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Bacillus thuringiensis: caractersticas gerais e fermentao

Bacillus thuringiensis: general characteristics and fermentation

Elisangela Andrade Angelo1*; Gislayne Trindade Vilas-Bas2;


Ral Jorge Hernan Castro-Gmez3

Resumo
O controle de insetos realizado, em sua maioria, por produtos qumicos; cujos efeitos cumulativos
ocasionam grandes prejuzos ambientais e sade humana, destacando-se ainda a rpida seleo de
insetos resistentes. O controle biolgico por entomopatgenos uma alternativa eficiente, principalmente
devido a sua alta especificidade, ausncia de resistncia nos insetos alvos e baixo efeito residual no
ambiente. Bacillus thuringiensis uma bactria Gram-positiva esporulante, produtora de cristais
proticos com atividade inseticida. Apesar do amplo uso B. thuringiensis no controle biolgico, h
poucos trabalhos publicados quanto a sua multiplicao, esporulao e produo de cristais, visto que
muitas informaes so segredos industriais. Esta reviso teve por objetivo reunir informaes gerais
sobre B. thuringiensis, bem como quanto sua produo em meios de cultivo.
Palavras-chave: Bacillus thuringiensis, entomopatgeno, bioinseticida, controle biolgico,
fermentao

Abstract
The insect control is carried out mostly by chemical products, whose cumulative effects cause serious
losses to environmental and human health, highlighting rapid selection of resistant insects. Biological
control by entomopathogenic bacteria is an efficient alternative, mainly due to high specificity, absence
of resistance in the target insects and low environment residual effect. Bacillus thuringiensis is a Gram-
positive spore-forming bacterium that produces a parasporal crystal protein toxic for many insect
species. Despite the widespread use of B. thuringiensis based products in biological control of insects,
there are little studies about its multiplication, sporulation and crystal production, as so many trade
secrets information. This revision was aimed at gathering general information about B. thuringiensis, as
well as its production in culture media.
Key words: Bacillus thuringiensis, entomopathogenic bacterium, bioinsecticide, biological control,
fermentation

1
Mestre em Cincia de Alimentos, Departamento Cincia e Tecnologia de Alimentos DCTA-CCA, Universidade Estadual de
Londrina UEL. E-mail: zanele77@gmail.com.br
2
Professora Doutora do Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina, UEL. E-mail: gvboas@uel.br
3
Professor Doutor do Departamento Cincia e Tecnologia de Alimentos, Universidade Estadual de Londrina, UEL/CCA. E-mail:
rcastro@yahoo.com
*
Autor para correspondncia
Recebido para publicao 26/01/09 Aprovado em 07/04/10
945
Semina: Cincias Agrrias, Londrina, v. 31, n. 4, p. 945-958, out./dez. 2010
Angelo, E. A.; Vilas-Bas, G. T.; Castro-Gmez, R. J. H.

Introduo A comercializao de bioinseticidas corresponde


a cerca de 5% do mercado mundial de pesticidas.
Estima-se que existam cerca de 2,5 milhes de
Porm, o uso destes produtos vem crescendo dez
espcies de insetos, das quais 10% causam danos ao
vezes mais do que o uso de inseticidas qumicos
ser humano ou perdas econmicas na pecuria ou
(BRAR et al., 2006). As bactrias destacam-se
na agricultura (ALVES, 1998). Muitas doenas de
como promissoras no controle biolgico. Entre
interesse da sade pblica, como malria, dengue,
estes microrganismos, Bacillus thuringiensis (Bt)
febre amarela, filariose e doena de Chagas so
o mais utilizado. Estima-se que os produtos
transmitidas por insetos vetores. Em geral, os pases
base dessa bactria correspondam a cerca de 90%
mais atingidos por estas doenas so os tropicais
do mercado mundial de bioinseticidas (VILAS-
e subtropicais, devido principalmente s suas
BAS; PERUCA; ARANTES, 2007). Os maiores
caractersticas climticas favorveis proliferao
produtores de produtos base de B. thuringiensis
de insetos. O crescente aquecimento global demanda
so Estados Unidos e Canad, que respondem por
preocupao especial, estendendo s reas propcias
cerca de 50% da produo mundial (TAMEZ-
a esta proliferao tambm a regies atualmente
GUERRA et al., 2001).
com clima temperado (ABDEL-HAMEED, 2001;
BECKER; MARGALIT, 1993; TALUIL, 2002). O Brasil um pas de clima tropical cuja economia
bastante ligada agricultura, onde insetos causam
O controle atual da populao de insetos
perdas substanciais na produo alimentar, alm de
realizado, principalmente, por inseticidas qumicos,
serem vetores de uma variedade de doenas como
cujo uso indiscriminado e massivo causa danos
dengue, malria e febre amarela (FORATTINI et
ambientais e sade humana. Produtos qumicos
al., 1995; SERUFO et al., 1993; TALUIL, 2002).
com alta toxicidade, porm com baixa especificidade
Na sua maioria, o controle efetivo de insetos tem
e alto efeito residual, prejudicam o meio ambiente,
sido feito com inseticidas sintticos, sendo pouco
alm de contriburem para a existncia de
utilizados produtos base de B. thuringiensis, uma
considervel nmero de espcies de insetos com
vez que, no Brasil existe apenas uma nica empresa
populaes resistentes, inviabilizando a aplicao
que produz e comercializa formulaes nacionais
de tais produtos (ALVES, 1998; ARANTES et al.,
base desta bactria.
2002).
A maioria dos produtos base de B. thuringiensis
Uma alternativa aos inseticidas qumicos o
encontrados no mercado nacional importada, o
controle biolgico, que pode ser feito com o uso
que causa aumento no preo final ao consumidor
racional de entomopatgenos, que constituem os
e conseqente diminuio da competitividade
componentes ativos dos bioinseticidas ou inseticidas
destes produtos em relao a inseticidas sintticos.
biolgicos. Entre as vantagens dos bioinseticidas
Este quadro demonstra a necessidade de produo
destacam-se: alta especificidade, menor risco
nacional de formulaes base de B. thuringiensis,
ambiental e sade humana, menor freqncia de
os quais poderiam ser empregados em programas
resistncia nos insetos alvo e a possibilidade do
locais de controle de insetos, como sugerido por
entomopatgeno se multiplicar no ambiente e, com
vrios autores (COUCH; ROSS 1980; SALAMA;
isso, aumentar sua permanncia. Como desvantagem
MARGALIT, 1993; ALVES et al., 1997; MORRIS;
principal destaca-se maior suscetibilidade s
KANAGARATNAM; CONVERSE, 1997; VORA;
condies ambientais, o que pode ser atenuado com
SHETHNA, 1999; POOPATHI; KUMAR, 2003;
o uso de boas formulaes e estudos para aplicao
PRABAKARAN; BALARAMAN, 2006).
dos produtos, a fim de torn-los mais resistentes
s condies ambientais e com maior tempo de A produo de formulaes base de B.
prateleira (ALVES, 1998). thuringiensis passa por diversas fases como a
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escolha de uma linhagem geneticamente estvel, entre 10 e 45 C. B. thuringiensis apresenta um


