Laboratorio N4: Inhibicin de

la actividad enzimtica en
procesos de transformacin.

1 1
Paula Camila Baron Tovar , Pamela Mariduea Muoz
1
DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA, UNIVERSIDAD DE LA SABANA.

1.Resumen: Doing different experiments variability in the

En esta prctica de laboratorio se estudiaron factors affecting enzyme activity such as
algunos aspectos cinticos para la incubation time, pH optimum, temperature
determinacin de la actividad enzimtica de la optimum, enzyme concentration, substrate
fosfatasa cida llevando a cabo distintos concentration and the presence of inhibitor were
procedimientos hechos en el laboratorio. performed.
Se realizaron diferentes experimentos haciendo
una variabilidad en los factores que afectan la Additionally the lab was based on the quantitative
actividad enzimtica, tales como, tiempo de method to measure phosphatase activity,
incubacin, pH ptimo, temperatura ptima, la consisting of the quantification of phosphate
concentracin de la enzima, concentracin del released which was performed by the method of
sustrato y la presencia de un inhibidor. Fiske Subbarrow considering the calibration curve
inorganic phosphorus for determining the
Adicionalmente la prctica de laboratorio se concentration of phosphorus released by action of
bas en el mtodo cuantitativo para medir la acid phosphatase; from this it could obtain the
actividad de la fosfatasa, que consiste en la following data, optimal incubation time 15 min, pH
cuantificacin del fosfato liberado la cual fue optimum of 5.6, optimum temperature of 37 C
realizada mediante el mtodo de Fiske- and Most enzymatic activity arises when a
Subbarrow teniendo en cuenta la curva de volume of 0.4 mL of enzyme is added to the
calibracin del fsforo inorgnico para la solution, maximum speed 2,0x10^9 Ml/min and
determinacin de la concentracin del fsforo Km 2,0x10^10 mg/mL.
liberado por accin de la fosfatasa cida; a
partir de esto se pudo obtener los siguientes Key words: acid phosphatase, enzyme activity,
datos, tiempo ptimo de incubacin 15 min, pH enzyme activity international units, absorbance,
ptimo de 5,6, temperatura ptima de 37 C y optimum pH, optimum temperature,
La mayor actividad enzimtica se presenta Lineweaver-Burk, maximum speed.
cuando se agrega un volumen de 0,4 mL de
enzima a la solucin, Vmx 2,0x10^9 M/min y Palabras claves: fosfatasa cida, actividad
Km 2,0x10^10 mg/mL. enzimtica, unidades internacionales de actividad
enzimtica, absorbancia, pH ptimo, temperatura
1.1 Abstract: In this lab some kinetic aspects ptima, Lineweaver-Burk, velocidad mxima.
for determining the enzymatic activity of acid
phosphatase conducting various laboratory
procedures facts were studied.
2. Introduccin:
Una de las reas ms fascinantes en el estudio
de la cintica qumica, es la catlisis enzimtica.
(Chang, 2005)
Una enzima es una protena modificada, que por
lo general cataliza reacciones qumicas, esta
catlisis enzimtica aumenta la velocidad de
reaccin; adicionalmente la enzima presenta un
factor de especificidad, es decir que una
molcula de la enzima es capaz de catalizar
selectivamente ciertos reactivos llamados
sustratos y discriminar otros.(Chang, 2005)

