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NDIA TAWIL
Orientador:
Prof. Dr. OVANDIR ALVES SILVA
So Paulo
2004
NDIA TAWIL
1. examinador
2. examinador
So Paulo,_________de_____.
Aquele que nada sabe, e no
sabe que no sabe, tolo
evita-o.
(Provrbio rabe)
A Deus, que essa luz maior e inigualvel,
por ter me dado a fora para finalizar esse trabalho,
acompanhando-me a todo o momento.
Ao Santo Expedito por ter me
auxiliado nas situaes que
pareciam impossveis.
Aos meus pais Younan e Alidis pela excelente
educao que me proporcionaram, muito importante
para minha formao.E tambm pelo amor, incentivo,
fora e compreenso.
Aos meus queridos irmos Cristiane e Alessandro
pelo amor, amizade e companheirismo.
Ao Professor Ovandir Alves Silva,
pela orientao e oportunidade.
E por ter acreditado no meu trabalho,
dando-me os incentivos necessrios
para que eu pudesse finalizar esse
trabalho.
AGRADECIMENTOS
1. INTRODUO........................................................................................... 01
2. ASPECTOS TOXICOLGICOS................................................................ 05
2.1. Consumo de Bebidas alcolicas....................................................... 05
2.2. Abuso e Dependncia ao lcool........................................................ 16
2.3. Toxicocintica do Etanol.................................................................... 24
2.4. Efeitos do Etanol............................................................................... 29
2.4.1. No Sistema Nervoso Central (SNC)........................................ 31
2.4.2. No Sistema Cardiovascular..................................................... 34
2.4.3. No Sistema Hematolgico ...................................................... 35
2.4.4. No Sistema Endcrino............................................................. 36
2.4.5. No Sistema Geniturinrio.......................................................... 36
2.4.6. No Sistema Gastrintestinal........................................................ 37
2.4.7. No Desenvolvimento Fetal........................................................ 39
2.5. Interao do Etanol com Frmacos................................................... 41
3. ASPECTOS ANALTICOS......................................................................... 48
4. OBJETIVO E PLANO DE TRABALHO...................................................... 65
5. MATERIAL E MTODOS.......................................................................... 66
5.1 Material............................................................................................... 66
5.1.1. Solues padro................................................................... 66
5.1.2. Equipamentos e acessrios..................................................... 67
5.1.3. Outros materiais....................................................................... 68
5.1.4. Amostras de saliva................................................................... 69
5.1.4.1. Referncia negativa (Grupo I A) ................................ 69
5.1.4.2. Referncia positiva (Grupo II B).................................. 69
5.1.4.3. Amostras de Voluntrios............................................. 69
Grupo II A.................................................................... 69
Grupo II B................................................................... 70
5.2 Mtodos............................................................................................. 71
5.2.1. Seleo do tempo de coleta para determinao de etanol
atravs do sistema Q.E.D. A 150........................................... 71
5.2.2. Padronizao e validao do mtodo para determinao
de etanol em amostras de saliva pela cromatografia
gasosa, aps separao por headspace............................... 71
5.2.2.1. Padronizao do mtodo............................................. 71
5.2.2.2.Curvas de calibrao..................................................... 73
5.2.3. Validao do mtodo.............................................................. 74
Linearidade da tcnica............................................................ 74
Limite de quantificao (LOQ)................................................ 74
Limite de deteco (LOD)....................................................... 75
Preciso intra e interensaio.................................................... 75
5.2.4. Determinao de etanol em amostras de saliva de
voluntrios, Grupo II B aps a ingesto de bebida
alcolica................................................................................. 76
5.2.4.1 Mtodo enzimtico (Q.E.D. A 150)............................. 77
5.2.4.2 Cromatografia gasosa, aps separao por
headspace.................................................................. 77
5.2.5. Determinao de etanol por Q.E.D A 150 e GC/HS em
amostras de voluntrios (Grupo II A) coletadas com Salivette
com e sem cido ctrico........................................................... 78
5.2.6. Estudo para verificar a estabilidade do etanol atravs do
sistema Q.E.D. A 150............................................................. 79
6. RESULTADOS.......................................................................................... 80
6.1 Seleo do tempo de coleta para determinao de etanol atravs do
sistema Q.E.D. A 150........................................................................ 80
6.2 Padronizao e validao do mtodo para determinao de etanol
pela cromatografia gasosa, aps separao por headspace.............. 80
6.2.1. Padronizao do mtodo.......................................................... 80
6.2.2. Validao do mtodo................................................................ 82
Linearidade da tcnica............................................................ 82
Limite de quantificao (LOQ)................................................. 84
Limite de deteco (LOD)........................................................ 85
Preciso intra e interensaio...................................................... 86
6.3. Determinao de etanol em amostras de saliva dos voluntrios do
Grupo II B........................................................................................... 88
6.3.1.Mtodo enzimtico (Q.E.D. A 150)........................................... 88
6.3.2 Cromatografia gasosa aps separao por headspace........... 89
6.4. Determinao de etanol por Q.E.D A 150 e GC/HS por amostras
de voluntrios (Grupo II A) coletadas com Salivette com e sem
cido ctrico......................................................................................... 92
6.5 Estudo para verificar a estabilidade do etanol atravs do sistema
Q.E.D. A 150..................................................................................... 95
7. DISCUSSO................................................................................................ 96
8.CONCLUSO................................................................................................ 108
9. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................ 109
10. ANEXOS.................................................................................................... 129
LISTA DE TABELAS
CV Coeficiente de variao
Dp Desvio padro
HS Headspace
Kcal Quilocaloria
NMDA n- metil-d-aspartato
PM Peso molecular
R2 Coeficiente de determinao
The abuse of alcohol leads to health injury and causes damage to the society.
