, al cabo de media hora) después de la defecacién. Si no es posible, Ia muestra debe tratarse con conservantes (véase la pagina 29). 4. El recipiente que contiene Ja muestra debe rotularse claramente con los si iguientes datos: — nombre 0 nimero del paciente = fecha de toma — hora de la excrecién (pregiintese al paciente). ‘La muestra fecal debe ser lo bastante grande para un examen satisfactorio. La muestra més pequefia que debe aceptarse es del tamafio aproximado de un hue- vo de paloma. La orina y la suciedad deben separarse. La orina destruye los tro- foottos amebianos que pudieran existiry Ia suciedad interfiere con el examen. Si la muestra es demasiado pequetia o si estd mezclada con orina o suciedad, debe rechazarse, Pidase al paciente que traign otra8 (elanda) Swen anal TOMA, PREPARACION Y ENSAYO DELAS MUESTS 6, Manténgase la caja de cartén en la que se encuentra le muestra dentro de un frigorifico; si ello no ¢s posible, coléquese en el lugar més fresco y sombreado del laboratotio, No debe mantenerse la muestra artificialmente templada ni de- jarse al sol Examen Examen macroscdpico de las heces 1, "Tan pronto como se reciba la muestra de excremento en el laboratorio, obsér- ‘vese su consistencia (grado de humedad) y andtese una de las siguientes letras cen el recipiente: F (formada), B (blanda), § (suelta) 0 A (acuos:), Si se observan mucosidades, andtese la letra M, y si se observa sangre eserfbase Sa. Por ejemplo, una deposicién suelea con sangre y mucosidades se describirfa ‘con las letras, S, Sa, M. La consistencia o grado de humedad serving de orien- tucidn para saber si serd més probable encontrar les protozoos en fase de tro: foroito 0 de quiste, Las diversas eategorias de excrementos y las técnicas més apropiadas en cada caso se muestran en el cuadro 1, 2, Sise reciben varias muestras al mismo tiempo, hay que examinar primero las que contengan sangre y mucosidades, y a continuacién las muestras liquidas. Estas muestras son las que con més probabilidad contienen trofozoftos ame~ bianos, que mueren al poco tiempo de la excrecién, por lo que deben exami- rarse durante la primera hora que sigue a ésta. Las heces formadas pueden exa- minarse en cualquier momento del primer dia, pero no deben dejarse de un da para otto (los quistes pueden desintegrarse). Examen microscopico de preparaciones humedas La prepatacion en hiimedo es la técnica mas sencilla y ficil para examina las he- ces; este método debe aplicarse en todos los laboratories del nivel periférico. Una preparacién hémeda puede prepararse directamente a partir de material fecal 6 de muestras concentradas (wéase la pagina 16). Las principales formas de pre- paracién en hiimedo que deben usarse en cada examen fecal son las realizadas con solucién salina, con solucién yodada y con azul de metileno amortiguado: = La prparacién co soln salina se usa en el examen microscépico preliminar de los excrementos. Se utiliza primordialmente para observar los huevos y larvas Cuadro 1. Categorias de heces y técnicas apropiadas Tecnica Consistencia Fase protozoaria Solucién Solucién Azul de metilano mas probable" salina -yodada_-—‘tamponado (6i se observan trofozoltes) Formada Quistes + + Bianca Quistes + + + (ocasionaimente trofozoitos) Suetta Trotozoltos + + ‘Acuosa Trofozottos + * Los huevos y las larvas de gusanos pueden encontrarse en los excrementos de cualquier ‘consistencia 10MUESTIAS FECALES de gusanos, los trofozoitos de protoz0os y los quistes. También puede revelat la presencia de eritrocitos y leucocitos — La preparacin con solu yodada se utiliza principalmente para teftir el glucégeno y los niicleos de los quistes, si existen, Por lo general, con esta preparacion puc- den identificarse los quistes — La preparaciin con azul de metilno amortiquade (AMA) debe hacerse cada vez que se observen trofozoitos amebianos en una preparacién salina, o cuando se sos- peche su presencia. El AMA tite los trofozoitos amebianos, pero no los quistes amebianos, ni los trofozoites si los quistes de flagelados. La coloracién con AMA sélo debe usarse para las muestras frescas sin conservantes; no se usa en las muestras tratadas con conservantes, en las que los organismos han muerto, Material y reactivos 1. Cubreobjetos Frascos cuentagotas con: solucién salina isoténica (reactivo n® 24).! ‘Yodo de Lugol (solucién al 1%) (seactivo n° 18) azul de metileno amortiguado (reactivo n° 2). Portaobjetos Boligrafos o rotuladores para las etiquetas Asa de siembra (o varillas aplicadoras, cerillas 0 mondadientes). Preparaciones directas con soluci6n salina y solucién yodada 1. Con un Lipiz de cera, eseribase el nombre o el niimero del paciente y la fecha en la parte iaquierda del portacbjetos. 