El suplemento de ibuprofeno y sus efectos sobre la activacin de NF-kB en el

msculo esqueltico despus del ejercicio de resistencia

Luke Vella1, James F. Markworth2, Jonathan M. Peake3, Rod J. Snow1, David Cameron-Smith2 &
Aaron P. Russell1
1 Centre for Physical Activity and Nutrition, School of Exercise and Nutrition Science, Deakin University, Burwood, Vic., Australia
2 Liggins Institute, University of Auckland, Auckland, New Zealand
3 School of Biomedical Sciences and Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, Brisbane, Qld, Australia

Palabras clave:
Recuperacin del ejercicio, inflamacin, NFkB, tratamiento con AINE, ejercicio de resistencia.

Resumen
El ejercicio de resistencia desencadena una respuesta inflamatoria subclnica que desempea un papel fundamental en
la regeneracin del msculo esqueltico. El factor nuclear-kB (NF-kB) es un factor de transcripcin de sealizacin de
estrs que regula estados agudos y crnicos de inflamacin. La va clsica NF-kB regula la activacin temprana de la
inflamacin post-ejercicio; sin embargo sigue existiendo margen para que este complejo factor de transcripcin
desempee un papel ms detallado en la recuperacin muscular despus del ejercicio. Diecisis voluntarios
completaron un ejercicio de resistencia corporal inferior con la ingestin de tres dosis de 400 mg de ibuprofeno o un
control placebo. Se obtuvieron muestras de biopsia muscular antes del ejercicio ya las 0, 3 y 24 h despus del ejercicio y
se analizaron los marcadores clave de la actividad de NF-kB. La expresin de la protena p65 fosforilada y los genes diana
inflamatorios p65 se elevaron inmediatamente despus del ejercicio independiente de los dos tratamientos. Estos
cambios no se tradujeron en un aumento en la actividad de unin al ADN p65. La expresin de la protena p50 de NF-kB
y la actividad de unin de NF-kB p50 fueron inferiores a las del pre-ejercicio a 0 y 3 h despus del ejercicio, pero se
elevaron a las 24 h despus del ejercicio. Estos hallazgos proporcionan nueva evidencia de que dos vas NF-kB distintas
estn activas en el msculo esqueltico despus del ejercicio de resistencia. La onda inicial de actividad que implica p65
se asemeja a la va clsica y se asocia con el inicio de una respuesta inflamatoria aguda. La segunda ola de actividad de
NF-kB comprende la subunidad p50, que se ha mostrado anteriormente para resolver un programa inflamatorio agudo.
El estudio actual no mostr ningn efecto del tratamiento con ibuprofeno sobre los marcadores de la va NF-kB, sin
embargo el examen de los efectos dentro del grupo del protocolo de ejercicio sugiere que esta va justifica
investigaciones adicionales.
Introduccin
El ejercicio de resistencia no acostumbrado provoca
dao en el msculo esqueltico que afecta la funcin
muscular y promueve sensaciones de dolor. Los
mecanismos de sealizacin precisos que inician la
reparacin muscular despus del dao inducido por el
ejercicio siguen siendo un tema de debate en curso
[previamente revisado por Paulsen et al. (2012)]. El
inicio del dao muscular desencadena una interaccin
compleja de eventos intracelulares que implican
lesiones de miofibras, inflamacin aguda y reparacin
celular. A nivel sintomtico, la inflamacin en el
msculo esqueltico se caracteriza por hinchazn y
dolor (Paulsen et al., 2012). Consecuentemente, la
inflamacin post-ejercicio es a menudo atribuida como
una causa de dolor muscular tardo (DOMS). DOMS
ocurre tpicamente 24-48 h post-ejercicio, y se
acompaa de una reduccin secundaria en la capacidad
de generacin de fuerza muscular. El tratamiento de
DOMS se ha centrado en reducir la inflamacin; Sin
embargo esto puede ser perjudicial para los procesos de
reparacin celular (Urso 2013). La atenuacin de la
inflamacin inducida por el ejercicio utilizando frmacos
antiinflamatorios no esteroideos reduce la sntesis de
protenas del msculo esqueltico (Trappe et al., 2002)
e impide la proliferacin de clulas satelitales
(Mikkelsen et al., 2009). Para desarrollar tratamientos
ms eficaces para DOMS, se requiere una mejor
comprensin de los mecanismos que gobiernan la
inflamacin y la reparacin tisular en el msculo
esqueltico despus del ejercicio.
