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By W. S.

111

Coordenadores:
WILLIBALDO SCHMIDELL
URGEL DE ALMEIDA LIMA
EUGNIO AQUARONE
WALTER BORZANI

BIOTECNOLOGIA
INDUSTRIAL.
VOLUME 11
ENGENHARIA
BIOQUMICA

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EDITORA EDGARD BLCHER LTDA.
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Este conjunto de quatro volumes, reunidos sob o ttulo amplo de BIOTEC-


NOLOGIA INDUSTRIAL, o resultado do trabalho de um grupo de profissionais
com vistas atualizao da coleo BIOTECNOLOGIA, cuja publicao foi iniciada
em 1975 e terminada em 1983.
A experincia acumulada e as muitas mudanas ocorridas nestes ltimos vinte
anos, ao lado da indiscutvel e crescente importncia das aplicaes da BIOTEC-
NOLOGIA em diversos setores de produo de bens e servios, justificam plena-
mente - assim pensam os Coordenadores e o Editor desta nova Coleo - esta
primeira atualizao, principalmente pelo fato de se destinar ao ensino em cursos
de graduao.
Nosso primeiro objetivo, nesta Apresentao, tomar conhecimento do que,
hoje, se entende por BIOTECNOLOGIA, e do que vem a ser BIOTECNOLOGIA
INDUSTRIAL.
A demarcao ntida do campo de atuao de qualquer ramo do conhecimento
sempre tarefa muito difcil, para no dizer impossvel.
Tanto isto verdade que, com certa freqncia, tratados relativos a um dado
setor do conhecimento atacam diretamente o exame de uma srie de temas sem
tentar esboar, preliminarmente, um quadro que, em largos traos, indique os
objetivos e as apJjcaes do que vai ser estudado.
Tal maneira de agir, principalmente em cursos de graduao, no nos parece
aconselhvel. Julgamos importante, no incio dos estudos, a apresentao de um
panorama que d, aos alunos, uma idia, ainda que no bem definida, daqueles
objetivos e aplicaes.
No nos parece que seja imprescindvel transcrever, aqui, todas as propostas
de "definio" do que se deva entender por Biotecnologia. Algumas delas sero
suficientes para que seja possvel alcanar nosso objetivo.
Iniciaremos com a proposta que o Prof. Antonio Paes de Carvalho, em seu
trabalho intitulado "Patentes para a Biotecnologia", apresentou, em dezembro de
1993, em reunio realizada na Academia Brasileira de Cincias:

"Entende-se por Biotecnologia o conjunto de conhecimentos, tcnicas e mtodos,


de base cientfica ou prtica, que permite a utilizao de seres vivos como parte
integrante e ativa do processo de produo industrial de bens e servios".
VI

O Office of Technology Assessment, por sua vez, "definiu" Biotecnologia como


sendo:

. "O conjunto de processos industriais que englobam processos biolgicos".

Por outro lado, a Union Intemationale de Chimie Pure et Applique, concei-


tuou Biotecnologia como:

"Aplicao da Bioqumica, da Biologia, da Microbiologia e da Engenharia Qumica


aos processos e produtos industriais (incluindo os produtos relativos sade, energia
e agricultura) e ao meio ambiente".

Finalmente, o Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico


(CNPq), em seu Programa Nacional de Biotecnologia, "definiu" Biotecnologia nos
seguintes termos:

"A utilizao de sistemas celulares para obteno de produtos ou desenvolvimento


de processos industriais".

. As poucas tentativas de definio aqui transcritas mostram, nitidamente, que


a Biotecnologia tem por base vrios ramos do conhecimento que poderiam ser
classificados de FUNDAMENTAIS (como, por exemplo, Bioqumica, Fisiologia,
Gentica, Microbiologia, Virologia, Botnica, Zoologia, Ecologia) ao lado de outros
que poderiam ser agrupados sob a denominao genrica de ENGENHARIAS (prin-
cipalmente a Engenharia Qumica).
Trata-se, portanto, de um campo de trabalho tipicamente multidisciplinar, o
que toma absolutamente imprescindvel a efetiva colaborao de profissionais
atuantes em diferentes setores do conhecimento.
Destaque-se, porm, que essa atividade multidisciplinar no deve ser enten-
dida como resultante de uma simples justaposio de profissionais, cada um deles
com sua formao especializada e preocupado apenas com sua rea especfica.
Importa que seja, de fato, um trabalho de vrios profissionais efetivamente
integrados, de modo que cada um deles tenha conhecimento, obviamente no
aprofundado, dos princpios e das tcnicas dos campos de atuao dos demais.
Assim, apenas para citar um exemplo, caso um microbiologista participe de um
grupo que estuda a otimizao de um dado processo, desejvel que tenha alguns
conhecimentos, mesmo que superficiais, a respeito das estratgias empregadas para
a modelagem matemtica. Vice-versa, o especialista em modelagem deve efetuar
um esforo adicional para compreender as caractersticas do sistema microbiano
em estudo, a fim de incorpor-las ao modelo. Somente desta forma a atividade
multidisciplinar efetivamente existir e poder ser mais eficiente.
VIl

Se verdade, por um lado, que a Biotecnologia s passou a ser considerada


altamente prioritria h relativamente pouco tempo, tambm verdade, por outro,
que processos biotecnolgicos vm sendo utilizados na produo de vrios bens,
principalmente alimentos, desde a mais remota antigidade. Basta, neste particu-
lar, fazer referncia ao preparo de bebidas fermentadas a partir de cereais na
Babilnia e no Egito (8.000 a 6.000 anos a.C.), produo de po, utilizando
fermentos, no Egito (4.000 anos a.C.) e produo de vinhos na Grcia (2.000 a.C.).
A Biotecnologia encontra muitas aplicaes importantes nas seguintes reas
de atividade:
Agricultura
Pecuria
Sade
Preservao do meio ambiente
Indstria
Suas aplicaes na indstria constitutem o objetivo primordial da Biotec-
nologia Industrial. A Fig. 1, adaptada de um artigo publicado pelo Prof. Rainer
Jonas, uma boa representao grfica da "localizao" da Biotecnologia Indus-
trial e de sua interao com outros ramos do conhecimento.

Figura I - Re presentao esquemtica da interao da Biotecnologia Industrial com outros ramos do con he-
cimento.
VIII

Convm, finalmente,,ressaltar que, como ocorre em outros campos de trabalho,


as reas de aplicao da Biotecnologia, anteriormente apontadas, no so "gavetas"
estanques. H entre elas, freqentemente, fortes interaes. Apenas para citar um
exemplo, considere-se o caso de uma dada vacina, desenvolvida na rea da Sade.
Na etapa final de produo dessa vacina em larga escala surgiro, muito provavel-
mente, problemas de cunho tecnolgico e de engenharia que podero tomar impres-
cindvel a efetiva participao da Biotecnologia Industrial na busca das solues
mais adequadas.
A presente Coleo consta de quatro volumes. No primeiro- FUNDAMEN-
TOS - renem-se, como o prprio nome claramente indica, temas fundamentais
indispensveis ao estudo de processos biotecnolgicos. O segundo- ENGENHA-
RIA BIOQUMICA- focaliza os principais problemas de engenharia envolvidos
naqueles processos, ao lado de assuntos correlatos de mbito mais geral, mas im-
portantes na produo em larga escala. Os dois ltimos volumes - PROCESSOS
FERMENTATIVOS E ENZIMTICOS e BIOTECNOLOGIA NA PRODUO DE
ALIMENTOS - foram dedicados descrio e discusso de processos biotecno-
lgicos de importncia industrial.
Todos os temas foram tratados partindo-se do pressuposto de que a obra se
destina, primordialmente, a cursos de graduao. A bibliografia indicada no final
de cada captulo poder servir como ponto de partida pra os que pretenderem um
exame mais aprofundado de um ou outro tpico.
Os Coordenadores, o Editor e, seguramente, tambm os Autores, agradecem
todas as sugestes relativas estrutura da Coleo ou de qualquer de suas partes,
bem como a identificao de falhas ou incorrees, infelizmente sempre possveis,
que lhes sejam encaminhadas pelo leitor.

Literatura Recomendada
1) Ancies, W. & Cassiolato, J.E. Biotecnologia: seus impactos no setor industrial.
CNPq, Braslia, 1985.
2) Haelm, H. Bioqumica de las fermentaciones. Aguilar S.A. de Ediciones, Madri,
1956.
3) Jonas, R. GBF -Scientific Annual Report (pp. 35-46). Alemanha, 1990.
4) Paes de Carvalho, A. Patentes para a Biotecnologia. Apresentad Academia
Brasileira de Cincias em 6.12.1993.
IX

Cuando la coleccin "Biotecnologia", editada por los profesores Eugnio


Aquarone, Walter Borzani y Urgel de Almeida Lima, apareci en 1975, caus un
hondo impacto entre los biotecnlogos latinoamericanos. Se trat de la primera
obra sobre el tema escrita y publicada en nuestra regin y represent una
contribucin especialmente valiosa al estudio y ensefianza de esa pujante disciplina.
"Biotecnologia" const originalmente de tres volmenes: Tecnologia das
Fermentaes, Tpicos de Microbiologia Industrial y Engenharia Bioqumica, a los cuales
se sum en 1981 Corroso Microbiolgica y luego Alimentos e Bebidas produzidos por
Fermentao en 1983. Ahora, pasados ya ms de veinte afios, losmismos editores,
com la participacin del profesor Willibaldo Schmidell, nos brindam la oportunidad
de apreciar y disfrutar la nueva coleccin "Biotecnologia Industrial" como una
sucesora natural de "Biotecnologia". El contenido de la nueva obra h sido
totalmente renovado y actualizado en concordancia com los notables avances
experimentados por el conocimiento en esta rea en las ltimas dcadas,.incluyendo
las modernas tcnicas de la ingeniera gentica y el uso de microorganismos recom-
binantes en bioprocesos.
La nueva coleccin est dividida en cuatro volmenes que abarcan los mas
variados tpicos relacionados com la biotecnologa industrial: Fundamentos, Ingeniera
Bioqumica, Procesos Fermentativos y Enzimticos y Biotecnologa en la Producccin de
Alimentos. En total son 74 captulos escritos por distinguidos especialistas brasileros,
conteniendo informacin actualizada acerca tanto de los aspectos bsicos como de
los aplicados de la utilizacin de clulas microbianas y no microbianas para
finalidades productivas.
El Volumen 1, Fundamentos, entrega un completo panorama del estado del
conocimiento en microbiologa, gentica, bioqumica y enzimologa, finalizando
com un panorama de las aplicaciones industriales de la biotecnologa, abriendo as
el camino a los prximos volmenes. En el Volumen 2, Ingeniera Bioqumica, se
exponen los principales aspectos relacionados com la cuantificacin de los procesos
microbianos y enzimticos y el disefio y operacin de los equipos de proceso
requeridos en una instalacin industrial. El Volumen 3~ Procesos Fermentativos y
Enzimticos, presenta y discute la aplicacin de los microorganismos a la produccin
de una amplia gama de metabolitos y enzimas de inters prctico, el uso de enzimas
como biocatalizadores industriales y la aplicacin de los procesos microbianos a
diversos sectores industriales y a la descontaminacin de efluentes lquidos y
resduos slidos. Finalmente, el Volumen 4, Biotecnologa en la Produccin de Alimentos,
X

detalla la aplicacin de la biotecnologa a una amplia variedad de industrias de ese


importante sector.
Por su estructura y contenido, y por la indiscutible autoridad de sus editores
y autores, estoy cierto que Biotecnologia Industrial est destinada a constituirse en
una obra insustituble para la ensefi.anza universitaria de pre y post-grado, as como
tambin en una valiosa fuente de consulta para el biotecnlogo en la industria.

Fernando Acevedo
Profesor
Escuela de Ingeniera Bioqumica
Universidad Catlica de Valparaso
Valparaso, Chile
XI

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Adalberto Pessoa Junior Haroldo Hiss


Professor Doutor Pesquisador Cientfico
Universidade de So Paulo Insituto Butant
Faculdade de Cincias Farmacuticas Av. Vital Brasil, 1500
Departamento de Tecnologia 05503-900, So Paulo, SP, Brasil
Bioqumica-Farmacutica
Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16 Iracema de Oliveira Moraes
05508-900, So Paulo, SP, Brasil Professora Titular
Aberto Colli Badino Jr. Universidade de Guarulhos
Professor Adjunto I Centro de CinCias Exatas e
Universidade Fderal de So Carlos Tecnolgicas
Departamento de Engenharia Qumica Praa Teresa Cristina, 1
Caixa Postal, 676 07033-070, Guarulhos, SP, Brasil
13565-905, So Carlos, SP, Brasil
Joo Carlos Monteiro de Carvalho
Antonio Bonomi
.Pesquisador Coordenador Professor Doutor
Instituto de Pesquisas Tecnolgicas do Universidade de So Paulo
Estado de So Paulo S.A. Faculdade de Cincias Farmacuticas
Diviso Qumica , Departamento de Tecnologia
Agrupamento de Biotecnologia Bioqumica-Farmacutica
Caixa Postal, 0141 Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16
01064-970, So Paulo, SP, Brasil 05508-900, So Paulo, SP, Brasil

Beatriz Vahan Kilikian Jos Geraldo da Cruz Pradella


Professora Associada Pesquisador
Universidade de So Paulo Instituto de Pesquisas Tecnolgicas do
Escola Politcnica Estado de So Paulo S.A.
Departamento de Engenharia Qumica Diviso Qumica
Caixa Postal, 61548 Agrupamento de Biotecnologia
05424-970, So Paulo, SP, Brasil Caixa Postal, 0141
01064-970, So Paulo, SP, Brasil
Deise Maria Fontana Capalbo
Pesquisadora
Empresa Brasileira de Pesquisa Josef Emst Thiemann
Agropecuria Pesquisador Snior
EMBRAPA/CNPMA Biobrs S.A.
Rodovia SP 340, km 127,5 Avenida C, 1413- Distrito Industrial
Caixa Postal, 69 Caixa Postal, 377
13820-000, Jaguarina, SP, Brasil 39404-004, Montes Claros, MG, Brasil.
XII

Luiz Carlos Urenha Pedro Srgio Pereiralima


Pesquisador Pesquisador
Instituto de Pesquisas Tecnolgicas do Instituto de Pesquisas Tecnolgicas do
Estado de So Paulo S.A. Estado de So Paulo S.A.
Diviso Qumica Diviso de Mecnica e Eletricidade
Agrupamento de Biotecnologia Agrupamento de Sistemas de Controle
Caixa Postal, 0141 Caixa Postal, 0141
01064-970, So Paulo, SP, Brasil 01064-970, So Paulo, SP, Brasil

Rafael Almudi Villen


Manuel Filgueira Barrai Professor Associado
Pesquisador Centro Universitrio do Instituto Mau
Instituto de Pesquisas Tecnolgicas do de Tecnologia
Estado de So Paulo S.A. Escola de Engenharia Mau
Diviso Qumica Departamento de Engenharia Qumica
Agrupamento de Biotecnologia e de Alimentos
Caixa Postal, 0141 Praa Mau, 1
01064-970, So Paulo, SP, Brasil 09580-900, So Caetano do Sul, SP,
Brasil

Sunao Sato
Maria Cndida Reginato Facciotti
Professor Titular
Professora Titular
Universidade de So Paulo
Universidade de So Paulo
Faculdade de Cincias Farmacuticas
Escola Politcnica
Departamento de Tecnologia
Departamento de Engenharia Qumica
Bioqumico-Farmacutica
Caixa Postal, 61548
Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16
05424-970, So Paulo, SP, Brasil
05508-900, So Paulo, SP, Brasil

Urgel de Almeida Lima


Maria Filomena de Andrade Rodrigues Professor Pleno
Pesquisadora Centro Universitrio do Instituto Mau
Instituto de Pesquisas Tecnolgicas do de Tecnologia
Estado de So Paulo S.A. Escola de Engenharia Mau
Diviso Qumica Departamento de Engenharia Qumica
Agrupamento de Biotecnologia e de Alimentos
Caixa Postal, 0141 Praa Mau, 1
01064-970, So Paulo, SP, Brasil 09580-900, So Caetano do Sul, SP,
Brasil

Michele Vitolo Vanildo Luiz Del Bianchi


Professor Titular Professor Doutor
Universidade de So Paulo Universidade Estadual Paulista
Faculdade de Cincias Farmacuticas Intituto de Biocincias, Letras e
Departamento de Tecnologia . Cincias Exatas
Bioqumico-Farmacutica Rua Cristovo Colombo, 2265
Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16 15054-000, So Jos do Rio Preto, SP,
05508-900, So Paulo, SP, Brasil Brasil
XIII

Walter Borzani Willibaldo Schmidell


Professor Pleno Professor Titular
Centro Universitrio do Instituto Mau Universidade de So Paulo
de Tecnologia Escola Politcnica
Escola de Engenharia Mau Departamento de Engenharia Qumica
Departamento de Engenharia Qumica Caixa Postal, 61548
e de Alimentos 05424-970, So Paulo, SP, Brasil
Praa Mau, 1
09580-900, So Caetano do Sul, SP,
Brasil (
XV

CDN

1 ENGENHARIA BIOQUMICA: UMA APLICAO SUl GENERIS


DA ENGENHARIA QUMICA .................................................................................... 1
Literatura recomendada ........................... :...................................................... 3
2 MICRORGANISMOS E MEIOS DE CULTURA PARA UTILIZAO
INDUSTRIAL ..................................................................................................................... 5
2.1 Introduo .............................................................................................................. 5
2.2 Fontes de microrganismos de interesse ............................................................. 7
2.3 Caractersticas desejveis de microrganismos e meios de cultura
para aplicao industrial ............................................................................. :..... 10
2.4 Consideraes finais ........................................................................................... 18
Referncias bibliogrficas : 18
ESTERILIZAO DO EQUIPAMENTO ............................................................... 19
3.1 Introduo ............................................................................................................ l9
3.2 Terminologia e modo de atuao ..................................................................... 20
3.3 Esterilizao por agentes fsicos ....................................................................... 25
3.4 Esterilizao e desinfeco por agentes qumicos ......................................... 33
Referncias bibliogrficas .....................................................:............................ 38
ESTERILIZAO DE MEIOS DE FERMENTAO POR
AQUECIMENTO COM VAPOR . ............... :: ............................................................ 39
4.1 Introduo ............................................................................................................ 39
4.2 Descrio sumria dos processos de esterilizao por calor mido ........... 40
4.3 Cintica da destruio trmica de microrganismos ....................................... 45
4.4 Destruio de nutrientes do meio corno conseqncia da esterilizao .... 51
4.5 Consideraes geris a respeito do clculo do tempo de esterilizao ...... 53
4.6 Clculo do tempo de esterilizao por processo descontnuo ..................... 56
4.7 Clculo do tempo de esterilizao por processo contnuo ........................... 60
Literatura recomendada .................................................................................... 62
ESTRILIZAO DE AR. : ~:: ........... 63
5.1 Introduo ............................... :............................................................................ 63
5.2 Aerossis microbianos ........................................................................................ 64
5.3 Arnostradores ...................................................................................................... 65
5.4 Mtodos para a esterilizao de ar .......... ......................................................... 75
5.5 Consideraes finais .....................................:..................... :............................... 90
Referncia.s biliogrficas .................................................................................... 90
XVI

6 CINTICA DE PROCESSOS FERMENTATIVOS . ............................................. 93


6.1 Introduo ................................................. ;........................................................... 93
6.2 Parmetros de transformao ' 95.
6.3 Clculo das velocidades .................................................................................. 101
6.4 A curva de crescimento microbiano ............................................................... 103
6.5 Classificao dos processos fermentativos ................................................... 107
6.6 Influncia da concentrao do substrato sobre a velocidade
especfica de crescimento .. .............................................................................. 110
Apndice ............................................................................................................ 114
Referncias bibliogrficas ................................................................................ 121
7 MODELAGEM MATEMTICA E SIMULAO DE PROCESSOS
FERMENTATIVOS . ..................................................................................................... 123
7.1 Introduo .......................................................................................................... 123
7.2 Formulao dos modelos matemticos de processos fermentativos ........ 124
7.3 Ajuste de parmetros do modelo formulado ............................................... 148
7.4 Avaliao do modelo matemtico .................................................................. 164
7.5 Simulao de processos fermentativos .......................................................... 172
Referncias bibliogrficas ........................................... ,.................................... 175
8 BIORREATORES E PROCESSOS FERMENTATIVOS . ................................. 179
8.1 Introduo .......................................................................................................... 179
8.2 Classificao dos biorreatores : 180
8.3 Formas de conduo de um processo fermentativo ................................... . 185
8.4 Exemplos de comparao de desempenho de biorreatores ....................... 189
Referncias bibliogrficas ............................................................................. ... 190
9 FERMENTAO DESCONTNUA. ................. :.................................................... 193
9.1 Introduo .......................................................................................................... 193
9.2 Inculo ................................................................................................................ 194
9.3 Mosto ........................................................................................ .......................... 196
9.4 Classificao ............. ......................................................................................... 199
9.5 Nmero de domas ............................................................................................ 200
Referncias bibliogrficas .........:......................... : 204
10 FERMENTAO DESCONTNUA ALIMENTADA . ...................................... 205
10.1 Introduo::.................................... 205
10.2 Aplicaes .......................................................................................................... 207
10.3 Classificao ............................................................... ....................................... 210
10.4 Modelos matemticos ....................................................................................... 212
Referncias bibliogrficas ................................................................................ 216
11 FERMENTAO SEMICONTNUA ..................................................................... 219
11.1 Definio ........................................................... :................................................ 219
11.2 Produtividade do processo semicontnuo .......................................... ~ ......... 220
11.3 Comentrios finais ................................................ ............................................ 222
Referncias bibliogrficas ...... ..................................................... ..................... 222
12 FERMENTAO CONTNUA . ............................................................................... 223
12.1 Conceitos bsicos .................................... .......................................................... 223
12.2 Vantagens e desvantagens do processo contnuo em relao
ao descontnuo .................................................................................................. 224
XVII