10/4/84 - N N 2. Coldquese una gota de solucién salina en el centro de la mitad iequierda del portaobjetos y una gota de solucién yodada en el centro de la mitad derecha. NOTA Si se sospecha la presencia de trofozoitos amebianos, debe utilizarse solucién salina tibia (37° ©). 7 En todo el manual el endmero de reactivo» se refiere al nimero asignado al reactivo en el anexo 2 "eee TOA PREPARACION YENSAYODE LS HUET SE 3. Con una varilla aplicadora (cerilla o mondadientes), tomese una pequetta por- cin de la muestra (del tamafio de la cabeza de una cerilla) y mézclese con la ‘gota de solucién salina, NoTA _Exeremente forma: omese Ia porcién de excremento de modo que contenga ma- terial del exterior y del interior de la muestea. Bxcremento on mussidades: si hay mucosidades, rotilese un segundo portaobjetos ‘con el nombre o el siimero del paciente. Coléquese una gota de solucién sa- lina en el portaobjetos, t6mese una pequeha porcién de mucosidad y mézclese con la solucién salina, Si existen trofozoites, a veces es mAs fécil encontrarlos cen las mucosidades que en las partes s6lidas del excremento. Exzremento sultoy aeaete: ino hay mucosidades t6mese una pequefta porcién del excremento (de cualquier parte) y mézclese con la solucién salina 4. Del mismo modo, témese una pequefia cantidad del excremento y mézclese ‘con la gota de solucién yodada. Si se utiliza un asa de siembra, pasese por la llama después de hacer la preparacién. Si se utilizan varillas aplicadoras, tiren- se después 5. Ciibrase la gota de solucién salina y la gota de solucién yodada con sendos cu- breobjetos. Se apoya el cubreobjetos sobre el portaobjetos en posicién inclina- da, se toca con él el borde de la gota y se hace descender lentamente hasta que quede sobre el portaobjetos. Con ello se reducita al minimo la posibilidad de que se formen burbujas de aire en la preparacién. Preparaci6n con azul de metileno amortiguado (AMA) (prepérese si se observan trofozoitos amebianos en la preparacién con soluci6n salina) Procédase como en Jos patos 1 a § en «Preparaciones directas con solucién salina y solucién yodada», pero colocando una gota grande AMA sobre el portaobjeto en 12SUEUR died lugar de solucién salina yodada, Déjense pasar 5-10 minutos antes del examen, para que el colorante penetre en los teofo2nitos. No deben dejarse pasar més de 30 minutos desde la preparacién del portaobjetos, pues de lo conteario el AMA daria tuna tincién excesiva de los trofozoftes Examen 1. Coléquese el portaobjetos con las prepariciones en la platina del microscopio y enfoquese la preparacién con el objetivo X10 0 uno de menor aumento. 2. Regilese la luz en el campo visual con el diafragma de debajo de Ia platina Los objetos deben verse con nitidez en el campo. Gradiiese adecuadamente la iluminacién del campo. 3. Examinese toda la zona del cubreabjetos con el objetivo x10; enféquese el én gulo superior izquierdo y mievase el portaobjetos con movimientos regulares en horizontal o en vertical. 4. Cuando se vean microorganismos © material sospechoso, pisese al objetivo de més aumento en seco y auméntese la iluminacidn abriendo el diafragma de de. bajo de Ia platina pata observar la morfologia en detale. Este es un examen sistemitico. Por este método podré localizarse habitualmente todo parisito que esté presente. Si la preparacin no se examina sistematicamente, cabe la posibilidad de pasar por alto algiin pardsito, Examinese cada campo mi- croseépico cuidadosamente, enfocando arriba y abajo, antes de pasar al campo si- guiente. RECUERDE EXAMINE SISTEMATICAMENTE LAS PREPARACIONES En la figura 1 se indican los exémenes que deben Ilevarse a cabo en los laborato- ios de distintos niveles. Identificacién de parasitos Huevos y larvas de gusanos en preparaciones con solucién lina Los huevos son ficiles de detectar y de identificar en las preparaciones con solu- cidn salina. No deben teairse (la tincién puede entorpecer la identificacién). Aun- gue la mayoria de los huevos son lo bastante grandes para poderlos reconocer con el objetivo de menor aumento (x10), algunos huevos pequefios deben examinarse fen seco con un objetivo de mayor aumento, En las preparaciones salinas pueden verse las larvas de Sirongylidessteroral. Las larvas de los anquilostomas no suelen hallarse en las muestras frescas, pero tal vez sea necesario distinguir estas dos especies si se examina una muestra antigua. Las caracteristicas en que se basa la identificacién de especies de huevos y larvas se describen en la seccién 2, pp 69-72, Los diagramas y las claves de esa seccién pueden usarse para identificar huevos y larvas. 