Several biological matrices can be used to monitor exposure to alcoholic
beverages. In this work, saliva was used in the determination of ethanol for both
techniques: enzymatic Q.E.D. A-150 screening test -, and headspace-gas
chromatography - confirmation test -. The method was developed, validated and
used for the analysis of saliva samples from volunteers who ingested alcoholic
beverages in a controlled schedule. Ethanol was detected and in all samples,
noticing a difference between the results of both techniques. Inter-volunteers
results showed high variability for the same collection times, although the
amount of ethanol ingested was equivalent. These results suggest that saliva is
a good option for the in field determination of ethanol in exposed individuals to
alcoholic beverages.
1. INTRODUO
O consumo de bebidas alcolicas tem se tornado cada vez mais abusivo pela
populao e a faixa etria do incio de sua utilizao tem diminudo causando
grande preocupao nas reas de sade e segurana pblica (HADFIELD;
MERCER & PARR, 2001; CARLINI, et al., 2002).
1
Em termos de consumo s perde para a cafena, gerando um grande
contingente de dependentes, que no Brasil de 11,2% da populao
(CARLINI, et al., 2002). O alcoolismo foi responsvel por 3.621 bitos em
indivduos com idade inferior aos 40 anos , sendo destes 89% do sexo
masculino (OLIVEIRA, 1999; PESSINI, 1999; BITTENCOURT, 2000).
Uma das medidas eficazes para alcanar xito na aplicao destes programas
a utilizao das anlises toxicolgicas, que considerada um importante
instrumento para verificar o consumo de substncias psicoativas. Diversas
matrizes podem ser utilizadas para tal finalidade: urina, sangue, ar expirado e
outras (CHROUCH, 1998; SILVA; YONAMINE & ODO, 1999).
2
As anlises toxicolgicas utilizadas para verificar a exposio a drogas so
divididas em dois tipos: uma de resposta imediata (triagem) e a outra de
confirmao do resultado, considerada imprescindvel para este tipo de
finalidade.
3
Na quase totalidade dos trabalhos encontrados na literatura os objetivos foram
dirigidos para analisar possveis correlaes entre as concentraes de etanol
existentes no sangue, ar expirado e/ou saliva. Os resultados demonstraram
uma boa correlao entre a concentrao no sangue e saliva (JONES, 1979a
1993; BATES & MARTIN, 1997; BENDTSEN, et al., 1999; GUBALA & ZUBA,
2003).
4
2. ASPECTOS TOXICOLGICOS
5
As bebidas alcolicas so misturas geralmente constitudas de etanol, gua,
cereais, vegetais ou frutas e de outras substncias: cidos orgnicos,
sters, leos essenciais e acetaldedo. So classificadas de acordo com o
processo de fabricao - fermentao e destilao - e de seu teor alcolico
(ABEL, 1983; OSBORN, 1994).
6
TABELA 1. Teores alcolicos das principais cervejas produzidas no Brasil
4,4 XINGU
5,3 CERPA
7
TABELA 2. Faixa de teor alcolico dos principais destilados consumidos
no Brasil.
USQUE 39 40%
CONHAQUE 38 39%
RUM 35 38%
GIM 43,5 45,3%
AGUARDENTE DE CANA 39 40%
CACHAA 39 43%
Fonte: Levantamento efetuado nas embalagens originais dos
produtos.
8
Desde 1997, este destilado vem recebendo incentivo do Governo Federal,
sendo includa no Programa Especial de Exportao PEE - com
estimativas de exportao de 30 milhes de litros, ultrapassando os 14,5
milhes do ano de 2002 (OLIVEIRA et al., 2001).
9
TABELA 3. Comparao de valores entre as doses de bebidas alcolicas
consumidas nos pases europeus com o lanche da principal rede mundial
de fast food.
10
A TABELA 4 apresenta o consumo de bebidas alcolicas em litros por
pessoa no Brasil, de 1961 at 2000.
11
Todos estes dispositivos legais regulamentam a propaganda sobre lcool
no rdio e televiso em certos horrios, restringe a incluso de jovens e
adolescentes vinculados a essas propagandas, alm da proibio de venda
de bebidas alcolicas a menores de 18 anos (BRASIL, 2000b; 2003b).
12
Os critrios utilizados para determinar os conceitos de uso, abuso e
dependncia so complexos, sendo influenciados pela cultura, sociedade e
variaes individuais (CAETANO, 2002).
13
TABELA 5. Classificao do consumidor de bebidas alcolicas de acordo
com a quantidade ingerida em determinados perodos.
MODERADO 4 14 doses/semana
14
A tabela 6 apresenta a concentrao sangunea obtida de acordo com a
quantidade e respectiva dose de bebida alcolica ingerida.
PESO CORPORAL
QUANTIDADE 60 Kg 70 Kg 80 Kg
INGERIDA
g/ L
15
2.2 Abuso e dependncia ao lcool
16
TABELA 7. Critrios para o diagnstico de uso abusivo de lcool, conforme
o DSM IV.
A. Preenchimento de pelo menos 1 dos critrios, ocorrendo em um
perodo de 12 meses
1. Uso recorrente da substncia resultando em problemas no
trabalho, escola (Ex: ausncias, suspenses, indisciplina, ou
expulso); ou no lar (negligncia dos deveres domsticos).