12.3 Formas de operao no sistema contnuo ............... ...................................... 225


12.4 Formao de produtos no sistema contnuo ....... .......................................... 242
Referncias bibliogrficas ............................................................ :................... 245
13 FERMENTAO EM ESTADO SLIDO. ......................................................... 247
13.1 Introduo .......................................................................................................... 247
13.2 Histria do processo da FSS ...................... .......... ....................................... ..... 248
13.3 Microrganisrhos comumente utilizados ............................,........................... 250
13.4 Substratos: caractersticas e composio ....................................................... 250
13.5 Reatores para fermentao semi-slida ......................................................... 254
13.6 Controles do processo ............................... ................................................... .... 259
13.7 Vantagens e desvantagens ............................................................................... 264
13.8 Exemplos de casos ....................................................................................... ..... 266
Referncias bibliogrficas ............................................................................ .... 270
@ AGITAO E AERAO EM BIORREATORES . ........................................:.. 277
14.1 A importncia da transferncia de oxignio ............ ........................... ......;... 277
14.2 Sistemas para a transferncia de oxignio .................................................... 279
14.3 Concentrao de oxignio dissolvido em soluces saturadas ................... 281
14.4 Transferncia de oxignio e respirao microbiana ................................. .... 284
14.5 Transferncia de oxignio em sistemas agitados e areados ........................ 308
14.6 Consideraes finais .......................................... .................................. ......... .... 329
~) R:ferncias bibliogrficas ................................................................................ 329
L!..?/ VARIAAO DE ESCALA. ...................,.................................................................... 333
15.1 Introduo .......... ,...........................:...................................... .............................. 333
15.2 Critrios para a ampliao de escala ................................ ............................. 336
15.3 Comparaes entre critrios para a ampliao de escala ........................... 348
15.4 Reduo de escala ................................................ ;........... .'................ ~ ............... 351
15.5 Consideraes finais .................................................................................... :.... 352
Referncias bibliogrficas ...................................................:....~ ............... ......... 353
16 REATORES COM CLULAS IMOBILIZADAS . .........................................:.... 355
16.1 Introduo ...... ,....................................................... ...... ........................... ........... 355
16.2 Mtodos de imobilizao ................................................................................. 356
16.3 Tipos de biorreatores empregados .............................. ,........ .................... ...... 360
16.4 Aspectos relativos ao transporte de massa ..................................... .... .......... 363
16.5 Processos que utilizam clulas imobilizadas ................................................ 366 .
16.6 Concluses ................................................. ........................................................ 370
Referncias bibliogrficas .................................................... :........................... 371
17 REATORES COM ENZIMAS IMOBILIZADAS ............................................... 373
17.1 Introduo ..................................................................................... ;.................... 373
17.2 Reatores enzimticos .................................................... :................................... 374
17.3 Exemplos de processos enzimticos .............. .......... ,.................... ................. 388
Referncias bibliogrficas ...........................................;.. :................................. 395
18 AUTOMAO E CONTROLI;: DE PROCESSOS FERMENTATIVOS . ... 397
18.1 Introduo .......................................................................................................... 397
18.2 Principais instrumentos para monitorao ein linha de processos
fermentativos .................... .. .......... ..................................................................... 398
XVIII

18.3 Controle aplicado a processos fermentativos ............................................... 411


Referncias bibliogrficas ................................................................................ 423
19 OPERAO DE INSTALAES INDUSTRIAIS DE
FERMENTAO . ........................................ :.............................................................. .425
19.1 Princpios gerais para operao ...................................................................... 425
19.2 Condies gerais para a execuo de um processo fermentativo ............. 426
19.3 Operao de uma indstria ............................................................................. 429
19.4 Operao de um processo frmentativo assptico ...................................... 434
19.5 Exemplo de operao de indstria de fermentao ................................... .435
Bibliografia ............................................................................................... ......... 439
20 CONSTRUO DE EQUIPAMENTOS DE FERMENTAO . ................. .441
20.1 Introduo .......................................................................................................... 441
20.2 Caractersticas bsicas de reatores para cultivo de bactrias ou
clulas animais .................................................................................................. 442

20.3 Construo do fermentador ........................................................................ .... 448


20.4 Cultivo de clulas animais .............................................................................. 468
20.5 Obteno e manuteno das condies de esterilidade e
biossegurana ..................................................................................................... _470
20.6 Vlvulas e purgadores de vapor .................................................................... 480
20.7 Outros tipos de reatores ................................................................................... 485
Bibliografia ........................................................................................................ 489
21 PURIFICAO DE PRODUTO~ BIOTECNOLGICOS . ............................493
21.1 Introduo ..............................:......... :......................................................:........... 493
21.2 Classificao ......................................... :............................................................. 494
21.3 Rompimento de clulas microbianas ............................... ,............................. 501
21.4 Precipitao ....................................................................................................... 504
21.5 Ultrafiltrao ..................................................................................................... 507
21.6 Extrao em sistemas de duas fases aquosas ............................................... 507
21.7 Cromatografia ................................................................................................... 510
21.8 Tratamentos finais ............................................................................................ 514
21.9 Rotinas analticas .............................................................................................. 515
21.10 O processo integrado de purificao ............................................................. 518
Referncias bibliogrficas ...................................................................~. ~ .......... 520
22 ASPECTOS ECONMICOS . .................................................................................. 523
22.1 Introduo .......................................................................................................... 523
22.2 Consideraes sobre as diferentes variveis e suas relaes
existentes em todo o estudo econmico ............................ :........................... 523
22.3 Anlise de viabilidade econmica ......................................... :....................... 528
22.4 Aspectos econmicos de processos fermentativos ...................................... 530
22.5 Mtodos de avaliao de investimento ........................... ;............................. 535
Bibliografia ........................................................................................................ 541

--- --- ------~----------


------- - - - - -- - -- - -- -- - ----
Walter Borzani

Durante a Segunda Grande Guerra (1939-1945), os ento "Aliados" concen-


traram esforos considerveis na consecuo de um objetivo muito especfico:
transferir para escala industrial o processo de laboratrio, ento conhecido, de
produo de penicilina por fermentao.
Ao lado de profissionais j de longa ~ata envolvidos no estudo de ativida-
des microbianas, passaram ento a atuar engenheiros qumicos, com vistas solu-
o de questesbastante complexs inerentes desejada ampliao de escala.
Foi nesse perodo que nasceu o ramo da Engenharia Qumica que, mais tar-
de, por suas peculiaridades, receberia o nome de Engenharia Bioqumica.
Neste praticamente meio sculo de existncia, esse novo ramo da Engenha-
ria Qumica progrediu rapidamente, conduzindo a muitos resultados de indiscut-
vel importnda-prtica.
O objetivo da Engenharia Bioqumica a aplicao dos conhecimentos da
Engenharia Qumica na soluo de problemas que se apresentam na implantao
de processos biotecnolgicos em larga escala, e em sua otimizao.
Segundo AIBA, HUMPHREY e MILLIS: "Biochemical engineering is concer-
ned with conducting biological processes on an industrial scale, providing the
links between biology and chemical engineering. The authors believe, moreover,
that the heart of biochemical engineering lies in the scale-up and management of
cellular processes".
BAILEY e LLIS, por sua vez, dizem: "Processing of biological materiais and
processing using biological agents such as cells, enzymes or antibodies are the
central domain of biochemical engineering. Success in biochemical engineering re-
quires integrated knowledge of governing biological properties and principies
and of chemical engineering methodology and strategy. (... ) Reaching this objecti-
ve clearly requires years of careful study and practice".
Convm citar que o primeiro livro dedicado Engenharia Bioqumica foi
publicado em 1958, por STEEL.
2 Engenharia bioqumica: uma aplicao sui generis da engenharia qumica

Os problemas que se apresentam no mbito da Engenharia Bioqumica so,


com alguma freqncia, de difcil soluo, dadas as peculiaridades e a complexi-
dade dos sistemas em que se desenvolvem os processos biotecnolgicos.
O estudo de vrios desses problemas constitui o principal objetivo deste vo-
lume, mas parece-nos aconselhvel, neste primeiro captulo, comentar alguns de-
les, com a nica finalidade de dar, aos alunos, uma idia das questes que sero
examinadas.
Comecemos tecendo alguns comentrios a respeito dos balanos materiais
em processos fermentativos. A clula microbiana responsvel pela transformao
que nos interessa em um dado processo realiza, alm dessa transformao, um
grande nmero de outras reaes com o objetivo, para ela absolutamente primor-
dial, de manter-se viva e multiplicar-se. Isso pode dificultar o estabelecimento de
balanos materiais, alm de afetar o rendimento do processo considerado. O co-
nhecimento das provveis vias metablicas que se desenvolvem nas clulas , nes-
te particular, de grande auxlio, fornecendo muitas vezes informaes que
indicam a maneira mais adequada de conduzir o processo que nos interessa.
O fato inevitvel, apontado hpouco, de a clula ter a nica "preocupao"
de manter-se viva e multiplicar-se, tambm pode acarretar srios problemas no es-
tudo da cintica da transformao que se tem em vista, uma vez que a velocidade
de formao do produto que nos interessa pode ser profundamente afetada pelas
velocidades de outras reaes integrantes do metabolismo do microrganismo. Isso
pode dificultar o estabelecimento de modelos matemticos, cuja importncia na
otimizao e no controle de processos j foi constatada muitas vezes.
A manuteno de um razovel grau de "homogeneidade" no reator, para que
todos os agentes da transformao se encontrem, pelo menos aproximadamente,
nas mesmas condies (temperatura, pH, concentraes de substncias do meio),
outro problema a ser considerado, principalmente em reatores industriais.
Consideremos, agora, a operao de esterilizao de grandes volumes de
meio, operao esta muito freqente em indstrias de fermentao. Como proce-
der: eliminar os microrganismos por filtrao do meio ou destru-los por aqueci-
mento? Se a esterilizao por aquecimento tiver sido escolhida, que processo ser
utilizado: o descontnuo ou o contnuo? Que temperatura de esterilizao ser
adotada e qual o correspondente tempo do tratamento trmico? Quais sero as di-
menses dos equipamentos e os controles necessrios em cada caso?
O meio, uma vez esterilizado, ser encaminhado ao fermentador onde ser
transformado pela ao das clulas microbianas. Aqui nos depararemos com mui-
tas alternativas. Sero utilizados microrganismos em suspenso no meio ou clu-
las imobilizadas em suportes inertes? Que processo de fermentao ser utilizado:
o descontnuo, o semicontnuo ou o contnuo? Com ou sem recirculao do mi-
crorganismo? Se for escolhido o processo descontnuo, ser o descontnuo simples
ou o descontnuo alimentado? Se o processo adotado for o semicontnuo, que fra-
o de meio fermentado ser periodicamente retirada do reator e substituda por
igual volume de meio novo? No caso de se ter optado pelo processo contnuo,
adotar-se- um nico reator de mistura, vrios reatores de mistura ligados em s-
rie, ou um reator pistonado? Quais sero as dimenses e o form~to do reator?
Como controlar as condies de fermentao? Como adicionar alguns nutrientes:
Engenharia bioqumica: uma aplicao sui generis da engenharia qumica 3

todos de uma s vez no preparo do meio, ou de maneira programada durante o


andamento do processo?
No caso de se tratar de um processo enzimtico contnuo com enzimas imo-
bilizadas, lanar-se- mo de um reator de leito fixo, ou de leito fluidizado?
Outro tpico a ser lembrado, o da ampliao da escala de trabalho ("sca-
le-up"): se bons resultado~ foram obtidos, em certas condies, em um reator de
pequena capacidade, como operar um reator industrial para que os mesmos resul-
tados sejam alcanados?
Finalmente, para no alongarmos demasiadamente estes comentrios, nunca
ser demais ressaltar a importncia de que se reveste a escolha dos processos que
sero utilizados, tanto na separao dos produtos e subprodutos, como no trata-
mento, ou no aproveitamento dos resduos.
A soluo adequada de muitas das questes com que se defronta a Engenha-
ria Bioqumica passa, necessariamente, pelo estabelecimento de modelos matem-
ticos, como se constatar ao longo deste Volume. Parece-nos oportuno, por esse
motivo, ressaltar a utilidade desses modelos, valendo-nos de um artigo publicado
por FREDRICKSON e colaboradores em 1970:
"1. Models serve to correlate data and so provide a concise way of
thinking about a system or process.
2. Models allow one- within limits- to predict quantitatively the per-
formance of a system or process.-Thus~ they can reduce the amount of
experimentallbor necessary to design and/ or optimize a process.
3. Models help to sharpen thinking about a system or process and can
be used to guide one's reasoning in the design of experiments, to isola-
te important parameters and elucidate the nature of the system r pro-
cess. That is to say,' the combinations of mathematical modelling and
experilllen_ta} research often suggests new experiments that need to be
done."

Literatura recomendada

(1) AIBA, S., HUMPHREY, A.E. & MILLIS, N .F. Biochemical Engineering.
University of Tokyo Press, Tquio, 1973.
(2) BAILEY, J.E. & OLLIS, D.F. Biochemical Engineering Fundamentais.
McGraw-Hill Book Company, Nova York, 1986.
(3) SIMON, P. & MEUNIER, R. Microbiologie Industrielle et Gnie Biochi-
mique. Masson et Cie., diteurs, Paris, 1970.
5

- - - - - - - - - - - - - -- -- -

Willibaldo Schmidell

2.1 - Introduo
O objetivo central do presente captulo reside na descrio das caractersti-
cas gerais que microrganismos e meios de cultura devem apresentar, a fim de ser
possvel utiliz-los em uma operao industrial de grande porte, ou seja, executa-
da em biorreatores com volumes de dezenas de milhares de litros.
Apesar de se procurar mencionar, ao longo do texto, alguns exemplos, no
h a preocupao em de$crever caractersticas particularmente importantes para
um determinado processo fermentativo, pois isto tornaria o tema extremamente
longo, alm de apresentar uma importncia questionvel, tendo em vista o escopo
geral do presente captulo.
Retomando as idias j abordadas no Captulo 9 (Vol. 1), na Figura 2.1 en-
contra-se um esquema geral de um processo fermentativo, na qual buscou-seres-
saltar alguns pontos essenciais, que permitem um incio de discusso dentro do
objetivo acima traado.
Conforme se pode observar na Figura 2.1, o sucesso de um dado processo
fermentativo depende muito de uma correta definio de quatro pontos bsicos: o
miCrorganismo, o meio de cultura, a forma de conduo do processo fermentativo
e as etapas de rec\lperao do produto.
Na verdade, esses quatro pilares de um processo fermentativo interagem
enormemente, sendo necessrio buscar defini-los de forma conjunta, levando em
considerao aspectos biolgicos e econmicos, o que torna bastante complexa
esta adequada definio. Para tornar clara essa idia, pode-se mencionar que sem-
pre se pretende empregar meios de cultura baratos, mas deve-se lembrar que o
microrganismo deve encontrar neste ineio condies adequadas para realizar a
converso pretendida.
6 Microrganismos e meios de cu~ura para utilizao industrial

Em termos de formas de conduo do processo fermentativo, seria difcil


imaginar a produo presente de etanol no Brasil (algo como 15 bilhes de litros
por ano), caso no se operasse os biorreatores em sistema descontnuo alimentado,
ou mesmo contnuo, porm com o reciclo das clulas. Da mesma forma, o grande
avano alcanado pela digesto anaerbia no tratamento biolgico de guas resi-
.durias, deveu-se muitssimo ao surgimento dos reatores contnuos operados com
fluxo ascendente e reciclo interno de clulas.

Matrias-primas

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Figura 2.1 - Esquema geral de um processo fermentativo

As operaes finais para a recuperao do produto (operaes de


"downstream"), so igualmente da mais alta importncia. Sabe-se ' que a melhor
forma presentemente para a recuperao do etanol, aps uma fermentao alcoli-
ca, a operao de destilao, mas ela incide significativamente no custo do pro-
duto final, em virtude da energia necessria para a sua execuo. No entanto, a
importncia de uma adequada definiao das operaes de recuperao do produ-
to, fica mais clara quando se aborda a produo de produtos de alto valor agrega-
do, como a produo de antibiticos, enzimas, ou outras protenas (insulina,
hormnios de crescimento, vacinas etc:). Pra esses casos, as operaes de recupe-
rao do produto podem ser responsveis por 50 a 70% do custo do produto final,
indicando, claramente, a sua importncia em termos de uma adequada definio.
Os aspectos relacionados com a forma de conduo de biorreatores, assim
como as operaes de recuperao de produtos, sero abordados em vrios cap-
tulos do presente volume.
.

Fontes de microrganismos de interesse 7

Cabe, portanto, conforme salientado anteriormente, abordar alguma refle-


xo sobre microrganismos e meios de cultura que podem ser eventualmente em-
pregados em uma operao industrial.

2.2 - Fontes de microrganismos de interesse


Microrganismos que possam ter interesse industrial, podem ser obtidos ba-
sicamente das seguintes formas :
isolamento apartir de recursos naturais
compra em colees de culturas
obteno de mutantes naturais
obteno de mutantes induzidos por mtodos convencionais
obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de
engenharia gentica.
O isolamento de microrganismos a partir de recursos naturais, tais como
solo, gua, plantas etc., sempre foi uma atividade de grande importncia para a
obteno de novas linhagens de interesse industrial.
Trata-se de uma atividade que envolve muito trabalho experimental, signifi-
cando um custo relativamente elevado, porm pode conduzir ao isolamento de li-
nhagens melhor produtoras de um dado produto, mas, mais importante do que
isto, pode conduzir descoberta de novos produtos, o que confere a esta possibili-
dade uma relevncia inquestionvel.
Cumpre lembrar que as grandes eni.presas produtoras de antibiticos, ou en-
zimas, mantm programas de isolamento de linhagens de recursos naturais, justa-
mente com o objetivo de incrementar a produo de certos produtos, ou com o
objetivo de encontrar linhagens produtoras de novos antibiticos por exemplo.
clarq ql.!e o isolamento de linhagens deve ter incio com certas premissas,
definindo-se o que se pretende obter, pois o simples isolamento poder levar
disponibilidade de um nmero inimaginvel de culturas, o que dificulta a conver-
gncia para o processo ou o produto qtie se pretende produzir.
A compra em colees de culturas presentemente bastante vivel, tendo
em vista a existncia de muitas colees de culturas em vrios pases. Nesse
sentido, STANBURY et al. 1 listam nada menos do que 11 colees de culturas em
vrios pases, podendo-se ainda acrescentar a Agricultura! Research Service
Culture Collection (EUA), tambm conhecido como NRRL Culture Collection
(http:/ /nrrl.ncaur.usda.gov) e a Coleo de Culturas Tropical {Campinas - SP;
http:/ /www.cct.org.br). O contato com essas colees atualmente muito facilita-
do, podendo-se utilizar os recursos da Internet para tal tarefa.
de se esperar que o microrganismo utilizado para a produo de um dado
antibitico no estar disponvel em uma coleo de culturas, sendo, com muita
freqncia, oriundo de programas de melhoramento gentico.
Como se sabe, quando uma dada clula prolifera, h sempre uma pequena
possibilidade de surgimento de mutantes naturais, os quais podem ser isolados e
ensaiados objetivando a verificao de sua potencialidade de produo. Conforme
io;;,..._ __ ___ - - - . ... --- ---- --
8 Microrganismos e meios de cultura para utilizao industrial

se ver adiante, essas alteraes naturais no so, de forma alguma, interessantes


do ponto de vista de um processo fermentativo, mas eventualmente podem gerar
novas linhagens que apresentem interesse prtico.
No entanto, aguardar o surgimento de mutantes naturais de interesse prti-
co, poder significar o dispndio de muito tempo, razo pela qual prefere-se, h j
vrias dcadas, lanar mo de mtodos que forcem o aparecimento de clulas inu-
tadas, como o caso de submeter suspenses de clulas ou esporos a radiaes ul-
travioleta ou a substncias qumicas mutagnicas, como a nitrosoguanidina. Ao se
permitir essa exposio ou contato, ocorre uma drstica destruio da maioria das
clulas, recuperando-se, a seguir, aquelas que sobreviveram, verificando-se se
mutaram na direo desejada.
Essa tcnica para a obteno de mutantes obviamente aleatria, tratan-
do-se de recuperar as clulas sobreviventes em meios ou condies especficas, de
forma a dirigir este isolamento para as clulas que se pretende. Tais programas de
mutao/seleo costumam ser bastante dispendiosos, mas levaram a vrias con-
dies de sucesso descritas na literatura.
Um caso bem relatado foi a significativa melhora de linhagens de Penicllium
chrysogenum para a produo de penicilina. De fato, na dcada de 40 obtinha-se
teor de penicilina no caldo fermentado da ordem de 100 unidades/ cm3, passan-
do-se a obter, j por volta de 1976, teores da ordem de 51.000 unidades/cm 3 J
acrscimos da ordem de 4 vezes foram obtidos entre 1970 e 1985 em uma determi-
nada empresa, 1 o que indica que este progresso costuma-~er muito estimulante, es-
pecialmente quando se parte de linhagens naturais. Incrementos semelhantes
foram obtidos na empresa Squibb Indstria Qumica S.A., no perodo de 1975 a
1992, conforme relatado por SCHMIDELL; FERNANDES. 2
Tais progressos realmente significativos costumam ser atribudos apenas a
esses programas de mutao/seleo, mas conveniente lembrar o necessrio tra-
balho de adaptao do meio de cultivo, da forma de conduzir o processo.fermen-
tativo e as alteraes nas etapas de recuperao do produto, a fim de propiciar o
real surgimento das vantagens, em nvel de produo industrial, da nova linha-
gem selecionada. 2
Finalmente, nas ltimas dcadas, as tcnicas de engenharia gentica (vide
Vol. 1, Cap. 4), tambm designadas por tcnicas ou tecnologia de DNA recombi-
nante, sem dvida trouxeram um imenso avano nas possibilidades de se obter c-
lulas mais produtivas, ou clulas produtoras de substncias que normalmente no
produzem. Como se sabe, ao lado dessas possibilidades, igualmente trouxeram
vrias reflexes e inquietudes, cujo teor no ser abordado no presente captulo.
A introduo de fragmentos de DNA de certas clulas em outras, via vetores
como os plasmdeos, permite a obteno de clulas alteradas geneticamente, po-
rm de forma muito mais dirigida do que as metodologias convencionais anterior-
mente mencionadas, sendo possvel de ser executada no apenas com microrga-
nismos, mas igulmente com clulas animais e vegetais.
Para se ter uma idia da potencialidade dessas tcnicas, imaginemos que se
_conhea a seqncia metabl~ca que leva ao acmulo de um dado produto de inte-
resse, por exemplo o produto P na seqncia genrica:
Fontes de microrganismos de interesse 9

A~B~C~D~ ... ~P
Um estudo mais aprofundado dessa seqncia, atravs da determinao das
concentraes dos compostos intermedirios (B, C, D etc.), pode levar determi~
nao da reao limitante da seqncia (aquela que determina a velocidade do flu-
xo metablico em estudo, por exemplo a reao C~ D) e, portanto, da enzima
responsvel pela reao especfica (enzima c). As etapas seguintes so a identifica-
o do gene que codifica 'para a sntese dessa enzima, introduzir este gene em
plasmdeos e volt-los clula produtora. Com esse procedimento, aumenta-se o
nmero.de cpias do gene responsvel pela sntese da enzima, o que permite au-
mentar a velocidade da reao limitante, pela presena de uma maior concentra-
o da enzima responsvel (no caso, a enzima c).
Essa estratgia foi empregada, por exemplo, no incremento da produo de
cefalosporina C por CephaZosporium acremonium. 1
Ainda, uma etapa intermediria poderia ser imaginada. Uma vez identifica-
da a enzima responsvel pela catlise da reao limitante, esta enzima poderia ser
manipulada, atravs do conhecimento de sua estrutura e alterao de determina-
dos aminocidos, por tcnicas de engenharia de protenas, objetivando obter uma
nova protena com atividade aumentada. O gene correspondente a essa nova enzi-
ma seria, ento, introduzido na clula produtora, conforme acima descrito.
A potencialidade dessas tcnicas realmente enorme, pois, uma vez solucio-
nado o problema de uma dada reao limitante, outra reao da seqncia meta-
blica passar a ser limitante, o que permite imaginar a realizao de igual estrat-
gia para esta nova reao. Claro est que tais procedimentos no so de simples
execuo, pois inclusive exigem um amplo conhecimento do material biolgico
utilizado, mas apresentam um enorme interesse prtico.
Conforme mencionado, as tcnicas de DNA recombinante tambm podem
ser aplicadas para tornar clulas produtoras de substncias que naturalmente no
so por elas produzidas, ,em virtude da ausncia de codificao gentica para tan-
to. Nesse caso, genes de certas clulas so transferidos, via vetores adequados, a
outras clulas, como o caso de introduzir a codificao para a sntese de glicoa-
milase de Aspergillus em clulas de Saccharomyces cerevisiae, o que passa a permitir
a realizao da fermenta)o alcolica de matrias~primas amilceas, pela levedura
alterada geneticamente. 3'
Com esse objetivo, a tecnologia do DNA recombinante tem sido empregada
para a obteno de protenas heterlogas de alto valor agregado, em particular
para uso em sade humana, como o caso da produo de hormnio de cresci-
mento humano, insulina, interferons, Fator VIII (tratamento da hemofilia) etc.
Como microrganismos receptores da codificao gentiCa empregam-se bactrias
(Escherichia coZi, Bacillus subtilis), leveduras (Saccharomyces cerevisiae) ou fungos fi-
lamentosos (Aspergillus niger). Igualmente so empregadas clulas animais (exem.:.
plo: BHK - "Baby Hamster Kidney"), particularmente para a produo de prote-
nas mais complexas e de maior valor agregado, o que explica o crescente interesse
das grandes empresas do setor no cultivo de clulas animais.
Presentemente, inclusive possvel imaginar o emprego de um pequeno n-
mero de microrganismos, bem conhecidos em termos de necessidades nutricionais
e caractersticas de crescimento, como o caso de Escherichia coZi ou Saccharomyces
cerevisiae, para a sntese de uma grande variedade de protenas, no lugar de se ter
como problema o cultivo de uma linhagem para cada composto a ser produzido.
IO Microrganismos e meios de cultura para utiliza~ industrial

. ~
Claramente isso pode contribuir pa~a uma certa simplificao dos processos pro-
dutivos, desde que se consiga obter os mutantes adequados.