Principios generales de la catlisis

enzimtica: Una enzima como ya se ha dicho es
una protena que cataliza reacciones biolgicas,
por lo general la misma tiene uno o ms centros
activos, en los cuales la reaccin con el sustrato
tiene lugar.
La reaccin que se lleva a cabo con el sustrato,
se ejemplifica a continuacin:
E + S ES E + P (1)
La esta reaccin, tiene como intermediario al
complejo enzima-sustrato, este paso de
formacin es reversible, lo cual conlleva a que
las constantes de disociacin en la reaccin se
lean de la siguiente manera: K 1 es la constante
de disociacin para el paso en el que ocurre la
formacin del complejo ES , K 1 representa el
paso de disociacin del mismo; as mismo el
paso de la reaccin en donde el producto es
liberado, tiene una constante de disociacin a K 2
(Chang, 2005) .
Ecuaciones de la cintica enzimtica:
En la cintica enzimtica, se mide principalmente
la velocidad inicial de la reaccin, esto con el fin puede ser representada , por la ecuacin de una
de minimizar los efecto causado en la velocidad
de reaccin, por la presencia de reacciones
reversibles y la inhibicin de la enzima por los
productos; adems la velocidad inicial
corresponde a la concentracin fija de sustrato Donde a y b son constantes (Chang, 2005).
que es conocida, (a medida que pasa el tiempo
la concentracin de sustrato se reducir) (Chang, Cintica de Michaelis- Menten:
2005).
Imagen N1:
V 0 Vs [S] Chang.(2005).Physical Chemistry for the
Biosciences.Recuperado
de:http://www.uscibooks.com/changten.pdf
La imagen N1 muestra la variacin inicial de la
velocidad ( V 0 ) de una reaccin catalizada por la
enzima con la concentracin de sustrato (Chang,
2005) .
De esta grfica se observa que la velocidad
aumenta rpidamente y de manera lineal con bajas
concentraciones de sustrato, y que gradualmente
se estabiliza hacia un valor lmite a altas
concentraciones del sustrato ( V max ), en este
punto todas las molculas de enzima se unen a las
molculas del sustrato y la velocidad inicial
depender principalmente de la concentracin de
este (Chang, 2005).
Por otra parte el anlisis matemtico arroja los
resultados de que, la relacin entre V O y [S]
hiprbola rectangular:
V 0 = b a+[s[]s] (2)
Michaelis-Menten en trminos generales propuso
que la velocidad de una reaccin catalizada por
cierta enzima est dada por la siguiente relacin
(Chang, 2005).
 V 0 = Vkmmax[s]
+[s] (3)
En condiciones de estado estacionario.
K m es la constante de Michaelis- Menten, que es
igual a:
k +k
K m = 1k 2 (4)
1
Adems se conoce que cuando la velocidad inicial
es igual a la mitad de la velocidad mxima se
obtiene que:
K m = [S]

Imagen N3: Chang.(2005).Physical Chemistry

for the Biosciences.Recuperado
de:http://www.uscibooks.com/changten.pdf

A Partir de la grfica anterior, los parmetros km y

Imagen N2: Determinacin grfica del V max y el Vmax pueden ser calculados mediante la
K m Chang.(2005).Physical Chemistry for the pendiente y el intercepto de la recta con el eje y
Biosciences.Recuperado .(Chang, 2005)
de:http://www.uscibooks.com/changten.pdf
Significado de Km y Vmax:
Los parmetros Km y Vmax pueden ser
determinados de manera grfica, sin embargo Km: Es la concentracin de sustrato a la cual la
este mtodo muchas veces no es prctico, ya que mitad de los sitios activos de la enzima estn
localizar la asntota, que permite calcular el valor ocupados por molculas de sustrato; el valor de la
de Vmax a concentracin altas de sustrato, es a constante Km depende de la temperatura, la
menudo difcil (Chang, 2005). naturaleza del sustrato, el pH, por lo tanto su valor
Por esta razn el enfoque propuesto por los sirve para la caracterizacin un sistema
qumicos estadounidenses H. Lineweaver (1907 enzima-sustrato particular, bajo condiciones
) and Dean Burk (19041988) , es mucho ms especficas.(Chang, 2005)
prctico, ya que este mtodo propone emplear Entonces se debe tener en cuenta que cuando el