El factor de transcripcin nuclear factor-kappa B (NF-kB)
acta como un regulador central de las vas de
sealizacin inflamatoria. La familia NF-kB consta de
cinco subunidades, incluyendo NF-kB1 (p105 / p50), NF-
kB2 (p100 / p52), RelA (p65), RelB y cREL que
comparten un dominio de homologa Rel. El dominio Rel
permite la unin al ADN, la localizacin nuclear, la
dimerizacin y la interaccin con su propia protena
inhibidora IjB (Delhalle et al., 2004, Mourkioti y
Rosenthal 2008, Bakkar y Guttridge 2010). Bajo
condiciones basales RelA (p65), cREL y RelB subunidades
permanecen secuestrados dentro del citoplasma unido
a una inhibicin IkB protena. La familia IkB que regula
NF-kB incluye las subunidades IkBb, IkBa, IkBc IkBe y
Bcl-3. A diferencia de las protenas Rel, las subunidades
p50 y p52 se sintetizan como protenas precursoras
grandes (p105 y 100, respectivamente) que requieren
procesamiento proteoltico para permitir la localizacin
nuclear. Estas subunidades carecen de un dominio de
REL, para iniciar la transcripcin de genes, y por lo
tanto, se consideran principalmente como represores
de la transcripcin de genes (Bonizzi y Karin 2004,
Bakkar y Guttridge 2010).
Tras la estimulacin, el complejo IkB quinasa (IKK)
controla la degradacin de IkB y sus protenas
precursoras, permitiendo as que las subunidades REL
de NF-kB controlen la transcripcin gnica. El complejo
IKK consiste en dos quinasas catalticas IKKa e IKKb, y
una subunidad IKKc reguladora. IKKb activa la va de
sealizacin NF-kB clsica a travs de la fosforilacin y
posterior degradacin del inhibidor IkBa (Zandi et al.,
1997). La va clsica comprende tpicamente p65: p50
heterodmeros, y es esencial para la activacin de la
inflamacin aguda mediante el control de la
transcripcin de citocinas inflamatorias y protenas de
fase aguda (Zandi et al., 1997). Ms recientemente se
ha descrito una va alternativa de NF-kB, que depende
de IKKa (Senftleben et al., 2001). La sealizacin
alternativa implica la activacin de una quinasa
inductora NF-kB secundaria (NIK), y se ha relacionado
con la activacin de ambas subunidades p52 y p50. La
importancia funcional de la expresin de genes
dependientes de IKKa en la inflamacin aguda an no
est bien establecida. Sin embargo, la investigacin
preliminar en tejido muscular de rata sugiere que los
homodmeros p50 pueden desempear un papel crucial
en la resolucin de la inflamacin aguda (Bohuslav et
al.1998, Lawrence et al., 2001).
A pesar de la importancia de la inflamacin en la
regeneracin de tejidos despus del ejercicio, se sabe
muy poco acerca de cmo se regula la actividad de NF-
kB en el msculo esqueltico despus del ejercicio
agudo. Se observa un aumento transitorio en varios
componentes de la va de sealizacin clsica de NF-kB
en el msculo de rata despus del ejercicio (Hollander
et al., 2001, Ji et al., 2004, Ho et al., 2005, Kramer y
Goodyear 2007). Por el contrario, en el msculo
humano se observ una disminucin en la unin del
ADN de NF-kB a 0 h post-ejercicio con un retorno a la
base de referencia 1 h despus del ejercicio (Durham et
al., 2004). El trabajo reciente de nuestro laboratorio,
utilizando un modelo de resistencia similar ejercicio,
demostr un aumento en NF-kB vinculante a la regin
promotora de las principales citoquinas inflamatorias a
las 2 h post-ejercicio, con un retorno a los niveles
basales a las 4 h post-ejercicio (Vella Et al., 2012). Estos
hallazgos sugieren que una respuesta transitoria de NF-
kB contribuye a la inflamacin aguda posterior al
ejercicio.
Para mejorar nuestra comprensin de los mecanismos
celulares que regulan tanto el inicio y la resolucin de la
inflamacin post ejercicio, el presente estudio tuvo
como objetivo investigar los cambios en la actividad de
las subunidades que comprenden las vas de
sealizacin clsica y alternativa NF-kB. Hemos
planteado la hiptesis de que la regulacin de NF-kB
post-ejercicio implicara dos ondas distintas de
activacin. Especficamente, la hiptesis de que el
clsico NF-kBpathway, la participacin de p65 y p50
dmeros se activara poco despus del ejercicio durante
las fases tempranas de la inflamacin, mientras que la
va alternativa, que comprende principalmente la
subunidad p50 se activara en posteriores puntos de
tiempo despus del ejercicio que corresponden con la
resolucin de la inflamacin aguda (Bohuslav et al.,
1998, Ishikawa et al., 1998). Tambin se plante la
hiptesis de que la administracin de ibuprofeno rompe
ambas ondas de activacin de de NF-kB,
proporcionando un mecanismo potencial a travs del
cual la medicacin antiinflamatoria podra atenuar la
inflamacin inducida por el ejercicio en el msculo
esqueltico.
Mtodos Participantes
Como se describi anteriormente, diecisis sujetos
sanos varones fueron reclutados para participar en el
estudio (caractersticas mostradas en la Tabla 1]
(Markworth et al., 2013). Todos los participantes
completaron un cuestionario de historia clnica que se
utiliz para identificar y excluir a los participantes con
una condicin diagnosticada o una enfermedad que les
impidi completar el ejercicio extenuante. Los criterios
de exclusin incluyeron la participacin en un programa
de ejercicios de resistencia corporal inferior en los
ltimos 6 meses para asegurar una respuesta de dao
muscular del estmulo del ejercicio y / o tratamiento
crnico con frmacos antiinflamatorios. El uso actual de
medicamentos recetados o suplementos nutricionales
tambin excluy a los sujetos de participar.