2.3 - Caractersticas desejveis de microrganismos e meios


de cultura para aplicao industrial
Conforme j anunciado, no presente item pretende-se apresentar algumas
caractersticas gerais que microrganismos e meios devem apresentar, a fim de que
seja possvel o estabelecimento de processo produtivo em larga escala. Buscar-se-
enunciar as caractersticas desejveis de microrganismos e, em seguida, aquelas
relacionadas aos meios de cultivo, lembrando, no entanto, que o desempenho de
um dado microrganismo depende muito da composio do meio de cultura em
que colocado.
Como se pretende expor caractersticas gerais, quando da anlise de um
dado processo fermentativo, possvel que algumas destas caractersticas no se
apliquem, enquanto outras,no abordadas no presente texto, podero ser de gran-
de importncia. No entanto, espera-se estabelecer certas reflexes que permitam
essa anlise crtica.

2.3. I - Caractersticas desejveis de microrganismos


Para uma aplicao industrial, espera-se que os microrganismos apresentem
as seguintes caractersticas gerais:
apresentar elevada eficincia na converso do substrato em produto;
permitir o acmulo do produto no meio, de forma a se ter elevada concen-
trao do produto no caldo fermentado;
no produzir substncias incompatveis com o produto;
apresentar constncia quanto ao comportamento fisiolgico;
no ser patognico;
no exigir condies de processo muito complexas;
no exigir meios de cultura dispendiosos;
permitir a rpida liberao do produto para o meio.
As duas primeiras caractersticas sero discutidas conjuntamente, pois, ape-
sar de serem distintas, concorrem para o mesmo objetivo geral de extrema impor-
tncia.
I)e fato, uma clula deve permitir elevada converso do substrato em produto,
pois, com muita freqncia, as matrias-primas incidem pesadamente no custo do
produto final, podendo-se mencionar uma incidncia de 38 a 73% do custo total de
produo como sendo devido s matrias-primas, em particular a fonte orgnica
de carbono. 1
Por outro lado, sempre desejvel que o microrganismo permita um elevado
acmulo do produto no meio, sem sofrer inibio mais acentuada em virtude deste
acmulo, pois isto concorre para uma reduo nos custos de recuperao, os quais
tambm podem ser muito acentuados.
Tome-se como exemplo o caso da fermentao alcolica, aqui representada
simplificadamente pela equao qumica final (glicose em anaerobiose sendo con-
vertida em etanol e gs carbnico):
Caractersticas desejveis de microrganismos e meios de cuaura para aplicao industrial II

.....
C 6 H 12 6 ~ 2C 2 H 5 0H+ 2C0 2
Como se pode observar, o fator estequiomtrico igual a 0,511, ou seja, cada
grama de glicose convertida gera 0,511g de etanol, sendo que o Saccharomyces cere-
visiae, normalmente empregado nesta fermentao, com freqncia permite obter
um rendimento da ordem de 90% deste valor estequiomtrico, o que torna este mi-
crorganismo o mais importante para Tealizar esta converso, lembrando que vrios
outros tambm podem acumular etanol, a partir da glicose, porm no com este
rendimento to elevado.
Obviamente, no se consegue manter um processo de fermentao alcolica
obtendo-se 100% de rendimento, pois as clulas tm de proliferar, o que significa a
sntese de muitos outros compostos intermedirios, sendo o acmulo de etanol a
via metablica que permite a gerao de energia na forma de ATP (gliclise). Cla-
ro est que esse um ponto fundamental, pois a matria-prima incide em algo
como 60% do custo do etanol e, desta forma, baixos rendimentos tornariam invi-
vel a produo deste produto de baixo valor agregado.
Por outro lado, sabe-se que quando se atinge 8 a 10% (em volume) em etanol
no vinho fermentado, j ocorre uma clara inibio da levedura, o que faz com que
( a velocidade da converso do acar em etanol fique prejudicada, razo pela qual
procura-se no ultrapassar estes valores, pelo menos na produo de lcool com-
bustvel (no se est aqui comentando o caso de bebidas alcolicas).
Isso significa a necessidade de destilar um lquido que contm apenas 10%
de etanol, o que - alm do dispndio de energia - ainda ir gerar 90% de resduo
na forma de vinhaa, que necessita encontrar um destino adequado.
O ideal seria encontrar leveduras mais resistentes ao etanol, porm sem que
f ocorra queda n. a velocidade da fermentao alcolica (sem queda na produtivida-
de), o que no tarefa simples.
De qualquer forma, fica claro que a converso da matria-prima em produto
j muito elevada, o que no permite visualizar grandes incrementos, lembrando,
novamente, a necessidade de manter a viabilidade celular para que a fermentao
no seja interrompida.
Uma situao bem diversa a que ocorre com os processos aerbios, por
exemplo, na produo de enzimas ou antibiticos. Nesse caso, a converso do a-
car pode ser representada esquematicamente da seguinte forma:

Acar + 0 2 ~ clulas + C0 2 + H 20 + Intermedirios + Produto


Nesse caso, por se operar em aerobiose, a quantidade de clulas geradas cos-
tuma ser muito intensa, em relao ao acar consumido, ao lado de uma quanti-
dade relativamente pequena do produto alvo (antibitico ou enzima). Se, por um
lado, o custo da matria-prima incide menos'pesadmente no custo do produto fi-
nal, as operaes de recuprao do produto so necessariamente mais onerosas
(chega-se a valores da ordem de 70%), mas o produto alvo de mais alto valor
agregado.
Assim, ao se encontrar linhagens que cresam relativamente menos, ou que
acumulem menos compostos intermedirios, possvel visualizar grandes incre-
mentos na sntese do produto, conforme mencionado anteriormente para o caso
da produo de penicilina.
12 Microrganismos e meios de cultura para utilizao industrial

Mesmo permitindo o acmulo do produto no meio, a clula produtora deve,


ainda, contar com a caracterstica de no produzir substncias que sejam incompatveis
com o produto, pois isto pode levar a uma situao de desinteresse pelo processo
produtivo.
Esse o caso, por exemplo, de se estar interessado na produo de uma dada
enzima, ou protena, mas se utilizar uma linhagem que tambm seja uma boa pro-
dutora de proteases extracelulares. Assim, ao se produzir a enzima, separar as c-
lulas e armazenar o produto, pode-se ter uma reduo sensvel da atividade
enzimtica em virtude da ao das proteases.
Um exemplo adicional, mais especfico, sobre a produo de glicoamilase
por Aspergillus. Como se sabe, a glicoamilase a enzima que hidrolisa o amido ge-
rando glicose, sendo pois de muito interesse em vrias aplicaes, destacando-se o
preparo de xaropes de glicose para a indstria de alimentos. Ocorre que alguns
microrganismos produtores de glicoamilase tambm sintetizam a transglicosida-
se, enzima esta que, quando na presena de glicose, volta a polimeriz-la, gerando
molculas que no so mais hidrolisadas pela glicoamilase.
Na realidade, a presente caracterstica desejvel em uma clula pode ser
bem mais generalizada. Um microrganismo ideal, quanto ao aspecto agora abor-
dado, deve produzir o mnimo de outras substncias, ao mesmo tempo em que
sintetiza o composto pretendido. Isso leva a uma maior disponibilidade de nutri-
entes para a sntese do produto (voltando-se discusso anterior), mas tambm
permite vislumbrar uma maior facilidade na recuperao deste produto. '
Uma outra caracterstica, da mais alta importncia, refere-se estabilidade fi-
siolgica da linhagem a ser empregada industrialmente. Isso significa que no bas-
ta que se tenha uma linhagem hiperprodutora de uma dada substncia de
interesse, mas que se conhea as tcnicas mais adequadas para a sua conservao
e, mais ainda, que ela se mantenha como excelente produtora da substncia de in-
teresse ao longo de todas as etapas envolvidas desde sua proliferao em nvel de
laboratrio, germinadores e biorreator principal (Fig. 2.1).
Assim sendo, o constante estudo dessas formas de conservao maiS ade-
quadas das linhagens tarefa das mais importantes, mantendo-se, na indstria,
aquelas realmente de interesse, assim como o imediato descarte dos lotes que de-
monstrem alguma tendncia atenuao quanto ao acmulo do produto no meio.
Para a clula h sempre a tendncia em otimizar o crescimento, em detrimento da
sntese do produto, motivo pelo qual no basta verificar, em termos de metodolo-
gias de conservao, se a clula cresce, mas se ela continua a acumular o produto
de maneira eficaz.
Conforme j mencionado anteriormente, quando uma clula prolifera, h
sempre alguma probabilidade de ocorrerem mutaes naturais. Em um processo
fermentativo tpico, normalmente parte-se de uma massa muitopequena de clu-
las nas etapas iniciais de preparo do inculo (Fig. 2.1), chegando-se a biorreatores
de dezenas de milhares de litros, contendo concentraes celulares com freqn-
cia acima de 10 g de matria seca de clulas/L, o que significa gerar, em termos de
massa de matria seca, algo em torno de toneladas de clulas. Isso mostra clara-
mente a necessidade de se operar com material gentico que seja estvel, a fim de
se contar com clulas competentes em termos de acmulo do produto.
O emprego de linhagens relativamente instveis, pode, inclusive, limitar o
emprego de sistemas de fermentao mais eficientes, como os processos contnuos,
Caractersticas desejveis de microrganismos e meios de cu~ura para aplicao industrial 13

pois poder ocorrer, ao longo do tempo, a seleo de clulas que privilegiem o


crescimento em detrimento do acmulo do produto.
O fenmeno da atenuao do acmulo do produto de interesse pode ocorrer
tanto com linhagens naturais como, em especial, com as linhagens mutadas. Na li-
teratura1 est bem documentada a viabilidade de se produzir lisina pOr mutantes
auxotrficos, em processo contnuo, apenas quando se empregam mutantes auxo-
trficos em dois aminocidps e no em apenas um, a fim de evitar os mecanismos
de controle da clula e obtr o acmulo intenso do aminocido de interesse. Nessa
condio, mais difcil o retorno s caractersticas da linhagem original, em virtu-
de de uma maior alterao a que a clula foi submetida.
Clulas recombinantes, por via da introduo de plasmdeos, igualmente
podem ser instveis em virtude da inexistncia de replicao do plasmdeo para
.as clulas filhas, ou mesmo devido destruio do plasmdeo na prpria clula
hospedeira, ou ainda expulso desse plasmdeo. necessrio lembrar que a in-
troduo de novas codificaes genticas pode, eventualmente, significar um nus
adicional para a clula, a qual est interessada em aprimorar o seu crescimento.
Inclusive, a integrao de uma codificao gentica contida em um plasmdeo ao
cromossomo da clula, o que poderia conferir a desejada estabilidade, pode ainda
no resultar na obteno de uma hiperprodutora, em virtude da existncia de um
nmero limitado de cpias do gene de interesse.
A operao de biorreatores de grande porte, conforme mencionado anterior-
mente, do ponto de vista tcnico e econmico, praticamente exige o emprego de
microrganismos no patognicos, os quais possam ser manuseados sem riscos ambi-
entais, particularmente nas etapas seguintes em relao ao t~rmino do processo
fermentativo. Mesmo durante a fermentao, caso se manuseasse microrganismos
patognicos em reatores de dezenas de milhares de litros, os cuidados teriam de
ser bastante -aumentados, particularmente com os gases efluentes, o que incidiria
em custos adicionais.
O cultivo de patogil.icos efetuado, por exemplo, para a produo de vaci-
nas, em reatores_le pequeno porte (da ordem de centenas ou poucos milhares de
litros), porm confinados em cmaras asspticas, tomando-se precaues necess-
rias para a 'rio ocorrncia de contaminao do meio ambiente. Isso, logicamente,
significa custo adicional, o qual pode ser justificado no caso de produo de vaci-
nas, mas tornaria invivel a produo de uma enzima ou mesmo um antibitico.
A obteno de clulas recombinantes de Escherichia coZi, via a introduo de
plasmdeos, sempre algo muito atraente, pois esta uma das bactrias mais co-
nhecidas presentemente, mas encontra resistncias em termos de uma utilizao em
instalaes de grande porte, justamente por ser uma enterobactria. Essa uma das
razes (no a nica), pelas quais hoje se prefere partir de clulas de leveduras, ou
fungos filamentosos no patognicos, ou mesmo de clulas animais, a fim de se ob-
ter recorri.binantes. Apesar disso, ainda existem discusses a respeito da disposio
final dessas clulas recombinantes, conforme mencionado anteriormente.
Um microrganismo tambm no deve exigir condies de processo muito comple-
xas, por motivos claros de economicidade da produo, sendo que dentro deste t-
pico muitos aspectos podem ser abordados.
Como se sabe, sempre existem valores timos d0 pH e da temperatura, por
exemplo, em termos do acmulo do produto. No entanto, tambm se sabe que o

~----- _._ ___ .___ ------ - --- -- ------- -- - --- ---- ---- - -. _j
14 Microrganismos e meios de cu~ura para utilizao industrial

controle preciso do pH e da temperatura apenas possvel em reatores de banca-


da, sendo que em reatores de grande porte (dezenas de milhares de litros), dever
ocorrer uma certa heterogeneidade ao longo da altura do reator, de forma que a
clula dever manter o seu desempenho, apesar de uma certa flutuao nos valo-
res destas grandezas tomadas como exemplo. Em outras palavras, o ideal que o
microrganismo tenha uma faixa de valores timos dessas grandezas e no valores
pontuais, particularmente no que se refere ao acmulo do produto.
Nessa direo, so igualmente muito interessantes os microrganismos que
conseguem manter um bom desempenho, quando cultivados em baixas concentra-
es de oxignio dissolvido. Como ficar claro no captulo sobre transferncia de
oxignio, a necessidade de manuteno de altas concentraes de oxignio dissol-
vido traz problemas bastante srios no tocante a um maior dispndio de energia,
em virtude de uma maior agitao e aerao do meio. Nesse sentido, os microrga-
nismos que crescem de forma aglomerada (forma miceliar, por exemplo), so sem-
pre mais complicados, pois a concentrao de oxignio no meio de cultivo ter de
ser mais elevada, a fim de que as clulas mais internas destes aglomerados tenham
acesso a este oxignio, quando comparadas s clulas que crescem isoladamente.
J foi abordado anteriormente a inconvenincia em operar corh linhagens
que excretem quantidades exageradas de protenas para o meio, mas ainda h
uma questo adicional, pois a gerao de espuma freqentemente se atribui pre-
sena de protenas no meio de cultivo, situao ainda mais complexa para os pro-
cessos aerbios, devido necessidade de aerar e agitar.o contedo do bioi:-reator.
Em geral, a gerao de espuma pode ocorrer no incio de um processo fer-
mentativo aerbio, quando se empregam meios de cultivo contendo extratos de
carne ou de levedura, ou gua de macerao de milho ("com steep liquor"), e nas
etapas mais avanadas de um processo em virtude da presena de protenas. Isso
causa srios problemas, como a necessidade de empregar um menor volume til
do reator, a fim de ter condies de controlar a espuma, alm da freqente necessi-
dade de empregar antiespumantes que, alm de onerarem o produto final, ainda
podem causar dificuldades nas etapas de recuperao do produto e uma reduo
na transferncia de oxignio, o que exige o aumento da agitao e da aerao,
agravando a situa.o. Assim, .importante a seleo de microrganismos que ex-
cretem poucas protenas juntamente com o produto desejado.
As caractersticas que um meio de cultivo devem apresentar sero discuti-
das no prximo subitem mas, neste momento, convm mencionar que o microrga-
nismo selecionado para um processo industrial no deve exigir meio de cultura
extremamente oneroso, por questes claramente de economia do processo produti-
vo. Essa a razo pela qual um maior conhecimento das necessidades nutricionais
de uma linhagem estudo de vital importncia, objetivando o fornecimento dos
nutrientes apenas necessrios. Em algumas circunstncias esse desconhecimento
leva necessidade da adio de certas substncias, como extrato de levedura, ex-
trato de carne, peptona etc., as quais costumam ser bastante dispendiosas.
Particularmente na rea de produo de vacinas, costuma-se utilizar meios de
cultura bastante complexos e.onerosos, assim como nos cultivos envolvendo clulas
animais, mas aqui, novamente, os volumes de reao so relativamente pequenos e
os produtos gerados podem ser considerados como de alto valor agregado.
Finalmente, como com muita freqncia imagina-se a produo de produtos
extracelulares, h todo o interesse em que a linhagem selecionada libere fcil e rapi-
Caractersticas desejveis de microrganismos e meios de cultura para aplicao industrial I5

damente o produto para o meio, de onde ele ser recuperado nas etapas seguintes ao
processo fermentativo .
Alm do aspecto ligado a uma eventual inibio do prprio microrganismo,
pela reteno de um dado produto do metabolismo, ainda cumpre lembrar que,
com freqncia, a primeira etapa de recuperao do produto significa a separao
do microrganismo (por centrifugao ou filtrao), trabalhando, a seguir, com o l-
quido isento de clulas e estas descartadas. Assim, se algum produto ainda per-
manece associado s clulas, ser perdido.
Sabe-se que a reteno de certos produtos pelas clulas depende de uma s-
rie de fatores, tais como: da linhagem empregada, da composio do meio de cul-
tivo e das condies impostas (pH, temperatura etc.).
Nessa direo, um exemplo interessante foi o apresentado por AGUERO et
al} trabalhando no estudo da produo de glicoamilase por Aspergillus niger
NRRL 337 e Aspergillus awamori NRRL 3112, sendo esta segunda linhagem, sem
dvida, melhor produtora que a primeira. Esses autores indicaram que, a pH 4, o
A. niger reteve cerca de 30% da atividade associada s clulas, enquanto que o A.
awamori apenas algo em torno de 10%, indicando que a linhagem melhor produto-
ra tende a ser mais eficiente na excreo. do produto de interesse. J a pH 6, as c-
lulas de A . niger retiveram cerca de 70% da atividade enzimtica, enquanto que
nas clulas de A. awamori esta reteno foi da ordem de 40%, em relao ativida-
de total (soma da atividade enzimtica extracelular, encontrada no caldo, e a ativi-
dade intracelular, ou seja, a atividade encOntrada nas clulas - atividades
enzimticas expressas por unidade de volume de amostra), mostrando de forma
clara a influncia do pH na eficincia da capacidade de excreo das clulas. Ain-
da, indicaram que as atividades totais obtidas com cada uma .das linhagens atin-
giram valores muito prximos, tanto a pH 4 como 6, indicando .que o pH interferiu
na excreo, mas no na sfntese propriamente dita.
Esses resultados indicam a necessidade de se verificar, com a devida aten-
o, a reteno do produto de interesse pelas clulas, quando se procura efetuar
trabalhos de seleo de linhagens, ou se esteja estudando diferentes condies de
cultivo, mesmo que o interesse resida na recuperao de produtos extracelulares.
Caso contrrio, corre-se o risco de descartar linhagens, ou condies de cultivo,
que poderiam ser potencialmente interessantes.