17
O conceito de dependncia apresentado na DSM-IIIR como: sintomas
comportamentais e fisiolgicos que indica que uma pessoa tem prejuzo do
controle do uso de uma substncia psicoativa ou o uso contnuo dessa
substncia a leva para conseqncias adversas. Este termo utilizado
alternadamente com o vcio e com o alcoolismo (WHO, 1994).
18
D-se preferncia ao uso do termo neuroadaptao, que a alterao
observada no sistema nervoso central devido a presena de uma
substncia psicoativa, aps exposio nica ou repetida, que se manifesta
pelo aparecimento de transtornos fsicos intensos quando o uso
interrompido - sndrome de abstinncia - ou pela resposta diminuda para
uma mesma concentrao no sito de ao - tolerncia farmacodinmica
(MDIO, 1992).
19
A reduo ou suspenso da ingesto de lcool em usurios crnicos, leva
ao aparecimento de um conjunto de sinais e sintomas definidos como
sndrome de abstinncia do lcool. (MASTERS, 2003).
20
TABELA 8. Critrios para diagnstico da dependncia de lcool, conforme
o DSM IV.
2. Abstinncia:
a) Sndrome de Abstinncia.
b) Utilizao da substncia para aliviar ou evitar os sintomas de
abstinncia
21
O consumo excessivo de lcool por um extenso perodo de tempo leva ao
desenvolvimento de tolerncia (DRUMMER, 2001; MASTERS, 2003). Os
consumidores crnicos no somente podem adquirem tolerncia, mas
tambm desenvolver a dependncia, o que explicaria o intenso desejo de
consumir a bebida pela manh, devido diminuio dos nveis de etanol no
organismo durante a noite (BRIEN, 2001).
22
Outra forma de tolerncia, que difere das anteriores a tolerncia rpida,
observada em resposta a segunda dose, ou seja, 8-24 horas, depois da
exposio prvia a 1a dose (KHANNA; CHAU & SHAH, 1996).
23
2.3. Toxicocintica do etanol
24
A biotransformao do etanol ocorre primeiramente no fgado, e uma
pequena quantidade ocorre nos pulmes, rins e intestino (ABEL, 1983;
BRUCKNER & WARREN, 2001).
25
O etanol em concentraes maiores tambm sofre biotransformao pela
ao do citocromo P450, principalmente a isoforma CYP2E1, do sistema de
oxidao microssomal MEOS - utilizando o NADPH como cofator. A
CYP2E1 tambm tem uma alta capacidade para biotransformar algumas
drogas conhecidas, como o paracetamol, para seu metablico txico que
pode promover a carcinognese. Por outro lado a ingesto aguda de etanol
pode inibir a biotransformao de algumas drogas por competio atravs
de uma pequena parcela da via microssomal. As interaes do lcool com
outros medicamentos sero abordados mais a diante (OSBORN, 1994;
AHMED, 1995; LIEBER, 1999; MOSLEN, 2001; PARKINSON, 2001;
SCIVOLETTO & MALBERGIER, 2003; MASTERS, 2003).
26
Microssomos
+
NADP . H2O H 2O A
OH
CH3CH
OH
+
NADPH + H
CYP 2E1
Mitocndria
+ O2
D
Citosol NADH + H
+
B
ADH O
O
CH3CH2OH CH3C CH3C
H ALDH H
etanol
acetaldedo cido actico
NAD+
+ +
NAD NADH + H
Peroxissomos
C
CATALASE
H2O2 H 2O
27
Aproximadamente, 2% do lcool ingerido so excretados inalterados
principalmente atravs dos rins e pulmes. Quando grandes quantidades de
etanol so ingeridas cerca de 10% no so oxidados. Pequenas
quantidades de etanol podem ser encontradas no suor, lgrima, bile, suco
gstrico, na saliva e outras secrees (LARINI & SALGADO,1997; HOBBS;
RALL & VERDOORN, 1996; RAMCHANDANI; BOSRON & LI, 2001).
28
2.4. Efeitos do etanol
29
TABELA 10. Efeitos do consumo de lcool apresentado por dois autores de
acordo com a alcoolemia.
Sinais e Sintomas
Concentrao
de lcool no MILHORN, 1990 MARQUES & RIBEIRO,2003
sangue (g/L)
0,2 Sensao de calor e relaxamento
0,3 Excitao e euforia
0,4 Relaxamento e pele ruborizada
30
2.4.1. No Sistema Nervoso Central (SNC)
31
O etanol aumenta a inibio sinptica mediada pelo GABA e pelo fluxo
de cloreto, sendo esta ao tambm considerada como mecanismo de
ao. Esse efeito e outras aes sedativas e motoras so inibidos pela
bicuculina, um antagonista especfico dos receptores GABArgicos. No
uso crnico, foi constatada nos nveis plasmticos uma diminuio da
funo dos receptores GABAA, resultando na sndrome de abstinncia
(OSBORN, 1994; HOBBS; RALL & VERDOORN, 1996; BITTENCOURT,
2000; FLEMING; MIHIC & HARRIS, 2001; MORROW et al., 2001).
32
Esses efeitos possivelmente contribuem para as suas aes
depressoras, inclusive, para os distrbios de memria, pois os
receptores do NMDA desempenham importante papel no tipo de
plasticidade sinptica ao longo prazo, responsvel pela memria
(JULIEN, 1998).