13TOMA, PREPARACION Y ENSAYO DE LAS MUCSTRAS SS Fig. 1. Técnicas de examen de heces segiin el nivel del laboratorio Laboratorio de centro de salud soluciin— y(sise — azul de Salina.” observan—metileno tofozotos _tamponado ‘amebianos) _amortiguado Proparacién muestra focal humeda ‘extension gruesa con celotan directa yodo solucién concentracisn [~ salina todas las muestras — con formaiina/ oer yodo Hospital de distrito ‘Muestras de heces sin conservante Preparaciones himedes directas solucion _yisise azul {sison heces emortas 0 salina’ observan — metileno fcompanadas de sangre y trotooites amortiguado ‘mucosidades) amebianos) yodo solucién todas las muestras-— concentracién --— salina con formalina/ eter = Muestras de heces con conservante solucién {lade con concentracisn | *2Hn® formatina on formalina) Stor yodo [No todos Io gusanos se hallan en todas las regiones del mundo; algunos tienen una disteibucién geogrifica limitada, Es conveniente elaborar una lista de las especies aque se encuentran en la zona geogrifica del laboratorio. Protozoos en preparaciones himedas Preparaciones con soluci6n salina En las preparaciones con solucién salina, pueden observarse los trofozoitos y los quistes de amebas y flagelados. Los quistes aparecen como estructuras refringentes redondas u ovaladas. Los trofozoitos amebianos pueden ser redondos o irregulares;, los trofozoitos de flagelados suelen ser piriformes (alargados, con forma de pers). En las heces recientes (de no més de una hora) pueden observarse trofozoitos mé- viles, La observacién de la motilidad puede ser muy stil para identificar especies, sobre todo en el caso de los flagelados. La motilidad caracteristica de cada especie se deseribe en Ia seccidn 2 (pp. 73-81). Aunque con el objetivo de menor aumento (x10) pueden detectarse microorga- rnismos, serd necesario recutrir al objetivo de mayor aumento y al examen en seco para determinar de modo fiable si la estructura es un quiste 0 un trofozoite. Con ese objetivo puede observarse la motilidad, las inclusiones como los eritrocitos y 4las levaduras en los trofozoltos amebianos, los ézganos cromatoides en los quistes amebianos y la forma y los detalles estructurales (por ejemplo, los discos de suc~ cidn, los surcos en espiral o los filamentos) de os trofozoitos y quistes de flagela dos. No se podra ver ningin detalle del nucleo en las preparaciones con solucién salina, No obstante, es necesario regular caidadosamente la iluminacién del mi- croscopio a fin de que los objetos aparezcan con claridad, Tanto el exceso como la cescaser de luz entorpecerin la observacién. También es preciso enfocar hacia arri- ba y hacia abajo para ver todas las capas o planos de la muestra, Examinese toda Ja zona del eubreobjetos de modo sistematico para reducie la posibilidad de que pase desapercibido algin microorganismo. Preparacién himeda con azul de metileno amortiguado (AMA) Si se observan trofozoitos amebianos o estructuras que lo parecen debe prepararse y examinarse una preparaciéa con AMA. Tras 5-10 minutos de tineida, los trofo- zoftos a veces conservan la movilidad, pero a menudo se enroscan en las prepara: ciones con AMA. (No deben confundirse con la solueién de AMA). Ea los trofo. zoftos, el micleo y las inclusiones (eritsocitos, levadusas) se tinen de color azul os: cura y el citoplasma se tifte de azul claro, Ocasionalmente quedan algunos trofo. zoitos sin tefl, de modo que conviene buscar microorganismos bien coloreados. Basquense grénulos en la periferia del micleo (en la membrana perinucleas); si exis- ten, el trofozoito pertenece al género Examorha: a continuacién debe identificarse la especie. (Las caracteristicas para identifica los trofozottos amebianos figuran en. Ia seccién 2, pp. 73-75). Si no se observan grénulos perinucleares, el trofozoito no pertenece al género Extamoba Preparacion himeda con yodo Las preparaciones con yodo sirven para observar los quistes de amebas y lagela- dos. Pueden detectarse con ¢l objetivo X10, pero no son tan refringentes como en las preparaciones con solucién salina, Debe usarse un objetivo de gran aumento en. seco pasa estudiar las caracteristicas de los quistes; Estos deben medirse para garan- tizar una identificacién correcta En Ia preparacién con yodo, el citoplasma de los quistes se tine de amarillo 0 de martén claro y los nticleos de mars6n oscuro. En los quistes de Fatanecba tenidos ‘con yodo, puede observarse la disposicién de la ceomatina periférica y Ia posicién del cariosoma, (Si no hay cromatina periférica, el quiste no pertenece al género Ex tamotha), Bstos oxgiulos cromatoides