altamente txica aos insetos alvo e que no apresente amplo complexo enzimtico, o que lhe permite
necessidades nutricionais exigentes para a sua utilizar uma variedade de substratos. A principal
produo em meio de cultivo, o que pode encarecer caracterstica que distingue a espcie das outras do
a produo. Aps a seleo, feito um estudo sobre mesmo gnero a presena intracelular de um cristal
sua produo em escala menor e posteriormente protico, cuja produo foi descoberta somente em
em grande escala. Concomitante a esses estudos 1953 por Hannay (GLARE; OCALLAGHAN,
ou aps a otimizao da produo, faz-se o estudo 2000; HABIB; ANDRADE, 1998; MORAES;
da formulao, a qual tem por objetivo aumentar CAPALBO; ARRUDA, 2001; VILAS-BAS;
a permanncia do produto no ambiente onde ser PERUCA; ARANTES, 2007).
aplicado e facilitar sua aplicao. So feitos tambm
A produo de cristais proticos representa
testes da toxicidade do produto, tanto em condies
uma caracterstica tpica de B. thuringiensis e,
de laboratrio como em condies de campo
em geral, ocorre durante a esporulao. Estes
(COUCH, 2000). Muitas informaes referentes a
cristais apresentam atividade entomopatognica
esses estudos no so divulgadas, por serem segredos
para vrias espcies de insetos, destacando-se as
industriais dos produtores de bioinseticidas.
Ordens dos lepidpteros, dpteros e colepteros.
O objetivo desta reviso apresentar aspectos Porm, h subespcies de B. thuringiensis que
gerais da biologia de B. thuringiensis, bem como de apresentam cristais txicos contra insetos das
aspectos relacionados sua produo. Ordens Himenoptera, Hemiptera, Orthoptera,
Phthraphera e tambm para alguns nematides,
protozorios e caros (BRAR et al., 2006; GLARE;
A base da entomopatogenicidade de Bacillus OCALLAGHAN, 2000; SCHNEPF et al., 1998).
thuringiensis
Os cristais de B. thuringiensis so formados
Bacillus thuringiensis foi descrito em 1915 principalmente por protenas denominadas Cristal
na Alemanha, isolado a partir de traa de farinha (Cry), antigamente conhecidas como -endotoxinas
(Anagasta kuehniella). Anteriormente, em 1902, (BRAVO; GILLB; SOBERN, 2007). Ao final da
no Japo, o pesquisador Ishiwata j havia isolado esporulao, o cristal protico corresponde a cerca
uma bactria a partir de Bombyx mori, que de 20% a 30% do peso seco da clula, sendo liberado
posteriormente se soube ser tambm uma subspcie no momento da lise celular (ARANTES et al., 2002;
de B. thuringiensis. A comercializao do primeiro GLARE; OCALLAGHAN, 2000).
produto base de B. thuringiensis foi iniciada
em 1938 na Frana, com o nome de Sporeine
(BRAR et al., 2006; CAPALBO; VILAS-BAS; Protenas Cry
ARANTES, 2004).
As protenas Cry so consideradas como os
Pertencente famlia Bacillaceae, a qual engloba principais constituintes dos cristais que caracterizam
a maioria das espcies formadoras de esporos, B. B. thuringiensis, so codificadas por genes que
thuringiensis um bastonete Gram-positivo, com geralmente se localizam em plasmdios e, com
clula vegetativa de 1,0 a 1,2 m de largura por 3,0 menor freqncia, no cromossomo bacteriano.
a 5,0 m de comprimento, geralmente mveis. O Atualmente esto descritas 436 protenas Cry, sendo
esporo dessa bactria possui formato elipsoidal e que a cada ano novas protenas so descobertas.
localiza-se na regio central ou paracentral quando Somente no ano de 2008 foram descritas 42 novas
no interior da clula-me. A espcie aerbia no protenas (CRICKMORE et al., 2008). Existe um
estrita com faixa de temperatura de crescimento banco de dados on-line que, periodicamente, atualiza
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a classificao e nomenclatura das protenas Cry receptores especficos, induziria uma srie de
(CRICKMORE et al., 1998, 2008). De acordo com reaes intracelulares, que envolvem a protena
a definio mais aceita, uma protena considerada G e a adenilato ciclase, resultando no aumento da
Cry, quando forma uma incluso paraesporal concentrao de adenosina monofosfato cclico
(cristal) em B. thuringiensis, exibe algum grau de (AMPc) intracelular e ativao da protena quinase
toxicidade a insetos alvos, ou apresente seqncia de A. Todas essas conseqncias provocariam
aminocidos similar a uma protena Cry j descrita um desequilbrio da presso interna celular,
(BRAVO; GILLB; SOBERN, 2007; SCHNEPF, danificando-a (BRAVO; SOBERN, 2008).
et al, 1998).
A ao das toxinas, seja por qualquer um dos
As protenas Cry so sintetizadas na forma de modelos, resulta na paralisia do aparelho digestrio,
protoxinas. Desta forma, sua ao depende de ocasionando morte por inanio, paralisia geral
processos de ativao, que ocorrem no interior dos msculos e septicemia (BRAVO; GILLB;
do aparelho digestrio do inseto. Atualmente, h SOBERN, 2007; BRAVO; SOBERN, 2008;
dois modelos, baseados em dados experimentais, HABIB; ANDRADE, 1986; VALLETE-GELY;
que explicam o modo de ao das toxinas Cry. LEMAITRE; BOCCARD, 2008).
As primeiras etapas desses dois modelos so
A formao de protenas Cry determinada por
idnticas: aps a ingesto dos cristais, esses so
genes denominados cry e uma mesma linhagem de
solubilizados no intestino do inseto, local com pH
B. thuringiensis pode conter um nico gene cry ou
alcalino, liberando as protoxinas que so clivadas
vrias cpias de um mesmo gene, ou mesmo vrios
por proteases do prprio inseto, resultando em
genes cry diferentes, determinando a formao
toxinas ativas, com cerca de 60 a 70% do tamanho
de diferentes protenas Cry, que podem compor
da protoxina. A toxina ativa capaz de ligar-se a
um ou mais cristais intracelulares. Grande parte
receptores especficos presentes nas microvilosidades
dos genes cry localiza-se em plasmdeos grandes,
das clulas intestinais do inseto (BRAVO; GILLB;
freqentemente conjugativos, o que pode possibilitar
SOBERN, 2007; SCHNEPF, et al., 1998).
a passagem destes plasmdeos de uma linhagem
O modelo de ao denominado formao de para outra, resultando na formao de linhagens
poros o mais antigo e parece ser o mais comum com uma grande diversidade de perfis de toxicidade
entre as diferentes ordens de insetos (Dpteros, (CAPALBO; VILAS-BAS; ARANTES, 2004;
Lepidpteros e Colepteros). Segundo esse modelo, LERECLUS; DELCLUSE; LECADET, 1993).
a ligao da toxina com receptores especficos levaria
A transcrio da maioria dos genes cry
a formao de oligmeros de toxinas, os quais se
dependente do fator sigma, produzido durante o
ligariam a receptores secundrios da membrana
processo de esporulao, por isso a maior parte
da clula intestinal. Como resultado dessa ligao,
das protenas que compem o cristal produzida
ocorreria a insero da toxina oligomrica na
durante essa etapa. Apenas uma pequena parcela
membrana da clula epitelial intestinal, resultando
dos genes cry regulada independentemente da
em poros nesse epitlio (BRAVO; GILLB;
esporulao, sendo, portanto, expressos tambm
SOBERN, 2007; BRAVO; SOBERN, 2008;
durante o crescimento vegetativo. Em ambos
HABIB; ANDRADE, 1986).
os casos, a protena Cry fruto do metabolismo
Outro modelo, recentemente publicado, secundrio (ARANTES et al., 2002; LERECLUS;
denominado transduo de sinal e foi estudado DELCLUSE; LECADET, 1993).
em apenas poucos insetos-alvos. De acordo com
A massa molecular das protenas Cry varia
esse modelo, a ligao da protena Cry com
entre 40 e 140 KDa. A molcula destas protenas

