SELECCIN DE MICROORGANISMOS PARA PRODUCCIN

DE VITAMINA B12
Romildo M. Sampaio, Ranulfo M. Alegre
Departamento de Engenharia de Alimentos - FEA - UNICAMP, Brasil

La fermentacin de vitamina B12 puede ser considerada un proceso industrial relativamente bien
establecido, pero an necesita ser mejorado. De esta forma, la elaboracin de este trabajo fue motivada
por la posibilidad de estudiar las condiciones ptimas de la fermentacin de vitamina B12. Se presentan
adems, los resultados referentes a la evaluacin y optimizacin de las variables experimentales y la
obtencin de parmetros cinticos de la fermentacin. Se estudiaron siete microorganismos, tres
composiciones de medios de cultivo y dos tipos de substratos. Los resultados mostraron que Pseudomonas
P3 y Propionibacterium jensenii tuvieron los mayores rendimientos de vitamina B12 (3,86 y 2,93 g
B12/mL respectivamente) utilizando sacarosa como substrato.
Palabras claves: vitamina B12, fermentacin, Propionibacterium, Pseudomonas.

The key step in the great majority of studies of the B12 production is the selection of the microorganisms
producers and a better understanding of the fermentation. In order to improve the vitamin B12
production, the purpose of this study was to investigate the influence of the different microorganisms
producers and culture media in the vitamin production. The results showed that the higher yields - 3,86
and 2,93 g B12/mL- were achieved with Pseudomonas P3 and Propionibacterium jensenii cultivated
using sucrose with main carbon source.
Key words: vitamin B12, fermentation, Propionibacterium, Pseudomonas.

Introduccin orden de cinco millones de dlares (Trade Point

Las vitaminas son substancias orgnicas ex-
tremadamente necesarias para muchas formas de
vida. Gran parte de los microorganismos vivos no
pueden sintetizarlas y deben, de esta forma, obte-
nerlas de fuentes externas.
La vitamina B12 fue descubierta como resul-
tado de investigaciones sobre anemia
megaloblstica. Su aislamiento se dio en 1948,
pero su sntesis qumica completa slo fue obte-
nida en 1973. Sin embargo, debido al gran nme-
ro de etapas involucradas, el procedimiento no
alcanz inters industrial. Actualmente, la vita-
mina B12 es producida exclusivamente por va
fermentativa. Segn Spalla et al. /1/, debido a sus
implicaciones en reacciones qumicas importan-
tes, la vitamina B12 origin gran inters y tiles
aplicaciones en la salud, tanto de personas como
de animales.
La produccin mundial de vitamina B12 vara
de 5 a 10 toneladas/ao, con un precio medio de
$ 5 000/kg (USD) /2/. Brasil se ha tornado a un
tradicional importador, con compras anuales del
de Campinas, So Paulo, 1997).
La vitamina B12 pertenece a un grupo de
molculas grandes y complejas, denominadas
cobalto-corrinoides. Todos los cobalto-
corrinoides cuyo ligante axial inferior de molcu-
la es el 5,6 dimetilbenzimidazol son conocidos
como cobalaminas. De la misma forma, si el
ligante axial superior est constituido por un
radical ciano, se obtiene la cianocobalamina o la
verdadera vitamina B12. /3/
A medida que la investigacin de la vitamina
B12 evolucion, se torn claro que la mejor
fuente productora es representada por los micro-
organismos. Actualmente, ella es sintetizada por
una gran variedad de bacterias, destacndose los
gneros Pseudomonas, Propionibacterium y
Corynebacterium. /1/
De acuerdo con Quesada-Chanto et al. /4/,
Cummin y Johnson /5/ y Keuth y Bisping /6/, la
uti-lizacin de Pseudomonas y Propionibacterium
se ha justificado, debido al hecho de que esas
bacterias y sus mutantes presentan ventajas, tales
como el aumento intracelular del contenido de