 Tabla 1. Caractersticas del sujeto y datos de ensayos de resistencia.

No se observaron diferencias significativas entre los dos grupos.

Aprobacin tica
Procedimientos experimentales
Antes de la participacin, cada sujeto recibi
Los participantes asistieron al laboratorio en estado de
informacin escrita y oral sobre la naturaleza del
ayuno durante toda la noche, habindose abstenido de
experimento antes de proporcionar su consentimiento
cafena, tabaco y alcohol durante las 24 horas
por escrito para participar. Todos los procedimientos
anteriores. Despus de 30 minutos de reposo en
involucrados en este estudio fueron aprobados por el
decbito supino se tom una biopsia muscular previa al
DeakinUniversity Human Research Ethics Committee
ejercicio. Los participantes completaron un
(DUHREC 2010-019). Todos los procedimientos de
calentamiento de 10 minutos consistente en ciclismo de
muestreo muscular se realizaron de acuerdo con la
baja intensidad en un ergmetro de bicicleta y un
declaracin de Helsinki.
conjunto de baja resistencia para cada ejercicio en
aproximadamente 30-50% de los participantes 1RM.
Familiarizacin y pruebas de fuerza
Cada participante complet una sola sesin de
Cada participante complet una sesin de
ejercicios de resistencia intensa. Esta sesin consisti en
familiarizacin al menos 7 das antes de completar el
tres series de 8-10 repeticiones de una mquina
ensayo de ejercicio. Los participantes realizaron pruebas
bilateral de Smith asistida en cuclillas, prensa de pierna
de repeticin mxima para determinar la carga de
de 45 y extensin de pierna. Estos ejercicios se
ejercicio experimental (80% de 1 repeticin mxima
realizaron todos al 80% 1RM. Los ejercicios se realizaron
(1RM)). El peso mximo que cada sujeto poda elevar se
secuencialmente como un circuito, con 1 minuto de
determin para la sentadilla asistida por la mquina de
descanso entre cada ejercicio, y 3 minutos de descanso
Smith, la prensa de pierna y la extensin de la pierna.
entre series. Hemos utilizado previamente este
Estos datos se sustituyeron en la ecuacin validada de
protocolo de ejercicio y demostrado que activa las vas
Brzycki para predecir 1RM para cada participante
de sealizacin inflamatoria (Vella et al., 2012). Despus
(Mayhew et al., 1995, Whisenant et al., 2003). Se
de la finalizacin del ejercicio, los participantes
requiri a los participantes que se abstuvieran de
descansaron en posicin supina mientras que las
cualquier otro ejercicio hasta la finalizacin del ensayo.
muestras de biopsia muscular se recogieron. Los
participantes regresaron al laboratorio a la maana
siguiente en un estado de ayuno durante la noche para
una muestra final de biopsia muscular. Las comidas
estandarizadas se proporcionaron a los participantes la
noche anterior al ensayo (carbohidratos 57%, grasa
22%, protena 21%), en el laboratorio inmediatamente
despus de la sesin de ejercicio (carbohidratos 71%,
grasa 13%, protena 16%), como aperitivos adicionales
Durante todo el da y una comida de noche
(carbohidratos 64%, grasa 27%, protena 18%).
Administracin de AINE
Antes del ejercicio, los participantes fueron asignados
aleatoriamente al grupo de ibuprofeno (NSAID) (n = 8) o
al grupo placebo (PLA) (n = 8). Los participantes en el
grupo de AINE consumieron la dosis mxima
recomendada de 1200 mg de ibuprofeno en tres dosis
de 400 mg durante todo el da del ensayo. La primera
dosis se administr al llegar al laboratorio la primera
maana del ensayo, inmediatamente antes de la
primera muestra de biopsia muscular. A los
participantes se les indic que consumieran dos dosis
adicionales a las 2:00 pm ya las 8:00 pm la misma tarde.
Esta estructura de dosificacin se prescribi para
optimizar los niveles de ibuprofeno circulante a niveles
biolgicamente activos a lo largo del curso del da de
prueba. Este protocolo ha sido previamente validado
por nuestro grupo de investigacin en este mismo
grupo de participantes del estudio y el mismo protocolo
de administracin de AINE (Markworth et al., 2013).
Alternativamente, el placebo era una cpsula de
gelatina que contena azcar en polvo, idntica en
apariencia a la cpsula de ibuprofeno.