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globular, formada por trs domnios estruturais Cyt1B, Cyt1C, Cyt2A e Cyt2B. O mesmo comit
ligados entre si por pequenas pontes. At o responsvel pela classificao das protenas Cry,
momento, seis protenas Cry tiveram suas estruturas tambm gerencia a classificao e nomenclatura das
bem determinadas por cristalografia por raios-X protenas Cyt (CRICKMORE et al., 2008).
(BRAVO; GILLB; SOBERN, 2007). Estas
Assim como as protenas Cry, as Cyt tambm
protenas apresentam alto grau de similaridade entre
so sintetizadas na forma de protoxinas. No interior
seus domnios, indicando modo de ao similar. O
do inseto, as protenas Cyt sofrem quebras, onde
domnio I, composto pela extremidade N-terminal
suas pores C-terminal e N-terminal so clivadas,
das protenas, formado por cadeias polipeptdicas
liberando a toxina ativa. Ao contrrio das protenas
com estrutura em -hlice, sendo uma central
Cry, Cyt no se liga a receptores especficos da
(hidrofbica), cercada por 6 cadeias marginais. O
membrana celular, e sim, diretamente aos lipdios
domnio II composto por trs cadeias polipeptdicas
da membrana. Aps sua ligao, as protenas
antiparalelas com estrutura folha pregueada,
Cyt induzem a formao de poros ou agem
enquanto que o domnio III apresenta estrutura tipo
desestruturando a bicamada lipdica das membranas
sanduche (BRAVO; GILLB; SOBERN, 2007).
(BRAVO; GILLB; SOBERN, 2007).
Embora estudos atuais indiquem que vrias
Vrios estudos tm demonstrado ocorrer um
pores dos diferentes domnios da protena se
efeito sinergstico entre as protenas Cry e entre
insiram na membrana no momento de formao dos
estas e as protenas Cyt, ou seja, a maior toxicidade
poros, acredita-se que o domnio I seja o principal
devida interao das protenas, onde uma
responsvel pela insero (NAIR; DEAN, 2008).
potencializa o efeito da outra (BRAVO; GILLB;
Os domnios II e III apresentam similaridades
SOBERN, 2007; SKAN et al., 2003).
estruturais com cadeias polipeptdicas que se ligam
a carboidratos e estariam envolvidos principalmente
no reconhecimento de receptores presentes na Outras toxinas produzidas por B.
membrana das clulas dos insetos-alvo (BRAVO; thuringiensis
GILLB; SOBERN, 2007).
Alm das protenas Cry e Cyt, B. thuringiensis
sintetiza outras toxinas que podem contribuir
Protenas Cyt para a ao entomopatognica. Em 1967 Heimpel
sugeriu o nome de -exotoxina para uma substncia
As protenas Cyt so definidas como protenas
termoestvel e txica para alguns insetos. Devido
com atividade hemoltica que compem uma
a sua estrutura qumica o nome -exotoxina vem
incluso paraesporal de B. thuringiensis, ou alguma
sendo substitudo por thuringiensina. Essas protenas
protena que apresente seqncia de aminocidos
possuem baixo peso molecular, a sua toxicidade
altamente similar s protenas Cyt j descritas.
relaciona-se a inibio da RNA polimerase, pois
Estas protenas apresentam uma similaridade
anloga a nucleotdeos. Embora no possua
estrutural com a valvatoxina, produzida pelo fungo
especificidade, a ao de thuringiensina contribui
Volvariella volvacea. As protenas Cyt so formadas
para a toxidade global das linhagens que a expressam
por apenas um domnio, composto por duas cadeias
(GLARE; OCALLAGHAN, 2000; HABIB;
externas em forma de -hlice, e uma cadeia interna
ANDRADE, 1998; LERECLUS; DELCLUSE;
em forma de -folha pregueada. Atualmente so
LECADET, 1993). Alguns trabalhos citam a
conhecidas 27 protenas Cyt (BRAVO; GILLB;
importncia dessa toxina no controle de besouros
SOBERN, 2007; CRICKMORE et al., 1998,
e algumas espcies de caros (WU et al., 2002). No
2008), classificadas em grupos principais: Cyt1A,
entanto, as linhagens comerciais de B. thuringiensis