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vitamina, alta productividad y un rpido creci-
miento.
El objetivo de este trabajo es estudiar las condi-
ciones ptimas de produccin de vitamina B12.
Para esto, fue efectuado un "screening" con bacte-
rias del gnero Propionibacterium y Pseudomonas,
as como una seleccin de la mejor fuente de substrato
y de la mejor composicin del medio de cultivo.
Materiales y mtodos
Microorganismo
Se realiz un "screening" con cuatro lneas de
bacterias, descritas en la literatura como buenas
productoras de vitamina B12: Propionibacterium
freudenreichii ATCC 9614, Propionibacterium
jensenii DSM 20274, Propionibacterium shermanii
ATCC 6207 y Pseudomonas sp. ATCC 13867. Los
tres primeros cultivos fueron conservados en medio
lquido a 4 C, mientras que la Pseudomonas sp. fue
mantenida en un tubo inclinado, con 1,5 % de agar
a 4 C.
Obtencin de los mutantes
La bacteria Pseudomonas sp. fue sometida a
un tratamiento qumico, usando concentraciones
crecientes de 5,6 dimetilbenzimidazol (5,6 DMI),
con el propsito de obtener mutantes que mostra-
sen mayores rendimientos de vitamina B12. Se-
gn Garofano y Merli (apud. por Spalla et al. /1/
), como solamente aquellos microorganismos que
sintetizan vitamina B12 pueden metabolizar
5,6 DMI, es posible obtener mutantes de
Pseudomonas sp. resistentes a altas concentra-
ciones del mismo.
Se hicieron experimentos usando concentra-
ciones de 5,6 DMI variando desde 25 mg/L hasta
1 g/L. En cada experimento fueron observados
cambios en relacin con la morfologa, creci-
miento del microorganismo y la produccin de
vitamina B12. Los mutantes obtenidos fueron
aislados en placas de Petri y mantenidos en tubos
de ensayo conteniendo el medio de cultivo apro-
piado y agar.
92
Substrato
Se evaluaron dos azcares como principales
fuentes de carbono: sacarosa y lactosa. La sacaro-
sa provino de un azcar comercial que contena
99,8 % de pureza, mientras que la lactosa fue
obtenida a partir de la ultrafiltracin del suero de
queso en polvo reconstituido. El filtrado obteni-
do fue diluido a fin de obtenerse las concentracio-
nes deseadas de lactosa. La ultrafiltracin del
suero de queso se efectu en una unidad del tipo
"Alfa-Laval-UFS 1", con una membrana "cut-
off" de 10 000 Daltons.
Medios de cultivo
Se evaluaron tres composiciones de medios de
cultivo, descritos como eficientes para el creci-
miento de Propionibacterias y Pseudomonas. Cada
medio fue evaluado usando sacarosa y lactosa como
substrato. En esta etapa del trabajo, para el desarro-
llo de los experimentos se utiliz un diseo factorial
completo. Los medios de cultivo empleados fueron
los siguientes:
Medio 1: Descrito por Florent /3/, usado para los
experimentos con Pseudomonas sp. y
sus mutantes. La composicin en (g/L)
fue: substrato=100; extracto de
l e v a d u r a = 2 ; ( N H 4) 2H P O 4= 5 ;
MgSO 4 .7H 2 O=3; MnSO 4 .H 2 O=0,2;
CoCl2.6H2O=0,02; ZnSO4.7H2O=0,02;
Na2MoO4.2H2O=0,005; Betana=10; 5,6
DMI=0,025; pH 7,4; T=29 C, agitacin
300 r/min aireacin 1 VVM.
Medio 2: Descrito por Quesada-Chanto et al. /
7/, usado para las fermentaciones con
Propionibacterias. La compo- sicin en
(g/L) fue: substrato=90, extracto de le-
vadura=10; KH 2 PO 4 =2;
MgSO4.7H2O=0,2; CoCl2.6H2O=0,02;
FeSO4 .7H2 O=0,005; (NH4 )2HPO4=4;
MnSO4.H2O=0,005; CaCl2.2H2O=0,02;
5,6 DMI=0,025; pH 6,8; T=29 C, agita-
cin 300 r/min, aireacin 0,5 VVM.
Medio 3: Descrito por Florent y Nine /8/, usado
para Propionibacterias. Su composicin
en (g/L) fue: substrato=100;
milosina=40; CoCl2.6H2O=0,02; 5,6
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 DMI=0,025; pH 7,0; T=29 C, agitacin
300 r/min, aireacin 0,5 VVM.
Fermentacin
Las fermentaciones fueron conducidas en fras-
cos agitados (erlenmeyers de 1 000 mL), los cuales
fueron adaptados para que se hiciera un control de
la aireacin y del pH. En los experimentos que
envolvieron Propionibacterias, que son
microaeroflicas, los frascos fueron llenados con
800 mL del medio de cultivo, y las fermentaciones
fueron conducidas bajo condiciones anaerbicas en
las primeras 64 h y aerbicas en las 64 h siguientes.
Este procedimiento fue descrito por Prez-Mendoza
y Garca-Hernandez /9/. Cuando el microorganis-
mo utilizado fue la Pseudomonas (aerbica), el
erlenmeyer contena un volumen de 500 mL, con
aireacin y agitacin eficientes, durante 120 h de
fermentacin.
Anlisis
La concentracin celular se determin al final
de la fermentacin por densidad ptica. Dos
alcuotas de igual volumen fueron extradas del
medio de fermentacin, centrifugadas y lavadas.
Posteriormente, una alcuota fue secada, mien-
tras que la otra fue sometida a diluciones conoci-
das, a fin de relacionar la concentracin celular
(g/L) vs absorbancia (610 nm). Ese procedimien-
to sigui la metodologa descrita por Quesada-
Chanto et al /7/.
La determinacin de la vitamina B12 a partir
del caldo de fermentacin fue hecha por el mto-
do qumico descrito por Rudkin y Taylor /10/ y
Fisher 11/, siguiendo la metodologa de extrac-
cin descrita por Marwaha et al. /12/ y Quesada-
Chanto et al. /7/, basada en la complexacin y
conversin de la cobalamina en cianocobalamina,
en presencia de NaCN. Despus de la extraccin,
la solucin final tuvo su absorbancia leda a
582 nm, contra una solucin patrn de
cianocobalamina de 100 mg/mL.
Cianocobalamina de la Sigma fue usada como
patrn. Los resultados de la determinacin de la
vitamina B12 por el mtodo qumico fueron pe-
ridicamente comparados con un mtodo micro-
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biolgico descrito por AOAC /13/, basado en el
crecimiento de un microorganismo evaluado -
Lactobacillus leishmanii ATCC 7830.
Resultados y discusin
Obtencin de los mutantes de Pseudomonas sp
Conforme fue descrito en el epgrafe tem 2.2.,
la bacteria Pseudomonas sp. fue sometida a un
tratamiento qumico, con concentraciones cre-
cientes de 5,6 DMI, con vistas a la obtencin de
mutantes que produjeran mayores rendimientos
de vitamina B12. Segn Spalla et al. /1/ como el
5,6 DMI es un nucletido importante en la
biosntesis de la vitamina B12, y solamente aque-
llos microorganismos productores de la misma
son capaces de metabolizarla, es posible obtener
mutantes de microorganismos que necesiten del
nucletido, pero no estn aptos para sintetizarlos,
como es el caso de las Pseudomonas. Todos los
mutantes aislados fueron evaluados con los dos
tipos de substratos.
Utilizando concentraciones de 5,6 DMI va-
riando desde 25,0 mg/L hasta 1,0 g/L, fueron
aislados tres mutantes, nombrados como
Pseudomonas P1 , Pseudomonas P2 y
Pseudomonas P3, que mostraron caractersticas
morfolgicas diferentes en relacin con la cultu-
ra original. Los tres mutantes fueron obtenidos
cuando la concentracin de 5,6 DMI alcanz el
valor de 800 mg/L, mientras que para la concen-
tracin de 1,0 g/L no hubo crecimiento de los
mismos. Los tres mutantes aislados mostraron
mejoras significativas cuando los comparamos
con el cultivo original. Los parmetros observa-
dos: rendimiento de vitamina B12, concentracin
celular y consumo de substrato fueron mayores
segn puede ser observado en la tabla 1.
Adems, de acuerdo con la tabla 1, se observa
que entre los mutantes el P3 present los mejores
rendimientos, siendo la produccin de vitamina
B12, en relacin con el cultivo original, aproxi-
madamente 5 veces mayor cuando se utiliz saca-
rosa como substrato y 1,5 veces mayor cuando la
lactosa fue utilizada. Tambin hubo una mayor
eficiencia en el consumo del substrato, permi-
tiendo mayores rendimientos celulares. Quesada-
93
 Tabla 1
Valores del rendimiento de la vitamina B12, concentracin celular y consumo de substrato, para
Pseudomonas sp. y sus mutantes
Cultivo Substrato B12 Conc. celular Consumo substrato
(g/mL) (g/L) (%)
Pseudomonas Sacarosa 0,68 2,40 20,1
Mutante P1 Sacarosa 2,50 3,30 58,7
Mutante P2 Sacarosa 2,85 2,65 14,2
Mutante P3 Sacarosa 3,86 6,06 81,4
Pseudomonas Lactosa No Detectable 1,80 9,2
Mutante P1 Lactosa No Detectable 1,93 9,5
Mutante P2 Lactosa 0,95 1,70 10,3
Mutante P3 Lactosa 1,40 1,49 19,2