Coleccin de muestra
Se obtuvieron muestras de biopsia muscular bajo
anestesia local (Xilocana 1%) a partir del msculo vasto
lateral de cada pierna utilizando la tcnica de biopsia
percutnea con aguja modificada para incluir la succin
(Buford et al., 2009). Las muestras se obtuvieron antes
del ejercicio, inmediatamente despus del ejercicio ya
las 3 y 24 h despus del ejercicio. La muestra de biopsia
muscular obtenida inmediatamente despus del
ejercicio se tom dentro de 1-2 minutos de la
finalizacin del protocolo de ejercicio, y en lo sucesivo
se denominar 0 h despus del ejercicio. Se ha
demostrado que el procedimiento de biopsia muscular
desencadena una respuesta inflamatoria local (Malm et
al., 2000). Para minimizar la interferencia del
procedimiento de biopsia, se tomaron muestras de la
misma pierna antes del ejercicio ya las 24 h post-
ejercicio, mientras que las muestras musculares
obtenidas a 0 y 3 h despus del ejercicio se tomaron de
la pierna opuesta. Se tomaron muestras dentro de la
misma pierna a al menos 5 cm del sitio anterior. Hemos
informado anteriormente que esta tcnica es eficaz
para minimizar la expresin de genes de citocinas y NF-
kB actividad en respuesta a las biopsias musculares
(Vella et al., 2012). El tejido extirpado se sumergi
inmediatamente en nitrgeno lquido y se almacen a
80C hasta un anlisis posterior.
Evaluacin subjetiva de DOMS y rango de
movimiento
La evaluacin subjetiva del dolor muscular (DOMS) y el
rango de movimiento se registraron antes del ejercicio
ya las 24 horas despus del ejercicio. A los sujetos se les
pidi que clasificaran sus niveles de dolor muscular y
rango de movimiento en una escala de 0-10. En ambos
casos 0 fue considerado como el mejor resultado
posible y una calificacin de 10 fue considerada como el
peor resultado.
Extraccin y cuantificacin de protenas
Las muestras de msculo se homogeneizaron en
tampn RIPA helado (Tris-HCl 50 mmol / L, pH 7,4, NaCl
150 mmol / L, cido desoxiclico 0,25%, NP-40 al 1%,
EDTA 1 mmol / L suplementado con proteasa e
inhibidores de fosfatasa incluyendo 1 mmol / L de
PMSF, 1 lg / ml de aprotinina, 1 lg / ml de leupeptina, 1
mmol / L de Na3VO4 y 1 mmol / L de NaF). El
homogeneizado se agit durante 1 h a 4 C y se
centrifug a 13.000 g a 4 C durante 15 min. El
sobrenadante resultante se retir y se almacen a \ sim
80C hasta un anlisis posterior. La concentracin de
protena total se determin usando un kit de ensayo de
protena BCA de acuerdo con las instrucciones del
fabricante (Pierce, Rockford, IL). Se desnaturalizaron
muestras de protenas (50 lg) en tampn de carga y se
separaron mediante SDS-PAGE al 10% y se transfirieron
a una membrana de PVDF. Las membranas se
bloquearon durante 90 minutos a temperatura
ambiente en solucin salina tamponada con BSA / Tris
al 5% con Tween 20 al 0,1% (TBST). Los anticuerpos
primarios [fosforilados NF-kB p65 Ser536, total NF-kB
p65, NF-kB p100 / p52, se diluyeron a 1: 1000 en BSA /
TBST al 5%, se aplicaron y se incubaron durante la
noche a 4 C con una solucin de B-actina de NF-kB
p105 / p50, NF-kB y b-actina (todos obtenidos de Cell
Signalling Technologies, Arundel, QLD) Agitacin suave.
Las membranas se lavaron durante 30 min en TBST y se
probaron con anticuerpos secundarios conjugados con
HRP diluidos a 1: 2000 en BSA al 5% / TBST, y se
incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Las
protenas se visualizaron mediante el uso de Western
Lighting quimioluminiscencia mejorada (Perkin Elmer
Lifesciences, Boston, MA). Las seales se capturaron
utilizando una Kodak Digital Image Station 2000M
(modelo: 440CF, Eastman Kodak, Rochester, NY) y se
cuantificaron por anlisis de banda de densitometra
usando el software de imgenes moleculares Kodak
(Versin 4.0.5, 1994-2005, Eastman Kodak). La
protena NF-kB p65 fosforilada se normaliz a la
protena p65 total (Figura 2A). NF-kB p50 expresin de
la protena se normaliz a su protena precursora p105
(Figura 2B]. NFBB p52 y cREL protena se normaliz a b-
actina (Fig. 2C].