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no devem produzir esta toxina, pois ela poderia Alm das toxinas, o esporo de B. thuringiensis
ocasionar efeitos adversos em organismos no tambm contribui para sua toxicidade, pois estes
alvos. podem germinar no interior do inseto-alvo,
ocasionando septicemia; ou potencializando o efeito
Muitos sorotipos de B. thuringiensis produzem
das toxinas em uma ao sinergstica (GLARE;
protenas denominadas Vip (vegetative insecticidal
OCALLAGHAN, 2000; RAYMOND et al., 2008).
proteins), as quais so sintetizadas na etapa
vegetativa do crescimento. Essas protenas foram
descritas por Estruch et al. em 1996. Apesar de no
Produo de B. thuringiensis
integrarem o cristal protico, elas contribuem para a
toxicidade global das linhagens que as apresentam Etapas da produo
e possuem forma de intoxicao similar s das Embora a produo de B. thuringiensis seja
protenas Cry (CRICKMORE et al., 2008; GLARE; bem estudada, h poucos dados na literatura a
OCALLAGHAN, 2000). Alguns trabalhos relatam esse respeito, visto que muitas informaes so
a importncia das protenas Vip na ao inseticida segredos industriais. Em geral, os produtos base
contra colepteras (Vip1 and Vip2) e lepidpteras de B. thuringiensis so compostos por uma mistura
(Vip3), as quais parecem intensificar a ao das de cristais, esporos, poucas clulas vegetativas
protenas Cry (ESTRUCH et al., 1996; CHEN; e ingredientes secundrios da formulao
HONG; WU., 2003; SHI et al., 2004). Os estudos (CAPALBO; VILAS-BAS; ARANTES, 2004).
de Yu et al. (1997) indicam que o principal modo de As principais etapas para a produo de B.
ao das protenas Vip resulta na ruptura das clulas thuringiensis so: seleo da linhagem, estocagem,
do intestino, sendo essa a forma de ao primria processo fermentativo, recuperao do princpio
dessas toxinas. ativo (esporos e cristais), formulao do produto
No mesmo site onde se encontra a classificao e anlise da qualidade (MORAES; CAPALBO; F;
das protenas Cry e Cyt, pode ser encontrada ARRUDA, 2001; COUCH, 2000).
tambm a classificao e nomenclatura das protenas Segundo Couch (2000) os principais critrios
Vip (http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_ para seleo de uma subespcie bacteriana para
Crickmore/Bt/vip.html). produo de bioinseticidas so: espectro de
Em acrscimo s protenas Cry, Cyt e Vip, no ao, potncia por unidade de volume da cultura,
ano 2000, Mizuki et al. descreveram uma nova requerimentos nutricionais, facilidade de produo,
toxina em uma linhagem de B. thuringiensis a estabilidade gentica e facilidade de estocagem.
qual passou a ser denominada Parasporina. Este A estocagem apropriada de grande importncia,
termo definido como uma protena paraesporal pois a linhagem deve conservar seu potencial
de B. thuringiensis e bactrias relacionadas, sem txico e velocidade de crescimento. No caso de
atividade hemoltica e que apresentam a capacidade B. thuringiensis, as trocas de plasmdios ocorrem
de atacar clulas cancergenas em geral (OHBA et com certa freqncia e h relatos de perda de
al., 2008). Atualmente existem 14 paraesporinas toxicidade aps sucessivas fermentaes, sendo
diferentes, classificadas em quatro grupos PS1A essencial a constante busca por novas linhagens e o
a PS4A. A nomenclatura destas protenas segue monitoramento durante o processo de fermentao
os mesmos critrios adotados para as protenas (COUCH, 2000; BIZARRI et al., 2008).
Cry e Cyt e um comit fundado no ano de 2006
A forma mais comum de produo de B.
determina a classificao e a nomenclatura de novas
thuringiensis por fermentao submersa (lquida)
parasporinas (http://parasporin.fitc.pref.fukuoka.jp/
descontnua, tambm conhecida como processo
index.html).
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Bacillus thuringiensis: caracteristicas gerais e fermentao