33
Essas sndromes podem ser devidas ao prprio etanol ou a seus
produtos de biotransformao como o acetaldedo ou os steres de
cidos graxos - metabolismo no oxidativo -. A maioria dos dependentes
evidencia um grau de demncia, tornando-se apticos e com
pensamentos empobrecidos. Tambm se observa ocorrncia de
degenerao cerebelar que leva a incoordenao motora, neuropatias
perifricas e miopatia. Algumas dessas alteraes no so devidas ao
lcool propriamente, mas a uma deficincia concomitante de tiamina,
associado a traumas freqentes, a deficincia de vitaminas e a
desnutrio (THERAPONDOS; DELAHOOKE & HAYES, 1999;
DRUMMER, 2001; HADFIELD; MERCER & PARR, 2001; MASTERS,
2003).
34
Em contrapartida vrios estudos tm relatado que o consumo moderado
de bebida alcolica, doses pequenas de etanol consumidas diariamente,
poderia reduzir o risco de problemas cardacos, arteriosclerose e certos
tipos de doenas, bem como, a reduo do risco de osteoporose em
mulheres na fase de menopausa. Esse efeito protetor ocorre porque o
lcool induz o aumento de HDL no sangue com correspondente
decrscimo da LDL (JULIEN, 1998; DUFOUR, 1999; LORIMIER, 2000;
MUKAMAL; CONIGRAVE & MITTLEMAN, 2003).
35
2.4.4. No Sistema Endcrino
36
2.4.6. No Sistema Gastrintestinal
O consumo intenso gera uma leso direta da mucosa gstrica que pode
resultar em gastrite; lceras de estmago, duodeno e pancreatite aguda
e crnica. Tambm apresentam diarrias crnicas, decorrentes da m
absoro de alimentos no intestino delgado (ABBOTT, 1996; FLEMING;
MIHIC & HARRIS, 2001; RANG et al., 2001a).
37
No fgado ocorre um aumento do acmulo de gordura - fgado gorduroso
-, que progride para uma hepatite - inflamao do fgado - e termina por
conduzir a necrose e fibroses hepticas irreversveis, que constitui a
cirrose, onde ocorre uma deposio de fibras ao redor das veias centrais
- esclerose hialina central - (FLEMING; MIHIC & HARRIS, 2001;
MOSLEN, 2001).
38
2.4.7. No Desenvolvimento Fetal
39
Estima-se que a incidncia global de SAF, seja de 1 a 2 por 1000
nascimentos vivos. Essa incidncia correlaciona-se fortemente com
consumo materno de lcool durante a gravidez e de cerca de 19% em
mes que bebem em mdia - um mnimo de 4 unidades dirias de
bebidas durante a gestao (RANG et al., 2001a).
40
2.5. Interao do Etanol com Frmacos
41
TABELA 11. Interaes entre o lcool e vrias classes de medicamento.
Classe de Princpio
medicamentos Ativo Especialidade Tipo de interao
42
Continuao da Tabela 11.
43
Existem no mercado alguns medicamentos e solues orais antisspticas
que contm etanol em suas composies, estes no deveriam ser
administrados ou utilizados por pessoas com distrbios hepticos ou at
mesmo nas populaes asiticas - japoneses e chineses - com variaes
no gene da enzima ALDH, apresentando reaes desagradveis na
presena de etanol (LIEBER & ABITTAN, 1999; RAMCHANDANI; BOSRON
& LI, 2001).
44
- Tambm foram encontradas as especialidades indicadas como calmantes
Maracugina, Pasalix e Calman - que apresentam em sua composio
extratos fluidos ou alcoolato, com teores alcolicos semelhantes s tinturas.
45
TABELA 12. Medicamentos e antisspticos bucais e suas respectivas
concentraes de etanol - em porcentagem -.
CONCENTRAO
PRODUTO DE ETANOL (%)
46
O cocaetileno tem propriedades farmacolgicas semelhantes s da cocana,
mas com meia vida plasmtica de 3 a 5 vezes maior. Tem maior
seletividade com transportador dopaminrgico e menor afinidade com a
serotonina, o que justifica o seu intenso efeito euforizante. Tambm est
associado com isquemias, infartos, hipertenso e arritmias, apresentando
graves conseqncias para o indivduo (HEARN et al., 1991).
47
3. ASPECTOS ANALTICOS
48
SANGUE
49
Na Europa limite mximo permitido de alcoolemia varia entre os pases. A
Frana, Itlia e Portugal tm seus limites estabelecidos em 50 mg/dL. Na
Espanha o limite o mesmo, mas difere para aqueles que acabaram de retirar
a carta de habilitao, sendo de 30 mg/dL. Na Polnia o limite de 20 mg/dL e
em Luxemburgo de 80 mg/dL. Alguns pases, principalmente do leste
europeu so bastantes rigorosos, pois no admitem nenhuma concentrao
alcolica no sangue de motoristas (WHO, 2003b).
50
Uma das tcnicas pioneiras denominadas Free Radical Assay Technique
FRAT -, foi amplamente empregada nas foras armadas americanas em 1971.
Em 1972, um novo mtodo imunolgico foi introduzido no mercado o
enzimaimunoensaio - homogeneous enzyme-multiplied immunoassay EMIT -.
Em seguida foi desenvolvido o imunoensaio por fluorescncia polarizada -
Florescence Polarization Immunoassay TDX - (SUNSHINE, 1998).