Extraccin de ARN y RT-PCR
El ARN celular total se extrajo como se ha descrito
previamente (Trenerry et al., 2007) usando el ToTALLY
RNA Kit (Ambion, Austin, TX). La calidad del ARN y la
concentracin se determinaron utilizando el Agilent
2100 Biolanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA).
El ADNc de la primera cadena se gener a partir de 0,5
lg de ARN total usando el kit RT de AMV (Promega,
Madison, WI). RT-PCR se realiz por duplicado
utilizando el sistema Biorad CFX384 (Biorad, Hercules,
CA), que contena 5XHOT FirePol EvaGreen Mix (Ciencia
Integrada, Sydney, NSW), cebador directo, cebador
inverso, agua libre de nucleasa estril y cDNA (0,125 ng
/ LL). Los datos se analizaron usando un mtodo de
umbral crtico comparativo (Ct), donde la cantidad del
gen diana especificado normalizado a la cantidad de
control endgeno, en relacin con el valor de control, se
da por 2 \ rightarrow DDCt. El control endgeno
utilizado en este experimento fue GAPDH. La eficacia de
GAPDH como control endgeno se examin utilizando la
ecuacin 2 \ Delta DCt. Los cebadores se disearon
utilizando el paquete de software Primer Express
versin 3.0 (Applied Biosystems, Mulgrave, Vic.,
Australia). Las secuencias gnicas se obtuvieron a partir
de GenBank (Tabla 2). La especificidad de la secuencia
del cebador se confirm utilizando BLAST. Se gener
una curva de disociacin del punto de fusin por el
instrumento de PCR para todos los productos de PCR
para confirmar la presencia de un nico producto
amplificado.
Ensayo de extraccin nuclear y factor de
transcripcin (TF)
Las protenas nucleares y citoplsmicas se extrajeron a
partir de 20 mg de tejido muscular utilizando un
reactivo de extraccin nuclear y citoplasmtica NE-PER
(Pierce, Rockford, IL), de acuerdo con las instrucciones
del fabricante. Se realiz un anlisis de transferencia de
Western sondado para GAPDH, a-tubulina y Lamina A
para asegurar que el extracto nuclear no estaba
contaminado por protenas citoplsmicas. Un ensayo de
factor de transcripcin que detecta la actividad de
unin del factor de transcripcin especfica del ADN se
realiz de acuerdo con las instrucciones del fabricante
(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). En resumen, se
cargaron 10 g de protena nuclear en un pocillo que
contena una secuencia de consenso NF-jB inmovilizada
(50GGGACTTTCC-30) y se incubaron durante la noche a
4C. Los anticuerpos primarios para las subunidades de
NF-kB p65 y p50 se cargaron en cada pocillo y se
incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Cada
pocillo se enjuag usando un tampn de lavado diluido
durante 30 min. Despus de un lavado secundario de 30
minutos, las muestras se incubaron con anticuerpo
conjugado HRP secundario durante 1 hora ms a
temperatura ambiente. Para cuantificar la unin del
factor de transcripcin, se aadi a cada pocillo una
solucin en desarrollo que contena una solucin de
3,30,5,50-tetrametilbencidina (TMB) y se incub
durante 45 min a temperatura ambiente. A
continuacin se cuantific la unin al ADN usando
fotospectometra con mediciones de absorbancia
tomadas a 450 nm usando un lector de placas Multiscan
RC (Labsystems, Finlandia) y el Software de Anlisis de
Datos Gen5 (BioTek, Winooski, VT).
Estadstica
Los datos se expresan como medios SEM. Antes del
anlisis, los datos que mostraban una falta de
normalidad se transformaron en registros para
estabilizar la varianza. Los datos se analizaron utilizando
un ANOVA bidireccional con medidas repetidas de
tiempo. Se comprob el ajuste de la esfericidad y, si se
requiri, se aplic una Epsilon de Greenhouse-Geisser a
los grados de libertad residuales. Se consider que un
punto de datos era un valor atpico estadstico en el que
una puntuacin z exceda un umbral predeterminado de
\ 4.00. En los casos en que se examin, se realizaron
comparaciones en pares entre puntos de tiempo
individuales utilizando las diferencias menos
significativas de las medias a P <0,05 para determinar
cambios estadsticamente significativos (Mead 1988,
Saville 1990). Los anlisis estadsticos se realizaron
usando GenStat para Windows 16 Edicin (VSN
International, Hemel Hempstead, UK).
Resultados
Los anlisis subjetivos DOMS mostraron un efecto
principal para el tiempo (efecto de tiempo P <0,01) sin
efecto para el tratamiento. El puntaje promedio de
DOMS despus del ejercicio fue de 4,81 0,5 y el puntaje
de ROM despus del ejercicio fue de 3,3 0,5. Estos datos
demuestran que el protocolo de ejercicio indujo un
nivel moderado de dolor muscular y este efecto fue
independiente del tratamiento con ibuprofeno. La
expresin de p65 NF-kB fosforilada (Ser 536) aument
con el tiempo (efecto de tiempo P = 0,006), pero esta
respuesta no fue en general diferente entre los grupos
(efecto de interaccin P = 0,253, efecto de tratamiento
P = 0,176). Sin embargo, comparaciones LSD pairwise
indic que el aumento principal de la lnea de base fue
en el grupo placebo a las 0 h post-ejercicio. Dentro del
grupo placebo, la expresin de la protena p65
fosforilada permaneci elevada a las 3 h despus del
ejercicio y regres a la lnea de base en 24 h (Figura 1A).