1/vo y 1/ [s] , como variables, realizando este Km presenta una variacin (manteniendo el
cambio se obtiene la siguiente ecuacin para la mismo sustrato y enzima), indica a menudo la
velocidad inicial: presencia de un inhibidor o activador, o cambios
en los factores que afectan la velocidad de
1 km
= V max 1 reaccin.(Chang, 2005).
vo [s] + vmax (5)
si la expresin anterior es graficada con varios
s la velocidad mxima alcanzable;
Vmax: E
valores de velocidad inicial y concentracin se
obtiene:
es decir, que es la velocidad a la que la
concentracin total de enzima est presente
como el complejo enzima-sustrato.(Chang,
2005)
En este practica de laboratorio se us como
enzima la fosfatasa cida (EC 3.1.3.2); la misma
es un tipo de enzima que se utiliza, para
provocar la liberacin de grupos fosfatos, los
cuales estn adheridos a otras molculas. Esta
enzima es almacenada en los lisosomas y
funciona cuando estos se unen a los
endosomas, los cules tienen un pH cido; por
esto mismo la actividad ptima de la enzima se
obtendr en pHs cidos (Daz,1997).
La cuantificacin de fosfato liberado ( para la
determinacin de la actividad de la fosfatasa) se
realiza mediante el mtodo de Fiske-Subbarow Tabla N1: volmenes usados en la preparacin
(mtodo colorimtrico), adems de calcular la para la curva de calibracin.
actividad enzimtica de la fosfatasa cida, esta
Los tubos fueron agitados y luego se dejaron en
prctica de laboratorio tiene como fin reconocer
los factores que afectan el clculo de los reposo por 3 min. A cada tubo se le adiciono 0,5 ml
parmetros cinticos para dicha reaccin (km y de la solucin de cido ascrbico y se debi agitar
vmax). nuevamente las soluciones, despus de esto las
soluciones se dejaron en reposo durante 10 min,
3. Materiales y metodologa: para que el color se desarrollara, por ltimo se
procedi a medir la absorbancia de cada muestra a
Para determinar la actividad enzimtica es 660 nm.
necesario obtener un extracto crudo de la Para la determinacin de la cantidad de fsforo
misma; por esto la extraccin de la fosfatasa producido por la accin de la fosfatasa cida se
cida se realiz de la siguiente manera: llev a cabo el siguiente procedimiento:
Se pesaron 10 g del germen de trigo y se Nota N 1: En todos los casos la mezcla de
adicionaron 50 ml de agua fra. Luego se agit reaccin se prepar como se indica a continuacin,
hasta conseguir una suspensin,la cual se dej agregando los reactivos en el orden a continuacin:
reposar por 30 min, para despus decantar por
15 min y filtrar a travs de un algodn Esta
solucin se debe Mantener en hielo.
Para la cuantificacin del fsforo liberado se
debi preparar, una curva de calibracin con
fsforo inorgnico de la siguiente manera.
Se prepararon las siguientes disoluciones a
Tabla N2: volmenes usados para la
partir de la siguiente tabla.
determinacin de fsforo.
Las mezclas se agitaron y se dejaron en reposo por determinacin de la cantidad de fsforo
3 minutos, despues de transcurrido este tiempo se producido. En la determinacin del pH ptimo se
adicionaron 0.5 ml de cido ascrbico.Se Agito emplearon los siguientes reactivos:
bien,y a continuacion se dejo en reposo por 10 Sustrato: Solucin de -glicerofosfato de sodio
minutos, por ultimo se lecho la absorbancia a 0.1 M
660nm. Buffer: Soluciones de buffer de citrato 0.1 M,
Con los valores obtenido de absorbancia, en esta diferentes pHs
medicin, se determina la cantidad de fsforo, Enzima: Extracto enzimtico crudo
interpolando en la curva de calibracin. Adicionalmente el tiempo de reaccin fue de 10
minutos.
En esta prctica de laboratorio era necesario
determinar el tiempo de reaccin conveniente
para obtener una cantidad de fsforo tal que, por
colorimetra se obtengan valores de %T entre 20 y
80 y adicionalmente correspondan a la parte recta
de la curva de progreso de la reaccin.
Para esta determinacin se prepararon las
siguientes mezclas de reaccin:

tubo buffer de -glicer AGU Mezcle Extra Tabla 4: Volmenes de reactivos utilizados en
citrato o A bien cto prueba de pH ptimo.
0,1 M de fosfato (mL) los enzi
pH 5,3 Las soluciones se mezclaron bien y luego de eso
de tubos y mtic
(mL).
sodio agregu o
se agreg la enzima en intervalos de 30
(ml) e (ml) segundos, es decir, pasados los 30 segundos de
agregar la enzima al primer tubo, se le agreg al
BB 5,6 - 2,4 - segundo y as hasta que los tubos fueron
completados de la siguiente forma:
BS 5,6 1,6 0,8 -

BE 5,6 - 1,6 0,8

TR 5,6 1,6 - 0,8 Se mezcl el contenido de cada tubo y se dej

Tabla 3: Volmenes de reactivos para prueba de
tiempo ptimo
Se agito e incubar a temperatura ambiente; el
blanco de buffer (BB) y el blanco de sustrato (BS)
se dejaron reaccionar 30 minutos. Pasado este
tiempo se tomaron alcuotas de 1 ml y estas se
reciben sobre cido tricloroactico al 10%.
Despues se tomar muestras de 1 ml de BE y TR a
los 2, 5, 10, 15, 20 y 30 minutos. Dichas alcuotas
se recibieron en tubos que contenan 1 ml de cido
tricloroactico al 10%. Seguido se agit y
centrifug a 2500 rpm durante 5 minutos.Por ltimo
se determin en el sobrenadante la cantidad de
fsforo producido, ajustando el 100% de T con el
tubo BB y siguiendo el procedimiento para la
incubando a temperatura ambiente durante 10
minutos.
Es importante que los 10 minutos se le cuenten a
cada tubo, pasado este tiempo, se le agregaron 2
ml de ATA 10% a cada tubo, para despus
mezclar y centrifugar a 2500 rpm durante 5
minutos.
El precipitado fue descartado y en el
sobrenadante de todos los tubos se determina la
concentracin de fsforo inorgnico, por medio
del procedimiento para la determinacin de la
cantidad de fsforo producido.
En esta prctica de laboratorio tambin se analiz el Se mezcl bien y se agreg la enzima, a
efecto de la temperatura sobre la velocidad de intervalos de 30 segundos:
reaccin, con esto se determin la temperatura
ptima:
En la determinacin de la temperatura ptima se
utiliz: Se agit y dej en incubacin durante 10
Buffer: Solucin de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3 minutos exactamente. Despus se adicionaron
Sustrato: Solucin de b-glicerofosfato de sodio 0.1
a todos los tubos 2 ml de ATA al 10% y se
M
Enzima: Extracto enzimtico crudo centrifug a 2500 rpm durante 5 minutos.
Adems se tiene un tiempo de reaccin de 10 El precipitado que se obtuvo se descart y en
minutos, y adicionalmente la incubacin se realizar el sobrenadante de todos los tubos se
a diferentes temperaturas como se muestra a determina la concentracin de fsforo
continuacin: inorgnico.
El efecto de la concentracin de la enzima
Temperatura, C Medio en la velocidad de reaccin se midi de la
siguiente manera:
0 Agua Hielo Se utiliz lo siguiente:
Buffer: Solucin de buffer de citrato, 0.1 M, pH
18 Temperatura 5.3
ambiente Sustrato: Solucin de b-glicerofosfato de
sodio 0.1 M
37 Termostato
Enzima: Extracto: enzimtico crudo
60 Termostato Tiempo de reaccin: 1 0 minutos
Temperatura: temperatura ambiente
98 Agua en ebullicin
Tabla 5: Temperaturas utilizadas en determinacin
de temperatura ptima.

Tabla 7: Volmenes de reactivos utilizados en

la determinacin del efecto de la concentracin
de la enzima.
Se mezcl bien y enseguida se agreg la
enzima, a intervalos de 30 segundos.
Tabla 6: Volmenes de reactivos utilizados en
prueba de temperatura ptima

Se agit y se dej en incubacin durante 10
minutos exactamente. al final se adiciono a
todos los tubos 2 ml de ATA al 10 % y se
centrifug a 2500 rpm durante 5 minutos.
El precipitado se descart y en el sobrenadante
de todos los tubos se determina la
concentracin de fsforo inorgnico.
Para determinar el efecto de la concentracin
de sustrato, se us lo siguiente:
Buffer: Solucin de buffer de citrato, 0.1 M, pH
5.3
Sustrato: Solucin de b-glicerofosfato de sodio
de diversas concentraciones en el rango 5
100 mM.
Enzima: Extracto enzimtico crudo
Tiempo de reaccin: 10 minutos
Temperatura: temperatura ambiente.
Tabla 8: Volmenes de reactivos para la
determinacin del efecto de la concentracin del
sustrato en la velocidad de reaccin.
Se mezcl bien y enseguida se agreg la
enzima, a intervalos de 30 segundos, hasta que
se complet el siguiente volumen:
Se agit y se dej en incubacin durante 10
minutos exactamente. Al final se adicionaron a
todos los tubos 2 ml de ATA al 10% y se centrifug
a 2500 rpm durante 5 minutos.
El precipitado se descart y en el sobrenadante de
todos los tubos se le determin la concentracin
de fsforo inorgnico.
El efecto que tuvo la presencia de un inhibidor
en la velocidad de reaccin fue cuantificado de la
siguiente forma:
Se usaron los siguientes reactivos:
Buffer: S olucin de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3
Sustrato: S olucin de b
glicerofosfato de sodio
de diversas concentraciones en el rango 5100
mM.
Enzima: Extracto enzimtico crudo
El tiempo de reaccin fue de 10 minutos, la
cuantificacin se realiz temperatura ambiente y 5
mg/ml de HgCl2 fueron usados como agente
inhibidor.
Tabla 9: Volmenes de reactivos para la
determinacin del efecto de la concentracin del
sustrato con inhibidor en la velocidad de reaccin.
Se mezcl bien y se agreg la enzima, a
intervalos de 30 segundos, se agreg a los
tubos los siguientes microlitros de enzima:

Se agit y se dej en incubacin durante 10

minutos exactamente. Al se adicionaron a todos
los tubos 2 ml de ATA al 10% y se centrifug a
2500 rpm durante 5 minutos.
El precipitado se descart y en el sobrenadante Grfica N1 : Absorbancia Vs concentracin, curva
de todos los tubos se determin la de calibracin de fsforo inorgnico.
concentracin de fsforo inorgnico.
4. Resultados y anlisis de resultado: Nota N2: Con esta curva de calibracin podremos
A. Curva de calibracin : calcular la concentracin de fsforo liberado por
Las resultados de absorbancia obtenidos para la accin de fosfatasa cida.
curva de calibracin son presentados a
B. Efecto del pH, Determinacin del pH ptimo:
continuacin:
En la determinacin del pH ptimo para la reaccin
Tubo Absorbancia Concentraci enzimtica se obtienen los siguientes resultados de
(nm) n (mg/mL) absorbancia, concentracin y velocidad:
1 0,086 0,0008
Tub Absorbanci Concentrac V0 (mg/mL* pH
2 0,203 0,0016 o a (nm). in min)
(N) (mg/mL)
3 0,336 0,0024
BS 0,022 0,0001876 1,87628 E-05 5,3
4 0,394 0,0032
BE 0,284 0,0022445 0,000224447 5,3
5 0,5 0,004
1 0,003 3,8468 E-05 3,84676 E-06 3
Tabla N10: Resultados de absorbancia y
2 0,062 0,0005017 5,01649 E-05 4
concentracin obtenidos para la curva de
calibracin . 3 0,042 0,0003446 3,44638 E-05 5

Nota N1: Se debe tener en cuenta que la 4 0,029 0,0002426 2,42581 E-05 5,4
concentracin final de fsforo es calculada con
5 0,144 0,0011454 0,000114539 5,6
la relacin C 1V 1 = C 2V 2 (6)
A continuacin se ejemplifica este clculo: 6 0,054 0,0004388 4,38844 E-05 6

C 1 = 0, 04 mg/mL Tabla N11: Resultados de concentracin,

V 1 = 0, 1 mL segn tabla N 1
V 2 = 5 mL segn suma tabla
C 1V 1/V 2 = C 2
C 2 = 0,04*5 0,1 = 8, 0 x 104
Teniendo estos datos se procede a graficar la
curva patrn:
absorbancia y velocidad para la determinacin del
pH ptimo
Nota N3: La concentracin es calculada con la
curva patrn, de la siguiente manera:

Y = 127, 38 x 0, 0019 (7) fosfatasa acta en medio cido pH= 5 a 5,6. (Lasa,
Y = absorbancia. 2011).
x = concentracin Teniendo en cuenta este reporte se analiza, que la
127, 38 = coeficiente de extincin molar mxima actividad enzimtica tendr que estar
Despejamos la concentracin, es decir la x y se presente en un rango de pH (5 a 5,6) ,por tanto el
obtiene la siguiente expresin: valor de pH ptimo determinado en el laboratorio
(5,6) es razonable.
x = Y 127,38
+ 0,0315
(8)
C. Efecto de la temperatura, Determinacin
Con esta expresin se calcularon todas las de la temperatura ptima:
concentracin reportadas en la tabla N11.
En cuanto al clculo de la velocidad inicial se
realiz de la siguiente manera:
[p]
VO= tiempo
Por ejemplo se calcula la velocidad inicial para la
primera concentracin de fsforo inorgnico
liberado reportada en la tabla N11 (tubo 1) y se
obtiene:
3,8468 x 105
VO= 10 = 3, 8468 x 106
Adicionalmente el pH fue medido en cada celda
con un potencimetro y los resultados son los
reportados en la tabla N11.