51
AR EXPIRADO
52
Esse fator significa que 2.100 partes de ar alveolar contm a mesma
quantidade de lcool que uma parte de sangue (SCHRAMM; SMITH & CRAIG,
1992; BRASIL, 1997; CHURCH & WITTING, 1997; CARVALHO & LEYTON,
2000).
53
URINA
54
SUOR
CABELO
55
O etanol e seus metablitos desaparecem rapidamente do corpo e outros
tecidos, sendo difcil a sua monitorao, requerendo tcnicas indiretas de
deteco. Contudo existem marcadores provenientes de seu metabolismo no
oxidativo, que podem ser utilizados para verificar o seu consumo crnico.
Como marcadores desse tipo de consumo tm-se os steres de cidos graxos
e o etil glicurondeo que so detectados no sangue somente aps 24 horas da
ltima exposio ao lcool e depois se depositam no cabelo. Devido a essa
caracterstica, essa matriz pode ser utilizada para verificar o consumo de etanol
por perodos mais extensos, como no caso de dependentes (BREWER, 1999;
WURST et al., 1999; PRAGST et al., 2001).
HUMOR VTREO
56
SALIVA
No caso do etanol a saliva tem sido usada com uma variedade de propsitos
incluindo testes em motoristas, servindo como suporte para as evidncias
clnicas e para diagnsticos mdico-legais da intoxicao alcolica (JONES,
1979a; CONE, 2001).
57
A saliva produzida cerca de 500-1500 mL/dia, sendo seu fluxo controlado
pelo Sistema Nervoso Parassimptico. Efeitos colaterais de medicamentos
como os anticolinrgicos, anticonvulsivantes, anti-parkinsonianos, drogas
ilcitas como a maconha, doenas como a diabetes Mellitus, o alcoolismo e a
doena sistmica de supresso de saliva em idosos provoca a xerostomia
boca seca , dificultando a coleta de saliva (DUBOWSKY, 2002).
58
Devido as caractersticas fsico qumicas do etanol, a sua concentrao em
saliva no influenciada por esses fatores (JONES, 1993).
59
A coleta de saliva pode ser efetuada atravs dos seguintes mtodos:
60
FIGURA 2. Foto ilustrada do coletor de saliva, com seus compartimentos
dispostos de maneira separada para a sua melhor visualizao.
A saliva pode ser armazenada a 4C por 7 dias ou a -20C por meses, sem
perda da quantidade de etanol. Aps a coleta recomendada a centrifugao
das amostras para obteno de um homogeneizado (MACCHIA et al., 1995).
61
O Q.E.D. A 150 - Orasure Technologies, Inc - um teste rpido para anlise
quantitativa de etanol em saliva, segundo seu fabricante e apresenta-se como
o mais recomendado em trabalhos da literatura. Tem como princpio de
operao a oxidao enzimtica com o lcool desidrogenase, ocorrendo
vrias reaes, tendo como ponto final o aparecimento da cor prpura -
figuras 3; 4 e 5 - (CHRISTOPHER & ZECCARDI, 1992; JONES, 1995; BATES
& MARTIN, 1997; BENDTSEN et al., 1999; BIWASAKA et al., 2001).
62
FIGURA 5. Reaes qumicas que ocorrem no Q.E.D A 150, na presena de
etanol.
pH alcalino
ACETALDEDO + TRAPPING AGENT COMPLEXO
diaforese
NADH + AGENTE OXIDANTE NAD + REDUZIDO
63
As variaes individuais encontradas na composio da saliva - viscosidade e
quantidade de material particulado - podem influenciar o preenchimento do
tubo capilar do Q.E.D. A 150 e conseqentemente no resultado. Segundo
Jones, (1995) o controle existente no teste indicar esta ocorrncia devido ao
no aparecimento da cor. A presena de bolhas no tubo capilar, devido
entrada de ar, tambm pode dificultar interpretao do resultado.
64
4- OBJETIVO E PLANO DE TRABALHO
65
5. MATERIAL E MTODOS
5.1. Material
66
5.1.2. Equipamentos e acessrios
Centrfuga (Tecnal)
67
5.1.3. Outros materiais
gua destilada
Pipetas volumtricas
Vidrarias
68
5.1.4. Amostras de saliva
Grupo II - A
69
Grupo II - B
70
5.2. MTODOS
71
Um mL das amostras e 1 mL da soluo aquosa de n-propanol a
0,6g/L foram transferidos para frascos especficos (10 mL) para a
separao do etanol por aquecimento - headspace. Estes foram
devidamente lacrados com septo de borracha e tampa de
alumnio e colocados em estufa a 70C por 30 minutos.
SALIVA
1mL
1 mL soluo aquosa de
n-propanol a 0,6g/L
RESDUO VAPOR
INJETAR 250l
DESPREZAR
GC/FID
72
Em fase posterior, amostras de saliva (n=15) provenientes de
voluntrios (n=3 do Grupo I-C) que ingeriram no prazo mximo de
20 minutos, usque foram obtidas atravs do coletor denominado
Salivette, nos seguintes tempos, aps a ingesto de etanol: 20;
50; 80; 110 e 130 minutos. O coletor permaneceu na cavidade
bucal at a completa saturao de saliva, sendo colocado
novamente no recipiente do Salivette. No momento da anlise
este foi levado centrifugao a 700g por 10 minutos. Foram
obtidos cerca de 3 mL de saliva submetidos ao procedimento
descrito acima.