No se observaron cambios significativos en el grupo de
ibuprofeno por comparaciones de LSD. No hubo efecto
de tiempo ni de tratamiento para la p65 total de NF-kB
(figura 2A). Hubo una tendencia hacia una interaccin
significativa del tiempo 9 (P = 0.057) para la expresin
proteica de la subunidad p50, aunque no se alcanz un
efecto principal en el tiempo (P = 0.376) o en el
tratamiento (P = 0.865). Nuestro anlisis revel una
estadstica atpica en el grupo de ibuprofeno en el
punto 24 horas. Cuando este sujeto fue retirado del
anlisis, esta tendencia fue ms dbil (P = 0.115) (Figura
1B). LSD comparaciones indicaron un aumento en la
expresin de la protena p50 se observ a las 24 h post
ejercicio en el grupo placebo slo (Figura 1B]. No hubo
efectos principales o de interaccin para la protena
precursora p50 de NF-jB p105 (figura 2B) ni para las
subunidades p52 y cREL (Fig. 1C y D). Para determinar la
unin de ADN especfica de la subunidad de NF-kB
Despus del ejercicio, se realizaron ensayos de unin
del factor de transcripcin para las subunidades p50 y
p65. La NF-kB p50 mostr un efecto principal para el
tiempo (P = 0,035), sin tiempo de interaccin del
tratamiento (P = 0,851) o efecto principal para el
tratamiento (P = 0,488) (Figura 3B). Las comparaciones
de LSD identificaron un aumento significativo en la
unin de p50 que se produjo a las 24 h post-ejercicio
cuando se compar con 0 y 3 h despus del ejercicio
dentro del grupo de placebo. Esto coincidi con el
aumento de la expresin de la protena p50 (Figura 1B].
No se observ ningn cambio en la unin del ADN p65,
a pesar de un aumento en la expresin de la protena
p65 fosforilada (Figura 3B). Se busc determinar si un
aumento en la sealizacin de NF-kB coincidi con un
aumento en las citoquinas inflamatorias aguas abajo, y
si la administracin de ibuprofeno influy en la
expresin de citoquinas despus del ejercicio. Los
niveles de ARNm de IL-6 (Figura 4A), IL-8 (Figura 4B) y
MCP-1 (Figura 4C) demostraron un efecto principal para
el tiempo (P <0,01), con la mayor elevacin de los
niveles de expresin en 3 h post-ejercicio despus de
aumentos significativos a las 0 h post-ejercicio. TNF-a
mRNA permaneci sin cambios despus del ejercicio
(Fig. 4D). COX-2 mRNA mostr un efecto principal para
el tiempo (P <0,01), aumentando a 0, 3 y 24 h post-
ejercicio (Fig. 4E). No hubo efectos de interaccin
significativos ni efectos principales en el tratamiento de
las citocinas inflamatorias o la expresin de mRNA de
COX-2. Consistentemente, las comparaciones LSD
pairwise revel cambios similares en el tiempo desde la
lnea de base en ambos grupos.
Discusin
El presente estudio tuvo como objetivo explorar la
regulacin de las diferentes subunidades de NF-kB
despus de una sola sesin de ejercicio de resistencia
corporal inferior e investigar el mecanismo a travs del
cual el tratamiento con ibuprofeno puede influir en la
inflamacin posterior al ejercicio.

Figura 1. Expresin de protenas de las subunidades NF-jB p65, p50, p52 y cREL.
Las transferencias Western representativas para p-p65 normalizaron a p65 total (A), p50 normalizaron a p105 (B), p52 normalizaron a
b-actina (C) y cREL normalizaron a b-actina (D) medidas en muestras de biopsia muscular. Los datos son unidades medias arbitrarias
SEM. * Denota significancia estadstica de los valores previos al ejercicio en el grupo placebo; ^ Significa significancia estadstica a
partir de las 24 h post-ejercicio en el grupo control (P <0,05). Barras blancas = grupo placebo; Barras negras = grupo ibuprofeno .

Los resultados de este estudio muestran por primera que comprende principalmente subunidades p50 se
vez que una va alternativa de sealizacin de NF-kB activa 24 h despus del ejercicio. Esta va aparece
claramente diferente de la activacin de NF-kB p65
subunidad que se produce durante las primeras etapas
de la inflamacin post-ejercicio agudo. La expresin de
la protena NF-jB p65 fosforilada fue significativamente
elevada en el grupo placebo cuando se midi a las 0 y 3
h despus del ejercicio y volvi a los niveles basales a las
24 h despus del ejercicio. Estos hallazgos apoyan los de
investigaciones previas que muestran un aumento post-
ejercicio en componentes claves de la va de
sealizacin clsica NF-kB en el msculo esqueltico,
incluyendo la protena p65 fosforilada NF-kB (Ji et al.,
2004, Vella et al., 2012), fosforilada IkBa (Ho et al.,
2005, Vella et al., 2012) y la actividad de unin al ADN
p65 de NFkB (Tantiwong y otros, Hyldahl et al., 2011).