periféricos se tinen de amarillo claro y a ve- ces no se ven con nitidez. En ocasiones, los quistes jévenes contienen glucégeno, que se tine de color matrén oscuro con el yodo. En los quistes lagelados tefidos con yodo pueden verse las fibrillas (Flamentos), Aunque por lo general en estas preparaciones puede identificarse Ia especie a la que pertenecen los quistes de amebas y flagelados, a veces es imposible una iden- tificacién definida, en cayo caso hay que utilizar tinciones petmanentes. En Ia seccién 2 (pp. 75-81) figuran las caracterstcas para la identiicacién de quistes. Técnicas suplementarias Adems de las preparaciones himedas directas, existen procedimientos suplemen- tarios para el diagnéstico de pardsitos intestinales, Los més comunes soa las técai: cas de concentracién para la recuperacién de huevos, larvas y quistes, y las técnicas de tincién permanente para la observacién de trofozoites y quistes. 15TOMA, PREPARACION Y ENSAYO DE LAS MUEST?AS Técnica de concentracién Si la muestra de heces contiene pocos microorganismos, es posible que no se de- tecten parisitos en una preparacién hiimeda directa. Asf pues, siempre que sea po- sible, debe concentrarse la muestra. Los huevos y larvas de gusanos y los quistes, de protozoos pueden recuperarse por concentracién, pero los trofozoitos de proto- zoos no se verin ya que este procedimiento suele destruitlos. Por ese motivo es im- prescindible el examen de Ia preparcién hiimeda directa como fase inicial del es- tudio microseépico. El procedimiento de concentracién esti indicado cuando el examen preliminar de ln preparacién hnimeda dé resultado negativo a pesar de los s{ntomas clinicos que indican la infeccién por parisitos del paciente, y para la deteccién de Schistosoma y Tenia El procedimiento de concentracién que se recomienda es el método formalina-éter (@ formalina acetato etflico)', Por este método pueden recuperarse todos los tipos de larvas y huevos de gusanos (iscaris, tenias, esquistasomas y otros huevos de tre- ‘matodos), asi como quistes de protazoos Material y reactivos 1. Varillas aplicadoras de madera. 2, Feascos, distribuidores 0 de plitico wexprimibles, de 250 ml 0 500 ml, Estos frascos son muy cémodos para aftadir formalina a los tubos de la centrifuga dora. Puede usarse también cualquier tipo de frasco o botella pequefia. 3, Centeifugadora, con cabezal y cubetas para alojar tubos cénicos de 15 ml. De- ben usurse cubetas herméticamente cerradas 4. Tubos de centrifugadora, 15 ml, ednicos (higase una marca a7 ml y 10 ml con un lipiz graso). 8, Torundas de algodén. 6. Cubseobjetos. 7. Embudo, 8. Gasa quinirgica. 9, Portacbjetos, 10. Pipetas Pasteur con perilla de goma. 11, Gradilla o soporte para los tubos. 12, Formalina, 10% (ceactivo n® 10). Para el uso cotidiano, viértase parte de la solucién en un frasco «exprimibles. El frasco debe ir etiquetado. 13, Bter 0 acetato etilico. ' 14. Yodo de Lugol, solucién al 1 9, en un frasco distribuido con pipeta (reacti- vo n° 18). 15. Solucién salina, isoténica (reactivo n° 24). PRECAUCION El éter es un producto sumamente inflamable que se prende y explota répidamente si hay una llama o una chispa en sus proximidades, Gudrdense las latas 0 frascos abiertos en un estante abierto en la parte mas fresca del laboratorio, Hay que cer- cionarse de que as latas o las botellas estén tapadas, Nunca debe ponerse ua reci- piente abierto de éter dentro del frigrorifico: los vapores se acumulan en el interior de éste, incluso cuando el recipiente esté cerrado, y pueden explotar cuando se abre Ia puerta, No deben colocarse recipientes abiertos en un armario. Es preferible de- jar el recipiente en un estante abierto de modo que los vapores puedan dispersarse sin dificultad. ¥ Sino se dispone de éter ni acetatoetiico, puede usarse gasolina ordinaria en idénticas pro- pporciones que at éter. El acetato etiico no es tan inflamable ni tan expiosivo como el ter, por lo que resulta menos peligroso en el laboratoio. 161 sae unto capas vasa Shima csrrtogacion EE Tecnica 1. Anédase 10 ml de formalina al 10% a aproximadamente 1 g de heces y re rmuévase utilizando un palilo aplicador hasta obtener wna svspensin ligera mente tabi 2. ‘Ajstese un feo de gis al embudo y coloquese éste sobre un tubo de centifa- gudorn 3. Higase pasar la suspensin fecal por el filtro dentro del tubo de centrifugadora hasta alcanzar la marca de los 7 tal 4. Retitese el fltzo 0 y urese junto com el residuo s6lido. 5. Aaidanse 3 ml de éter o de acetatoetlico y mézclese bien durante un minoto. 