em batelada. Nesta fermentao, um recipiente at a metade deste total. H vrios mtodos que
contendo meio de cultura lquido inoculado com o podem ser utilizados para a recuperao destes
microrganismo, no havendo acrscimo ou retirada cristais e esporos, sendo a centrifugao e a micro-
significativa do meio fermentado. Portanto, ocorre filtrao os mais comuns. importante ressaltar
todo o desenvolvimento da cultura, sendo retirado que tais processos permitem a recuperao
o produto apenas no final do processo. Em geral, principalmente das protenas Cry. Muitas outras
as protenas Cry de B. thuringiensis so formadas toxinas que podem contribuir para a toxicidade final
no fim da fermentao, quando as condies do do produto so perdidas. Atualmente novas tcnicas
meio se tornam desfavorveis, sendo o processo em de recuperao e/ou concentrao do produto esto
batelada satisfatrio para tal produo (MORAES; sendo desenvolvidas para complementar as mais
CAPALBO; ARRUDA, 2001). utilizadas, destacando-se: a liofilizao e a flotao
(BRAR et al., 2006; COUCH, 2000).
Alguns pesquisadores tm estudando as
fermentaes slida, contnua e em batelada Aps a recuperao dos metablitos de
alimentada, porm at o momento, o mais vivel para interesse, os produtos so formulados. No caso
produo de protenas Cry ainda o processo em dos bioinseticidas, a formulao tem trs objetivos
batelada submersa (ADAMS; EITENAN; HANEL, principais: conferir estabilidade ao produto durante
2002; CHEN; HONG; WU, 2003, MORAES; a estocagem e aplicao, facilitar a aplicao do
CAPALBO; ARRUDA, 2001; VALLEJO et al., produto e proteger o microrganismo e os cristais das
1999). condies adversas do ambiente (BRAR et al., 2006;
COUCH, 2000). Embora sejam segredos industriais,
Na fermentao industrial os passos a serem
os produtos formulados geralmente contam com
seguidos so: pr inculo, geralmente feito em
uma combinao de aditivos reconhecidos pela
frascos pequenos, pr fermentador, comumente com
USA/FDA (Food and Drug Administration) ou
1/5 do volume da fermentao e o fermentador final.
pelo rgo competente do pas. comum o uso de
Durante todas as etapas deve-se analisar a cultura
dispersantes, protetores e surfactantes (GLARE;
quanto contaminao, caractersticas morfolgicas
OCALLAGHAN, 2000; BRAR et al., 2006).
e potencial entomopatognico. Em geral, os reatores
utilizados permitem o controle das condies Antes de ser comercializado, o produto formulado
principais de cultivo, as quais so: temperatura, pH, deve passar por testes de anlise de qualidade
aerao e agitao. O pr-inoculo, pr-fermentador que atestem principalmente sua potncia txica.
e o fermentador em volumes crescentes so feitos a Para B. thuringiensis, a toxicidade geralmente
fim de diminuir o tempo da fase lag, ou seja, o perodo analisada por meio de bioensaio com o inseto-alvo
de adaptao do microrganismo s condies de (COUCH, 2000). Alm dos testes de toxicidade, os
cultivo. Em geral, pr fermentadores e fermentador bioinseticidas comercializados devem passar por
possuem os mesmos ingredientes no meio de uma srie de testes que assegurem sua segurana
cultivo. importante limitar o nmero de passos no ambiental e sade humana. Em geral, so feitos
processo de produo a fim de evitar contaminaes testes com mamferos sadios e imune-suprimidos,
e mudanas indesejveis no comportamento da os quais so submetidos exposio drmica,
bactria (COUCH, 2000; MORAES; CAPALBO; ocular, inoculao intraperitoneal e subcutnea. Em
ARRUDA, 2001). relao inocuidade ambiental, so feitos testes
para avaliar a toxicidade dos produtos sobre aves,
Ao final da fermentao, a cultura de B.
vertebrados aquticos, invertebrados, incluindo
thuringiensis apresenta em mdia 6 a 8% de slidos,
insetos no-alvo, vegetais e at mel de abelhas. Estes
sendo que os esporos e cristais podem corresponder
ensaios de toxicidade no devem indicar efeitos
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Angelo, E. A.; Vilas-Bas, G. T.; Castro-Gmez, R. J. H.

