PROVAS BIOQUMICAS PARA IDENTIFICAO DE BACILOS GRAM-

NEGATIVOS

Esta aula tem como objetivo a identificao de enterobactrias em

gneros ou espcies, atravs da utilizao de meios de cultura especiais que
possibilitam a verificao da presena de enzimas bacterianas relacionadas
ao metabolismo de vrios substratos. As alteraes nos meios produzidas
pelo metabolismo bacteriano serviro de base para sua identificao de
acordo com o esquema a seguir:

1) PLAQUEAMENTO SELETIVO

a etapa de isolamento bacteriano a partir do espcime clnico,

utilizando meios seletivo-indicadores como o Agar EMB. A presena dos
corantes eosina amarela e azul de metileno inibem as bactrias Gram
positivas. Ao prepararmos este meio, a eosina e o azul de metileno reagem e
formam o eosinato de azul de metileno (sal). As bactrias Gram negativas
que fermentam lactose (LAC+) e, consequentemente, produzem cidos que
dissociam este sal, apresentando-se como colnias rosa-avermelhadas com
ou sem um centro negro, devido ao azul de metileno, enquanto as no
fermentadoras (LAC-) formam colnias transparentes.

2) CONFIRMAO BIOQUMICA
um conjunto de provas bioqumicas necessrias para a identificao
das colnias suspeitas. Sero utilizados os meios abaixo. Estes meios
totalizam oito testes que somados ao da fermentao da lactose permitem
identificar com fidelidade a grande maioria das enterobactrias isoladas em
espcimens clnicos.
A) Meio EPM
O meio EPM contm os testes de fermentao e produo de gs a partir
de glicose, produo de H 2S, hidrlise da uria e desaminao de
triptofano.
B) Meio MILi
O Meio MILi contm os testes de motilidade, indol e descarboxilao de
lisina.
C) Citrato de Simons
Este teste permite identificar espcies que utilizam citrato como nica
fonte de carbono.

2.1) Fundamento terico:

Hdrlise da uria: Este teste verifica a habilidade de um

microrganismo em utilizar a uria, formando duas molculas de
amnia pela ao da enzima urease (uria 2 NH3 + CO2 + H2O).
Motilidade: O teste visa verificar se a bactria mvel ou imvel.
Logo pode ajudar na diferenciao de alguns gneros como por
exemplo Enterobacter (usualmente +) e Klebsiella (-). A mobilidade
das bactrias proporcionada pela presena de um ou mais flagelos.
As bactrias imveis no possuem flagelos.
 Produo de indol: Este teste tem como princpio determinar a
habilidade de um microrganismo em produzir indol a partir da
molcula de triptofano. Pode ajudar na diferenciao de alguns
gneros de bactrias como, por exemplo: E. coli (usualmente +) do
grupo Klebsiella-Enterobacter (-).
Citrato de Simmons: Este teste visa determinar se um
microrganismo capaz de utilizar citrato como uma nica fonte de
carbono para o seu metabolismo, resultando em uma alcalinidade no
meio. As bactrias citrato positivas crescem usando sais de amnia
como fonte de nitrognio, liberando amnia e conseqentemente
deixando o meio alcalino. O indicador de pH o azul de bromotimol,
que em meio cido fica amarelo e em meio bsico, azul.
Produo de H2S: Este teste visa determinar a capacidade de
produo de ons S-2 a partir do metabolismo bacteriano.
Produo de gs: Este teste visa determinar a capacidade de
produo de gs CO2 a partir da fermentao da glicose.
Descarboxilao de lisina: Este teste visa determinar a capacidade
de descarboxilar a lisina, por ao da enzima lisina descarboxilase.

2.2) Procedimento:
Tocar a colnia com agulha bacteriolgica e semear os 3 meios na
seguinte ordem: Citrato, EPM e MILi. Para inocular o meio de citrato deslizar
a agulha pelo centro estriando toda a superfcie inclinanda. No meio EPM
introduzir a agulha at o fundo do tubo e ao retir-la semear a superfcie do
meio enquanto o MILi deve ser semeado por picada central que deve atingir
o fundo do tubo.

2.3) Leitura e interpretao:

A) Meio EPM:
Produo de gs: Aparecimento de bolhas ou deslocamento do meio
de cultura do fundo do tubo.
Produo de H2S: Enegrecimento do meio em qualquer intensidade.
Hidrlise da uria: Aparecimento de cor azul ou verde azulada
(reao fraca) que se estende para a base do meio, envolvendo-a
totalmente ou no.
Desaminao do triptofano: Aparecimento de cor verde-garrafa na
superfcie do meio.

B) Meio MILi
Motilidade: A bactria mvel cresce alm da linha de picada. A
imvel somente nesta linha.

Resultado Cor do meio

Positivo (+) Crescimento fora do local da picada
Negativo (-) Crescimento ao redor da picada

Descarboxilao da lisina: Quando a lisina descarboxilada o meio

adquire cor prpura acentuada ou discreta. Quando o aminocido no
 utilizado, o meio adquire cor amarelada nos seus 2/3 inferiores.
Considerar o teste positivo sempre que o meio no estiver amarelo.
Produo de indol: Adicionar 3 gotas a 4 gotas do reativo de Kovacs
superfcie do meio e agitar levemente. Quando a bactria produz
indol, o reativo adquire cor rosa ou vermelha. Quando no produz, o
reativo mantm sua cor inalterada.

Resultado Cor do
reagente
Positivo (+) Rosa
Negativo (-) Amarelo

C) Meio Citrato de Simmons

A utilizao do citrato revela-se pelo aparecimento de cor
azul na superfcie do meio. O teste deve ser considerado negativo quando a
cor do meio no sofre alterao.

Resultado Cor do meio

Positivo (+) Azul
Negativo (-) Verde

SISTEMA NUMRICO PARA ENTEROKIT B

As 9 reaes bioqumicas do Enterokit B foram agrupadas em 3

conjuntos de provas. O resultado de cada um destes conjuntos produz um
algarismo, de modo que o resultado dos 3 conjuntos produz um nmero de 3
dgitos, que identifica uma espcie bacteriana.

Os 3 conjuntos de provas e seus valores so:

Primeiro algarismo Segundo Terceiro algarismo(C)

(A) algarismo(B)
Lactose 4 Urease 4 Indol 4
Gs 2 LTD 2 Lisina 2
H2S 1 Mot 1 Citrato 1

Observaes:
1) Para a interpretao das provas ver item Leitura e Interpretao.
2) Quando a reao da cepa investigada positiva (+), colocamos o nmero
correspondente. Exemplos: Urease + = 4, Lisina + = 2. Se a reao
negativa (-), colocamos para a mesma o valor 0. 3) Em seguida somamos os
valores obtidos em cada srie. O valor de A d o primeiro algarismo, o valor
de B d o segundo e o valor de C d o terceiro algarismo.

Assim por exemplo uma cepa que apresente o seguinte resultado

bioqumico:
 Lactose - 0 Urease +4 Indol -0
Gs -0 LTD +2 Lisina -0
H2S +1 Mot +1 Citrato +1
Total: 1 Total: 7 Total:1

ter o nmero 171 que corresponde na relao bactria Proteus mirabillis