73
5.2.3 Validao do mtodo
Linearidade da tcnica
74
Limite de Deteco (LOD)
75
5.2.4 Determinao de etanol em amostras de saliva de
voluntrios, Grupo II - B aps ingesto de bebida alcolica
76
5.2.4.1 Mtodo Enzimtico (Q.E.D. A 150)
77
5.2.5 Determinao de etanol por Q.E.D. A-150 e GC/HS em
amostras de voluntrios (Grupo II A) coletadas com
Salivette, com e sem cido ctrico.
Nos tempos de 20; 50; 80; 110 e 130 minutos foi aplicado o
seguinte esquema de coleta em cada voluntrio:
a) coleta e respectiva determinao de etanol atravs do
sistema enzimtico Q.E.D A-150.
b) Imediatamente, aps a coleta para aplicao do Q.E.D
foram realizadas duas coletas em srie com o Salivette ,
com e sem cido ctrico
78
5.2.6 Estudo para verificar a estabilidade do etanol atravs do
sistema Q.E.D. A 150
79
6. RESULTADOS
Tempo (min)
VOLUNTRIO 10 60 90
1 70 90 80
2 45 65 50
3 50 85 70
4 40 50 42
80
A figura 7 mostra o cromatograma obtido na determinao de etanol
em saliva, utilizando o n propanol como padro interno. O tempo de
reteno do etanol foi 2.284 e do n - propanol de 5.311.
ETANOL n - PROPANOL
Concentraes Replicatas
etanol (g/L) 1 2 3 Mdia
0,15 0,14 0,13 0,14 0,137
0,6 0,48 0,46 0,48 0,473
1,5 1,37 1,38 1,33 1,36
81
Os resultados obtidos atravs da anlise das amostras de voluntrios
(Grupo II A) por GC/HS so mostrados na tabela 15.
Tempo (min)
VOLUNTRIO 20 50 80 110 130
Linearidade da tcnica
82
TABELA 16. Valores obtidos nos experimentos para verificar a
linearidade da tcnica, a partir das concentraes estabelecidas. Os
valores so apresentados pela razo das reas absolutas de etanol
pela do padro interno (n propanol).
Concentraes Replicatas
etanol (g/L) 1 2 3 Mdia Dp CV
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0 1 2 3 4
conc (g/L)
83
Limite de Quantificao (LOQ)
1 0,023
2 0,027
3 0,028
4 0,027
5 0,025
6 0,027
MDIA 0,026
Dp 0,002
CV (%) 7,69
84
Limite de Deteco (LOD)
1 0,017
2 0,027
3 0,022
4 0,023
5 0,025
6 0,022
MDIA 0,023
Dp 0,003
CV (%) 13,04
85
Preciso intra e interensaio
DIAS
REPLICATAS 1 2 3
86
TABELA 20. Coeficientes de variao intra e interensaio do etanol, na
concentrao de 0,3g/L .
DIAS
REPLICATAS 1 2 3
DIAS
REPLICATAS 1 2 3
1 1,10 1,08 1,13
2 1,10 1,09 1,18
3 1,14 1,10 1,18
4 1,09 1,11 1,16
5 1,09 1,13 1,16
6 1,09 1,11 1,16
87
6.3. Determinao de etanol em amostras de saliva dos
voluntrios do Grupo II - B
CONCENTRAES (mg/mL)
A 50 75 90 70 80
B 110 80 70 65 45
C 50 60 55 35 40
D 60 90 80 70 70
E 45 50 50 50 40
F 70 65 60 55 50
G 80 110 100 80 90
H 45 50 65 70 60
I 50 60 50 45 35
J 95 100 70 60 50
88
6.3.2. Cromatografia gasosa aps separao por
headspace
CONCENTRAES (mg/mL)
B 113 105 94 83 77
C 113 80 69 57 52
D 84 104 103 87 83
E 65 67 66 67 61
F 78 78 68 56 42
H 53 74 89 83 80
I 72 78 52 47 30
J 107 99 79 75 69
89
Na figura 9 so apresentados os grficos com os resultados das anlises
enzimticas (Q.E.D. A 150) e cromatogrficas (GC/HS) das amostras
dos voluntrios do Grupo II B.
100 100
50 50
0 0
20 50 80 110 130 20 50 80 110 130
150 150
130
110
100 90
70
50 50
30
0 10
20 50 80 110 130 -10
20 50 80 110 130
QED QED
Voluntrio E Voluntrio F
CG/HS CG/HS
150 150
130 130
110 110
90 90
70 70
50 50
30 30
10 10
-10 -10
20 50 80 110 130 20 50 80 110 130
90
QED QED
Voluntrio G CG/HS
Voluntrio H CG/HS
150 150
130 130
110 110
90 90
70 70
50 50
30 30
10 10
-10 -10
20 50 80 110 130 20 50 80 110 130
QED QED
Voluntrio I CG/HS Voluntrio J CG/ HS
150 150
130
110
100
90
70
50 50
30
10 0
-10 20 50 80 110 130
20 50 80 110 130
120
100
80
QED
60
Hs
40
20
0
20 50 80 110 130
FIGURA 10. Grfico das mdias dos resultados das duas tcnicas
empregadas.
91
6.4 Determinao de etanol por Q.E.D. A-150 e GC/HS em
amostras de voluntrios (Grupo II A) coletadas com Salivette ,
com e sem cido ctrico.