2.3.2 - Caractersticas desejveis de meios de cultivo


Conforme j comentado no incio do item 2.3, sempre muito difcil mencio-
nar as caractersticas de microrganismos, sem associ-los a um determinado meio
de cultivo. Dessa forma, as caractersticas acima indicadas, na verdade em muitos
casos, dependem do meio utilizado, de maneira que se poderia repetir, no presen-
te item, caractersticas como permitir o acmulo de produto no meio, no permitir
a sntese de substncias incompatveis com o produto etc. Claramente isso no te-
ria um maior interesse, alm de tornar-se montono, preferindo-se descrever algu-
mas caractersticas mais especficas, mas que agora, obviamente, dependero do
microrganismo a ser utilizado. Igualmente, no ser apresentada uma discusso
item a item, mas ser efetuada uma abordagem mais geral.
16 Microrganismos e meios de cultura para utilizao industrial

Algumas caractersticas gerais, que devem ser consideradas, so:


ser o mais barato possvel;
atender s necessidades nutricionais do microrganismo; '
auxiliar no controle do processo, como o caso de ser ligeiramente tampo-
nado, o que evita variaes drsticas de pH, ou evitar uma excessiva for-
mao de espuma;
no provocar problemas na recuperao do produto;
os componentes devem permitir algum tempo de armazenagem, a fim de
estarem disponveis todo o tempo;
ter composio razoavelmente fixa;
no causar dificuldades no tratamento final do efluente.
Todas essas so caractersticas importantes, destacando-se o custo do meio
de cultura, que deve ser o menor possvel, desde que atenda s necessidades do
microrganismo selecionado.
Justamente essa combinao de atender s necessidades nutricionais do mi-
crorganismo, a fim de que o produto possa ser sintetizado, e ser minimamente
oneroso, que, com freqncia, acaba por causar certas complicaes, que mere-
cem ser mais detidamente discutidas.
Como se sabe, os microrganismos utilizam como fonte de carbono, e fre-
qentemente de energia, diversos acares, tais como:.glicose, sacarose, frutose,
ou ainda polissacardeos, como o amido e a celulose. Como fonte de nitrognio
{ so freqentemente utilizados sais, como o (NH4 hS0 4 (o qual costuma provocar
redues significativas do pH e, em alguns casos, fenmenos de inibio pelo sul-
fato), o (NH4 ) 2HP04 , ou aminocidos, ou a uria (a qual permite reduzjr os proble-
mas de controle do pH). Como fonte de fsforo utilizam-se os fosfatos solveis,
como o monoamnio fosfato (MAP), ou o diamnio fosfato (DAP), os quais pas-
sam a ser fontes de nitrognio e fsforo simultaneamente. Ainda, necessita-se adi-
cionar outros elementos, como: Na, K, Ca, Fe, Cu, Mg, Mn, Co etc., em
concentraes freqentemente muito reduzidas, na forma de seus sais solveis.
Meios de cultura constitudos apenas por essas substncias costumam ser
chamados de meios definidos, ou meios sintticos, cuja composio qumica
sempre muito bem conhecida e pode ser reproduzida a qualquer instante. Por essa
razo, para as clulas que apresentam bom desempenho em meios desse tipo, es-
pera-se a ocorrncia de um sistema produtivo muito estvel, alm de, em geral,
no apresentarem problemas quanto recuperao e purificao do produto final.
Esses meios, mesmo sendo mais onerosos, podem ser preferidos, caso realmente
permitam uma maior economia nas etapas de recuperao do produto.
No entanto, para uma grande variedade de linhagens, h a necessidade da
adio de certos "fatores de crescimento", ou seja, alguns aminocidos especficos
ou vitaminas (como biotina, tiamina, riboflavina etc.). Claro est que, quando se
conhecem essas necessidades especficas, o que nem sempre o caso, possvel
adicionar essas substncias puras, a fim de manter o meio em sua forma mais defi-
nida, mas o custo destes meios pode tornar-se invivel, particularmente para ins-
, talaes de grande porte, a menos que isto signifique um enorme ganho
Caractersticas desejveis de microrganismos e meios de cultura para aplicao industrial 17

econmico na recuperao do produto, ou preserve alguma caracterstica funda-


mental deste produto, necessariamente de alto valor agregado.
Alternativamente, para suprir as necessidades de linhagens mais exigentes
e, em geral, com caractersticas nutricionais mal conhecidas, pode-se adicionar
certos materiais complexos como: extrato de levedura (autolisado de leveduras),
extrato de carne, extrato de malte, peptona (hidrolisado de protenas) etc. Esses
materiais (individualmente ou adicionados .conjuntamente) permitem introduzir
no meio de cultura os fatores faltantes em um meio definido, mas, alm de onero-
sas, so complexas e de composio varivel ao longo do tempo de armazenagem
e na dependncia do fabricante e do lote empregado. Assim, pode-se imaginar a
ocorrncia de oscilaes no processo fermentativo, alm de possveis dificuldades
nas operaes de recuperao do produto final, dependendo das caractersticas
deste produto e das operaes de recuperao.
freqente observar-se, n~s trabalhos bsicos de isolamento ou seleo de
linhagens, o emprego de meios contendo quantidades muito grandes desses extra-
tos ou hidrolisados (vrios gramas por litro, ou mesmo dezenas de gramas por li-
tro). Dessa forma, no desenvolvimento do processo produtivo, uma das tarefas
iniciais verificar a possibilidade da obteno de iguais desempenhos, porm em
meios isentos desses materiais, ou com a adio de quantidades mnimas, tendo
em vista o custo envolvido.
Na direo dos meios mais complexos e, igualmente, menos onerosos, razo
pela qual so empregados na maioria dos processos fermentativos em grande es-
cala, cumpre mencionar o uso de matrias-primas naturais, tais como caldo de ca-
na-de-acar, melaos, farinhas diversas (farinha de trigo, milho, soja, cevada),
gua de macerao de milho ("corn steep liquor") etc.
Essas matrias-primas so de composio qumica desconhecida, poden-
do-se conhecer os teores dos acares disponveis, nitrognio, fsforo, mas no se
conhecem os teores dos sais minerais, pois certamente h sempre um nmero mui-
to grande de constituintes. Meios de cultura contendo esses materiais naturais
com freqncia so completados com alguns sais (particularmente contendo nitro-
gnio e fsforo) .
Claro est qu~ a composio qumica estar na dependncia de uma srie de
fatores, tais como solo, variedade do vegetal, safra, clima, processamento durante
a colheita e estocagem etc. Esses fatos indicam j a expectativa de que possam
ocorrer oscilaes no processo fermentativo que emprega essas matrias-primas,
alm de obrigarem as empresas produtoras de antibitico$, ou enzimas a mante-
rem instalaes piloto para o ajuste da composio do meio a cada novo lote de
matria-prima que a empresa recebe (particularmente aquelas que usam a gua de
macerao de milho), a fim de evitar maiores surpresas nos biorreatores de grande
porte.
Inclusive essas matrias-primas naturais podem causar problemas adicionais
na recuperao e purificao do produto final, assim como problemas nos trata-
mentos das guas residurias.
No entanto, ainda continuam a ser as matrias-primas preferidas em grande
nmero de casos, pela simples razo de serem as mais baratas.
18 Microrganismos e meios de cultura para utilizao industrial

2.4 - Consideraes finais


A definio adequada do microrganismo a ser empregado, assim como do
meio de cultura para este microrganismo, etapa fundamental para o sucesso de
um processo fermentativo. No entanto, sempre importante lembrar que a defini-
o de um processo fermentativo. mais adequado, assim como as preocupaes
com a recuperao do produto, so etapas da mais alta importncia.
Em alguns casos, o emprego de microrganismos disponveis em colees de
cultura pode levar ao desenvolvimento de processos produtivos que sejam atraen-
tes. necessrio lembrar, no entanto, que presentemente se dispe de muitos re-
cursos para o aprimoramento de linhagens produtivas, o que torna os processos
fermentativos cada vez mais promissores.
Essas consideraes trazem tambm um importante alerta sobre a constante
necessidade de desenvolvimento do processo produtivo j instalado, justamente
por essa grande variedade de desenvolvimentos possveis. Presentemente bas-
tante difcil imaginar que uma dada empresa disponha do microrganismo "ti-
mo", ou do meio de cultura "otimizado". da mais alta importncia que essa
empresa continue a busca por melhores condies, em termos de microrganismo e
meio; caso contrrio, poder ser ultrapassada por outras com ofertas de produtos
de menor custo, ou melhor qualidade.

Referncias bibliogrficas
(1) STANBURY, P.F.; WHTAKER, A.; HALL, S.J. Principies of fermentati-
on Technology. 2.ed. Reino Unido, Elsevier Science Ltd., 1995.
(2) SCHMIDELL, W.; FERNANDES, O.L. O aspecto evolutivo dos processos
industriais biotecnolgicos. Revista Politcnica, n. 209, p. 31-3, 1993.
(3) SANTOS, M.G.G.R.; ABOUTBOUL, H.; FARIA, J.B.; SCHMIDELL, W.;
SCHENBERG, A.C.G. Genetic improvement of Saccharomyces for et.hanol producti-
on from starch. Yeast, v. 5 (Spec. Iss.}, p. 11-15, 1989.
(4) ABUD, A.K.S.; TAVARES, L.B.B.; FACCIOTTI, M.C.R.; SCHMIDELL, W.;
FARIA, J.B.; SCHENBERG, A.C.G. Avaliao do comportamento cintico da leve-
dura Saccharomyces cerevisiae recombinante L36 em biorreator: influncia do mto-
do de preparo do inculo. In: XI Simpsio Nacional de Fermentaes, So Carlos
(SP), 1996. Anais, v.1, p. 1-6, 1996.
(5) AGUERO, J.M.Z.; MACEDO, G.R.; FACCIOTTI, M.C.R.; SCHMIDELL,
e
W. Influncia do pH na sntese liberao de glicoamilase por Aspergillus awamori
NRRL 3112 e Aspergillus niger NRRL 337. Revista de Microbiologia, v. 21, n. 4, p.
355-60, 1990.
19

--- -.
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- - - - -----=D~ =-~a
- - '-V --5_, - I~V~
:la~'2N'-ft
-r.~111s; . -1- V --
---------~

- - - - - ----------

Luiz Carlos Urenha


Jos Geraldo da Cruz Pradella
Maria Filomena de Andrade Rodrigues

3.1 - Introduo
Esterilizar um equipamento significa eliminar todas as formas de vida de
seu interior ou superfcie. Em alguns processos biotecnolgicos industriais, a eli-
minao parcial da populao microbiana dos equipamentos suficiente para ga-
rantir a qualidade que se deseja no produto. Por exemplo, nos processos onde
inibidores de crescimento so produzidos (fermentao alcolica, produo de vi-
nagre/ cido actico, cido lctico ou antibiticos e outros biocidas, etc.) o teor de
inibidor impede em maior ou menor grau o crescimento de vrios microrganis-
mos. Na indstria de laticnios, os processos de pasteurizao destroem a maior
parte, mas no todos os microrganismos presentes. 1' 2 A pasteurizao emprega-
da quando uma assepsia mais rigorosa destruiria propriedades importantes do
alimento e seus subprodutos .
Assim, desenvolveram-se processos de desinfeco que no esterilizam, mas
garantem a assepsia adequada. Essa situao comum na indstria de alimentos,
onde a eliminao de microrganismos patognicos levada a efeito por processos
no esterilizantes. Nesses casos, a populao de microrganismos que no elimi-
nada mantida sob controle pela imposio de condies que impedem seu de-
senvolvimento, como refrigerao ou aplicao de inibidores de crescimento (sais,
acares em altas concentraes, condimentos, preservantes qumicos, biocidas,
biostticos, etc.).
Os processos de produo de bens destinados sade humana ou animal e
os de alimentos enlatados esto entre os mais restritivos com respeito presena
de contaminantes. Nesses casos, a simples presena de uma nica clula de conta-
minante pode pr a perder todo um lote do produto.
Para lidar com essas situaes, desenvolveu-se uina srie de tcnicas para al-
canar o tipo adequado de assepsia. Esse assunto ser abordado no item 3.2.
20 Esterilizao do equipamento

A esterilizao de equipamentos feita pela aplicao de mtodos fsicos ou


qumicos. Os mtodos fsicos mais freqentes so o calor seco, calor mido, radia-
o ultravioleta, radiao com partculas ionizantes (gama) e ultra-som. Os mto-
dos qumicos consistem na limpeza do equipamento com lquidos ou gases que
matam os microrganismos oudanificam irreversivelmente sua capacidade repro-
dutiva (hipoclorito, fenis, formaldedo, xido de etileno, oznio, dixido de en-
xofre, etc.).
Reatores bioqumicas e tubulaes so, geralmente, esterilizados pela apliw
cao de calor mido (vapor saturado).
Equipamentos destinados ao processamento de produtos de fermentao
(bombas, filtros, centrfugas, misturadores, separadores, colunas cromatogrficas,
homogeneizadores, etc.) so preferencialmente esterilizados por calor mido. Nos
casos em que isto no possvel, empregam-se agentes qumicos adequados.
Material de laboratrio utilizado durante o processo esterilizado por calor
mido (autoclaves), seco (fornos) e mais raramente por radiao ultravioleta.
Meios de cultura so esterilizados por calor mido. Nos casos em que a ina-
tivao trmica de nutrientes do meio significativa (cultura de clulas animais,
vegetais ou de insetos, por exemplo) emprega-se a filtrao em membranas ou car-
tuchos esterilizantes para remover fisicamente os microrganismos.
O ar para o processo fermentativo esterilizado por filtrao em cartuchos
esterilizantes.
Embalagens so em geral esterilizadas por radiao gama, calor mido, ou
por lavagem com produtos qumicos adequados.
Os mtodos de esterilizao agem destruindo ou comprometendo estruturas
microbianas, como paredes celulares, cidos nuclicos, etc., ou iriativando enzi-
mas, protenas, etc.
O nmero de microrganismos que sobrevive em qualquer estgio de uma es-
terilizao depende diretamente do nmero inicialmente presente. Portanto, onde
for necessrio aplicar esterilizao, a limpeza e uma baixa carga inicial de micror-
ganismos interferem fortemente na severidade do processo a ser aplicado. 3

3.2 - Terminologia e modo de atuao

3.2.1 - Esterilizao
Esterilizao o processo fsico ou qumico que destri ou inativa todas as
formas de vida presentes em um determinado material, especialmente microrga-
nismos incluindo bactrias, fungos - tanto em suas formas vegetativas corno es-
poruladas - e vrus. O termo esterilizao possui um significado absoluto e no
relativo, ou seja, urna substncia ou material no pode ser parcialmente estril.
Um material estril totalmente isento de qualquer organismo ativo. Essa condi-
o deve se manter indefinidamente. 3' 4' 5' 6
Terminologia e modo de atuao 2I

3.2.2 - Desinfeco
Desinfeco um processo menos rigoroso de eliminao de microrganis-
mos, envolvendo usualmente o uso de um agente qumico, denominado desinfe-
tante ou germicida, geralmente lquido e temperatura ambiente ou moderada. A
desinfeco no implica necessariamente na eliminao de todos os microrganis-
mos, sendo direcionada aos mais prejudiciais, principalmente em sua forma vege-
tativa, que menos resistente que a forma esporulada.
Antissptico um desinfetante, aplicvel em seres animados (humanos e
animais) para eliminar microrganismos patognicos.3
A Tabela 3.1 apresenta uma relao dos principais termos tcnicos relaciona-
dos a processos de desinfeco, com seus significados.

3.2.3 - Modo de ao dos agentes esterilizantes


Agentes esterilizantes podem ser classificados como agentes fsicos oU qu-
micos. Esses agentes podem induzir, por diferentes mecanismos, a formao de
substncias qumicas letais no interior das clulas e/ ou alteraes em molculas
essenciais para a manuteno e sobrevivncia celular, levando morte do micror-
ganismo.
A morte celular pode ser causada por uma ou mais leses. Na clula viva
normal existem inmeros alvos possveis de leso celular, tais como: (a) enzimas,
responsveis pelos processos metablicos; (b) membrana citoplasmtica, que man-
tm a integridade do contedo celular, controlando o transporte de substncias
entre a clula e seu meio externo, alm de ser tambm o local de algumas reaes
enzimticas; (c) parede celular, que proporciona rigidez e resistncia mecnica aos
microrganismos e participa de alguns processos fisiolgicos. Uma leso em qual-
quer um desses nveis pode desencadear alteraes que levam morte celular.
Alternativamente, um dano irreversvel a um gene, responsvel pela codificao
de alguma niima essencial, tambm pode levar morte celular.
A seguir descreveremos como agem os principais agentes esterilizantes. 3 A 6

Calor mido
A temperatura elevada, associada ao alto grau de umidade, representa um
dos mtodos mais efetivos para a destruio dos microrganismos. O calor mido
mata os microrganismos, principalmente pela desnaturao irreversvel de suas
protenas, destruindo portanto elementos essenciais para a sobrevivncia e multi-
plicao celular, como enzimas e membranas celulares.
A resistncia das protenas ao calor uma funo da hidratao da clula.
Quanto maior a quantidade de gua, mais facilmente esta entrar nos domnios
internos das molculas de protena, causando mudanas conformacionais irrever-
sveis.
Alm das protenas, os carboidratos tambm sofrem alteraes sob o trata-
mento de calor, sendo muitas vezes caramelizados e gerando produtos txicos.
Essa degradao exerce, portanto, um papel importante na esterilizao.
22 Esterilizao do equipamento

Tabela 3.1 - Principais termos tcnicos utilizados em processos de assepsia e seus significados

TERMO SIGNIFICADO l'ff,


l~-------------------------------4---------------------------------i -~
Remoo de todas as formas de vida ti]
Esterilizao
ll---------------+-----=--------,----------1~.:, .
de um objeto ou material. ~~
Remoo ou destruio dos organis- "
~~ "i
Desinfeco mos vivos capazes de causar danos ~.
ou infeces. ""
1~--------------------~---------------------; ~-
Agente qumico capaz de promover ~
Desinfectante ou germicida
desinfeco. ~->
11-----------------+--------------~<

Agente qumico aplicvel em pessoas


Antissptico ou animais, com capacidade de elimi-
nar microrganismos patognicos.

Remoo de microrganismos patog-


Assepsia
nicos ou indesejados.
1~------------------------+---------~------------~ ~
Tratamento trmico (geralmente 62C 1'
por 30 min, seguido de resfriamento ~
brusco) para reduo drstica no n-
Pasteurizao mero de microrganismos - presentes :-r.
em alimentos, normalmente leite, i-
seus derivados, e bebidas enlatadas .~.-~:
ou engarrafadas. :~
l~-------------------------------4----~~-------------------------i~
Processo de esterilizao capaz de
eliminar esporos altamente resisten-
tes ao calor. Consiste em manter, o
material a 100C por vrios minutos,
resfri-lo a temperatura ambiente e
Tindalizao . incub-lo por cerca de 24 h. O proce-
dimento repetido vrias vezes. Du-
rante a incubao, os esporos passam
forma vegetativa, onde so suscep-
tveis destruio durante o aqueci-
mento seguinte.

Agentes capazes de causar a morte


Biocidas
de microrganismos.

Agentes capazes de impedir a repro- [!


Biostticos duo de microrganismos, sem neces- -~
~i

Na esterilizao por vapor sob presso (por exemplo, nas autoclaves), esta
tem duas funes principais: uma delas est relacionada com a transferncia de
calor, que favorecida pela condensao ocorrida no material, levando a um rpi-
do aumento de temperatura (difuso de calor) e a outra a manuteno ou au-
Terminologia e modo de atuao 23

menta do nvel de hidratao no interior das clulas, favorecendo portanto a


coagulao das protenas.
Calor seco
O calor seco destri os microrganismos atravs da oxidao de seus consti-
tuintes qumicos . A esterilizao por calor seco muito mais lenta e menos eficaz
que por calor mido. Ao contrrio do calor mido, nesse tipo de esterilizao o ca-
lor transferido muito lentamente e o nvel de hidratao das clulas tende a di-
minuir, conferindo urna certa proteo s protenas.
Apesar de a esterilizao pelo calor seco ser principalmente um processo de
oxidao, no se pode afirmar que a ao do calor seco seja restrita a isto, pois
nem sempre o que ocorre uma esterilizao apenas por calor seco. Dependendo
do contedo de gua na clula, pode oorrer tambm a coagulao de protenas.
Irradiao por luz ultravioleta (UV)
A radiao UV absorvida por muitas substncias celulares, mas de modo
mais significativo pelos cidos nuclicos, onde geralmente ocorrem as leses. O seu
efeito letal proporcional dose de radiao aplicada. A regio do espectro de UV
com ao esterilizante de 220 a 300 nrn, muitas vezes chamada de regio "abitica".
Existe urna relao entre os comprimentos de onda germicidas e aqueles ab-
sorvidos por cidos nuclicos ou seus constituintes. Compostos corno as purinas e
pirirnidinas, absorvem UV a aproximadamente 260 nm, bem prximo da radiao
mais efetiva que 253,7 nrn. Os aminocidos aromticos, corno o triptofano, feni-
lalanina e tirosina, absorvem UV a 280 nrn. .
Dentre os componentes dos cidos nuclicos, os fosfatos de acares no ab-
sorvem significativamente UV acima de 220 nrn. As pirirnidinas so muito mais
sensveis ao UV do que as purinas, por isto os efeitos letais e de rnutagnese nos sis-
temas biolgicos so atribudos a transformaes fotoqumicas das bases de pirirni-
dina. A ao esterilizant do UV ocorre primeiramente pela produo de ligaes
cruzadas entre pirirnidinas adjacentes na mesma fita de DNA (cido desoxirribonu-
clico), formando drneros. Essa reao ocorre principalmente entre resduos de ti-
mina, formando drneros de tirnina, levando perda da integridade do DNA
bacteriano (Fig. 3.1). Essas ligaes podem causar erro de leitura do cdigo genti-
co, resultando em mutaes que prejudicam funes vitais do organismo e conse-
qentemente causando a morte celular. Existem mecanismos de reparo, pelos quais
a integridade do DNA pode ser recuperada, dependendo do nvel de leso.

uv

Timinas Dmero de .timinas

Figura 3.1 - Formao do dmero de timina


24 Esterilizao do equipamento

Dmeros mistos de citosina-timina e citosina-citosina tambm foram identifi-


cados em DNA de organismos irradiados. Apesar de serem menos freqentes,
tambm podem apresentar efeitos letais.
ORNA tambm pode sofrer ao do UV, que gera dmeros de hidratos e
uracila, que podem causar inativao do RNA.
I
Vrios fatores podem influenciar na sensibilidade microbiana a UV. Desta-
cam-se o pH, o estado fisiolgico das clulas (a maior atividade na fase logart-
mica de crescimento) e a constituio gentica.
Radiao ionizante
As radiaes ionizantes eletromagnticas so principalmente alfa (a), beta
(p), gama (y), raios X, raios catdicos, alm de prtons, nutrons e eltrons de alta
energia. Esse tipo de radiao pode causar uma grande variedade de efeitos fsicos
e bioqumicas em microrganismos. O principal alvo que leva perda de viabilida-
de a molcula de DNA.
Na radiao ionizante, um tomo emite eltrons de alta energia, que ioni-
zam sua molcula. O eltron ejetado e absorvido por outro tomo, criando uma
cadeia de ionizaes na substncia irradiada. Essa atividade excita grupos qumi-
cos no DNA, causando a produo de radicais qumicos altamente reativos, os
quais podem alterar grupos qumicos e at quebrar as fitas de DNA, causando
mutaes.
A morte celular resulta da formao de uma cadeia de ionizao numa por-
o significativa do DNA. Geralmente, a sensibilidade dos diferentes organismos
a radiaes ionizantes varia com o volume de DNA. Em geral, formas multicelula-
res so mais sensveis radiao ionizante do que organismos unicelulares,
xido de etileno
xido de etileno (EtO) um ter cclico que mata as clulas, agindo como
agente alquilante. A sua ao consiste na substituio de um tomo de hidrognio
(atravs de umareao de alquilao) de grupos funcionais de protenas, cidos
nuclicos e outras molculas (carboxila livre, amino ot sulfidrila) pela molcula
de EtO aberta (CH 2CH2 0-) como exemplificado na Figura 3.2. Essa reao resulta
no bloqueio dos grupos ativos das molculas. No caso das protenas, ocorre a des-
naturao.

xido de etileno Enzima inativada

Figura 3.2 - Reo de alquilao entre o xido de etileno e uma enzima


Esterilizao por agentes tlsicos 25

Glutaraldedo
O glutaraldedo age na superfcie das clulas, onde ocorrem interaes glu-
taraldedo-protenas, gerando diversos produtos. Essa interao aumenta com a
elevao do pH, mas os produtos formados so estveis hidrlise cida.
O glutaraldedo reage principalmente com os grupos amina livres das pro-
tenas da camada de peptoglicana das bactrias, o que interfere no transporte de
aminocidos de baixo peso molecular. Em vrios microrganismos ocorre a aglu-
tinao celular, devido formao de ligaes intercelulares.

3.3- Esterilizao por agentes fsicos


Os principais agentes fsicos esterilizantes so: calor seco, calor mido, radia-
o ultravioleta, radiao gama e sonicao. Cada um deles encontra aplicao em
diferentes partes de um processo de assepsia.