Chanto et al. /7/, tambin obtuvo mejores resul-
tados cuando utiliz sacarosa como substrato
para la produccin de vitamina B12.
Seleccin de los microorganismos
De acuerdo con los resultados descritos en el
epgrafe 3.1, los experimentos para la obtencin de
los mutantes permitieron seleccionar el microorga-
nismo Pseudomonas P3 y la sacarosa como substrato,
para las etapas posteriores del trabajo: anlisis y
optimizacin de las variables experimentales y la
obtencin de los parmetros cinticos.
Adems de la Pseudomonas sp., tres bacterias
ms, - Propionibacterium freudenreichii, P.
jensenii y P. shermanii, fueron empleadas para la
etapa de "screening". Cada una de ellas se evalu
usando dos composiciones de medio de cultivo
(medio 2 y medio 3) y dos substratos (sacarosa y
lactosa). La tabla 2 presenta los resultados obte-
nidos para las fermentaciones. Como se observa,
los mejores rendimientos fueron obtenidos por el
Propionibacterium jensenii, alcanzando un mxi-
mo de 2,93 g B12/mL de medio. Para esta
corrida, el consumo de sacarosa fue de 16,8 % y
la produccin celular de 4,78 g/L. El medio de
composicin 2 y la sacarosa propiciaron los me-
jores rendimientos cuando se utiliz el
Propionibacterium jensenii. Tal comportamien-
to no se repiti para el Propionibacterium
freudenreichii y el P. shermanii, donde la lactosa
y el medio 3 promovieron los mejores rendimien-
tos de vitamina B12.

