Guia de Ejercicios PEP I IGMO 1S_2017

PREGUNTA 1
a) Describa una estrategia para aislar DNA genmico a partir de una bacteria
Gram positivo e indique el fundamento terico que permite su aislamiento a
partir de una muestra compleja.
b) Indique el fundamento terico de porque el RNA es soluble en fenol cido
caliente y no el DNA.

PREGUNTA 2
a) Indique 3 mtodos para cuantificar cidos nucleicos y las ventajas de cada
uno.
b) Usted tiene una muestra problema (producto de PCR) y quiere determinar su
concentracin utilizando sondas Taqman. Explique paso a paso como lo hara.

PREGUNTA 3
a) Defina lo que es la hipercromicidad del DNA.
b) Explique porque la concentracin de sales afecta la temperatura melting de
un DNA de doble hebra.
c) Indique dos mtodos para verificar la calidad de una muestra de DNA

PREGUNTA 4
Ud desea clonar un fragmento de PCR en un vector de expresin. El producto
de PCR tiene los sitios para las enzimas BamHI (GG ATCC) y SalI (GTCGAC)
en sus extremos, mientras que el vector tiene los sitios BclI (TG ATCA), SalI
(GTCGAC) y BamHV (GGATCC).
a) Qu enzimas de restriccin ud utilizara? (Indique que enzimas usara
con el vector y que enzimas utilizara con el producto PCR.
b) Dibuje el esquema de un vector de expresin que se induzca por
Arabinosa
c) Qu es un isoesquizomero?

PREGUNTA 5
Explique el mecanismo de regulacin de los vectores pET. (En su explicacin
incluya los conceptos DE3, regulador, operon lac, inductor, RNApolT7,
lyzozima)

PREGUNTA 6.
Ubique en el mapa los siiguientes sitios para enzimas de restriccin, teniendo
en consideracin los tamaos que se obtienen despues de las digestiones:
PstI: 4,36 kb
EcoRI: 4,36 kb
SalI: 4,36 kb
EcoRI + SalI: 3,98 kb, 0,38 kb
EcoRI + PstI: 3,61 kb, 0,75 kb
PstI + SalI: 3,23 kb, 1,13 kb

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PREGUNTA 7.

a) Describa una estrategia para aislar RNA a partir de una bacteria Gram con
fenol cido caliente e indique el fundamento terico que permite su
aislamiento a partir de una muestra compleja.
b) Indique 2 estrategias para determinar la calidad del cido nucleico que aisl
y como confirmara que su muestra no esta contaminada con gDNA.

PREGUNTA 8.

Con respecto a las propiedads de los cidos nucleicos:

a) Defina lo que es la hipercromicidad del DNA y que factores lo afectan
b) Indique por la razn de la absorbancia a 260nm/280nm es un indicador de la
pureza de los cidos nucleicos
c) Indique 3 mtodos para cuantificar DNA.

PREGUNTA 9.

Usted es invitado a participar de un comit para resolver el caso de la perdida

de material en una oficina pblica. Afortunadamente, se posee DNA de todos
los integrantes de la oficina y DNA de los sospechosos. Para identificar al
llevador de material, usted decide realizar un RFLP y slo sabe que el
sospechoso es el nico que puede tomar leche (en base a esto asume que
tiene una mutacin en el gen LCT: C/T-13910). Explique brevemente la
estrategia experimental a seguir para identificar con 99.99% de certeza al
llevador.
Secuencia LCT en regin cercana a mutacin

Toman Leche: ATCGTGATCGGCTAGGCTAGGCATCAGCTAGCATAGCTA

No toma leche: ATCGTGATCGGCTAGGCCAGGCATCAGCTAGCATAGCTA

Tabla de enzimas:

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PREGUNTA 10.

Al realizar una serie de digestiones de un plasmido X con las enzimas de

restriccin PstI y HindIII (que slo tienen un sitio de corte en el plasmido) usted
procede a realizar un gel de electroforesis. Camino a la sala de geles, usted
tropieza con el profesor y bota sus muestras al suelo. En ese mismo momento
usted se da cuenta que las muestras no estaban rotuladas y para no quedar
mal frente al profesor quien espera con ansias el resultado del gel, lo corre de
todas formas. Al sacarle una foto, obtiene lo siguiente:
Que podran ser los carriles 2,3,4 y 5? Explique el por qu de su
deduccin.

PREGUNTA 11.

Respecto a los plasmidios

a.- Indique las caracteristicas basicas de un vector de clonamiento bacteriano

(dibuje y explique).
b.- En que consiste la alpha complementacin y para que se utiliza.