Para la determinacin del pH ptimo, se deben

graficar los datos de V 0 vs el pH Tabla N12: Datos de concentracin (fsforo
inorgnico), absorbancia y velocidad de reaccin.
Para la determinacin de la temperatura ptima de
debe realizar un grfico, de Actividad enzimtica Vs
temperatura; la temperatura ptima para la reaccin
enzimtica se deber reflejar en un aumento de la
actividad enzimtica.
Por otra parte se tiene que tener en cuenta que , la
actividad enzimtica est relacionada directamente
con la temperatura, un aumento de la misma puede
provocar un aumento en la actividad enzimtica ,
pero no se debe olvidar que las enzimas son
Grfica N2 : V 0 vs el pH , para determinacin del protenas y sufren procesos de desnaturalizacin,
pH ptimo. los cuales a menudo son provocados por un
Se observa la grfica y se encuentra que el pH al aumento en la temperatura, por lo tanto si la
cual se presenta una mayor actividad enzimtica temperatura del sistema sobrepasa por mucho a la
es de 5,6 , tericamente se conoce que la temperatura ptima, la enzima sufrir procesos de
fosfatasa cida es una enzima que es desnaturalizacin, lo cual disminuir la actividad
almacenada en los lisosomas y funciona cuando enzimtica.
estos se unen a los endosomas, los cules tienen
un pH cido; por esto mismo la actividad ptima
de la enzima se obtendr en pHs cidos
(Daz,1997).
Adicionalmente en la literatura se reporta que la
Al graficar los valores de velocidad inicial y
temperatura reportados en la tabla N12 se obtiene lo
siguiente:
Grfica N3: V 0 V s T , para la determinacin de la
temperatura ptima.
Segn el grfico N 3 se ve un aumento en la
actividad enzimtica a la temperatura de 37 C ,
segn los reportes literarios la temperatura de
reaccin de la fosfatasa cida es de 25, 30 0 37 C
(Wiener, 2000) , como ya se ha descrito
anteriormente la velocidad de reaccin se relaciona
directamente con la temperatura, a mayor
temperatura mayor velocidad de reaccin, por lo tanto
teniendo la naturaleza proteica de la enzima, se
puede analizar que la temperatura ptima para la
fosfatasa cida es de 37C, tal y como se reporta en
la literatura y como se determin en la prctica de
laboratorio.
D. Efecto de la concentracin de la enzima en la
velocidad de reaccin:
En presencia de un exceso de sustrato, la velocidad
de una reaccin enzimtica vara directamente
proporcional a la concentracin de la enzima, por lo
tanto a mayor concentracin de enzima, mayor
velocidad.( Granados, 2009)
La velocidad inicial fue graficada vs el volumen del
extracto enzimtico, se obtiene la siguiente grfica:
Grfica N4: V 0 V s volumen del extracto enzimtico
Para la determinacin del efecto, de la
concentracin enzimtica en la velocidad de
reaccin.
Se observa en el grfico N 4 que la velocidad de
reaccin aumenta cuando se adiciona una
cantidad mayor de enzima, es decir la velocidad
de reaccin est dada por la concentracin de la
enzima , se infiere entonces que el sustrato se
encontraba en exceso.
La mayor actividad enzimtica se presenta cuando
se agrega un volumen de 0,4 mL de enzima a la
solucin.
E. Efecto de la concentracin de sustrato,
determinacin de la constante de Michaelis
(Km).
Se conoce que si se tiene una cantidad fija de la
enzima, la velocidad de reaccin aumenta
proporcional a la concentracin de sustrato, la
velocidad mxima de reaccin ser alcanzada
cuando la enzima se encuentre saturada por el
sustrato.
Tabla N13: Datos de concentracin,
absorbancia y velocidad de reaccin, efecto de la
concentracin del sustrato.
Se procede a graficar la velocidad inicial versus la
concentracin de sustrato, y se obtiene la grfica
N5, presentada a continuacin:
 F. Efecto de la presencia de un inhibido en la
velocidad de reaccin:
Para la determinacin del efecto inhibidor del
HgCl2, se llev a cabo una interpolacin de los
datos obtenidos para la absorbancia, estos
resultados, son reportados a conen la tabla N14:

Grfica N5: V 0 V s concentracin de sustrato (mM)

Se obtiene una lnea recta, sin descensos o cadas,
de los cual se puede analizar que la enzima aun no
haba alcanzado estado de saturacin, con la
cantidad de sustrato agregado a la solucin.
De igual manera se realiza la linealizacin de los
datos experimentales , es decir ( 1/ vo y 1/s) , estos
datos son graficados a continuacin con el propsito
de calcular el valor de Km:

Tabla N 14: Datos obtenidos para la

concentracin, velocidad inicial , absorbancia y
absorbancia interpolada.
Con estos datos se procede a graficar la velocidad
inicial vs la concentracin de sustrato.

Grfica N6 : Linealizacin de datos, tabla N 13 , (

concentracin y velocidad)
El clculo de Km se realiza de la siguiente manera:
1. Se calcula la Vmax a travs de la pendiente
de la recta:
2. Teniendo el valor de la Vmax se calcula Km Grfica N7: Efecto de la presencia de la
mediante el valor de la pendiente de la recta. concentracin del inhibidor en la velocidad de la
Nota N4: El procedimiento descrito anteriormente reaccin.
no puede llevarse a cabo, ya que dara un valor de
velocidad negativo, por lo cual se requiere de una
interpolacin.
Los datos anteriores son linealizados, los resultados
se presentan a continuacin:
G. Determinacin del tiempo ptimo de
incubacin:
Los extractos crudos de la enzima pueden perder
su actividad enzimtica durante el tiempo de
almacenamiento, por esto mismo en la prctica de
laboratorio se llev a cabo la determinacin del
tiempo ptimo de incubacin para la fosfatasa
cida .
Las absorbancias obtenidas para el Blanco de la
enzima y el tiempo real se presentan a
continuacin:

Tiempo BE TR
(min)

2 0,226 0,298

Tabla N 15: Datos obtenidos al realizar la 5 0,223 0,322

linealizacin de la velocidad con respecto a la
10 0,279 0,509
concentracin del sustrato.
15 0,284 0,574

20 0,364 0,582

30 0,351 0,594

Tabla N16: Datos obtenidos de absorbancia para

el BE Y TR.