adversos significativos nos organismos testados, possuem uma fonte de nitrognio, outra de carbono
o que garante a segurana ambiental dos produtos e sais minerais. Algumas vezes se adicionam ao
(VILAS-BAS; PERUCA; ARANTES, 2007). Nos meio alguns tampes e anti-espumantes a fim de
Estados Unidos, esses testes so regulamentados facilitar o processo. A fonte de carbono, alm de
pela Agncia de Proteo Ambiental (US-EPA) fornecer matria prima para muitos compostos
e departamento de agricultura dos estados, os celulares, serve como fonte de energia. O nitrognio
quais exigem uma licena para que o produto seja requerido principalmente para sntese de protenas
comercializado. No Brasil, essa licena expedida e cidos nuclicos. Os sais minerais atuam como
pela ANVISA (Agncia Nacional de Vigilncia co-fatores, sendo tambm importantes no controle
Sanitria), a qual tambm exige testes padres para da osmolaridade celular.
liberao da comercializao do produto.
Couch (2000) cita os principais componentes
e suas concentraes utilizadas no cultivo de B.
thuringiensis na Amrica do Norte (Tabela 1).
Meios de cultura
Apesar das indstrias no revelarem a composio
A escolha do meio de cultivo adequado de seus meios, sabe-se que estes geralmente so
extremamente importante para o sucesso de um resultantes da combinao dos produtos listados.
produto. Esta escolha deve proporcionar a mxima Muitos dos produtos utilizados so componentes
produo com o mnimo custo (COUCH, 2000). Os indefinidos, porm no devem apresentar muita
meios de cultivo para B. thuringiensis geralmente variao de um lote para outro.