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c.- Qu son las familias de incompatibilidad de plasmidios y cual es su

aplicacin practica?

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PREGUNTA 12.

Ud desea clonar en el siguiente vector pBluescript. Indique las caracteristicas

del medio que debe usar para identificar los clones que contienen el inserto,
justificando su respuesta.

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PREGUNTA 13.

A partir de muestras de DNA aisladas desde dos especies de bacterias

distintas, A y B, se determin que la adenina constituye el 32% y 17%,
respectivamente, del total de bases.
a) Cual sera la proporcin de adenina, guanina, timina y citosica que espera
encontrara en las dos muestras de DNA? Explique las asunciones que usted
tomo.
b) Una de las especies bacterianas fue aislada desde una fuente termal (70C).
Establezca cual de las dos especies es una bacteria termofila, explicando las
asunciones que usted tomo.

PREGUNTA 14.

Usted amplifica por PCR un fragmento de DNA correspondiente al gen de

resistencia a tetraciclina, su idea es insertarlo en el vector de clonamiento
pUC19. A continuacin se muestra el mapa de restriccin para este gen y para
el plasmido:

a) Disee un protocolo para insertar el fragmento de mayor tamao posible,

obtenido a partir de la digestin del producto de PCR, en el vector de
clonamiento. Explique todos los pasos y enzimas necesarias para obtener el
vector recombinante.
b) Explique que debe hacer para disminuir las probabilidades de obtener
plasmado recircularizado.

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c) Finalmente se le pide que realice un clonamiento dirigido de un fragmento

digerido con las enzimas de restriccin SacI y KpnI y que posea un tamao
aproximado de 940 pb. Explique los pasos a seguir para obtener el vector
solicitado.

PREGUNTA 15.
Cuando se analiza por electroforesis el DNA genmico de bacterias o de clulas
eucariticas incluyendo hongos, plantas y mamferos, se observa slo una
banda que migra a la misma altura en el gel que un fragmento lineal de DNA
de aproximadamente 23 kilopares de bases. Si sabemos que los genomas de
los distintos organismos son diferentes en cuanto a nmero y tamao de
molculas de DNA, entonces porqu se obtiene slo una banda y con igual
migracin electrofortica en todos los casos? Proporcione una explicacin
molecular de este hecho.

PREGUNTA 16.
Un plsmido bacteriano circular de 5000 pb se digiri completamente con cada
una de las siguientes enzimas de restriccin: HindIII, BamHI y EcoRI. Los
productos de digestin resultantes se resolvieron por electroforesis en gel de
agarosa, obtenindose los siguientes resultados:

i) Al digerir el plsmido con HindIII se obtuvieron 2 bandas en el gel, una

de 1200 pb y la otra de 3800 pb.
ii) Al digerir el plsmido con BamHI se obtuvo slo una banda de 5000 pb.
iii) Al digerir el plsmido con EcoRI se obtuvo slo una banda de 2500 pb.

a) Cuntos sitios de corte hay en el plsmido para cada una de las

enzimas? Fundamente
b) Podra usted predecir cuntos fragmentos se obtendran en el gel y de
que tamaos seran, si se hace una doble digestin del plsmido con
BamHI y EcoRI?. Explique.

Nota: Para elaborar y fundamentar sus respuestas puede hacer dibujos del
plsmido y/o del gel de agarosa.

PREGUNTA 17.
El plsmido pBR322 posee el replicn pMB1 y su nmero de copias intracelular
es normalmente de 15 a 20 copias por clula bacteriana. Los plsmidos del tipo
pUC tambin poseen el replicn pMB1, sin embargo el nmero de copias es de
500 a 700 por clula de Escherichia coli.

a) Explique el porqu de esta diferencia si ambos plsmidos poseen el

mismo replicn?
b) Indique cules son los marcadores de seleccin contenidos en ambos
tipos de plsmidos y como se seleccionan los clones recombinantes en cada
caso.

PREGUNTA 18

Compare los sistemas de restricccin metilacin presentes en E. coli.

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Pregunta 19

Ud, a determinado la concentracin y pureza de DNA mediante Absorbancia a

260/280 nm. 1 ml de la solucin tienen una absorbancia a 260 de 0,5, y una
absorbancia a 280 de 0,25.
a) Cual es la concentracin de DNA?
b) Que puede decir de la pureza?
c) Si la muestra fuera de RNA que puede decir de su concentracin y
pureza?