Tiempo Absorbancia Concentracin

(min) (nm) (mg/ml)

Grfica N7: Linealizacin de la presencia de la 2 0,072 0,000580154

concentracin del inhibidor de la velocidad de la 5 0,099 0,000792118

reaccin.
10 0,23 0,001820537
De la grfica N7 se obtiene la siguiente ecuacin:
Y = 10 x + 5 x 10 10 , con esta ecuacin se calcula 15 0,29 0,002291569
el Km de la siguiente forma:
20 0,218 0,001726331
1. Se calcula la Vmax a travs de la pendiente
de la recta: 30 0,243 0,001922594
1
a = V max (9) Tabla N17: absorbancia real en el tiempo y
V max = 1 concentracin de fsforo liberado.
a
V Max = 2, 0 x 109 M/min
Nota N 5: l a absorbancia real =
2. Teniendo el valor de la Vmax se calcula Km Absorbancia de BE Absorbancia de T R
mediante el valor de la pendiente de la recta.
b = VKm
max (11) Para determinar el tiempo ptimo de reaccin se
10 = Km procede a graficar la concentracin a travs del
2,0 x 109
9 tiempo de reaccin,
10(2, 0 x 10 ) = K m
K m = 2, 0 x 1010mg/ml
Grfica N8: Determinacin del tiempo ptimo de
incubacin, Concentracin del fosfato liberado vs
tiempo (min).
De la grfica N8 se analiza que en un tiempo de 15
minutos se obtiene una liberacin de fosfato mayor,
por tanto este ser el tiempo ptimo de reaccin.
5. Cuestionario 3. Cmo se define la unidad de actividad?
1. Mediante qu cdigo se identifica la fosfatasa Se define como la cantidad de enzima que en una
cida y qu indica cada nmero? reaccin enzimtica cataliza la conversin de 1
La fosfatasa cida se puede identificar mediante el mol de sustrato por minuto. Se utiliza tambin en
cdigo EC 3.1.3.2, donde el 3 representa su combinacin con otras unidades (U/mg de
capacidad para hidrolizar los fosfomonosteres, protena o U/mL) para sealar, respectivamente,
liberando como producto un alcohol y el fosfato la actividad enzimtica especfica, bajo
inorgnico, el 3.1 acta sobre enlaces de steres, condiciones previamente determinadas .
haciendo que se rompan, el 3.1.3 representan las
hidrolasas de monosteres fosfricos, ya que acta 4. En qu condiciones se logra la mejor
como una enzima capaz de catalizar los enlaces extraccin de la fosfatasa cida de levadura?
O-P y el 3.1.3.2 es el nombre final que se le brinda A partir de 3 mtodos se puede lograr una mejor
(Chem, 2016). extraccin de la fosfatasa cida en la enzima, el
2. Cmo podra purificar la fosfatasa cida del primero consta de un lisado con agitacin
germen de trigo? constante, esto va a generar el rompimiento de la
Hay varios mtodos para la purificacin de una membrana celular de la levadura, aunque esto no
enzima, uno de los ms usados es la separacin es suficiente para que suceda este procedimiento,
cromatogrfica, la cual se basa en la separacin de as que se le agrega un reactivo como el
estas dependiendo de su carga, tamao o afinidad bicarbonato de sodio, ya que este va a permitir
de las diferentes protenas que se encuentran en la que el pH se mantenga alcalino alrededor de 8, el
enzima. Estas se pueden dividir en dos, preparativa proceso mejora si se le agrega algn grupo
o analtica; la diferencia de estas se encuentra aromtico (tolueno), se realiza con 4g de levadura,
presente en el volumen de la muestra y la se le adiciona 1000 mL de agua, 350 mL de
recuperacin de fracciones que permitirn obtener tolueno y 130 g de bicarbonato de sodio y se agita
protenas sobrantes para un posterior uso de estas, por 4 horas con una temperatura constante de 37
esto lo hace la preparativa a diferencia de la C (Suarez & Gascon).
analtica que no lo permite.
Esta cuenta con una columna en su interior que 5. Para la fosfatasa cida de levadura en qu
posee un material slido con las caractersticas condiciones se logra la mxima estabilidad en
qumicas diversas (fase estacionaria), y una soluciones de etanol?
solucin tampn se hace pasar a travs de esta Al agregar Mg2+ a temperaturas menores a 0 C y
(fase mvil). El extracto crudo de la fosfatasa cida valores de pH entre 7- 8.5 (Quirasco & Lpez-
del germen de trigo se aplica en la parte superior de Mungua, 2011).
la columna y poco a poco va entrando en la
columna con la fase mvil. Estas protenas que se 6. Cul es la constante de sedimentacin de la