6. Wuelvase a verter en el tubo de centefagadora y centrifiguese durante un mi sto. El rabo debe presentar el mismo aspecto que en a ilustacién, Despéguese el tapéa grasa (rsiduo) con wn palillo apicador,y tirese el sobre nadante invirtiendo rapidamente el tubo 8, Coldquese de nuevo el tubo en la grailla y déjese que el liquide de los lados del tubo escurea hast el sedimeato. Mézclese bien y transfirase una gota a un portobjetos para examinarlo bajo un cubreabjctos, Hégase también una prepa- racién tetido con yoo. 9. Usillcense los objesivos x10 y x40 para examinar todo el material que queda bajo el cubreobjetos en busca de huevos, quistes y larvas Examen del sedimento ‘Las preparaciones de material concentrado deben examinasse del mismo modo que se ha descrito para las preparaciones hnimedas directas (véase la p. 13). La prepa- racién con solucién salina (o sin tefis) debe examinarse de modo sistematico en busca de huevos, larvas y quistes. Si se observan quistes o estructuras que Io pare- ccen, debe examinarse la preparacién con yodo para hallar més detalles. Los microorganismos tendrin el mismo aspecto que se ha deserito en el caso de las preparaciones himedas directas. Ein las preparaciones con solucién salina con. entradas con formalina-tter (0 acetato etilico), los niicleos de los quistes quedan fijados y pueden resultar visibles. No obstante, las preparaciones hiimedas con yodo. deben examinarse para alcanzar una identificacién més fiable, Técnicas de tincién permanente Normalmente no suele recurritse a los métodos de tincién permanente para el diag- néstico, porque no son necesarios para la identificacién de huevos o larvas de gu: sanos. No obstante, a veces es preciso urilizarlos con los siguientes fines — identificacién de oocistos de Crypioporidinm, — identificacién de trofozoitos de protoz00s, en aso de dudas — confirmacién de la especie a la que pertenecen los quistes de protozoos, en caso de duda.s — mantenimiento de un registro permanente; — envio a un laboratorio de referencia para obtener Ia opinién de un experto. Tincién de oocistos de Cryptosporidium Los oocistos de Cryptosporidium que aparecen en las heces son esféricos, con un dié- metro de 4.6 pt. Pueden concentrarse usando una técnica modificada de formali- nna-éter, pero deben identificarse por métodos de coloracién. El método recomen- dado es la técnica modifieada de Zichl-Neelsen; otra posibilidad es la tinciéa con safranina-azul de metileno. Material Palillos aplicadores de madera Cubreobjetos 7TOMA, PREPARACIONY ENGAYO DE LAS MUESTRAS Pinas Portaobjetos Boligrafo o rorulador para las etiquetas Vatilla de cristal Soporte para portaobjetos, para preparaciones terminadas Frasco pequefio de medio de preparacién Cubetas de tincién Esponja o papel sccante, Técnica modificada de Ziehl-Neelsen Reactivos Carbol-fucsina (reactivo n° 4) Formalina (formaldehido) (reactivo a° 10) Solucién de fcido clorhidrico - etanol (reactivo n° 13) Solucién de glicerina - verde de malaquita (o azul de metileno) (reactivo n° 12) Solucién de acido clorhfdrico - metanol (reactive n° 14) ‘Agua, Preparacion 1, Haigase una extensién de material fecal en capa fina, déjese secat al aire y fijese fen metano! durante 2-3 minutos. Si es posible, debe seguirse fijando eon vapor de formalina, a fin de reducir la infecciosidad. (No puede usarse el sedimento de la extracci6n con formalina-éter) 2. Titiase la extension con carbol-fucsina frla durante 5-10 minutos. 3. Diferénciese en dcido clorhidrico-etanol al 1 % hasta que éste deje de salir colo- reado, 4. Aclérese con agua del grifo, 5. Hégase una tincién de contraste con verde de malaquita al 0,25 % (o azul de metileno) durante 30 segundos. 6, Aclirese con agua del grifo, 7. Bseicrase hasta sequedad o eliminese el sobrante con papel secante. 8, Examinese con el objetivo de gran aumento en seco y confirmese la morfologta examinando con el objetivo de inmersién, Midanse los quistes. Los quistes de Coptoporidium mien entre 4 y 6 jum, Cuando se tien con esta técnica, los oocistos de Cryptaporidium aparecen como es: férulas de color rosa fuerte sobre un fondo de color verde pilido. Se abservan dis tintos grados de tincién interna, atendiendo a Ia edad y el estado del aocisto, Tincién con safranina - azul de metileno Reactivos Solucién de dcido clorhideico - metanol (reactivo n° 14) Solucién de azul de metileno - fosfato (reactivo n° 19) Solucién de safranina (reactive n° 23) Agua, Preparacion 1. Prepirese una extensi6n de heces en capa fina. 2. Déjese secar la extensién al aire, Pésese una ver el portacbjetos por la llama de un mechero de alcohol. 