3.3.1 -Esterilizao por calor mido


O agente de uso mais freqente o calor mido, fornecido por vapor de gua
saturado. A facilidade de obteno, de manuseio, sua eficcia e custo relativamente
baixo explicam o uso freqente. O vapor obtido em caldeiras e distribudo por
dutos de ao galvanizado ou ao inoxidvel, isolados termicamente. Pelas altas
temperaturas e presses nas caldeiras, o vapor considerado estril. No entanto,
em alguns casos mais crticos, utiliza-se filtrao em cartuchos esterilizantes ime-
diatamente antes da entrada do vapor no processo.
Tubulaes e reatores (fermentadores), vazios ou carregados com meio de
cultura, so usualmente esterilizados por calor mido.
Esterilizao de reatores vazios
A esterili:zao de reatores vazios consiste em injetar vapor diretamente em
seu interior e promover inicialmente a expulso de todo o ar presente. Aps a ex-
pulso do ar, o reator fechado e injeta-se vapor at que a temperatura e presso
internas sejam adequadas, comumente 121 oc e 1 atm. A partir desse momento, e
por todo o tempo de esterilizao, novas injees s so necessrias para manter
constantes a presso e temperatura. Terminada a esterilizao, a entrada de vapor
fechada e ar esterilizado deve ser injetado, para evitar que o resfriamento e a
conseqente condensao do vapor presente no interior do reator gere vcuo, o
que poderia provocar danos ao equipamento ou promover a entrada de ar externo
contaminado, por eventuais pequenas fissuras em soldas, vazamentos em vlvu-
las, etc. Aps o resfriamento e estabilizao da presso interna, o meio de cultura
esterilizado externamente, por esterilizao contnua ou no, pode ser carregado e
a utilizao do tanque ser iniciada.
Esterilizao de reatores com meio de cultura
A esterilizao de reatores como meio de cultura (esterilizao descontnua)
feita em trs etapas. Durante todo o processo de esterilizao, uma agitao m-
nima deve ser fornecida ao meio de cultura.
26 Esterilizao do equipamento

Inicialmente, circula-se vapor pela serpentina ou camisa at que a tempera-


tura do meio de cultura seja maior que 96 a 97C. Durante essa etapa, a cabea do
tanque deve receber vapor fluente para expulso do ar de seu interior. Ao mesmo
tempo, as vlvulas, filtros e tubulaes de entrada e sada do reator tambm so
esterilizadas por vapor fluente.
Na etapa seguinte, injeta-se vapor diretamente no meio de cultura at que
este atinja 100C. A partir desse momento, o reator completamente fechado e a
injeo de vapor continua at que a temperatura e presso internas sejam adequa-
das (por exemplo 121 C e 1 atm).
Atingido esse patamar, a injeo direta de vapor pode ser cortada e o contro-
le de temperatura e presso mantidos atravs da serpentina ou camisa pelo tempo
necessrio.
O resfriamento feito pela circulao de gua fria na serpentina ou camisa.
Quando a temperatura atingir a marca dos 100C, deve-se injetar ar esterilizado
no tanque para evitar formao de vcuo pela condensao do vapor presente.
A injeo direta de vapor provoca um aumento no volume de meio de cultu-
ra de cerca de 10 a 15%, em funo da condensao. Por essa razo, o meio de cul-
tura deve ser preparado concentrado, tendo em vista sua posterior diluio pelo
condensado.
O tempo de esterilizao funo das condies do prprio reator e do pro-
cesso. Se um reator usado sempre com o mesmo micrOrganismo, e se ele estiver
em bom estado (perfeitamente limpo, sem fissuras, sem vazamentos em vlvulas
ou conexes de sensores), 20 a 40 minutos a 121 oc e 1 atm devem ser suficientes
para sua esterilizao. Se for um reator multipropsito, utilizado com bactrias ou
fungos formadores de esporos altamente resistentes ao calor, ele deve passar por
assepsia qumica antes da esterilizao por vapor. Nesse caso, a manuteno a
121 oc e 1 atm deve se estender por um tempo que pode ser maior que 60 minutos,
desde que no prejudique o meio de cultura.
Uma etapa crtica a de aquecimento do meio de cultura desde a temperatu-
ra ambiente at atingir 96 a 97C, quando o processo feito por serpentinas ou ca-
misa. Nesse caso, uma relao adequada entre a rea de serpentina ou camisa e o
volume de meio de cultura favorece o rpido aquecimento. As Figuras 3.3 e 3.4
apresentam curvas de aquecimento de meio de cultura em reatores de volume til
2
200 1 e 2.000 1 respectivamente. O tanque de 200 1 apresenta 6,5 m de rea de troca
3 2
trmica por m de meio de cultura. O tanque de 2.000 1 apresenta 1,8 m de rea de
troca trmica por m 3 de meio de cultura.
Reatores com esterilizao programvel
Equipamentos mais sofisticados, completamente automatizados, trazem in-
corporada a funo de esterilizao em seu software de controle. Nesse caso, para
proceder operao de esterilizao, basta um comando do operador num painel
ou em um rn.icrocomputador de controle. Em geral, pode-se escolher. o tempo e a
temperatura de esterilizao. Esses equipamentos so disponveis em qualquer ca-
pacidade, desde os de bancada at os industriais.
Esterilizao por agentes fisicos ., 27

o o
o o
o o
o o

CURVA DE AQUECIMENTO
fermentado r de 200 L

120

100

~ 80
~
B 60
~
C1l
a.
E 40
C1l
t-
20

o
o 5. 10 15 20 25 30
Tempo (min)
2 3
Figura 3.3 - Formato do tanque de 200L teis (6,5 m serpentina/m de meio de cultura), e curva de aquecimento.

Caso a auto-esterilizao seja feita por injeo de vapor diretamente no meio


de cultura, deve-se considerar a diluio de 10 a 15% provocada pela condensao
do vapor.
A injeo direta de vapor pode, em alguns casos, provocar a formao de es-
puma em grande quantidade no reator. Se o problema for crtico, a esterilizao
deve ser levada a cabo apenas atravs da camisa ou serpentina.2
Esterilizao em autoclaves
A esterilizao por calor mido de reatores de pequeno porte (at cerca de
30 L) e de vidrarias e outros materiais, inclusive meio de cultura, em geral feita
em autoclaves. A Figura 3.5 apresenta simplificadamente um reator sendo esterili-
zado em uma autoclave.
28 Esterilizao do equipamento

o o
o o
o o
o o

CURVA DE AQUECIMENTO
fermentado r de 2.000 L

140

120
100
~
:J
80
!!G.l
a. 60
E
G.l
1- 40

20

o
o 30 60 90 120 150 180

Tempo (min)

Figura 3.4 - Formato do tanque de 2.000 L teis (I ,8 m2 serpentina/m 3 de meio de cuh:ura), e curva de aquecimento

Existem autoclaves das mais diversas dimenses, e em geral so verticais


ou horizontais. Nas verticais (como na figura), a porta de acesso localiza-se na
parte superior. As horizontais podem ter uma ou duas portas de acesso. O
aquecimento para gerao de vapor pode ser eltrico (mais comum) ou a gs. O
vapor pode tambm ser gerado externamente numa caldeira e em seguida inje-
tado na autoclave. Algumas autoclaves de grande porte podem ter sistemas in-
ternos para circulao do vapor e operarem continuamente, em vez da
operao tradicional por ciclos.
A operao simples. Se o vapor gerado internamente, a primeira providn-
cia completar o nvel de gua at a marca indicada pelo fabricante. Em seguida, o
material ou equipamento a ser esterilizado colocado na autoclave e a porta fe-
chada. O vapor gerado ocupa todo o espao interno e deve fluir para o exterior, por
uma vlvula de descarga, expulsando assim todo o ar contido na autoclave e nos
materiais e equipamentos presentes. Aps a expulso do ar (10 a 20 minutos, em
geral) a vlvula de descarga fechada e a presso e temperatura internas devem
Esterilizao por agentes ffsicos 29

subir at a temperatura e presso de esterilizao (geralmente, 121 C e 1 atm).


Atingida a condio de esterilizao, o sistema de aquecimento ou a entrada de
vapor devem ser controlados para manter estveis a presso e temperatura. A eta-
pa de resfriamento inicia-se com o desligamento do aquecimento ou fechamento
da entrada de vapor. A autoclave s deve ser aberta aps a temperatura chegar
prxima da ambiente, j que uma despressurizao brusca pode provocar danos
aos sensores colocados nq interior dos reatores, como sondas de pH e de oxignio
dissolvido.

Vlvula de
segurana MANMETRO

Auto clave

Fermentador

GUA

Figura 3.5 - Esterilizao de reator em autoclave

Erlenmeyers com meio de cultura, pipetas graduadas, tubos de ensaio, etc., em


geral so esteriliZados por 15 a 30 minutos. Reatores necessitam uma esterilizao por
mais tempo (40 minutos a 1 hora), j que no so agitados durante a esterilizao e o
seu centro demora para atingir a temperatura adequada. A Figura 3.6 apresenta a
curva de aquecimento em autoclave de um reator com volume til de 10 litros. O sen-
sor de temperatura foi colocado prximo ao centro geomtrico do reator. Pode-se no-
tar que cerca de uma hora aps o termmetro da autoclave indicar a temperatura de
121 C, o centro do reator ainda no havia atingido esta temperatura.
A esterilizao em autoclave no altera significativamente o volume dos l-
quidos presentes nos frascos ou reatores.

3.3 .2 - Alguns detalhes de projeto de reatores esterilizveis por


calor mido
A Figura 3.7 apresenta alguns pontos a serem considerados quando se proje-
ta um reator a ser esterilizado por calor mido {vapor saturado).
A entrada de ar para o reator (1) deve conter um filtro esterilizante adequado
(2) . Toda a linha, incluindo o filtro, deve ser esterilizada por vapor saturado (V).
30 Esterilizao do equipamento

O reator deve ser dotado de uma vlvula de segurana e uma quebra-vcuo


(3), para evitar pressurizao ou despressurizao (vcuo) excessivas que possam
danificar o equipamento durante o processo de esterilizao ou de fermentao.

Curva de aquecimento em autoclave

120


~
.a
~
<1>
100

80
v Y#
.........
- I--
f-- 1--

c.
E
~ 60
/
v
40 /
__... /
20

o
o 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tempo (min)
Figura 3.6 - Curva de aquecimento em autoclave vertical de um reator com volume til de I O lrt:ros. O ponto a indi-
ca o momento em que o termmetro da autoclave marcou 121 C. O ponto b indica o momento em que a tempera-
tura da autoclave passou a ser controlada em 121 oc.
4
v

2
11

12 10

o o
o o 7
o o
o o

Figura 3.7 - Alguns detalhes a serem considerados no projeto de reatores esterilizveis por calor mido.
Esterilizao por agentes ffsicos 3.1

A linha de exausto de gases tambm deve conter um filtro esterilizante


adequado (4), que evite tanto a contaminao do reator por microrganismos do
ambiente como a contaminao do ambiente por microrganismos e aerossis origi-
nados no reator.
O sistema de agitao do lquido deve preferencialmente ser colocado na
parte superior do reator. Dessa maneira, o selo que permitir a vedao do orifcio
por onde penetra o eixo Q5) dever ser projetado para reter apenas gases. Quando
for mais conveniente a colocao do eixo pelo fundo do reator, o sistema de se-
lagem dever ser capaz de reter lquidos. Em geral, selos para gases so mais
eficientes e de manuteno mais simples.
As linhas de inoculao (6), amostragem (7), e esgotamento (9) devem tam-
bm ser esterilizadas pela passagem de vapor saturado. A de amostragem deve
ser esterilizada aps cada retirada de amostra.
Um procedimento comum para esterilizao descontnua do reator o se-
guinte: (a) o reator recebe o meio de cultura e aplica-se uma agitao baixa; (b)
aquece-se o meio atravs da serpentina ou camisa (8, 10) at cerca de 96 a 97C; (c)
simultaneamente ao item b, injeta-se vapor pelas linhas de entrada superior de ar
(11) e de inoculao (6), deixando o vapor fluir pela linha de exausto (4) e se pos-
svel pela vlvula de segurana (3); (d) inicia-se a aplicao de vapor vivo ao tan-
que pela linha de entrada inferior de ar (12) e, se necessrio, pelas linhas de esgo-
tamento do tanque (9) e de amostragem (7); (e) quando o meio de cultura atingir
100C, as vlvulas de exausto, de segurana, de entrada superior de ar (12) e de
inoculao (6) so fechadas; (f) quando a temperatura e presso internas atingirem
as indicadas para esterilizao (em geral, 121 C e 1 atm), as vlvulas de entrada
inferior (12), de esgotamento do tanque (9) e de amostragem (7) devem ser fecha-
das; (g) manter a presso e temperatura de esterilizao pelo tempo necessrio
atravs da aplicao de alor pela serpentina ou camisa; (h) atingido o tempo ne-
cessrio, iniciar o resfriamento pela aplicao de gua fria atravs da serpentina
ou camisa; (i) quando a temperatura do meio de cultura atingir 100C, iniciar a
pressurizao do tanque com ar estril (1, 11), o suficiente para evitar formao de
vcuo no reator; (j) quando a temperatura atingir 'cerca de 85C, abrir a vlvula de
exausto de gases (4); (k) continuar o resfriamento do tanque at a temperatura
desejada.
A manuteno peridica do reator deve incluir a limpeza e eventual substi-
tuio de todas as vlvulas que tenham contato direto com o reator ou com as li-
nhas esterilizadas (ar, inculo, amostragem, exausto, descarga, etc.). Outros pon-
tos sensveis so o sistema de selagem do eixo do agitador e as soldas e conexes
do reator. Pequenos vazamentos em vlvulas, selos, conexes e soldas podem ser
detectados, fechando-se todas as sadas do reator e pressurizando-o com ar at
cerca de 1 atm. Fecha-se o ar e verifica-se se a presso mantidapor perodos lon-
gos (24 h). Caso haja perda de presso, deve-se buscar e corrigir os vazamentos.
Vazamentos na serpentina ou camisa podem ser detectados, secando-se to-
talmente o reator e circulando-se gua sob presso no sistema de aquecimen-
to/resfriamento por um perodo longo (24 h). Se houver vazamento, aparecer
gua no interior do reator.
32 E~erilitao do equipamento

3 .3 .3 - Esterilizao por calor seco


A esterilizao por calor seco empregada para vidrarias, ;metais e slidos
resistentes ao calor. levada a efeito em fornos ou estufas que atingem temperatu-
ras superiores a 150C.
Na ausncia de umidade, a transferncia de calor mais lenta e os microrga-
nismos apresentam maior resistncia inativao. Dessa forma, os tempos de ex-
posio ao calor devem ser muito maiores (cerca de 3 a 4 horas), para garantir a
2
eficincia da operao de assepsia.

3.3.4- Esterilizao por radiao ultravioleta


Radiao ultravioleta utilizada para esterilizar materiais slidos, como vi-
drarias, utenslios metlicos, embalagens, etc.
Os raios ultravioleta agem diretamente sobre o DNA e RNA, alterando a es-
trutura dessas molculas e provocando danos ao processo de manuteno e divi-
so celular. Em funo do tempo de exposio, esses danos normalmente levam os
microrganismos morte.
Ultravioleta jamais deve ser usado na presena de pessoas ou animais.
A fonte de ultravioleta normalmente uma lmpada emissora dessa radia-
o. A emisso diminui com o tempo, exigindo um controle sobre o tempo de vida
til dessas lmpadas.
A esterilizao feita simplesmente expondo os materiais radiao em am-
biente fechado, pelo tempo adequado (vrias horas). Como a capacidade de pene-
trao da radiao ultravioleta muito baixa, apenas a superfcie do material
exposto eo ar ao redor so esterilizados.

3.3.5- Esterilizao por radiao gama


Rdiao gama, em geral produzida por cobalto 60 ou csio 137, tem poder
de penetrao extremamente alto. O bombardeio de microrganismos por gama
gera grande quantidade de alteraes nas molculas de DNA, danificando-as, em
geral irreversivelmente. Adicionalmente, inmeras molculas internas aos micror-
ganismosso ionizadas (a gua, por exemplo), dando origem a espcies txicas al-
4
tamente reativas, como os perxidos e vrios radicais livres. Essas molculas .
desestruturam o equilbrio bioqumico dos microrganismos, mesmo esporulados.
Os materiais expostos radiao gama no guardam resqucios radiativos,
da ser um mtodo seguro de esterilizao.
O bombardeio com radiao gama deve ser feito em cmaras especiais, em
geral muito grandes. Uma vez posta em operao, no mais possvel impedir a
emisso da radiao, de forma que essas cmaras operam continuamente.
A esterilizao feita colocando-se o material a ser esterilizado em um con-
tiner, que por sua vez colocado em uma esteira que circula pelo interior da c-
mara de irradiao. O material pode entrar e sair da cmara vrias vezes, at
atingir o nvel de irradiao adequado.
Esterilizao e desinfeco por agentes qufmicos 33

Dada a complexidade do mtodo, apenas materiais como vidrarias, metais, e


materiais slidos como ps, solo, alimentos, sementes, embalagens, etc. so sub-
metidos a esse processo de esterilizao.
A unidade de medida da irradiao no SI o gray. Materiais pouco conta-
minados so submetidos a doses de 10 a 30 quilograys. Materiais mais
contaminados requerem doses maiores, como 50 a 75 quilograys. O microrganis-
mo mais resistente radiao chama-se Deinococcus radiodurans e exige cerca de 60
. quilograys para ser inativado. Esporos de Clostridium botulinum demandam 5 a 22
quilograys para serem inativados. O gray substituiu a unidade rad, muito utiliza-
da. Na converso, 1 gray corresponde a 100 rad.

3.4- Esterilizao e desinfeco por agentes qumicos

3.4.1 -Germicidas qumicos


A utilizao do calor mido , de longe, a tcnica mais utilizada para pro-
porcionar a esterilizao e a desinfeco de equipamentos dentro de uma inds-
tria de fermentao.
Os agentes qumicos de esterilizao e desinfeco so utilizados quando
equipamentos de operaes unitrias ou componentes de uma instalao industrial
no admitem esterilizao pelo vapor de gua saturado. Isso pode ocorrer em vir-
tude da incompatibilidade dos materiais de construo desses componentes com
temperaturas elevadas (por exemplo, filtros; bombas, centrfugas, secadores, vl-
vulas, linhas de transferncias de fluidos e equipamentos de medio, etc.).
Nesses casos, para atingir o grau de sanitizao necessrio a um dado pro-
cesso, faz-se uso de agentes sanitizantes lquidos denominados germicidas qumi-
cos. Diferentemente da esterilizao pelo calor, essas substncias agem
temperatura ambiente, necessitando entretanto tempos maiores de contato para
produzir o efeit() _d esejado. Alm disso, sua capacidade sanitizante est fortemente
relacionada a fatores ligados s propriedades fsicas do material a ser tratado (ma-
terial plstico ou metlico, superfcie lisa ou rugosa, porosidade do material, au-
sncia ou presena de locais de difcil acesso) e s caractersticas qumicas do
ambiente (pH, presena de matria orgnica contaminante, formao de filmes e
depsitos no material, dureza da gua utilizada na diluio do princpio ativo,
presena de resduos de sabo). Todos esses fatores podem afetar negativamente o
processo de esterilizao ou desinfeco, e somente a prtica pode dar ensejo a um
procedimento padronizado que conduza a um nvel de sanitizao adequado a
um determinado processo industrial.
Em razo dos grandes problemas advindos das infeces em ambientes hos-
pitalares, especialmente pelo fato do surgimento de linhagens bacterianas patog-
nicas resistentes, responsveis por doenas como a tuberculose, meningite e
pneumonia e de vrus como o da hepatite B e o HIV, promotor da SIDA/ AIDS
(Sndrome da Imunodeficincia Adquirida), um grande trabalho de pesquisa e de
regulamentao vem sendo dedicado ao uso de germicidas qumicos no controle
dessas infeces. Como conseqncia, o uso desses compostos tem se transforma-
do em um mtodo bastante conveniente e efetivo de esterilizao e desinfeco e
34 Esterilizao do equipamento

um grande nmero de formulaes comerciais surgiram no mercado. At o incio


dos anos 90, havia nos Estados Unidos, registrados na EP A (Environmental Pro-
tection Agency), uma das agncias americanas responsveis pelo registro e legisla-
o sobre o uso desses produtos, cerca de 14.000 formulaes comerciais com ao
germicida.
Baseado na experincia prtica, possvel estabelecer-se urna ordem de re-
sistncia dos microrganismos exposio aos germicidas qumicos (Tabela 3.2).

Tabela 3.2 - Ordem descendente de resistncia a germicidas qumicos e nvel de atividade requerido
para esterilizao (adaptado de Favero; Bond 7) .

NVEL DE ATIVIDADE
TIPO DE MICRORGANISMO
REQUERIDO

BACTRIA ESPORULANTE Alto


Bacillus subtilis
Clostridium sporogenes

MICOBACTRIA Alto a intermedirio


Mycobacterium tuberculosis
var. bovis

VRUS PEQUENOS OU NO LIPDICOS Alto a intermedirio


poliovrus
rhinovrus

FUNGOS Intermedirio a baixO


Trichophyton spp.
Cryptococcus spp.
Candida spp.

I
BACTRIA VEGETATIVA Baixo
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Salmonella choleraesuis

VRUS MDIOS OU LIPDICOS Baixo


vrus da Herpes simplex
Citomegalovrus
Esterilizao e desinfeco por agentes qumicos 35

Essa tabela mostra que as bactrias formadoras de esporos, exemplificadas


aqui por Bacillus subtilis e Clostridium sporogehes, so as mais resistentes aos germi-
cidas, enquanto que, em ordem descendente de resistncia, os vrus de tamanho
mdio ou que possuem componentes lipdicos em sua composio tendem geral-
mente a possuir a mais baixa resistncia aos germicidas.
Esporos bacterianos necessitam alto nvel de atividade germicida para se-
rem destrudos. Essa condio pode ser conseguida com a utilizao de solues
aquosas de glutaraldedo, perxido de hidrognio de 6 a 30% e produtos que con-
tm mistura a baixas concentraes de cido peroxiactico e perxido de hidrog-
nio (0,1% e 1,0%, respectivamente).
O dixido de cloro (Cl0 2 ) pode ser usado a concentraes variadas. Porm,
por ser .fortemente oxidante, seu uso limitado, devido ao efeito altamente corro-
sivo em superfcies de metal ou de plstico. O uso de formaldedo em solues
aquosas de 6 a 8% efetivo, embora haja controvrsias devido ao seu possvel efei-
to carcinognico.
Germicidas de nvel intermedirio no necessariamente causam a destruio
de esporos bacterianos, mas devem possuir a caracterstica de inativar Mycobacte-
rium tuberculosis var. bovis, assim como fungos, vrus lipdicos ou no lipdicos e
bactrias vegetativas.
Exemplos desses germicidas so solues hidroalcolicas 70 a 90% de etanol
ou isopropanol, compostos clorados com cerca de 500 a 5.000 ppm de cloro livre,
soluo aquosa de perxido de hidrognio 3a 6%, algumas preparaes fenlicas
e os iodophors (preparaes que conseguem carrear 12 concentrao de 40 a 50
ppm de iodo livre).
Os germicidas qumicos de nvel baixo so capazes de destruir formas vege-
tativas de bactrias, a maioria dos fungos (mas no todos), assim como vrus que
contm lipdios em sua composio.
Esses germicidas no conseguem inativar Mycobacterium tuberculosis var. bo-
vis nem tampouco bactrias esporuladas. Exemplos desses desinfetantes so as
formulaes de compostos quaternrios de amnio concentrao de 0,1 a 0,2%.
Como foi dito, a prtica de desinfeco/esterilizao industrial utilizan-
do-se germicidas qumicos depende de uma srie de fatores ambientais, que de-
vem ser levados em conta quando do estabelecimento do protocolo de sanitizao
de um determinado equipamento. De uma maneira geral, um ciclo de desinfeco
I esterilizao qumic de um equipamento contm as seguintes etapas:
a) desmontagem do equipamento (se for o caso);
b) limpeza dos componentes, procedendo-se remoo de todo tipo de res-
duos de meio de cultura, biomassa e produtos, fazendo uso de detergentes, se ne-
cessrio;
c) lavagem dos componentes com gua com baixo teor de dureza para remo-
o dos detergentes utilizados;
d) montagem do equipamento e introduo da soluo aquosa do germici-
da, propiciando o tempo de exposio preestabelecido para a ao germicida re-
querida;
....._____ _ _ e) dren-~ge~ ~a soluo germicida do sistema; ----- ~--
J'
36 Esterilizao do equipamento

f) remoo dos resduos do germicida atravs de circulao cuidadosa de


gua ou outro fluido estril.
A Tabela 3.3 descreve algumas utilizaes tpiCas de germicidas qumicos.
I Existem disponveis no comrcio vrias preparaes com caractersticas semelhan-
I

tes s descritas nessa tabela. No Brasil, a regulamentao e recomendao do uso


de um germicida particular realizada por organismos como o INCQS (Instituto
Nacional de Controle de Qualidade em Sade). A Tabela 3.3, pretende, dessa ma-
neira, ser meramente didtica.