20 70 AI 75 77 90 65 78 81 83 91
50 70 77 80 88 91 60 72 81 82 81
80 68 75 78 78 82 60 67 70 73 78
110 58 60 65 73 76 58 62 61 65 67
130 55 60 62 66 72 48 51 53 61 62
92
100
concentrao
80
60 QED
40 HS
20
0
20 50 80 110 130
minutos
Relao-Mdia
100
80
60 QED
40 HS
20
0
20 50 80 110 130
93
100
concentrao
80
60 QED
40 HS
20
0
20 50 80 110 130
minutos
100
concentrao
80
60 QED
40 HS
20
0
20 50 80 110 130
minutos
94
6.5 Estudo para verificar a estabilidade do etanol atravs do sistema
Q.E.D. A 150
60 58,33 57 56,33
90 82,33 80 79,66
95
7. DISCUSSO
96
O sistema escolhido se enquadra nas condies do DOT, que define uma
tcnica de triagem para determinao de lcool como um sistema para
detectar a presena de 20 mg/dL ou mais de lcool no sangue, podendo ser
utilizado para esta finalidade qualquer fluido biolgico, porm o resultado deve
expressar a alcoolemia (DUBOWSKI, 2002).
A coleta foi efetuada pelos prprios doadores que foram instrudos para inserir
na cavidade oral os swabs do sistema Q.E.D., mantendo-os em movimentos
circulares durante um minuto. No geral, esse procedimento foi adequado para a
completa saturao do algodo e tambm garantiu a obteno de um
homogeneizado de saliva provenientes das secrees das glndulas
existentes na cavidade oral.
Em alguns casos foi verificado que este tempo no foi suficiente para a
obteno da quantidade de saliva necessria para a realizao da anlise.
Nestes, uma nova coleta foi efetuada com a orientao de que os doadores da
amostra deveriam permanecer com o basto coletor swab na boca por
um perodo maior. O controle de qualidade do Q.E.D. A 150 permitiu evidenciar
com segurana quando o volume de amostra fornecido era insuficiente.
97
As leituras foram realizadas exatamente aps 2 minutos da insero do swab
no canal onde ocorre a reao qumica, pois findo esse tempo poderia haver
uma retrao no volume da amostra na coluna que indica a concentrao de
etanol, levando a uma leitura abaixo do valor real.
98
Os estudos de otimizao das condies cromatogrficas foram iniciados com
a aplicao dos parmetros propostos por Corra, (1997; 2001). A temperatura
selecionada para a operao da coluna foi a de 130C e a razo da diviso split
foi alterada para 1/10. O modo split foi adotado prevendo a possibilidade da
ocorrncia nas anlises de elevadas concentraes de etanol, devido a sua
facilidade de volatilizao. Assim, a diviso da amostra impediria uma possvel
saturao da coluna capilar e permitiria uma melhor resoluo cromatogrfica,
tendo como conseqncia a obteno de picos mais adequados.
Os tempos de reteno obtidos, 2.28 min para o etanol e 5.31 min para o
padro interno foram adequados finalidade. O uso do n-propanol, como
padro interno, foi apropriado por ser da mesma funo qumica do etanol. Nos
experimentos realizados a sua concentrao de referncia foi fixada em 0,6
g/L, por apresentar como resultado uma rea apropriada aos clculos da
concentrao de etanol.
99
Na fase de padronizao tambm foram realizados experimentos in vivo com a
utilizao de salivas coletadas em diferentes tempos 20, 50, 80, 110 e 130
minutos aps a ingesto controlada de bebidas alcolicas pelos voluntrios
(Grupo II A).
100
Em todas as amostras coletadas nos diferentes tempos foi possvel determinar
a concentrao de etanol, no foi observado a presena de interferentes devido
as substncias presentes na saliva, mostrando a aplicabilidade do mtodo
padronizado e os valores de relao das reas (etanol / n-propanol) obtidos
nos experimentos in vitro (5.2.2.1) e in vivo foram satisfatrios demonstrando
que o mtodo para determinao de etanol proposto por Correa, 1997 para
sangue e urina pode ser aplicado em saliva.
O mtodo se mostrou linear nas concentraes de 0,01 a 3,0 g/L (TABELA 18);
a concentrao inicial foi escolhida por ser o limite de quantificao do mtodo
e a final por ser uma concentrao bem acima das concentraes passveis de
serem encontradas em anlises realizadas com essa finalidade. O coeficiente
de variao (CV) obtido foi menor que 5% e o coeficiente de determinao (R 2)
foi de 0,9986 (FIGURA 10).
101
A preciso do mtodo foi avaliada, segundo seus coeficientes de variao,
atravs da anlise de 3 nveis de concentraes 0,03; 0,3 e 1,5 g/L, que
apresentaram os seguintes valores, respectivamente intraensaio 1,7; 2,8 e
10,7% e interensaio 3,1; 3,2 e 4,0%. Os valores encontrados foram adequados
a finalidade de anlise.
102
Considerando o esquema de tempo adotado para a coleta foi observado que a
concentrao mxima de etanol na saliva foi atingida aos 70 minutos aps o
incio do consumo da bebida, leituras efetuadas aos 50 min , resultado
prximo dos relatados em estudos anteriores.(JONES, 1995; GUBALA &
ZUBA, 2002).
103
Diversos fatores contribuem para explicar essas diferenas interindividuais
como o sexo; volume de distribuio e raa. Outro fator a ser considerado a
diferena na velocidade de eliminao do etanol entre bebedores no habituais
de 12 a 15 mg/dL por hora e bebedores contumazes de 30 a 50 mg/dL
por hora.