En el presente estudio, el incremento en la expresin de
la protena p65 de NF-kB fosforilada no se asoci con un
aumento en la actividad de unin del factor de
transcripcin p65 a 0, 3 y 24 h despus del ejercicio. Sin
embargo, los genes de citocinas regulados por NF-kB
incluyendo MCP-1, IL-6 e IL-8 aumentaron a las 3 h
despus del ejercicio. Trabajos anteriores de nuestro
grupo mostraron un aumento en NF-kB p65 vinculante a
la regin promotora de los genes que codifican las
citoquinas inflamatorias a las 2 h despus de la
resistencia tradicional ejercicio (Vella et al., 2012). Esta
investigacin llev a cabo una serie de ensayos de
cambio de movilidad electrofortica que se vea
especficamente NF-jB vinculante a los genes que
codifican MCP-1, IL-6 e IL-8 y por lo tanto las diferencias
en la metodologa puede
Explicar los resultados contradictorios. Adems, la
discrepancia en los resultados entre nuestros dos
ensayos puede explicarse por la corta vida media de NF-
kB en ausencia de un estmulo activador. En una lnea
celular HL60, se ha informado que la vida media de NF-
kB es inferior a 30 min (Hohmann et al., 1991). Del
mismo modo, la protena IkBa inhibitoria tiene una vida
media de 25 min en clulas Jurkat (Dodd et al., 2009).
Por lo tanto, en el presente estudio, NF-jB activacin
puede haber regresado a los niveles de reposo de 3 h
despus del ejercicio. Los modelos de investigacin
utilizando un modelo de ejercicio de resistencia
excntrica extrema fueron capaces de demostrar un
aumento en la unin del ADN p65 a la protena nuclear
a las 3 h despus del ejercicio (Hyldahl et al., 2011, Xin
et al., 2013).
 Figure 2. Protein expression of total NF-jB p65, NF-jB p105 and b-actin. Data are mean arbitrary units _ SEM.
White bars = placebo group;
black bars = ibuprofen group

Figura 3. NF-jB subunidades p65 (A) y p50 (B) vinculante a la protena nuclear. Los datos son unidades
arbitrarias medias? SEM. #denotes significacin estadstica de 0 h post-ejercicio en el grupo de control; $
Denota significacin estadstica de 3 h despus del ejercicio en el grupo de control. Barras blancas = grupo
placebo; Barras negras = grupo ibuprofeno.
Por el contrario, la investigacin de Durham et al.
(2004) mostraron una disminucin en la actividad de
unin a ADN de NF-kB inmediatamente despus del
ejercicio, que volvi a los niveles basales a 1 h despus
del ejercicio. Colectivamente, estos hallazgos sugieren
que la activacin de la unin del ADN de NF-kB ocurre
transitoriamente dentro de las primeras horas de
ejercicio. Los cambios en la actividad de NF-kB en el
msculo esqueltico pueden depender del modo de
ejercicio y del estado de entrenamiento de los
participantes.
.
Tabla 2. Las secuencias de cebadores se disearon utilizando Primer Express Software v 3.0 (Applied Biosystems) usando secuencias accedidas
a travs de Genbank y verificadas para determinar la especificidad usando la bsqueda de nucletido-nucletido BLAST.
Coincidente con esta respuesta, la actividad de unin
del factor de transcripcin p50 fue ms alta a las 24 h
despus del ejercicio. La importancia biolgica de este
retraso en el aumento de NF-kB p50 sealizacin
durante las ltimas etapas de la recuperacin despus
del ejercicio sigue siendo incierto. Sin embargo, el
trabajo in vitro sugiere que puede desempear un papel
Esta investigacin tambin proporciona nuevas pruebas
de un posible papel de NF-kB p50 activacin como un
componente de la inflamacin de la resolucin. En
nuestro anlisis inicial de la expresin de la protena
p50, hubo una tendencia hacia un efecto de interaccin
de grupo de tiempo 9 (P = 0,057), pero esta tendencia
fue ms dbil (P = 0,115) despus de eliminar un valor
estadstico atpico. A pesar de esta interaccin ms
dbil, dentro del grupo de anlisis por LSD
comparaciones revel que la expresin de la protena
p50 fue elevada en el grupo placebo a las 24 h post-
ejercicio
en la regulacin de la resolucin activa de la inflamacin
aguda en el msculo esqueltico (Lawrence et al., 2001,
Senftleben et al., 2001). En un modelo de pleuritis
inducida por carragenina en ratas, Lawrence et al.
(2001) aportaron pruebas preliminares de una compleja
interaccin entre distintas vas de sealizacin de NF-kB
que controlan una respuesta inflamatoria aguda y
transitoria. Informaron que la fase preliminar de la
que ocurri a las 6 h fue caracterstica de la ruta clsica
NF-kB, y se asoci con el inicio de la inflamacin aguda.
La fase secundaria era tpica de la ruta alternativa NF-
kB, que comprenda homodmeros p50. Es importante
destacar que la inhibicin de esta ola de actividad caus
una respuesta inflamatoria prolongada (Lawrence et al.,
2001). Los hallazgos del presente estudio apoyan el
concepto de dos ondas funcionalmente distintas de
actividad de NF-kB despus de
Ejercicio de resistencia tradicional. Se justifica el trabajo
futuro para determinar cmo esta ola secundaria de la
actividad de la va NF-JB influye en la inflamacin post-
ejercicio y la recuperacin del msculo esqueltico.