Tabela 3.3 - Utilizao tpica de germicidas qumicos


(N.A.=nvel de atividade, sol.aq.=soluo aquosa)

GERMICDA ATIVIDADE E UTILIZAO


QUMICO CARACTERSTICAS TPICA

Bactrias vegetativas, gram-


Compostos quaternrios de
negativas, podem ser resis- Limpeza geral e manuteno
amnio sol. aq. at 0,2%
tentes, N.A. baixo

Pode ser ativo at contra v-


Compostos fenlicos, sol. Desinfeco de reas de la-
rus no lipdicos, N.A. baixo
aq. at 5% boratrio e produo
a intermedirio

Bactrias vegetativas, fun-


Sol. aq. etanol ou isopropa- Desinfeco de materiais
gos e amplo espectro de v-
nol a 70% por imerso na soluo
rus, N.A. intermedirio

Amplo espectro, pode inati-


var bactrias esporuladas, li- Desinfeco de equipamen-
Sol. aq: 0,5% cloro livre mitao de uso pela ativida- tos, reas de laboratrio e
de corrosiva, N .A. produo
intermedirio

Amplo espectro, pode inati-


var bactrias esporuladas,
Desinfeco de equipamen-
Sol. aq. Formaldedo 4 a 8% potencial carcinognico,
tos
irritante, N.A. intermedirio
a alto

Amplo espectro, ao contra


Esterilizao de equipamen-
Sol. aq. Formaldedo 8% e micobactrias e bactrias es-
tos, dependendo do tempo
etanol ou isopropanol a 70% poruladas, potencial carci-
de exposio
nognico, irritante, N.A. alto

Amplo espectro, ao contra Esterilizao de equipamen-


Sol. aq. glutaraldedo 2% e
micobactrias e bactrias es- tos, dependendo do tempo
surfactante
poruladas, iritante, N.A. alto de exposio

Amplo espectro, ao contra Esterilizao de equipamen-


Formulaes contendo per-
micobactrias e bactrias es- tos, dependendo do tempo
xido de hidrognio 6 a 10%
poruladas, N.A. alto de exposio
Esterilizao e desinfeco por agentes qumicos 31

Assim, recomenda-se fortemente utilizar as formulaes comerciais dispon-


veis no mercado, segundo a orientao do fabricante, de acordo com seu registro
nos rgos governamentais competentes.
Desde que as operaes preliminares de limpeza das partes a serem desinfeta-
das ou esterilizadas tenham sido feitas cuidadosamente, o tempo de exposio para
se atingir um determinado nvel de destruio microbiana em um dado equipamento
vai depender fundamentalmente do germicida escolhido e das caractersticas da po-
pulao microbiana remanescente, ou seja, tipo e nmero de microrganismos presen-
tes. Embora a temperatura seja um fator relevante nos processos de destruio
microbiana, no estamos levando isto em conta, pois supe-se que o procedimento de
desinfeco I esterilizao seja realizado temperatura ambiente.
O tempo necessrio para se atingir um determinado nvel de sanitizao,
dessa forma, varia bastante. Uma simples desinfeco, com a qual se pretenda des-
truir a populao ativa de bactrias vegetativas, a maioria dos fungos e os vrus li-
pdicos, rode ser conseguida utilizando-se etanol 70% em gua em cerca de 10
8
minutos. Uma populao de esporos de bactrias aerbias bastante elevada (10
esporos) pode ser destruda em 60 minutos com exposio a uma soluo de per-
8
xido de hidrognio a 10%. Por outro lado, uma soluo de formaldedo 8% e iso-
propanol 70% pode levar at cerca de 18 h para a eliminao de uma alta
7
populao de esporos bacterianos.
A escolha de um germicida qumico particular vai se basear, dessa maneira,
no nvel de desinfeco requerido pelo processo e em aspectos econmicos.

3 .4. 2 - Agentes gasosos


Agentes gasosos no o mtodo de escolha em indstrias de fermentao,
sendo rara, para no dizer inexistente, sua utilizao para esterilizao e desinfec-
o de equipamentos. A assepsia de salas e laboratrios, porm, comumente rea-
lizada com vapores de formaldedo.
Os agentes de esterilizao gasosos mais importantes so os seguintes: xido
c;!e etileno, xido de propileno, formaldedo e betapropiolactona.
O primeiro utilizado principalmente na esterilizao dos mais diversos
itens hospitalares, artigos plsticos de laboratrio e outros materiais. O processo
se d em cmaras especiais s!melhantes a autoclaves de esterilizao por vapor. A
cmara carregada com os itens a serem esterilizados, onde a seguir insuflada
uma mistura gasosa do agente ativo e um gs inerte como co2 ou freon (fluoroclo-
rocarbono). Aps um determinado tempo de exposio, a mistura gasosa drena-
da da autoclave e esta cuidadosamente limpa pela passagem de ar, para
9
eliminao total de resduos do xido de etileno.
10
O xido de propileno utilizado na esterilizao de alimentos.
Vapores de formaldedo e betapropiolactona so utilizados principalmente
para desinfeco de cmaras, salas e ambientes onde assepsia desejvel.
A resistncia de bactrias vegetativas e esporuladas, vrus e fungos aos m-
todos de esterilizao por gases bastante varivel, e depende do agente utiliza-
do, sua concentrao, umidade relativa do ambiente e temperatura do processo.
6
Por exemplo, uma populao de 10 esporos de Bacillus subtilis v ar. niger pode ser
38 Esterilizao do equipamento

inativada -a 50% de umidade, 47,5C e 500 ppm de xido de etileno, em cerca de 50


minutos. Outros microrganismos possuem resistncias menores ao xido de etileno.
Detalhes a respeito da utilizao de gases como agentes desinfetantes e este-
rilizantes podem ser encontrados em literatura sobre o assunto. 10' 11

Referncias bibliogrficas
(1) BAILEY, J.E.; OLLIS,D.F. Biochem. Engineering Fundamentais. McGraw-Hill Book
Company, Nova York. 1986.965 p.
(2) SCRAGG, A.H. Bioreactors in Biotechnology. A Practical Approach. Ellis Horwo-
od, Nova York. 1991. 328 p.
(3) RICHARDS, J.W. Introduction to Industrial Sterilization. Academic Press, Londres.
1968. 173 p.
(4) BLOCK, S.S. Disinfection, Sterilization, and Preservation. Lea and Febiger, 2nd
edition, Filadlfia. 1991. 1162 p. -
(5) REDDISH, G.F. Antiseptics, Disinfectants, Fungicides, and Chemical and Physical
Sterilization. Lea and Febiger, 2nd edition, Filadlfia. 1957. 953 p.
(6) QUESNEL, L.B. Sterilization and Sterility. In: Bullock, J.; Kristiansen, B. Basic Bio-
technology. Academic Press, Londres. (1987). 545 p.
(7) FAVERO, M.S.; BOND, W.W. Chemical Disinfection of Medicai and Surgical Materi-
ais. In: Block,S.S. Disinfection, Sterilization, and Preservation. Lea and Fabiger, 2nd edition,
Filadlfia. 1991. Chapter 35, pp.617-641
(8) WARDLE, M.D.; RENNINGER, G.M. Biocidal effect of hydrogen peroxide in space-
craft bacterial isolates. Appl. Microbiol.,30, 710-711, 1975.
(9) PARISI, A.P.; YOUNG, W.E. Sterilization with Ethylene Oxide and other Gases, In:
Block,S.S. Disinfection, Sterilization, and Preservation. Lea and Febiger, 2nd edition, Filadl-
fia. 1991. Chapter 33, p. 580-595.
(10) ALGUIRE, D.E. Effective sterilization with 100% ethylene oxide. Bul. Par. Drug
Assoc.,17,1-8,1963:
(11) CHAIGNEAU, M. Strilisation et Dsinfection par les Gaz. Maisonneuve Editeur,
Saint-Ruffine. 1977. 329 p.
39

=---=-=l!.SftRIBZA~O-DE=MEIOS-=~:
A -::=.:..-::_~-~oE=t=-ERIUIENTAJO=P-OR===---~-:
- -J. . -G~u~~IMENr:O=c-GM::VAP-OR~
- --------------------------------------------------------
-- ----- ----
Walter Borzani

4.1 - Introduo
Em muitos processos fermentativos, a presena de microrganismos estra-
nhos (e, s vezes, de vrus) denominados, genericamente, "contaminantes", pode
levar a prejuzos considerveis. .
No caso da produo de penicilina, por exemplo, os contaminantes podem
produzir penicilinase, enzima que decompe a penicilina, resultando meios fer-
mentados com baixa ou mesmo nula concentrao do antibitico.
Outro exemplo que merece citao o da fermentao acetona-butanlica. A
bactria responsvel por sse processo pode ser rapidamente destruda por vrus
bacterifagos, paralisando completamente a fermentao.
Outras vezes os contaminantes afetam negativamente o processo, principal-
mente pelo fato de consumirem nutrientes do meio, competindo assim com os mi-
crorganismos responsveis pela fermentao desejada. o que acontece, por
exemplo, na produo de enzimas, vitaminas, antibiticos, etanol, etc.
H, porm, casos em que a presena de contaminantes pouco ou nada inter-
fere no processo. Assim, por exemplo, na fermentao ltica de hortalias, no tra-
tamento biolgico de resduos, na produo de vinagres, na lixiviao bacteriana
de minrios, a boa marcha do processo assegurada pelas prprias condies de
trabalho, sendo dispensvel eliminar eventuais contaminantes.
Entre os dois casos extremos, isto , aqueles processos em que a presena de
contaminantes compromete seriamente o resultado, e aqueles em que os contami-
nantes praticamente no interferem no bom andamento da fermentao, h um
grande nmero de situaes intermedirias.
Em resumo, o grau de eliminao de containinantes com o objetivo de obter
bons resultados depende de cada caso. Informaes pormenorizadas a respeito
desse assunto sero fornecidas, quando necessrio, no Volume 3 desta Coleo, ao
se estudar vrios processos fermentativos industriais.
40 Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vapor

No podemos deixar de lembrar que, s vezes, a operao de eliminao to-


tal de contaminantes pode inviabilizar economicamente o processo, como o caso
da fermentao para produo de etanol a partir de caldo de cana-de~acar.
No presente captulo examinaremos apenas os processos de destruio de
contaminantes por aquecimento com vapor, tambm chamados "esterilizao por
calor mido".

4.2 - Descrio sumria dos processos de esterilizao


por calor mido
Consideraremos aqui apenas os dois processos mais importantes de esterili-
zao de meios em escala industrial, utilizando-se vapor como fluido de aqueci-
mento: o processo descontnuo (tambm chamado processo de batelada) e o
processo contnuo.
No processo descontnuo, o meio quase sempre colocado no fermenta-
dor e, a seguir, aquecido com vapor. Nessas condies, esterilizam-se simulta-
neamente o meio e o fermentador. O aquecimento do sistema pode ser
efetuado, quer borbulhando-se diretamente vapor no meio ( o chamado aque-
cimento com "vapor direto"), quer passando-se vapor por uma serpentina mer-
gulhada no meio ou por uma camisa que envol_ve o fermentador ( o
aquecimento com "vapor indireto"). Em qualquer dos casos, o meio agitado
mecanicamente, a fim de assegurar, tanto quanto possvel, a mesma temperatu-
ra em todos os pontos do sistema.
O aquecimento com vapor direto acarreta, obviamente, diluio do meio (da
ordem de 10 a 15%), como conseqncia da condensao do vapor injetado.
Na esterilizao descontnua distinguem-se nitidamente trs fases (ver Figs.
4.1, 4.9 e 4.10):
a) aquecimento, que eleva a temperatura inicial do meio (sempre prxi-
ma da temperatura de preparo do meio) at temperatura de esterili-
zao (geralmente da ordem de l20C);
b) esterilizao, na qual a temperatura mantida aproximadamente
constante durante um intervalo de tempo adequado, chamado tempo
de esterilizao;
c) resfriamento, quando, com auxlio de gua fria passando pela serpen-
tina ou pela camisa, a temperatura reduzida at se atingir a tempera-
tura de fermentao.

A rigor, a destruio trmica dos microrganismos no se d apenas na fase


chamada "esterilizao". No aquecimento, e tambm durante o resfriamento, en-
quanto a temperatura for superior denominada "temperatura mnima letal" (da
ordem de 80 a 100C), tambm h destruio de microrganismos (ver Fig. 4.1) .
Voltaremos a examinar esse assunto mais admte.
Descrio sumria dos processos de esterilizao por calor mido 41

Algumas horas

Tempo
Figura 4.1 - Representao esquemtica da variao de temperatura do meio durante sua esterilizao por proces-
so descontnuo. 1: Aquecimento. 11: Esterilizao. 111: Resfriamento. Te: temperatura de esterilizao. Ti: temperatura
inicial. T t: temperatura final do meio esterilizado = temperatura de fermentao. T m: temperatura mnima letal. e:
tempo de esterilizao.

Se, por um lado, a esterilizao descontnua apresenta a vantagem de esteri-


lizar simultaneamente o meio e o fermentador, reduzindo assim os perigos de con-
taminao nas operaes de transferncia do meio para a dorna, ela apresenta, por
outro lado, algumas srias desvantagens, a saber:
a) manuteno do meio em temperaturas relativamente altas (acima de
100C), por perodos bastantes longos (da ordem de algumas horas), favorecendo
o desenvolvimento de reaes qumicas no meio com possveis alteraes indese-
jveis em sua composio (decomposio de nutrientes, por exemplo);
b) elevados consumos de vapor (no aquecimento) e de gua (no resfriamen-
to), conseqentes da eficincia relativamente baixa do sistema de troca de calor;
c) problemas de corroso ocasionados pelo contato prolongado do fermenta-
dor com o meio aquecido;
d) tempo "no produtivo" relativamente elevado, uma vez que o fermenta-
dor utilizado apenas como um tanque de esterilizao durante o processo de
destruio dos contaminantes.

Passemos agora ao exame da esterilizao por processo contnuo, represen-


tado esquematicamente na Figura 4.2.: o meio recentemente preparado enviado,
pela bomba B, ao trocador de calor TCl (de tubos, ou de placas), onde atua como
fluido de resfriamento do meio j esterilizado e ainda quente; desse trocador de
calor, o meio, agora preaquecido, mistura-se com vapor enviado ao injetor I onde
a temperatura sobe quase instantaneamente, at alcanar a temperatura de esteri-
lizao; a essa temperatura, praticamente constante, o meio percorre o tubo de re-
42 Esterilizao de meios de fennentao por aquecimento com vapor

teno ou de espera TE (quase sempre termicamente isolado), dimensionado de


modo a que o tempo de residncia do meio no tubo seja igual ao tempo de esterili-
zao; o meio j esterilizado, mas ainda a uma temperatura muito alta, passa pela
vlvula de reduo de presso V e vai, em seguida, ao trocador de calor TCl j ci-
tado; deste ltimo, o meio esterilizado encaminhado a um segundo trocador de
calor (TC2), onde sua temperatUra reduzida at alcanar o valor desejado; o flui-
do de resfriamento no trocador TC2 gua fria . Tratando-se, pelo que foi descrito,
de aquecimento com vapor direto, haver diluio do meio, da ordem de 10 a 15%.
O mosto esterilizado, e j na temperatura de fermentao, ento enviado
ao fermentador.

Vapor

TE
----------- --- -- ------------ ---- --------, I
I

,------------------------- --- -- ------ --


I

-- -- -- -- --- -- ------- -- --- ----- --- --- -- -.


I

Fermenta dor

TC1 TC2

-- -- --------- ---- i--------i - ------- - -------- t - - - - - - '


'-------+---- -- -- ------- --

Agua
Meio
B

Figura 4.2 - Representao esquemtica de um esterilizador contnuo. B:.bomba. TC I e TC2: trocadores de calor.
1: injetor de vapr. T: termmetro. P: manmetro. TE: tubo de reteno ou de espera. V: vlvula de reduo de pres-
so.

A Figura 4.3 mostra, esquematicamente, a variao da temperatura do meio


durante a esterilizao contnua. Nesse caso, a destruio de microrganismos du-
rante o aquecimento e durante o resfriamento pode ser desprezada.
Descrio sumria dos processos de esterilizao por calor mido 43

Alguns minutos

Tempo

Figura 4.3 - Representao esquemtica da variao de temperatura do meio durante sua esterilizao por proces-
So contnuo. Ti: temperatura inicial. Tt : temperatura final do meio esterilizado= temperatura de fermentao. Te:
temperatura de esterilizao. Tm: temperatura mnima letal. 9 : tempo de esterilizao.

Na esterilizao contnua, o aquecimento do meio at temperatura de este-


rilizao tambm pode ser efetuado com vapor indireto, substituindo-se o injetor
de vapor I (Figura 4.2) por um trocador de calor. Neste caso, no haver diluio
do meio.
A Figura 4.4 representa, de maneira esquemtica, um tubo de espera.
Um tubo de espera como o representado na Figura 4.4, desde que adequada-
mente projetado (o nmero de ramos em U deve ser sempre maior que o necess-
rio, para assegurar a esterilizao do meio), permite, por um lado, a execuo de
eventuais reparos sem interromper o processo e, por outro, alterar, dentro de cer-
tos limites, o tempo de permanncia do meio na temperatura de esterilizao sem
variar a vazo.
Seguem alguns valores numricos relativos s condies de operao dos es-
terilizadores contnuos:
a) vapor de aquecimento: vapor saturado com presso de 6,8 a 8,5 atm;
b) bomba de recalque do mosto n~o esterilizado: podem ser utilizadas bom-
bas centrfugas, rotativas ou de pisto;
c) dimetro do tubo de espera: 4 a 12 polegadas (10 a 30 em, aproximada-
mente);
d) tempo de enchimento do fermentador: no superior a 8 h;
e) velocidade do meio no tubo de espera: 3 a 60 cm/s, sendo mais utilizado o
intervalo de 6 a 12 em/ s;
f) nmero de Reynolds no tubo de espera: 36.000 a 80.000;
g) temperatura de esterilizao: 130 a 165C.
44 Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vapor

-----. c

..,. ____ _

..,. ____ _

Figura 4.4 - Representao esquemtica de um tubo de espera. A: meio temperatura de esterilizao. B: tubos
verticais. C: tubos em U dispostos em planos horizontais. D : meio esterilizado. As setas indicam o percurso do meio
no tubo de espera com os registros I , 2 e 3 fechados.

Para se colocar em funcionamento um aparelho de esterilizao contnua, pro-


cede-se do seguinte modo: em primeiro lugar injeta-se em todo o sistema, incluiTI.do o
fermentador, vapor a 1 atm (aproximadamente 121 oq durante 2 horas; a seguir, inje-
ta-se ar esterilizado no fermentador de modo a nele se ter uma sobrepresso de 0,3
atm; regulam-se ento as c<;>ndies de trabalho utilizando-se gua em vez do mosto;
quando as condies estiverem ajustadas, comea-se a bombear o meio a ser esterili-
zado; uma vez eliminada toda a gua existente no aparelho, abre-se o registro para o
fermentador, que ento carregado com meio esterilizado.
O processo contnuo de esterilizao apresenta, em relao ao descontnuo,
algums vantagens, a saber:
a) por se trabalhar a temperaturas mais elevadas, e tambm por serem muito
rpidas as operaes de aquecimento e resfriamento do mosto, o tempo de perma-
nncia do meio em alta temperatura relativamente pequeno (da ordem de 5 a 15
min), o que acarreta menor destruio de nutrientes (como veremos mais adiante);
como conseqncia deste fato, a prtica tem mostrado, em vrios casos, que a fer-
mentao de um meio esterilizado por processo contnuo apresenta rendimento
substancialmente maior do que o obtido na fermentao do meio esterilizado por
processo descontnuo (5 a 6 vezes maior na produo de riboflavina, e cerca de 10
vezes maior na produo de vitamina B12, por exemplo);
b) pelo fato de ser de dimenses relativamente pequenas, o tubo de espera
pode ser construdo com ligas especiais, evitando a contaminao metlica (mui-
tas vezes prejudicial fermentao) do mosto que poderia resultar do ataque da
parede do tubo pelo meio;
Cintica da destruio trmica de microrganismos 45

c) quando o meio apresenta densidade ou viscosidade relativamente alta,


como no caso de mostos de cereais, o processo contnuo dispensa os motores de
potncia elevada que seriam necessrios para o acionamento dos agitadores no
processo descontnuo de esterilizao;
d) economia de vapor, e de gua de resfriamento, em relao ao processo
descontnuo, desde que os trocadores de calor e o isolamento trmico da tubula-
o sejam adequadamente dimensionados;
e) os esterilizadores dmtnuos podem ser tambm utilizados nos processos
de cozimento e sacarificao de matrias.:.primas amilceas.
Importa, contudo, no esquecer que as viabilidades tcnica e econmica do
processo contnuo dependem das dimenses e do regime de trabalho dos fermen-
tadores da instalao industrial.

4.3 - Cintica da destruio trmica de microrganismos


A velocidade de destruio pelo "calor mido" de microrganismos presen-
tes em um dado meio depende de vrios fatores, a saber:
a) do microrganismo (gnero, espcie, linhagem; idade da cultura, existncia
ou no de esporos);
b) do meio (composio, pH, presena de slidos em suspenso);
c) da temperatura.
Imaginemos um experimento em que um determinado microrganismo, em
suspenso em um dado meio, mantido a uma temperatura constante e superior
temperatura mnima letal. Se durante o ensao determinarmos o nmero de mi-
crorganismos vivos existentes no sistema, como a temperatura superior mni-
ma letal esse nmero de microrganismos vivos ser uma funo descrescente do
tempo. A experincia mostra que, com boa aproximao, os resultados podem ser
representados como indica ,a Figura 4.5,

z
E

Figura 4.5 - Representao esquemtica da variao do nmero de microrganismos vivos (N) aps um tempo t de
manuteno do meio a uma temperatura letal constante T N 0 =nmero de microrganismos vivos no instante t = O.
46 Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vapor

Isso nos mostra que, do ponto de vista cintico, a destruio do microrganis-


mo se comporta como se fosse uma reao de primeira ordem, isto :

dN (4.1)
-=-k N
dt
sendo N o nmero de microrganismos vivos existentes no meio aps um tempo t
de aquecimento do sistema a uma dada temperatura constante. A constante k de-
nominada constante de velocidade de destruio trmica do microrganismo.
O valor de k depende dos fatores citados no incio deste item. Para um dado
microrganismo em um dado meio, k depender apenas da temperatura.
Sendo N 0 o nmero de microrganismos vivos no instante t =O, a eq. (4.1) nos
d:

lnN=lnN 0 -kt (4.2)

equao esta que nos permite, a partir de valores experimentais resultantes de me-
didas de N para diferentes valores de t, calcular a constante k do microrganismo
em estudo, no meio considerado, na temperatura ensaiada.
A ttulo de exemplo, consideremos os valores da Tabela 4.1, obtidos de expe-
rimentos realizados com esporos de Bacillus stearothermophilus, suspensos em solu-
o tampo de pH = 7,0, temperatura de 105C.