encuentran en la enzima migrarn a distinta enzima de levadura purificada?
velocidad dependiendo del grado de afinidad que
tenga este por la fase estacionaria, hay distintos
tipos de cromatografa, de intercambio inico,
hidrofbica, de afinidad y de filtracin o exclusin
molecular (Cabello Daz, 2013).
El coeficiente de sedimentacin es la medida del la velocidad de la reaccin que cataliza, en este
tiempo en la cual una partcula tarda en caso, la grfica que se realiz represent la
centrifugarse y se mide en la unidad de svedberg aparicin del producto frente al tiempo.
(Sv o S) que se usa en ultra centrifugacin, la
constante de sedimentacin para la levadura 6.4) En muchos experimentos la concentracin del
purificada es de 1.4 svedberg (Palomares, 2016). sustrato es mayor que la de la enzima, esto es
debido a que el sustrato suele encontrarse en
7. Cules son las caractersticas de estabilidad condiciones de saturacin, por lo que el factor que
trmica de la fosfatasa cida de levadura y las limita la reaccin es la cantidad de enzima que se
caractersticas de inactivacin por agitacin? encuentra presente en la reaccin.
La enzima presenta estabilidad a un temperatura 6.5) Cuando la concentracin del sustrato es muy
alta 50C, esta va a depender del pH en que se elevada, la velocidad de reaccin se aproxima a
encuentre, adems la presencia o ausencia del un lmite superior que se conoce como Vmx, esto
Mg2+ afecta, ya que en ausencia de Mg2+ este es debido a que las concentraciones del sustrato
presenta su mxima actividad o estabilidad en un es proporcional a su velocidad.
pH cercano a 8.0 y en presencia de este, tendr un
pH entre 8.0 y 8.5. La enzima tambin fue 7. Bibliografa
desnaturalizada por agitacin y se observ que Cabello Diaz, J. M. (2013). Identificacin y
empieza con una fuerte disminucin con respecto al caracterizacin de fosfatasas cidas con
tiempo, pero luego disminuye con menor rapidez. actividad 5'-nucleotidasa en ejes de juda.
En este caso tambin se ve como la adicin de Crdoba: Servicio de Publicaciones de la
magnesio contrarresta el efecto desnaturalizante y Universidad de Crdoba.
ms an cuando est a una temperatura de 0C. Carrascal. (s.f.). Introduccin a la qumica de la
Hay que tener presente que a medida en que haya vida. Obtenido de
ms protena la inactivacin por agitacin ser https://campus.usal.es/~histologia/movil-histologia/
menor (Quirasco & Lpez- Mungua, 2011). 1-la%20celula/quimica/enzimas.htm
Chang. (2005). Enzyme Kinetics. Changted.
6. Conclusiones Chem. (08 de 08 de 2016). IUBMB Enzyme
6.1) Se identific los factores experimentales que Nomenclature. Obtenido de
afectan la cintica enzimtica dentro de una http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzym
reaccin, tales como, presencia de un inhibidor, e/EC3/1/3/2.html
temperaturas altas o bajas que logran que la Daz. (1997). Aspectos bsicos de la bioqumica
enzima se desnaturalice a temperaturas muy clnica.
elevadas o pH que no corresponde a la acidez o Granados. (2009). UNAD. Obtenido de
alcalinidad de la enzima. http://datateca.unad.edu.co/contenidos/200
6.2) La curva de calibracin del fsforo inorgnico 002/MODULO%20SISTEMAS%20METAB
permiti encontrar la concentracin del sustrato OLICOS%20NUTRICIONALES/protocolo.h
usado en la prctica (B-glicerofosfato) para cada tml
una de las pruebas que se llev a cabo en el Lasa. (2011). Fosfatasa. Obtenido de
laboratorio y as, poder determinar el pH ptimo de http://www.portalesmedicos.com/diccionari
la reaccin, temperatura ptima y dems. o_medico/index.php/Fosfatasa
6.3) La velocidad de reaccin se define como la Palomares. (08 de 10 de 2016). SIGNIFICADO
cantidad de sustrato consumido o de producto DEL COEFICIENTE DE
formado por unidad de tiempo, para esto, la SEDIMENTACION. Obtenido de
actividad de una enzima se determina conociendo http://preguntasbiotecnologia.blogspot.com
.co/2015/06/significado-del-coeficiente-de. html .
Quirasco, & Lpez- Mungua. (2011). Qumica de
los alimentos.
Suarez, & Gascon. (s.f.). Fosfatasa cida de
levaduras. Oviedo: Departamento
Interfacultativo de Bioqumica.
Wiener. (2000). Fosfatasas Acidas. 3.