Se utiliz ibuprofeno suplementacin para investigar si
la manipulacin de la respuesta inflamatoria al ejercicio
a travs de la ciclooxigenasa prostaglandina va altera
post-ejercicio NF-jB sealizacin. Informes anteriores
indican que NF-jB puede funcionar antes de la COX-2
para controlar la transcripcin de este gen (Pahl 1999,
Poligone y Baldwin 2001). Alternativamente, la
actividad de prostaglandina tambin puede afectar a
NF-jB (Rossi et al., 2000, Straus et al., 2000, Poligone y
Baldwin 2001). Los estudios in vitro demuestran que el
efecto de las prostaglandinas sobre la actividad de NF-
kB es especfico para la clase de prostaglandina. La
prostaglandina E2 activa la va clsica NF-kB, mientras
que la prostaglandina A2 y la prostaglandina J2 y sus
anlogos posteriores pueden inhibir la activacin de NF-
kB en respuesta a estmulos proinflamatorios (Castrillo
et al., 2000, Rossi Et al. 2000; Straus et al. 2000;
Lawrence et al. 2002). Recientemente, nuestro grupo
inform de cambios en las prostaglandinas en muestras
activacin de NF-kB
de suero sanguneo despus del ejercicio de resistencia
tradicional (Markworth et al., 2013). Curiosamente,
PGE2, PGA2 y PGD2 todos los mximos de expresin a
las 2 h post-ejercicio. No se encontr ningn tiempo
significativo 9 efectos de interaccin de grupo para el
cambio en la fosforilacin p65; Sin embargo, las
comparaciones de LSD sugirieron que la expresin de
p65 fosforilada slo pareca aumentar en el grupo de
placebo. De forma similar, los cambios observados en la
expresin de la protena p50 y la unin al ADN slo se
identificaron dentro del grupo placebo. Estos hallazgos
estn respaldados por los datos del estudio de
Lawrence et al. (2001), que no demostr ningn cambio
en la onda secundaria de actividad de unin a ADN de
NF-kB despus de la administracin de un inhibidor de
COX alternativo, NS398, en ratas con pleuresa. Aunque
estos hallazgos no ofrecen ninguna evidencia
concluyente de que el tratamiento con ibuprofeno
inhiba la va NF-kB, proporciona justificacin para
explorar esta va como mecanismo potencial a travs
del cual el tratamiento con ibuprofeno inhibe la
inflamacin post-ejercicio. Existen varias limitaciones al
presente estudio que deben ser consideradas. En
primer lugar, este anlisis se llev a cabo como parte de
un estudio ms amplio que investiga los efectos de la
administracin de ibuprofeno en mltiples
componentes de la respuesta post-ejercicio
inflamatorio y la hipertrofia (Markworth et al., 2013,
2014). Por lo tanto, la muestra de msculo limitada se
mantuvo para completar anlisis adicionales. La
investigacin futura debera considerar la regulacin
post-ejercicio de marcadores aguas arriba incluyendo IKKa e IKKb.

Figura 4. Anlisis por RT-PCR de los genes diana NF-jB IL-6 (A), IL-8 (B), MCP-1 (C), TNF-a (D) y COX-2 (E) en el
msculo esqueltico CDNA. Los datos son unidades medias arbitrarias SEM. * Denota significancia estadstica
de pre ejercicio en el mismo grupo de tratamiento; #denotes significacin estadstica de 0 h post-ejercicio en
el mismo grupo de tratamiento; ^ Denota significancia estadstica a partir de las 24 h post-ejercicio en el
mismo grupo de tratamiento (P <0,05). Barras blancas = grupo placebo; Barras negras = grupo ibuprofeno.

Conclusin especfica. La primera onda involucra la clsica

Esta investigacin proporciona nuevos conocimientos
sobre la regulacin de NF-kB despus de una sesin de
ejercicio de resistencia aguda. El principal hallazgo de
este estudio es que la activacin de NF-kB sigue un
patrn de activacin bifsico que es subunidad
subunidad p65 de NF-kB, y corresponde con el inicio de
una respuesta inflamatoria aguda y un aumento en la
expresin del gen de la citocina inflamatoria. La
segunda onda es consistente con una ola secundaria
previamente identificada de actividad NF-kB que implica
la subunidad p50 alternativa. La investigacin en
modelos alternativos de inflamacin sugiere que esta
segunda ola de actividad puede estar asociada con un
programa de resolucin inflamatoria activa. Ms
investigacin sobre el papel de la p50 sealizacin en el
msculo esqueltico representa un rea clave para la
investigacin futura con el fin de comprender mejor los
mecanismos que regulan la inflamacin post-ejercicio.
Anlisis de la LSD para examinar parejas dentro de
grupo diferencias sugieren que los cambios observados
en ambos NF-kB p65 y p50 se detectaron slo en el
grupo placebo. La compleja interaccin entre el NF-kB y
la va de la COX / prostaglandina en el msculo inducido
por el dao muscular sigue siendo poco entendido, y
debe ser un foco de investigacin en el futuro.