Tabela 1. Principais ingredientes utilizados em meios de cultivo de bactrias entomopatognicas e suas


concentraes.

Ingrediente Concentrao (g/L)


Farinha de soja 20-40
Farinha da semente do algodo 14-30
Protena de batata 15-40
Licor de milho ou slidos derivados de milho 15-30
Glicose 10-30
Peptona 2-5
Xarope de milho 20-45
Melao 1.0-18.6
Glicerol 2.0-10
Amido de milho 10-15
Extrato de levedura 2.0
KH2PO4 1.0
K2HPO4 1.0
FeSO4 0.02
FeSO4.7H2O 0.0005-0.02
MgSO4. 7H2O 0.3
MnSO4. H2O 0.02
ZnSO4.7H2O 0.02
(NH4)2SO4 2
CuSO4.5H2O 0.005
CaCO3 1.0-1.5
Fonte: Couch, 2000.

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Bacillus thuringiensis: caracteristicas gerais e fermentao

Meios alternativos vm sendo estudados a fim etapas de fosforilao da protena quinase Calfostina
de baratear o produto final, principalmente nas C, responsvel pela produo das protoxinas Cry.
produes regionais e em escala piloto. Vrios Segundo os autores, as melhores fontes de carbono
autores obtiveram resultados satisfatrios com meios para biossntese da -endotoxina seriam dextrina,
de cultivo empregando componentes alternativos: aveia, maltose, lactose, inulina, glicerol e sacarose,
Poopathi et al. (2002) em cultivos em meio base sendo a dextrina a mais promissora de todas quanto
de batata, Vora e Shethna (1999) estudaram um esporulao e produo de toxina.
meio contendo extrato de soja suplementado com
Resultados conflitantes aos deste trabalho foram
cistina, e Prabakaran et al. (2008) desenvolveram
obtidos por Vora e Shethna (1999) e Prabagaran et
um meio de cultivo base de gua de coco.
al. (2004), os quais indicam o melao-de-cana como
No Brasil, a possibilidade de se utilizar meios
uma boa fonte de carbono para produo de toxina.
alternativos apresenta um amplo potencial tendo
Todos estes estudos, entre outros, comprovam que
em vista a diversidade natural e variabilidade da
necessrio otimizar um meio para cada sorotipo, ou
agroindstria.
mesmo para cada linhagem, pois os resultados de
Vrios estudos tm sido feitos utilizando-se estudos com um determinado sorotipo muitas vezes
como meio de cultivo para B. thuringiensis guas no podem ser extrapolados para outros.
residuais de indstrias e de estaes de tratamento
As fontes de nitrognio podem ser tanto orgnicas
de gua, tais trabalhos tm apresentado bons
quanto inorgnicas, sendo comum a utilizao
resultados, e muitas produes em escala piloto em
conjunta das duas formas. Os estudos de Arcas,
vrias regies do mundo j utilizam tais resduos
Yantoro e Ertola (1984), Igen, Igen e zcengiz
(LACHHAB; TYAGI;VALRO, 2002; MONTIEL;
(2002b), skan et al. (2003) e Zouari e Jaoua (1999)
TYAGI; VALERO, 2001; VIDYARTHI et al., 2002;
indicam que o uso de apenas nitrognio inorgnico
YEZZA et al., 2005, 2006; CHANG et al., 2008).
no aconselhvel para o cultivo de B. thuringiensis,
A fonte de carbono para cultivo de B. thuringiensis pois h diminuio de crescimento, esporulao e
varia muito conforme o objetivo da fermentao, biossntese, em relao aos meios com nitrognio
bem como qual linhagem est sendo cultivada. A orgnico e inorgnico. Dentre as mais promissoras
maioria dos trabalhos revela que a melhor fonte para fontes de nitrognio inorgnico apontadas por estes
crescimento vegetativo no corresponde melhor autores, destacam-se os fosfatos [NH4H2PO4 e
fonte para esporulao e formao dos cristais (NH4)2HPO4], isto , fosfato de amnia monobsico
proticos (IGEN; IGEN; ZCENGIZ, 2002b; e dibsico, respectivamente, e sulfato de amnia por
SKAN et al., 2003). otimizarem esporulao e muitas vezes a produo
de toxinas.
Os estudos de Igen, Igen e zcengiz (2002b)
indicam um efeito inibidor de altas concentraes de Entre as fontes orgnicas de nitrognio, o
glicose durante a sntese da -endotoxina. De acordo extrato de levedura bastante utilizado no cultivo
com este trabalho, as melhores fontes de carbono de B. thuringiensis, porm peptona e derivados de
para produo dos cristais txicos e esporulao so soja apresentam resultados satisfatrios (VORA;
lactose, sacarose e inulina. SHETNA, 1999; IGEN; IGEN; ZCENGIZ,
2002b; MORRIS; DEAN, 1997). Como fontes
Segundo de skan et al. (2003), glicose, amido
alternativas, vm se destacando farinhas derivadas
e melao inibem a produo de protenas Cry, em
de protena animal (farinha de peixe e de crislida) e
particular da protena Cry4B (134KDa). Este estudo
alguns cereais (cevada e trigo) (ALVES et al., 1997;
foi feito com B. thuringiensis subsp. israelensis e
DEVI; RAVINDER; JAIDEV, 2005; GHRIBI;
ressalta o efeito repressor da glicose, a qual agiria em

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Angelo, E. A.; Vilas-Bas, G. T.; Castro-Gmez, R. J. H.