3. Fijese la extensién con solucién de fcido clorhidrico - metanol dusante 4 minu- tos. 4. Lavese con agua limpia del grifo 18NT 5, Tifiase la extensién con solucién acuosa de safranina al 1 % durante un minuto. Caligntese el colorante colocando debajo del portaobjetos una torunda empa- pada en alcohol y encendida. No debe dejarse que el colorante se seque sobre Is extensin, 6. Livese el colorante que sobsa con agua limpia del grifo. 7. Higase una tincién de contraste con solucién al 1 % (p/v) de azul de metileno durante 30 segundos. 8. Livese con agua limpia del grifo y séquese el portacbjetos 9. Recérrase la extensién en busca de oocistos con el objetivo x40 y tsese el ob- jetivo 100 para identificar los que se encuentren. Los oocistos de Cyptospor ridium aparecen como corpisculos redondos u ovalados de color anaranjado © rosa (4-6 im de didmetro). Los esporozoitos que hay dentro de los oocistos se tinea de un color ligeramente més oscuro. Técnica de tincién tricromética para protozoos La tincién tricromética resulta util para colorear las muestras fecales recientes, asi como el material fiiado con polivinil-alcohol (PVA). No obstante, para conseguir resultados fiables hay que cerciorarse de que no se ha exigido la fecha de caducidad de los reactivos y de que se aplica el método con exactitud, Reactivos Solucién decolorante de icido acético-alcohol (teactivo n° 1) Etanol al 70°% (seactivo n° 7) Etanol al 9596! Solucién de carbol-xileno (reactivo n° 5) 0 etanol absoluto Solucién de alcohol yodado (reactivo n° 16) Fijador de Schavdinn (zesctivo n° 25) Solucién de colorante tricromético (ceativo n° 27) Xileno * Preparacién de los iscos de tincion y sustitucion de los colorantes i) Bhigutene os dios de sia necearios pry el procedimienoy dapén ganse en fila en el orden siguiente: Fijador de Schaudinn Solucién de aleohol yodade Etanol al 70% (1) Etanol al 70% (2) Solucién decolorante tricromético Solucién decolorante acido acético-alcohol Etanol al 9596 (1) 8, Etanol al 95% (2) 9, Carhol-xileno 0 etanol puro 10, Xileno Coléquense varias capas de papel absorbente delante de los discos, 0, en s0 defecto, esponjas o papel de pe: ii) Lignese cada disco con la solucién apropiada. Compruchese que se ha aftadi do Acido acético al Sjador de Schaudinn iil) Vigrease una pequeta cantidad de medio de preparacida en un pequetio fras- co con tapa o tapén, (Manténgase la botella grande de reserva bien cerrada para evitar Ia evaporaci6n). adico, El conjunto de discos de tincién se dispone en un lugar conveniente y se deja listo para usarlo cuando se necesite. Si las tapas de los discos tienen el borde de cristal " Este reactivo no requiere preparacién. Se usa drectamente a partir del envase comercial 19TOMA, PREPARACION Y ENSAYO OE LAS MUESTRAS esmerilado, péngase una capa fina de vaselina en el borde para que la tapa quede bien sellada. Las soluciones deberin reemplazarse periddicamente, de acuerdo con las siguientes 1. Fijador de Schaudina: cémbiese todos los meses, Viértase el fijador usado en tun frasco de desechos de soluciones orginicas y sustitiyase con una solucién recién preparada. 2. Solucién de alcohol yodado: cimbiese cada tzes semanas, Si el color desapa- rece 0 se vuelve muy pilido, sustitiyase inmediatamente. 3. Etanol al 70°96 (1). Bsta solucién amarilleart por el yodo del alcohol yodado. biese cada tres semanas 0 cuando se hayan tefiido 30 extensiones, segin lo que suceda antes, 4. Etanol al 70 9 (2): cémbiese cada tres semanas. 5, Solucién de colorante tricromatico: cémbiese sélo cuando la solucién se vuel- vva verdosa. Mueva suavemente el frasco hacia delante y hacia atris, Si el co- lorante que queda en las paredies del frasco esté més verde que violeta, tirese el colorante del frasco sustitdyase por colorante nuevo. 6. Solucién decolorante de Acido acético-alcohol: cambiese cuando se hayan de- colorado 20 extensi6n o una vez a la semana, Etanol al 95% (I): cdmbiese todas las semanas. Etanol al 95% (2): cdmbiese cada dos semanas. Etanol puro: cémbiese cada semana; carbol-xileno: cémbiese todos los meses. Xileno: cimbiese todos los meses, 1 Anétese el nombre de cada solucién y la fecha en que se llené el frasco como sigue: Nombre de la slacin Fecha de comionza Fecha de cambio Schaudinn 13 enero 1990 12 febrero 1990 Aleohol yodado. T enero 1990 28 enero 1990 Compruébense estas anotaciones, todas las semanas. Ast, las soluciones de coloran. tes siempre estarin en buen estado para tefir extensiones de heces. NOTA [Abra los frascos de colorante solamente para introducir o extraer preparaciones. Nunca deben dejarse destapados mientras las muestras se estén tiflendo, ya que las soluciones absorben Ia humedad del aire y dejan de teflir de modo satisfactorio, 20NT La solucién de catbol-xileno y el