Tabla 2
Valores del rendimiento de vitamina B12, concentracin celular (X) y consumo de substrato, para
Propionibacterium freudenreichii, P. jensenii y P.shermanii
Cultivo Medio/Substrato B12 Conc. celular Consumo substrato
(g/mL) (g/L) (%)
P. jensenii 2 Sacarosa 2,93 4,78 16,8
P. freudenreichii 2 Sacarosa 1,78 1,08 3,0
P. shermanii 2 Sacarosa 0,83 0,56 1,3
P. jensenii 2 Lactosa 2,02 1,72 25,5
P. freudenreichii 2 Lactosa 2,08 4,51 36,3
P. shermanii 2 Lactosa 1,43 2,39 16,9
P. jensenii 3 Lactosa 1,72 1,30 14,5
P. freudenreichii 3 Lactosa 2,14 5,57 33,6
P. shermanii 3 Lactosa 1,38 2,43 10,2
P. jensenii 3 Sacarosa 1,98 1,84 10,2
P. freudenreichii 3 Sacarosa 1,29 1,60 3,8
P. shermanii 3 Sacarosa 0,97 0,79 2,1

94 TECNOLOGA QUMICA Vol. XIX, No. 2, 1999

 Tabla 3
Valores de YX/S y B12/X para los mejores rendimientos de cada microorganismo
Cultivo Medio/Substrato
Pseudomonas P3 1 Sacarosa
Prop. jensenii 2 Sacarosa
Prop. Freudenreichii 3 Lactosa
Prop. shermanii 2 Lactosa
De acuerdo con la tabla 3, para los mayores
rendimientos de vitamina B12 obtenidos con cada
microorganismo, los valores del rendimiento celu-
lar, YX/S (0,07 a 0,25) no fueron elevados. Quesada-
Chanto et al. (1997) obtuvieron valores de YX/S de
hasta 0,7; sin embargo, segn ellos, cuando se
utilizan bajas tasas de aireacin se favorece la
produccin intracelular de vitamina B12, disminu-
yendo la concentracin celular, y consecuentemen-
te, el valor del rendimiento celular. Por otro lado,
los valores obtenidos para el rendimiento B12/X
(tabla 3), se situaron en el rango descrito en la
literatura por algunos autores, que consiguieron
valores de 0,4 a 1,12 mg B12/g clula seca para B12/
X (Quesada-Chanto et al. /4/, Marwaha et al. /12/ y
Bainotti et al. /14/).
Conclusiones
Los resultados obtenidos nos permiten afirmar
que de las siete lneas de bacterias estudiadas, la
Pseudomonas P3 y el Propionibacterium jensenii
mostraron los mayores rendimientos en trminos de
vitamina B12. De la misma forma, la sacarosa
pareci ser la fuente de substrato ms indicada para
la continuidad de los trabajos, permitiendo la obten-
cin de mejores rendimientos de B12, concentra-
cin celular y consumo de substrato, en compara-
cin con aqullos donde se utiliz la lactosa como
fuente de substrato. En relacin con los medios de
cultivo, los ms indicados fueron los de composi-
cin 1 y 2 para Pseudomonas P3 y Propionibacterium
jensenii, respectivamente.
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0,17 0,38
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