104
Os resultados obtidos nas amostras coletadas com cido ctrico foram
semelhantes ao experimento realizado com voluntrios do Grupo II B, pois a
diferena entre as tcnicas - cromatogrfica e sistema Q.E.D. A 150 -, foi de
29% maior. Contudo, essa diferena diminuiu para 22% quando se utilizou o
Salivette sem o cido ctrico.
Os fatos acima discutidos levam a inferir que o tempo decorrido entre a coleta e
a anlise e a presena do cido ctrico seriam fatores que influenciariam nas
diferenas observadas nos resultados, sendo que aproximadamente 9% estaria
relacionado ao tempo e 6% presena do cido ctrico. Com base nessas
consideraes a diferena real entre os resultados das duas tcnicas seria
cerca de 14%. Este nvel de diferena encontra-se dentro do padro aceitvel
de anlise, considerando que uma tcnica de triagem e a outra de referncia.
105
No experimento para verificar a estabilidade, os coletores utilizados para a
obteno do pool de saliva foram imediatamente centrifugados aps a coleta,
o que no acontecia nos experimentos anteriores, j que estes eram
centrifugados no momento da anlise, realizada aps 24 horas. Provavelmente
o procedimento de centrifugao promove um rompimento das paredes das
bactrias encontradas na cavidade oral e assim impediria que estes
microorganismos interferissem na concentrao de etanol pelo processo de
fermentao devido a presena de acares existentes nessa amostra.
106
A anlise dos resultados obtidos demonstra o quanto complicado estabelecer
uma legislao com aplicaes de sanes tendo por base a alcoolemia.
Contudo, em todas as amostras coletadas nos diferentes tempos foi possvel
determinar a concentrao de etanol, mostrando a aplicabilidade do mtodo
padronizado.
De acordo com Gubala & Zuba, (2002) a determinao de etanol em saliva era
at o presente utilizada como mtodo de triagem, apesar do valor da
concentrao de etanol nessa matriz ser amplamente correlacionada com os
encontrados no sangue. Na opinio desses autores a saliva constitui de uma
matriz adequada para verificar a sobriedade com propsitos forenses.
107
8. CONCLUSES
A saliva uma amostra alternativa que poderia ser utilizada para verificar a
exposio de indivduos a bebidas alcolicas.
108
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128
10. ANEXOS
ANEXO I
129
130
ANEXO II
131
Identificao da amostra: N...................
QUESTIONRIO
1. Dados pessoais:
Sexo:
( ) Masculino ( ) Feminino
Idade:.................anos
132
ANEXO III
133
I DADOS DE IDENTIFICAO DO SUJEITO DA PESQUISA
1. Nome :
...............................................................................................................................
...............................................................................................................................
134
III - REGISTRO DAS EXPLICAES DO PESQUISADOR AO VOLUNTRIO
OU SEU REPRESENTANTE LEGAL SOBRE A PESQUISA CONSIGNANDO:
135
V INFORMAES DE NOMES, ENDEREOS E TELEFONES DOS
RESPONSVEIS PELO ACOMPANHAMENTO DA PESQUISA:
VI OBSERVAES COMPLEMENTARES:
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Declaro que, aps convenientemente esclarecido pelo pesquisador e ter
entendido o que me foi explicado, consinto em participar do presente
Protocolo de Pesquisa.
Prezado participante
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Estou desenvolvendo um estudo para a determinao de lcool (etanol) em
saliva e para tal necessito de sua participao.
Sendo o lcool uma droga de uso lcito e o alcoolismo uma doena
importante adoo de medidas que colaborem na reduo de seu consumo,
pois a ingesto de lcool est intimamente relacionada com: acidentes no
trnsito e ocorrncias no ambiente de trabalho e internaes em clnicas e
hospitais. Dessa forma necessrio desenvolver mtodos que permitam
verificar a concentrao de etanol no organismo, possibilitando que pessoas
(inclusive voc) bebam de acordo com seus limites biolgicos, evitando a
exposio a riscos desnecessrios.
O objetivo desse estudo investigar a possibilidade de utilizao da amostra
de saliva como matriz alternativa para determinao de etanol em campo
aberto, substituindo as matrizes convencionais atualmente utilizadas.
O estudo no oferece riscos para participante, pois as coletas de saliva so
feitas com coletores individuais e especficos, no tendo carter invasivo e no
transmitindo nenhum risco de contaminao para o participante.
Voc poder escolher entre as bebidas: cerveja e usque e a quantidade a ser
ingerida deve ser proporcional ao seu peso, no ultrapassando 0,68g/Kg de
etanol, concentrao que no ocasiona embriaguez. A ingesto da bebida
ocorrer em 20 (vinte) minutos e aps isso sero realizadas coletas de saliva
no intervalo de 50 (cinqenta) a 130 (cento e trinta) minutos.
O estudo annimo e a confidencialidade de sua participao ser preservada.
A identificao das amostras ser feita apenas atravs de uma numerao
impressa nos coletores de saliva e nos testes rpidos aplicados. As dvidas
podero ser esclarecidas pelo Prof. Dr. Ovandir Alves Silva ou por mim no
telefone (11) 3889-8960.
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TERMO DE AUTORIZAO
Eu............................................................Identidade n.......................................
autorizo a coleta de amostras de saliva aps ter sido esclarecido pelo
responsvel pela pesquisa e ter entendido os procedimentos de coleta.
Data......./........./........ ___________________________
Assinatura do doador
da amostra
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