xileno sirven para deshideatar y aclarar las pre paraciones; eliminan el agua de la extensién y vuelven el material transhicido para poderlo examinas. Si penetra humedad en estas soluciones, no se obtendri el re- sultado apetecido. A veces se forman gotas de humedad en las paredes de los fras. cox; en ese caso, deséchese la solucién y sustitiyase por otza aueva. Tecnica 1, Etiquétese un portaobjetor con el nombre o el nimero del paciente y la fecha, 2. Con un palillo aplicador, témese una pequesa cantidad de excremento y ex tiéndase en capa fina frotando el material a derecha e izquierda con el apli- ceador en la parte central del portaobjetos. La capa de material debe ser tan uuniforme y homogénea como sea posible y de la densidad adecuada. Ello debe hacesse sépidamente para evitar que se seque Ia muestra, Introdizcase inmediatamente la extensién en el fjador de Schaudinn, NOTA Si el excremento es duro, puede mezclarse una pequefia porcién con solucién sx- lina para ablandarlo y hacer la extensi6n a partir de esta mezcla, LA EXTENSION NO DEBE SECARSE DESDE EL MOMENTO EN QUE SE PREPARA HASTA, EL MOMENTO EN QUE SE MONTA se en el fjador de Schandinn durante 1 hora a la temperatura ambiente, (La extensién puede permanecer en el fijador incluso hasta 2 dias, en caso ne- cesario). Coléquese el portaobjeros en el disco de modo que el extremo que leva el nombre del paciente quede en Ja parte superior. 4, Extrdigase el portaobjetos del disco con unas pinaas. Escirrase el exceso de liquido tocando el borde del portaobjetos con papel secante 0 una esponja. A. continuacién, coléquese el portaobjetos en el siguiente disco de tincién. 5. Déese en solucién de alcohol yodado durante exactamente 1 minuto. Retf- rese la extensidn y déjese escurrir como en el paso 4, Pasese al disco siguiente. 6 Introduzcase en etanol al 70% (1)* durante 1 minuto. Siquese el portaobje- tos y escirrase el exceso de liquide. Invrodiizcase en etanol al 70 % (2)* durante 1 minuto. Retirese el portaobje- tos y déjese escurrir. 8, Tiase con solucién de colorante tricromético durante 8 minutos. Retirese el portacbjetos y escuirrase. 9. Decol6rese con solucién de dcido acético-aleohol: sujétese el portaobjetos con las pinzas ¢ introdiizease dos veces en la solucién (tiempo total: 5 segundos) El dcido-aleohol seguir decolorando Ia muestra mientras estén en contacto y. por lo tanto, 5 segundos resultan suficientes. (No debe introducirse el por taobjetos en el disco y contar hasta 5). Déese escurrit el exceso de liquido del portaobjetos sobre un papel secante 0 ‘una esponja, Lavese inmediatamente la extension en etanol al 90% (1) para climinas el acido, 10, Introdiizcase una ver el portaobjetos en etanol al 95 % (1) durante 1-2 segun- dos. Retirese el exceso de liquido antes de colocaslo en el disco siguiente. 11, Introddzcase el portaobjetos 2 veces en etanol al 95 % (2) durante 2-3 segun- dos. Déjese escurrir el exceso de liquido antes de colocar el portaobjetos en. interrumpirse el proceso. Si tincion ya ha legado a la segunda etapa de lavado con etanl al 70 % (paso 7), debe tor- inarse. En ningun caso debe interrumpirse después del paso 7. 24TOMA, PREPARACION Y ENSAYO DELASMUEST®S 12, Introdiiacase el portaobjetos en cargol-xileno o etanol puro durtnte 1 minuto, Déjese escusrir el exceso de liquido antes de colocarlo en el disco siguiente. 13, Déjese la preparacién en xileno durante 2-3 minutos. 14, Retirese el portaobjetos y escirrase el Uguido sobrante. NO DEBE DEJAR- SE SECAR EL PORTAOBJETOS ANTES DE PONER EL CUBREOBJE- TOS, currie el xileno sobrante antes de poner el medio de montaje sobre Ia exten- comicnza a secarse, vuélvase a introducir en el xileno, pero déjese es- 15, Coléquese plano el portaabjetos sobre un papel secante 0 de periédico; con una varilla de cristal, pénganse 3 6 4 gotas de medio de montaje sobre la ex tensién, Sujtese un Cubreobjetos formando ingulo con el portaobjetos, con el borde en contacto con el de la extensién, Hagalo descender suavemente so bye la extensién de modo que el medio se distribuya uniformemente bajo cl eubreobjetos y que éste no aprsione busbujas de aie. NOTA, Si se estérinlendo més de una extensidn al mismo tiempo, decolore cada una por se- parado, Extrdigase una extensién del bao decolorante, retirese el exceso de Iiqui- do, decolérese, aclirese en etanol al 95.