Tabela 4.1 - Destr_uio trmica de esporos de Bocillus steoro thermophilus a Iosoc.

t (minutos) N '*~

25 8,5. 104 ~j~


50 3,5. 104 '~
~
100 ..
6,0 . 103 ..
~
~,

200
'"
~

2,0. 102 "-i!

.
250
-
40
-
~
. .. -
.~ ....
- ! ,_::;.~
w . ~T:!". "';;r-::iE j

A partir dos valores da Tabela 4.1, por regresso linear obtemos (ver Fig.
4.6), no intervalo de tempo 25 mina 250 min:

ln N = 12,1626- 0,0341 t
(r= -0,9998)

sendo r o coeficiente de correlao. Nesse caso, o valor de k 0,0341 min- 1


Se o experimento tivesse sido realizado no a 105C, .mas a 121 oc, valores de
k prximos de 3 min - 1 poderiam ser obtidos, dependendo da variedade do Bacillus
Cintica da destruio trmica de microrganismos 47

stearothermophilus utilizada (ver Fig. 4.8). A influncia da temperatura no valor de


k ser considerada mais adiante.

12

z
E

o
o 100 200 300
t (min)
Figura 4.6- Representao grfica dos resultados da Tabela 4.1 .

Mostra a experincia que os esporos so bastante mais resistentes destrui-


o trmica do que as clulas vegetativas.
Alm disso, observa-se que no h, nesse caso, obedincia, eq. 4.2 no inter-
valo de tempo inicial de exposio d suspenso de esporos temperatura consi-
derada, como indica a Figura 4.7. No cabe, neste livro, o exame desse problema.
Considerando-se, porm, que a destruio trmica de esporos , na prtica, sem-
pre realizada em temperaturas elevadas (pelo menos l20C), e considerando-se
que, nessas temperaturas, o desvio da curva experimental em relao eq. 4.2.
geralmente pequeno, pode-se, para fins de clculos de interesse industri;Il, consi-
derar aplicvel a expresso 4.2.
No estudo da destruio trmica de microrganismos, costuma-se definir um
outro parmetro: o tempo de reduo decimal, indicado por D . o tempo necess-
rio para reduzir o nmero de microrganismos a 1/10 do valor inicial (em outras
palavras, para destruir 90% dos microrganismos vivos existentes). Se na equao
4.2 fizermos N = 0,1 N 0 , teremos, de acordo com a definio de tempo de reduo
decimal, t = D. Logo:

ln(O,lN 0 )=lnN 0 -kD


e, portanto:

D= 2,303 (4.3)
k
48 Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vapor

z
E

Figura 4.7- Representao esquemtica de curvas de destruio trmica de esporos a diferentes temperaturas
(Tl , Tz e T 3)

No caso do exemplo indicado na Tabela 4.1, teremos:

D=67,5min
isto , temperatura de 105C, 90% dos microrganismos presentes no meio consi-
derado sero destrudos em 67,5 min.
A eq. 4.3 mostra, ainda, que os fatores que afetam o valor de k afetam tam-
bmD. '
Uma vez fixados o microrganismo e o meio, vejamos de que maneira a tem-
peratura afeta o valor de k. D11as equaes foram propostas com o objetivo de cor-
relacionar k e a temperatura, a saber:

a) Equao de Arrhenius

k=Aexp(-a I RT) (4.4)

onde A uma constante emprica, R a constante universal dos gases perfeitos, T


a temperatura absoluta e a a denominada energia aparente de ativao de des-
truio trmica do microrganismo (ou simplesmente energia de ativao de des-
truio do microrganismo).

b) Equao de Bigelow

k =A' exp (!) T') (4.5)

onde A'e!) so constantes empricas e T' a temperatura medida em C ou em F.


I
I

Cintica da destruio trmica de microrganismos 49

As eqs. 4.4 e 4.5 conduzem, respectivamente, a:


a 1
lnk=lnA--- (4.6)
R T

lnk=lnA'+f3T' (4.7)

Conhecendo-se os valores de k para diferentes temperaturas, as eqs. (4.6) e


(4.7) permitem calcular, por regresso linear, os valores das constantes nelas indi-
cadas. Em particular, a equao 4.6 nos dar o valor da energia de ativao a.
A Figura 4.8 mostra a influncia da temperatura no valor da constante de
velocidade de destruio trmica de esporos de Bacillus stearothermophilus. Obser-
ve-se a obedincia eq. 4.4. Neste exemplo, os valores experimentais representa-
dos na Figura 4.8 conduzem a um valor de a igual a 68,7 kcal/mol. Para muitos
microrganismos encontram-se valores de a entre 65 e 85 kcal/mol.


0,1

0,05

255 260 265

10 5 /T (K- 1)
Figura 4.8 - Influncia da temperatura (T) na constante de velocidade de destruio trmica (k) de esporos de Bacil-
lus stearothermophilus.

Se aplicarmos as equaes de Arrhenius e de Bigelow a um mesmo micror-


ganismo, no mesmo meio e mesma temperatura, teremos:

. Aexp(-a. I RT) =A'exp(f3 T')


Logo:
, 1 A a 1
T =-ln----- (4.8)
13 A' f3 R T
~ .

50 Esterilizao de meios de fermento por aquecimento com vapor

Lembrando que A, A ', a,~ e R so constantes, a eq. 4.8 nos diz que T' varia
linearmente com 1IT, o que um absurdo, uma vez que T' (expressa em oq
igual a T-273 . Acontece, porm, que a equao 4.8 permite, com boa aproximao,
calcular T' em funo de T, desde que no se considerem intervalos de temperatu-
ra muito amplos. Assim, por exemplo, no intervalo de 100 a 160C, a seguinte
equao pode ser obtida por regresso linear:

T' = 532,9 -1,620(10 5 I T) (4.9)


(r = -0,9992)

onde T' a temperatura em C, T a temperatura absoluta e r o coeficiente de


correlao.
Se considerarmos apenas o intervalo de 120 a 160C, que do ponto de vista
de aplicaes prticas o mais importante, teremos:

T' = 552,4 -1,701 (10 5 I T) (4.10)


(r =- 0,9995)

A Tabela 4.2 mostra, para vrios valores de T, 'OS valores de T' calculados
por T-273 e pelas eqs. (4.9) e (4.10).

Tabela 4.2 - Aplicao das equaes 4.9 e 4. 1O.

T (K)
T-273 Eq. 4.9 Eq. 4.10
rr-------------r-------------+-----~------+-----------~rf
373 100 98,6 - j

383 110 109,9 - l't'i


rr-------------r-------------+-------------+-------------~~-3
393 120 120,7 119,6 . '.
'
~----4_
o3____~______
13_o____-+_____13_o_,9____-r____1_3~0,_3____~t~
~
413 140 140,6 140,5
r r-----4-2-3----~------1-5-0-----+-----1-4-9,~9----~-----15-0-,3----~~!

433

Explica-se, portanto, levando-se em conta os erros experimentais que afetam


os valores de k (principalmente os inerentes s medidas dos nmeros de clulas
vivas), a possibilidade de cqrrelacionar k com a temperatura, tanto pela eq. 4.4
quanto pela 4.5.
Destruio de nutrientes do meio como conseqncia da esterilizao 5I

4.4 - Destruio de nutrientes do meio como conseqncia


da esterilizao
O aquecimento de um meio com o objetivo de destruir microrganismos nele
existentes acarreta, simultaneamente, alteraes em sua composio. Reaes in-
desejveis (como por exemplo, decomposio de vitaminas e reaes entre glicose
e aminocidos), cujas vlocidades aumentam com a temperatura, podem prejudi-
car a posterior atividade dos microrganismos da fermentao, conduzindo a ren-
dimentos ou produtividades menores do que os esperados.
A temperatura escolhida para a esterilizao do meio desempenha, nesse
particular, papel relevante. A experincia mostra que, quanto mais elevada for a
temperatura escolhida para se conseguir a destruio de uma dada quantidade de
microrganismos do meio, menor ser a destruio de nutrientes existentes nesse
meio e, conseqentemente, melhores sero os resultados obtidos na fermentao
posterior. Isso uma conseqncia do fato de ser a energia de ativao da destrui-
o trmica dos microrganismos (65 a 85 kcal/mol) maior que a da destruio tr-
mica de nutrientes. A Tabela 4.3 mostra valores da energia de ativao de
destruio trmica de alguns nutrientes.

Tabela 4.3 - Energia de ativao de destruio trmica de alguns nutrientes.

,.
Energia de ativao
Substncia
(kcal/mol)

Vitamina C 23,1
'~
:~
cido flico 16,8

Vitamina B12 23,1 f.


:
Vitamina A 14,6
l"\:i

Vitamina B1 26,0
-,:;... -
.. . ... ~~- ,...,_!:.8
Por sua importncia prtica, tanto na esterilizao de meios de fermentao
como na esterilizao de alimentos, essa afirmativa deve ser demonstrada.
Consideremos um dado volume de meio contendo N 0 microrganismos vi-
vos, nmero esse que deve ser reduzido a N 1 < N 0 Seja 50 a concentrao de um
nutriente termolbil no meio, antes do tratamento trmico. Suponhamos que esse
tratamento trmico seja realizado a duas temperaturas constantes TI e T2 , com T2 >
TI. Sejam:
ti = tempo para reduzir.o nmero de microrganismos vivos de N o a N 1, quan-
do a temperatura TI; .
t 2 = tempo para reduzir o nmero de microrganismos vivos de N o a N fl quan-
do a temperatura T 2;
ki = constante de velocidade de destruio dos microrganismos temperatu-
ra T,;
52 Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vapor

k2 = constante de velocidade de destruio dos microrganismos temperatu-


ra Tz;
a = energia de ativao de destruio dos microrganismos;
5 1 = concentrao final do nutriente aps o tratamento do meio temperatu-
ra T 1;
5 2 = concentrao final do nutriente aps o tratamento do meio temperatu-
ra T 2;
k1' =constante de velocidade de destruio do nutriente temperatura T1;
kz' = constante de velocidade de destruio do nutriente temperatura T2;
a ' =energia de ativao de destruio do nutriente.

A eq. 4.2 nos permite calcular t 1 e t 2 :

1 N0
t 2 = - l n -
kz Nf

Logo:
(4.11)

Mas, pela eq. 4.4, temos:

(4.12)

k 2 =Aexp(-a. I RT2 ) (4.13)

Substituindo-se, na eq. 4.11, os valores de k 1 e k 2 dados pelas eq. 4.12 e 4.13,


teremos:

(4.14)

Vejamos, agora, o que aconteceu com a concentrao do nutriente. Admitin-


.do, apenas para simplificar a demonstrao, que a destruio trmica do nutrien-
te seja de primeira ordem, teremos:
Consideraes gerais a respeito do clculo do tempo de esterilizao 53

(4.15)

Pela equao de Arrhenius:

Logo, a eq. 4.15 nos d:

!.1_ = ln (5 0 I 51) exp(~. T2- T1,J (4.16)


t2 (5 0 I 52) R T1 T2

As expresses 4.14 e 4.16 permitem, ento, escrever: "

(a
exp - T 2
R
- T1
T1 T2
J=ln (5 0 I 5 1) exp (a'- T
(5 0 I 52) R
2 - T1.
T1 T2
J
tf
Lembrand? que a >a', teremos:

N
:.~

Ficando assim demonstrado que a concentrao final do nutriente no trata-


mento trmico do meio, temperatura T 2 , maior do que a concentrao final do
nutriente no tratamento trmico do meio temperatura T 1 < T 2 , isto , a destrui-
o do nutriente . menor quando o meio termicamente tratado a temperatura
mais alta.

4.5 Consideraes gerais a respeito do clculo do tempo


de esterilizao
J vimos que a eq. 4.2 nos d:
(4.17) ~
.l,.

ij
54 Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vapor

expresso esta que nos permite, conhecido o valor de k, calcular o tempo necess-
rio para reduzir o nmero de microrganismos vivos de N 0 at N.
A aplicao dessa equao a clculos de tempos de esterilizao no to
simples como pode parecer primeira vista.
O primeiro problema que se apresenta, decorre do fato que os meios de fer-
mentao a esterilizar no possuem uma nica espcie de microrganismo a ser
destruda. Nos meios utilizados na prtica encontramos microrganismos vivos
pertencentes a diferentes gneros e espcies, alguns esporulados e outros no, que
devem ser eliminados para assegurar a inexistncia de contaminantes na fermen-
tao posterior. Lembrando que o valor de k depende do microrganismo, a aplica-
o da eq. 4.17 torna-se praticamente impossvel. Contorna-se esse problema esco-
lhendo-se um microrganismo de referncia conhecido, altamente resistente ao ca-
lor, e admitindo-se que todos os microrganismos existentes no meio a ser esterili-
zado apresentem uma resistncia destruio trmica igual do microrganismo
de referncia. bastante freqente a escolha do Bacillus stearothermophilus esporu-
lado como microrganismo de referncia.
O segundo problema que surge ao tentarmos aplicar a eq. 4.17 a casos reais
reside no fato de a constante de velocidade k depender, tambm, do meio e da
temperatura. Uma vez escolhido o microrganismo de referncia, preciso, portan-
to, conhecer os valores de k desse microrganismo em suspenso no meio a ser este-
rilizado e a diversas temperaturas, o que pode, com freqncia, implicar na reali-
zao de experimentos preliminares de determinao de k. Como primeira aproxi-
mao, quando no se conhecem valores de k, pode-se admitir k ~ 1 ~in- 1 (a 121 oq
e a~ 75 kcal/ mol.
O terceiro problema a ser considerado conseqente do fato de, nos meios a
esterilizar, as clulas microbianas a serem destrudas poderem se encontrar na for-
ma de aglomerados, ou ainda protegidas por partculas slidas em suspenso no
meio. Isso acarreta um verdadeiro aumento da resistncia dos microrganismos
destruio trmica, aumento esse de quantificao muito difcil.
Finalmente, outro problema na aplicao da eq. 4.17 ao clculo do tempo de
esterilizao decorre da prpria definio de esterilizao. De fato, lembrando que
a esterilizao a operao que tem por finalidade destruir todos os microrganis-
mos vivos existentes no meio, o nmero final de microrganismos vivos dever ser
N =O e, neste caso, a eq. 4.17 deixa de ser aplicvel.
Esse ltimo problema pode, porm, ser resolvido a partir da definio de
probabilidade de falha de uma esterilizao. Sendo:
E1 = nmero total de operaes de esterilizao realizadas nas mesmas con-
dies;
E1 = nmero de operaes de esterilizao que falharam, isto , que no con-
duziram a um meio esterilizado.
Define-se probabilidade de falha (P) dessa esterilizao pela relao:
(4.18)
Consideraes gerais a respeito do clculo do tempo de esterilizao 55

Multiplicando-se por 100 essa ltima frao, a probabilidade de falha ser


expressa em porcentagem.
Suponhamos, para facilitar a exposio, que uma dada esterilizao apresen-
te probabilidade de falha igual a 0,03 (ou 3%). Isso significa que, de 100 partidas
de meio tratadas termicamente nas mesmas condies, sero obtidas, em mdia,
97 partidas esterilizadas e 3 partidas no esterilizadas. Se indicarmos por N0 o n-
mero de microrganismos vivos em cada partida de meio a esterilizar, o nmero de
microrganismos nas 100 partidas de meio a esterilizar ser 100 N0 Acontece, nesse
caso, que 3 partidas no se encontravam esterilizadas aps o tratamento trmico
do meio. Se considerarmos que a condio necessria e suficiente para que falhe a
esterilizao de uma partida de meio que nele exista, aps o tratamento trmico,
um microrganismo vivo, o nmero final de microrganismos vivos nas 100 partidas
ser, no mnimo, igual a 3 (um .em cada partida em que a esterilizao falhou).
Aplicando-se a eq. 4.17 ao conjunto das 100 partidas, teremos:

t=.!_ln 100No =.!_ln No


k 3 k 0,03

De um modo geral, sendo P a probabilidade de falha, podemos escrever:

1 N0 (4.19)
t=-ln-
k p

Para fixar idias, consideremos o seguinte exemplo numrico: um dado vo-


lume de meio a esterilizar contm 2,5.10 1 0 microrganismos vivos; o valor de k 3,4
1
min - ; calcular os tempos .de esterilizao para que as probabilidades de falha se-
jam iguais a 0,1 (ou 10%), 0,01 (ou 1%) e 0,001 (ou 0,1%). Aplicando-se a equao
4.19, teremos:
a) para P = 0,1 (10%)

t =__!__ ln-2'-,5__10_1_0 = 7,7 min


3,4 0,1

b) para P = 0,01 (1%)

t = _!_ ln 2,5 1010 = 8,4 min


3,4 0,01

c) para P = 0,001 (0,1 %)

t = __!_ ln 2,5 1010 = 9,1 min


3,4 0,001
56 Esterilizao de meios de fermentao por aquedmento com vapor

4.6 - Clculo do tempo de esterilizao por processo


descontnuo
Suponhamos que na esterilizao descontnua de um dado volume de meio,
a curva da Figura 4.9 represente a variao da temperatura do meio com o tempo.

1---e-_ ___.,
N2
---------~~----~
r
r
r
r
_ _ _ _ _l _ _ _ _ _ _ _ L_ ~P
r

I' N Ir rI Ir
I 1 I I I
I I I I
r 1 1 r
I I I I
I I I I
- ---r----~-------r-r-----
1 I I I
I I I I
r 1 1 r
I I I I
r 1 1 r
I I I I
I I I I
I I I I
I I I I
I I I I

Tempo
Figura 4.9- Variao de temperatura do meio com o tempo, durante sua esterilizao por processo descontnuo.
Te: temperatura de esterilizao. Tm: temperatura mnima letal. T t: temperatura final do meio esterilizado= tempera-
tura de fermentao. T 0 : temperatura inicial do meio a esterilizar. N 1 : nmero de clulas vivas no instante t 1 . P: proba-
bilidade de falha.

Para calcularmos o tempo de esterilizao (9) precisamos conhecer:


a) o nmero inicial de clulas vivas no meio (N1 );
b) a probabilidade de falha (P);
c) as curvas de aquecimento e de resfriamento do meio;
d) a temperatura mnima letal (Tm);
e) a temperatura de esterilizao (Te);
f) a variao de k com a temperatura.

Na Figura 4.9, N 2 e N 3 so, res~ctivamente, os nmeros de microrganismos


vivos no fim da fase de aquecimento e no incio da fase de resfriamento. Como ve-
remos logo mais, N 2 e N 3 no precisam ser conhecidos.
Tanto no aquecimento como no resfriamento, o valor de k varia como conse-
qncia da variao da temperatura. Nesses casos, a eq. 4.1 nos dar:
Z66
Clculo do tempo de esterilizao por processo descontnuo 57

a) no aquecimento:
N 12
l n -1 = Jk dt (4.20)
N2 I
1

b) no resfriamento: ,
N I,
(4.21)
3
ln- =fk dt
p I
3

Essas integrais podem, por exemplo, ser calculadas do seguinte modo: esco-
lhem-se diversos valores de t na fase de aquecimento (ou de resfriamento); para
cada valor escolhido de t, a curva de aquecimento (ou de resfriamento) nos d a
temperatura correspondente; mas para cada valor da temperatura, lembrando que
a variao de k com a temperatura conhecida, calcula-se o correspondente valor
de k; teremos, deste modo, a variao de k com o tempo no aquecimento (ou no
resfriamento); tendo-se k = f(t), podemos calcular as integrais das eqs. 4.20 e 4.21.
Sendo k. o valor de k na temperatura de esterilizao, podemos ento escre-
ver:

N 12
1
ln- = JlC dt
N2 I
1

lnN 2 =k 8
N3 e

N . 1,
3
1n- =fkdt
p I
3

Logo:

N t2 I,
ln p1 =ke 8+ Jkdt+ Jkdt (4.22)
t, !3

A eq. 4.22 nos permite calcular 8.


A ttulo de exemplo numrico, consideremos o clculo do tempo de esterili-
zao de um mosto, sendo dados:
a) volume do mosto= 100m3 (10 5 litros);
b) concentrao de microrganismos vivos no mosto= 7,2 10 9 clulas/litro;
58 Esterilizao de meios de fennentao por aquecimento com vapor

.c) temperatura de esterilizao = l20C;


d) temperatura mnima letal = 80C;
e) probabilidade de falha= 0,001 (ou 0,1 %);
f) curvas de aquecimento e de resfriamento= ver Fig. 4.10;
g) variao de k (em min-1) com a temperatura T' (em 0 C):

k =6,04 . 1Q-11 . e 0 , 200 T'(equao de Bigelow) (4.23)

T'
120 / e Resfriamento 120

80 80
~ ~
~ ~

40 Aquecimento 40

o
o 40 80 o 40 80
t (min)

Figura 4.1 O- Curvas de aquecimento e de resfriamento do meio (exemplo numrico).

A partir das curvas da Figura 4.10 e da equao que relaciona k com a tem-
peratura T', montamos as Tabelas 4.4 e 4.5, que nos permitem representar grafica-
mente a variao de k com o tempo (ver Fig. 4.11)
Tabela 4.4 - Valores de k durante o aquecimento do meio (exemplo numrico).

t (min) T' ( 0 C) k (min 1)


..

20 75 0,0002

~
30 87 0,0022

40 97 0,016

50 105 0,080
.
60 112 0,32

70 116 0,72
i~
80 120 1,60
""i~
. .- - ,, --
Clculo do tempo de esterilizao por processo descontnuo 59

Tabela 4.5- Valores de k durante o resfriamento do meio (exemplo numrico).

t (min) T ' (0 C) k (min-1)


~-----------------r-----------------4----------------~i :
o 120 1,60
i:F,
''
Ir-------------------~--------------------~-------------------; "
2 114 0,48 ~;~
t-------------------~--------------------~-------------------11 ,..
4 109 0,18 :;~
~-------6--------1--------10-5------~----------------~l ~
0,080 -~-.
lr-------------------~--------------------~---------------------111 ~-.;

8 101 0,036 f:~


lr-------1-0-------r-------97-------+------0-,0-1-6----~14~

15 88 0,0026

20 80 0,0005 I ~~' I

: < ;,. .. - ~. :. ,. .' . ,.. t:. .-,~ . ... :,; ::, t.. '
-f
::..~-~.r.
-.
.. :.Z... _._-.. ~ ~~ :\ :~.:;."'.' :'.;_~:r:J:~=:if,. :......... ~~--~.t~-

1,6 1,6
Aquecimento Resfriamento

1,2 1,2

~ ~

i:: i::
.E 0,8
80
0,8
.E
20
?;! Jk dt ?;!
24 fok dt

0,4 0,4

o o
20 40 60 80 o 4 8 . 12
t (min) t (min)

Figura 4.11 -Variao de k durante o aquecimento e o resfriamento do meio (exemplo numrico).

Teremos ento:

N 1 =10 5 7,2 -10 9 =7,210 14


p =0,001 .

ln (N 1 I P) = 41,12
60 Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vapor

80
Jkdt2::19,40 (ver Fig. 4.11; fase de aquecimento)
24

20
Jk dt 2::3,23 (ver Fig. 4.11; fase de resfriamento)
o

Substituindo esses valores na equao 4.22, calculamos e:

41,12 = 1,60 e+ 19,40 + 3,23

e = 11,6 min 2:: 12 min


Suponhamos, agora, que tivssemos:
a) concentrao de microrganismos vivos no mosto= 4,3 102 clulas/litro;
b) probabilidade de falha= 0,1 (10%).