ZOUARI; JAOUA, 2005; MORRIS; DEAN, 1997; ZCENGIZ, 2002a; SKAN et al., 2003).
PRABAKARAN; BALAMARAN, 2006; ZOUARI;
Metais como zinco, cobre e ferro apresentam
JAOUA, 1999).
resultados negativos para o crescimento, esporulao
A concentrao de sais no meio de cultivo e produo de toxina Cry mesmo em concentraes
influencia diretamente a osmolaridade do mesmo. pequenas como 10-7 M (IGEN; IGEN;
Entretanto, no h consenso sobre qual porcentagem ZCENGIZ, 2002a; SKAN et al., 2003).
de sais mais adequada, bem como quais os sais
Tendo em vista a influncia de diferentes
que devem ser adicionados (ARCAS; YANTORO;
variveis, o desenvolvimento de meios de cultivo
ERTOLA, 1987; IGEN; IGEN; ZCENGIZ,
para a produo de B. thuringiensis bastante
2002a; SKAN; IGEN; ZCENGIZ, 2003).
complexo. Alm disso, h uma variao muito
Arcas Yantoro e Ertola (1987) obtiveram uma grande de uma linhagem para outra, o que, muitas
boa produo de toxina com um meio contendo vezes, dificulta a extrapolao dos resultados de um
osmolaridade de 808 miliosmol, tal trabalho trabalho. Ressalta-se nesse sentido, a necessidade de
experimento clssico que resultou em um meio utilizao de mtodos de planejamento e otimizao
bastante adotado para crescimento e produo de B. eficazes, como a metodologia de superfcie de
thuringiensis. importante ressaltar que embora os resposta, a qual leva em considerao vrios fatores
sais ajam como um todo na osmolaridade, cada on que influenciam em uma produo.
fornecido pelos sais pode ter um efeito diferente.
Muitas vezes, produo e crescimento no esto
associados e a presena de alguns ons melhora um Parmetros fsicos durante a fermentao
parmetro e prejudica ou neutra para outro. Geralmente, os parmetros monitorados durante
Os estudos de skan et al. (2003) e Igen, Igen o processo de fermentao so: temperatura, pH
e zcengiz, (2002a) revelaram que o mangans e taxa de oxignio dissolvido. Sendo este ltimo
crtico para a diferenciao celular, sendo requerido influenciado, principalmente, pelas taxas de aerao
para esporulao e formao do cristal. Os melhores e agitao (COUCH, 2000).
resultados aparecem quando a concentrao de O cultivo de B. thuringiensis feito com
mangans varia entre 10-6 e 10-4M, sendo que valores temperaturas em torno de 30C, sendo que
maiores que estes se tornam txicos para todos os temperaturas superiores podem induzir a supresso
processos celulares. da formao de protenas Cry e conseqente
Assim como mangans, o magnsio influencia diminuio do rendimento. Da mesma forma,
o metabolismo secundrio, portanto, com efeito na temperaturas inferiores desaceleram o ciclo de
produo das protenas Cry. Sua concentrao ideal multiplicao celular, o que causa aumento no
em torno de 10-3 M. O clcio bastante importante no tempo e conseqente custo da produo (MORAES;
processo de esporulao, promovendo a estabilidade CAPALBO; ARRUDA, 2001; COUCH, 2000).
do cristal protico. A concentrao de 10-3 M de O pH do processo fermentativo pode ser
clcio estimula a esporulao, porm inibidora monitorado por eletrodos sensveis a variaes, os
para o crescimento vegetativo e sntese protica. Ao quais acionam reservatrios de cidos ou bases a fim
que parece, o clcio no essencial para a sntese de manter o pH constante. Uma opo comumente
das protenas Cry. Desta forma, diversos estudos empregada para inibir variaes de valores de pH o
recomendam o uso de concentraes menores uso de solues tampo. No entanto, h controvrsias,
que 10-3 M de clcio, a fim de no comprometer pois alguns estudos apontam que variaes na faixa
a formao das protenas Cry (IGEN; IGEN; de pH podem proporcionar melhorias na produo,

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Bacillus thuringiensis: caracteristicas gerais e fermentao

enquanto outros consideram estas variaes Concluses


prejudiciais (IGEN; IGEN; ZCENGIZ, 2002a).
Devido s caractersticas biolgicas, B.
Essas variaes nos valores de pH durante o cultivo
thuringiensis destaca-se como a principal
de linhagens de B. thuringiensis em diferentes meios
bactria utilizada no controle biolgico. No
de cultivo j foi demonstrada anteriormente, como
entanto, a utilizao de produtos derivados desse
no estudo de Abdel-Hameed (2001), com o meio
entomopatgeno menos difundida no Brasil
TYG-agar, base de triptona, extrato de levedura e
que em pases desenvolvidos, sendo necessria
glicose e com pH inicialmente neutro. Neste estudo
a divulgao de produtos, implementao de
sem controle de pH, a cultura apresentou reduo
produes regionais, as quais diminuem o custo e o
nos valores de pH para valores cidos no incio
estabelecimento de incentivos para implantao de
da esporulao, seguindo-se de valores alcalinos
programas de manejo integrado de insetos (MIPs).
no final do processo de fermentao (ABDEL-
HAMEED, 2001). Apoio financeiro: Conselho Nacional de
Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq)
A quantidade de oxignio dissolvido no meio
por meio de concesso de bolsa de mestrado.
de cultura dependente de diversos fatores como
osmolaridade do meio, taxa de aerao e agitao
(COUCH, 2000). Este um fator bastante crtico para
Referncias
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deve ser bem analisado, pois em grandes volumes
thuringiensis H-14 for production of the mosquitocidal
de fermentao o suprimento adequado de oxignio -endotoxin: matematical modelling and scalling-up
torna-se ainda mais difcil e oneroso. strudies. World Journal of microbiology e Biotechnology,
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Segundo o estudo de Wu et al. (2002) a morfologia
ADAMS, T. T.; EITENAN, M. A.; HANEL, B. M. Solid
das clulas de B. thuringiensis ao microscpio
state fermentation of broiler litter for production of
ptico pode variar conforme as mudanas nos biocontrol agents. Bioresource Technology, New York, v.
parmetros de cultivo, com especial destaque para 82, n. 1, p. 33-41, 2002.
o suprimento de oxignio, sendo que o excesso de ALVES, L. F.; ALVES; A. S. B.; PEREIRA, R. R.;
aerao pode provocar uma desacelerao no ciclo CAPALBO, D. M. F. Production of Bacillus thuringiensis
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ARANTES, O. M. N.; VILAS-BAS, L. A.; VILAS-
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se os parmetros individuais, o cultivo deve ser visto
ARCAS, J.; YANTORO, O.; ERTOLA, R. A new medium
e estudado como um todo. Neste sentido destaca- for growth delta-endotoxin production by Bacillus
se o mtodo de superfcie de resposta que permite thuringiensis var. kurstaki. Biotechnology Letters,
uma anlise mais ampla dos parmetros, bem como London, v. 6, n. 8, p. 495-500, 1984.
o estudo da combinao destes fatores (HSU; WU,
2002).

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