%, séquese y sumérjase en carbol-xileno 0 etanol puro (pasos 9-12). A continuacién, siquese otro portaobjetos del colorante y trhtese del mismo modo, Repitase hasta haber decolorado todas las extensiones, Si se esté tidendo mis de un portaobjetos al mismo tiempo, retirese del xileno uno de cada vez, esciirrase y méntese. No importa que algunas de las preparaciones de- ‘ban quedar en el xileno durante 4 6 5 minutos. Déjese la preparacién montada so- bre una mesa o un mostrador en posicién horizontal sobre un papel secante o de pe- riédico; debe permanecer en un lugar plano hasta que se seque. Ello puede llevar toda la noche o més. No obstante, aunque no estén completamente secas, las pre: paraciones pueden examinarse al cabo de 30 minutos. Una vez examinadas, no debe intentarse limpiar el aceite de inmersién hasta que el montaje esté completamente seco (alrededor de 24 horas), ya que si se frota para eliminar el aceite puede mo: verse el cubreobjetos. Si esto sucediera, aclérese inmediatamente la extensién en xi- leno durante 5 segundos y vuélvase a hacer el montai. Tecnica para muestras fecales fijadas con PVA 1. Agitese el material fijado con PVA (véanse las pp. 29-30), suave pero minu- ciosamente, a fin de mezclar de modo homogéneo el excremento con el fijador. 2. Rotiilese un portaobjetos como se indica en el paso 1 para material fresco. 3. Introdizease un palillo aplicador en Ia muestra fjada con PVA para tomar un poco de materal. Extiéndase haciendo girar el palillo sobre el protaobjetos. El ‘material también puede extenderse moviendo el palillo en sentido lateral y en. Zigaag sobre el portaobjetos. La capa de material debe ser tan uniforme y ho- mogénea como sea posible. Su espesor debe ser tel que a través del material pueda verse texto impreso pequefio sobre un papel colocado detris pero no ccon bastante claridad como para leerlo. Las preparzciones demasiado espesas Despiazarionts 22fo se tien bien y son dificiles de examinar. Si la preparacién es demasiado fina, no hay bastante material para llevar a cabo un examen fiable, 4, Las extensiones DEBEN SECARSE antes de tenirlas. Déjense sobre una su- perficie plana o en un soporte para que se sequen, a temperatura ambiente 0 ‘en una incubadora a 39°C, El tiempo de secado es de 8-10 horas, por lo ge- neral de un dia para oto. Es preferible preparar las extensiones un dia, dejar las secar durante la noche y tefielas al dia siguiente. En caso necesario, las ex- tensiones secas y sin tefir pueden conservarse durante 3-4 semanas antes de proceder a la tincién, 5, Sumérjase la extensién fijada con PVA y seca en una solucién de alcohol yo- dado, ) i) ii) iv) vi) vii) viii) ix) ») Solucién de alcohol yodador 15 minutos. Escirrase la extensién como se indies anteriormente pata los frotis de heces recientes. Etanol al 70° (1): 5 minutos, Bscdcras. Etanol al 70° (2): 5 minutos. Bscirrase Solucién colorante tricromitica: 8 minutos, Siquese un portaobjetos del colorante y déjese escurit. Si se esti tilendo mis de un portaobjetos, dé jease los ot dentro del colorante. Decolore sélo una preparacién cada Solucién decolorante de Acido acético-alcohok: sujétese el portaobjetos con las pinzas y sumérase en el decolorante 2 6 3 veces (tiempo total: 5 segundos). Déjese escurtir el portaobjetos durante 1-2 segundos. (Vi se cl paso 9 paca heces recientes, pp. 21). Exanol al 958 (1): sumésjase el portacbjetos en la solucién 2 veces para lavar el dcido, Déjese escurzir el portacbjetos durante 2 segundos. Etanol al 95% (2): 5 minutos. Déjese escusri. Solucién de carbol-ileno o alcohol puro: 7 minutos: Déjese escurzs Xileno: 10 minutos, Skquese un poraobjetos del xileno, déjese escurrir durante 2 segundos, y coldquese a continuacién plano sobre un papel absorbente 0 corrien- te. Para el monte, procédase como se indieé en el easo de muestras de haces freseas (pp. 21) Aspecto microscépico de la muestra tefiida El aspecto de las extensiones preparadas a pattie de heces sin conservante y a partir de heces fijadas con PVA es el mismo, aunque hay ciertas variaciones por las si- guientes causas: — el espesor de la extension no sera exactamente el mismo, — el tiempo de decoloracién puede ser ligeramente distinto, y — las muestras fecales varian de una persona a otra, En general, el material del fondo se tine de verde o de azul verdoso. En algunas cocasiones la muestra puede tefirse de rojo, pero ello no interfiere con el recono- cimiento y la identificacién de los microorganismos. Las distintas inclusiones del cexcremento se tien ast VERDE (0 verde azulado) — citoplasma de trofozoltos y quistes (bien fjados y tefidos), — citoplasma de eélulas de pus y tisulares, — levaduras y mohos (en general), — protozoos degenerados, — microorganismos que se han decolorado en exceso o demasiado poco, — Blaituyits bominis (protozoo que & menudo se observa en las heces); contiene gré- rnulos rojos alrededor del borde exterior de la célula, 23