Nesse ltimo caso:

p = 0,1

ln(N 1 I P)=19,88

A equao 4.22 nos daria, ento:

19,88 = 1,60 e+ 19,40 + 3,23

e=-1,7min

Esse resultado indica que, nesse ltimo exemplo numrico, o aquecimen-


to e o resfriamento so mais que suficientes para conseguirmos a esterilizao
desejada.

4. 7 - Clculo do tempo de esterilizao por processo


contnuo
Lembrando que, no processo contnuo, tanto o aquecimento quanto o resfri-
amento do meio so muito rpidos, as integrais representadas nas eqs. 4.20 e 4.21
podem ser desprezadas, e o clculo do tempo de esterilizao e se resume na apli-
cao da equao:
Clculo do tempo de esterilizao por processo contnuo 61

Nl
In-=k .e
p e

Voltemos ao exemplo numrico citado no item anterior, mas com tempera-


tura de esterilizao igual a 130C. Teremos, pela eq. 4.23:

ke = 11,8 min - l
Logo, o valor de e ser':

41)2 =11,8 -e :. e =3,5min


Resta-nos, finalmente, considerar o dimensionamento do tubo de espera.
Sejam:
V= volume de meio necessrio para encher um fermentador;
te = tempo de carga do fermimtador;
p = massa especfica do meio temperatura de esterilizao;
J..l =viscosidade do meio temperatura de esterilizao;
e = tempo de esterilizao = tempo de residncia do meio no tubo de espera;
Re = nmero de Reynolds no tubo de espera;
D = dimetro interno do tubo de espera;
v = velocidade de meio no tubo de espera;
L= comprimento do tubo de espera.
Os valores de V te, p, J..l, e, so conhecidos e, alm disso, sabemos que Re e v
devem estar compreendidos nos intervalos 36.000 a 80.000 e 3 a 60 em/ s, respecti-
vamente.
Interessa-nos calcular D e L, lembrando que o valor de D deve estar contido,
aproximadamente, no interv~lo 10 a 30 em.
Sendo F = V I te a vazo do meio no tubo de espera, podemos escrever:

rr.D 2 . z V=--
4 F (4.24)
F=-- V . .D
4 rr.

Por outro lado:

Re = D v p :.D V= JJ.Re (4.25)


,.... p

As equaes 4.24 e 4.25 nos do:

D=4 fp __!_ (4.26)


rr.JJ. Re
Para cada valor de Re, a eq. 4.26 permite calcular D e, ento, a eq. 4.24 nos
d o correspondente valor de v. Considerando que L ,;, v e, calculamos o corres-
pondente valor de L.
62 Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vapor

A ttulo de exemplo numrico, imaginemos um caso no qual:


3
V= 100m3 = 1,00.10 8 cm
te= 4 h= 1,44.10 4 S
p = 1,06 g/cm 3
3
J.l = 0,55 cp = 5,5.10- p
e= 3,5 min = 2,1.10 2 s

A partir dos valores de V e te calculamos a vazo do meio:

F=V !te =6,94 10 3 cm 3 /s


Com esses valores numricos, poderemos calcular D, v e L para cada valor
de Re (ver Tab. 4.6).
A escolha do valor de D (e do correspondente L) depender, obviamente,
dos dimetros de tubos existentes no mercado, dos preos desses tubos, de algu-
ma caracterstica peculiar do meio, e de outros requisitos ou limitaes inerentes
ao projeto global. Por segurana, o projeto poder prever, no tubo de espera, um
"tubo em U" (ver Figura 4.4) suplementar.

Tabela 4.6- Valores do dimetro (D) e do comprimento (L) do tubo de espra, e da velocidade (v) do meio no
tubo de espera para diferentes valores do nmero de Reynolds (Re ), no exemplo numrico considerado.

Re D (em) v (cm/s) L (m)

40000 42,6 4,87 10,2


:
~~~ r

i~.-
50000 34,1 7,60 16,0 '~
.,._!:-
,.::".
60000 28,4 10,96 23,0 "'..
-;'
"- ~

70000 24,3 14,97 31,4 . i'


.
1~----------~-------------+------------~----------~~j

80000 21 ,3 19,49 40,9 ~t


r:t~.. - . ~~;r~ ..:'iit;'.~"i" : .:... -. "\i ..;.

- '-=-. -~--

Literatura recomendada
(1) AIBA, S., HUMPHREY, A.E. & MILLIS, N .F. Biochemical Engineering. Univer-
sity of Tokyo Press, Tquio, 1973.
(2) BAILEY, J.E. & OLLIS, D.F. Biochemicai Engineering Fundamentais. McGraw-Hill
Book Company, Nova York, 1986.
(3) BLAKEBROUGH, N . Biochemicai and Bioiogicai Engineering Science. Academic
Press, Nova York, 1967 e 1968.
(4) SIMON, P. & MEUNIER, R. Microbioiogie Industrielle et Gnie Biochimique. Mas-
son et Cie., diteurs, Paris, 1970.
(5) SOLOMONS, G.L Materiais and Methods in Fermentation. Academic Press, Lon-
dres, 1969.
63

::

Willibaldo Schmidell

5.1- Introduo
Como se sabe, os processos qumicos industriais podem ser divididos, de
uma forma simples e global, em processos inorgnicos, orgnicos e biolgicos.
Assim, um processo qumico industrial biolgico aquele no qual o processo de
converso da matria-prima em produto repousa basicamente em um fenmeno
biolgico.
Esse tipo de indstria apresenta uma srie de caractersticas prprias,
pois freqentemente trata-se de fazer crescer um certo microrganismo ou, de
forma mais geral, uma dada clula, seja microbiana, animal ou vegetal. Esse
fato exige a pres.ena, desde o projeto da planta at sua operao em regime, de
uma mentalidade prpria e particular em relao existente na indstria qu-
mica no biolgica.
tambm fato conhecido, que at a Segunda Guerra Mundial no s~ dispu-
nha de tecnologias adequadas para a conduo de processos fermentativos em
grande escala e em condies de assepsia, motivo pelo qual no havia a possibili-
dade de se fabricar produtos tais como antibiticos, vitaminas, enzimas, etc.
Os produtos elaborados por processos fermentativos eram aqueles cuja ge-
rao, no caldo em fermentao, tornassem o meio no adequado para a prolifera-
o de possveis contaminantes, determinando, desta forma, uma proteo natural
ao meio (etanol, acetona, cidos orgnicos, etc.).
O grande avano observado durante a Segunda Guerra Mundial foi exata-
mente o desenvolvimento dessas estratgias que permitiram a conduo de pro-
cessos em larga escala em condies de assepsia, em particular a possibilidade
de se efetuar a esterilizao de grandes volumes de ar, necessrio aos processos
biolgicos aerbios.
Apenas para se ter uma idia da importncia da: esterilizao do ar, imagi-
ne-se a necessidade de fornecer ar esterilizado para um reator de 100 m 3 a uma va-
ffi
'",,I'
64 Esterilizao de ar

zo especfica de 0,5 min- 1 (ou, como freqentemente mencionado, 0,5 v.v.m., ou


li.
I seja, volume de ar por volume de meio por minuto). Esse problema, que nada tem
de extraordinrio, sendo mesmo bastante freqente, pode ser resumido necessi-
dade de se esterilizar 50 rn 3ar I rnin.
Admitindo-se urna contaminao do ar ambiente da ordem de 103 partcu-
las/m3 (vide item seguinte), caso no houvesse a esterilizao do ar, introdu-
zir-se-iam no reator 5x10 4 partculas/min. Lembrando que um processo
fermentativo pode freqentemente ocorrer durante 50 ou 100 horas, isto significa-
ria introduzir um total de 3x10 8 partculas contendo microrganismos, ao longo de
100 horas de fermentao.
Esse exemplo torna claro que no se poder obter sucesso nesse processo,
caso o acmulo do produto desejado dependa da ao isolada do microrganismo
responsvel pela sntese deste produto.
Na verdade, caso se trate de um processo descontnuo de fermentao, os
instantes mais problemticos so os instantes iniciais do processo, pois a se tem
baixa concentrao do microrganismo produtor e alta concentrao de substratos,
o que significa alta potencialidade de contaminao do sistema. J nos instantes
mais avanados tem-se uma alta concentrao do microrganismo responsvel pelo
processo produtivo e uma baixa concentrao de substratos, o que torna o caldo
em fermentao menos suscetvel a contaminaes. Isso no significa que se possa
conduzir o process<;> de forma menos atenta, pois a ocrrncia de contaminaes
que produzam substncias que destruam o produto gerado pode _comprometer o .
processo, como o caso de contaminaes com clulas produtoras de proteases
em um processo de produo de uma dada enzima.
Claro est que o nvel de preocupao com a esterilizao do ar depende da
maior ou menor suscetibilidade do. processo quanto a cntaminantes. Caso o meio
de cultivo, ou as condies impostas ao reator (pH, temperatura), sejam extrema-
mente seletivos, os cuidados podem ser atenuados, mas ainda assim a ocorrncia
de contaminaes pode interferir negativamente no que se refere obteno de al-
tos rendimentos, o que geralmente no compensa a economia que se tenha feito, e
que no mais permita uma operao assptica eficiente.
No presente captulo pretende-se descrever certas particularidades sobre os
aerossis microbianos, indicar formas para se estimar a concentrao de microrga-
nismos suspensos no ar, apresentar as formas mais freqentes e disponveis para
se executar a esterilizao do ar, sempre com a principal preocupao no forneci-
mento de ar esterilizado para processos fermentativos aerbios.

5.2 - Aerossis microbianos


As espcies microbianas suspensas no ar atmosfrico, assim como sua con-
centrao, podem ser extremamente variveis, dependendo de uma srie de fato-
res. Pode-se encontrar microrganismos de maiores dimenses, como bolores
(fragmentos de hifas) e leveduras, assim como espcies de menores dimenses
como bactrias ou seus esporos. Esses microrganismos so provenientes do solo,
ou de plantas, ou ainda de cursos de gua, sendo postos ein suspenso pela
Amestradores 65

movimentao do ar ambiente, sendo os de menores dimenses freqentemente asso-


ciados a partculas de poeira.
A simples meno desses fatos j indica que, dependendo do clima de urna
dada localidade, ou mesmo de um dia para outro em urna mesma localidade, po- ,
dern-se encontrar diferentes concentraes de microrganismos suspensos no ar,
assim corno distintas espcies de microrganismos suspensos. De fato, ao se efetuar
a contagem de rnicrorgni~rnos no ar em um ambiente livre de radiaes solares e
com umidade relativa elevada, muito provavelmente obtm-se concentraes ele-
vadas de clulas vegetativas. Ao contrrio, urna determinao feita aps longa ex-
posio luz solar forneceria urna contagem preferencial de espcies mais
resistentes, corno os esporos de bactrias. Analogamente, a concentrao de mi-
crorganismos suspensos no ar drasticamente reduzida aps um perodo de chu-
vas e extremamente elevada aps. um perodo de ventos fortes .
Essas informaes permitem refletir sobre o local de onde se deve proceder
captao de ar para processo. Esse local de captao no deve ser entendido
corno aleatrio, pois podemos estar captando ar de locais IIJ.Uito contaminados,
corno seria o caso de se localizar a entrada de ar do sistema de compresso muito
prxima do solo, ou ainda voltada para locais particulares e sujeitos a um maior
nvel de contaminao.
No prximo item se buscar descrever sistemas para a determinao da con-
centrao de microrganismos suspensos no ar, mas j se pode afirmar que, apesar
das possveis variaes em urna mesma localidade, ao se efetuar estas deterrnina-
.es por longos perodos (um ano por exemplo), obtm-se valores mdios relativa-
mente prximos. Assim, AIBA et al. 1 indicam, para a atmosfera de Tquio, urna
concentrao mdia de microrganismos de 12x103 partculas/rn3, enquanto que
GADEN;HUMPHREY 2 indicam, para Londres, um valor de 3 a 9x103 partculas/rn3
PARIS et al. 3 chegaram a urna concentrao mdia de 1 a 3x103 partculas/rn3,
no que se refere atmosfera da capital de So Paulo, aps realizarem amostragens
durante o perodo-de um ano e em diversas localidades. '
Deve-se salientar que as diferenas observadas entre esses diversos dados
disponveis na literatura so devidas s prprias caractersticas do fenmeno, con-
forme discutido anteriormente, mas tambm em virtude do emprego de diferentes
rnetodologias na quantificao.
Quanto s dimenses dos microrganismos suspensos no ar, pode-se conside-
rar corno representativos valores da ordem de 0,5 a 1,0 !JID, ou seja, dimenses de
bactrias ou seus esporos. Por outro lado, as partculas de poeira, que freqente-
mente transportam os microrganismOs, apresentam dimetros freqentemente su-
periores a 4 IJID, sendo que os esporos normalmente no esto associados a estas
partculas de poeira. 4
.'

5.3 - Amestradores
A determinao da concentrao de microrganismos suspensos no ar atmos-
frico realizada atravs do uso de dispositivos designados genericamente por
arnostnidores. Esses instrumentos no so apenas importantes por realizarem essa
66 Esterilizao de ar

tarefa, como tambm so empregados para a verificao da efetiva esterilizao


do ar destinado ao processo, ou na quantificao de eventuais contaminantes e.m
reas ditas estreis (salas de cirurgia).
Essas so as razes pelas quais reveste-se de importncia o conhecimento de
alguns detalhes sobre .os tipos de amestradores que podem ser empregados, assim
como sua forma de operao e limitaes.
De uma forma geral, todos os amestradores operam de maneira semelhante,
pois o princpio bsico deles consiste em reter, de alguma forma, os microrganis-
mos suspensos em um determinado volume de ar, dando-se, a seguir, condies
para que estas clulas proliferem, de maneira a tornar possvel a contagem de co-
lnias, para a quantificao dos contaminantes no volume de ar amostrado.
Tendo em vista essa descrio geral, pode-se concluir que:
a) dependendo da forma empregada para reter os microrganismos, no se
pode assegurar que esta reteno seja total, podendo-se inclusive imaginar que
haja distintas eficincias de coleta para diferentes amestradores;
b) ainda na dependncia da forma de reter os microrganismos, pode-se tam-
bm imaginar a possibilidade da ocorrncia de destruio de certas espcies;
c) lembrando que clulas microbianas suspensas no ar podem estar associa-
das a partculas de poeira, podendo ocorrer a existncia de mais que uma clula
por partcula, por mais que se busque desagregar estes conjuntos, sempre difcil
afirmar que uma colnia tenha tido, obrigatoriamente, origem em uma nica clu-
la. Essa , inclusive, a razo pela qual os resultados so freqentemente expressos
em nmero de partculas, ou de nmero de colnias por unidade de volume de ar
amostrado;
d) conforme indicado, a etapa final da determino consiste em contar co-
lnias que se desenvolveram em um dado meio de cultura e, tendo em vista a
grande variedade de microrganismos suspensos no ar, torna-se difcil eleger um
meio no qual se possa afirmar que todas as espcies se desenvolvam em um dado
intervalo de tempo.
Uma primeira conseqncia dos fatos acima apontados/ reside n<J'dificulda-
de em comparar resultados obtidos pelo uso de diferentes amestradores, ou com
um mesmo amestrador~ porm operado de formas distintas.
Outra conseqncia clara a impossibilidade de se obter a concentrao, to-
tal ou absoluta, de microrganismos suspensos no ar atmosfrico.
Uma forma de minorar esses problemas, especialmente quando se deseja
efetuar testes de efetividade de esterilizao de um dado sistema, por exemplo de
um dado filtro, consiste em preparar uma suspenso de um dado microrganismo
em ar, previamente submetido esterilizao. Esse ar, artificialmente contamina-
do com o microrganismo usado como marcador, passado atravs do filtro, deter-
minando-se a concentrao (ou o nmero) de microrganismos no ar antes e aps o
elemento filtrante, desde que tambm se conhea o volume de ar amostrado, me-
dindo-se a vazo de ar e o tempo do ensaio. Pode-se assim quantificar a eficincia
de reteno (TJ) do filtro em teste:
N ~N
. TJ = l z X 100 . (5.1)
Nl
-- ----C---------- ----- ...... ...~
Amestradores 67

onde: N 1 =concentrao de microrganismos no ar antes da passagem pelo filtro


.(partculas ou colnias por unidade de volume) e
N 2 = concentrao de microrganismos no ar aps a passagem pelo filtro,_
(partculas ou colnias por unidade de volume). .
O fato de se conhecer o microrganismo empregado para esse tipo de deter-
minao, significa que se conhece perfeitamente o aspecto dl.s colnias que se
quer contar (formato, apar&ncia, cor), alm de se conhecer o meio de cultura e as
condies mais adequadas para a sua proliferao.
Vrios microrganismos tm sido empregados para a realizao desses testes,
tais como Serratia marcescens,S Pseudomonas diminuta 6' 7 e esporos de Bacillus subtilis
var. niger. 4 Obviamente esses microrganismos so de pequenas dimenses, como
o caso do Pseudomonas diminuta, que apresenta dimetros de 0,3 por 0,8 J.Lm. 7
Pretende-se, a eguir, apresentar algumas caractersticas de alguns amostra-
dres mais freqentemente empregados. Convm salientar que na literatura h a
descrio de um nmero elevado de amostradores, sendo freqente que um pes-
'
quisador, ao trabalhar sobre. o tema, acabe por desenvolver o seu prprio sistema, i
ou propondo variaes sobre os existentes. Isso resulta na gerao de dados que I
ti
so de difcil comparao, a no ser que se empregue sistema idntico.

5.3.1 - I!Tlpinger
O impinger um dos amostradores mais conhecidos e sobre o qual h inui-
tas referncias. Existem, inclusive, inmeras verses desse amostrador, sendo um
exemplo tpico o indicado na Figura 5.1, extr_ada do trabalho de TYLER; SHIPE, 8
sendo conhecido como "all-glass impinger" (AGI).

13cm

8
Figura 5.1 - "AII-glass impinger" (AGI). (I) Entrada do ar; (2) Sada do ar (bomba de vcuo).
68 Esterilizao de ar

Esse amostrador consta de um recipiente de vidro que contm 10 mL do l-


quido coletor, que pode ser gua destilada, ou determinadas solues como a so-
luo gelatina-fosfato, constituda de gelatina (2 g/L) e Na 2HPQ4 (4 g/L), qual se
adiciona 0,01 mL de leo de oliva esterilizado, a fim de evitar a formao de espu-
ma. Antes do incio da amostragem, todo o conjunto deve ser esterilizado.
Ao se iniciar a amostragem do ar, liga-se a abertura 2, indicada na Figura
5.1, a uma bomba de vcuo, de forina a reduzir a presso no interior do recipiente.
Dessa forma, o ar entrar no amostrador atravs da abertura 1, borbulhando no l-
quido coletor atravs do tubo de vidro, o qual capilar em sua parte final para
gerar bolhas de pequeno dimetro. Espera-se, portanto, que os microrganismos
existentes no ar fiquem retidos no lquido.
Terminada a tomada de amostra, o frasco agitado, a fim de promover a de-
sagregao dos eventuais aglomerados de clulas, determinando-se, ento, a con-
centrao de microrganismos no lquido coletor, atravs dos mtodos usuais de
diluies e contagem de colnias em placas.
Conhecendo-se a vazo de ar e o tempo de amostragem, conhece-se o volu-
me de ar amostrado, tendo-se, portanto, todos os dados necessrios para o clculo
da concentrao de microrganismos neste ar.
Uma das vantagens desse amostrador consiste no fato de Iio ser necessrio
o uso de medidor de vazo de ar, uma vez executada a calibrao do aparelho,
pois o tubo capilar funciona como um "orifcio crtico". Essa expresso "orifcio
crtico" significa uma condio de trabalho na qual a relao entre as presses rei-
nantes nas extremidades do tubo capilar suficiente para produzir velocidade do
ar igual do som. Essa velocidade no mais ultrapassada, mesmo que a presso
do lado do vcuo diminua ou oscile abaixo desse valor crtico. Para o ar, a relao
de presses de 0,53, significando que se a amostragem for efetuada de um ambi-
ente presso de 1 atm, a presso do lado do vcuo dever ser inferior a 0,53 atm,
podendo inclusive oscilar entre valores abaixo deste e, mesmo assim,' a vazo per-
manecer constante. 9 Assim, uma vez construdo o instrumento, ele deve ser sub-
metido a uma calibrao, para se conhecer a vazo de ar que ele pe/mite, com a
devida preciso.
No caso do AGI utilizado por TYLER; SHIPE, 8 a vazo de ar era de 12,5 L/min
e a distncia da extremidade livre do capilar ao fundo do frasco era de 4 mm. Esse
impinger apresentou uma eficincia de reteno de esporos de Bacillus subtilis su-
perior a 99%, em comparao com os dados obtidos com um amostrador de algo-
do (vide a seguir) considerado como absoluto, apesar de se saber que ocorre
destruio de clulas neste tipo de amostrador.
Em vista desses fatos, os mesmos autores puderam imaginar que haveria re-
teno de microrganismos no tubo de admisso de ar, assim como poderia ocorrer
destruio de clulas, em virtude da excessiva velocidade com que as partculas
so lanadas no meio, podendo, inclusive, haver choque contra o fundo do frasco.
Para demonstrar a ocorrncia de reteno no tubo de admisso 'do ar, TYLER
et al. 10 empregaram aerossol contendo cristal violeta, sendo que aps certo tempo
de amostragem efetuavam uma lavagem no tubo de admisso, determinando a
concentrao daquele corante atravs de um colormetro. Demonstraram que no
Amostradores 69

apenas ocorre essa reteno, como tambm que ela depende do tamanho da part-
cula, observando que para partculas de 20 Jlm ocorre praticamente reteno total.
Um dos mtodos emp~egados pelos autores para a determinao da des-
truio de clulas vegetativas durante a amostragem, consistiu no uso de clulas
marcadas radiativamente. Para tanto, usaram uma suspenso de Serratia marces-
cens previamente cultivada em meio glicosado contendo fsforo ou enxofre radio-
ativos. Aps a amostragen( determinavam o nmero de partculas no lquido
coletor atravs de um contador Geiger e as clulas viveis pela tcnica usual de
contagem de colnias em placas.
Uma vez constatados esses problemas com o AGI, SHIPE et al. 11 desenvolve-
ram um outro tipo de amestrador, que recebeu a designao de amestrador Shipe,
indicado na Figura 5.2.

11
Figura 5.2 - Amostrador Shipe. (I) Oriffcio crtico (entrada do ar); (2) sada do ar (bomba de vcuo).

Esse outro tipo de instrumento consiste em um erlenmeyer de 125 mL, sendo


a entrada do ar feita atravs de um "orifcio crtico". Ele opera de forma similar ao
AGI, colocando-se no erlenmeyer 25 mL do lquido coletor e ligando-se a sada de
ar a uma bomba de vcuo. Devido entrada do ar em alta velocidade ser efetuada
na superfcie do lquido, isto provoca um movimento circular do lquido coletor,
sendo importante a localizao do orifcio de entrada, a fim de evitar uma excessi-
va umidificao das paredes do frasco.
~- - - . ....... .. ..... . - ------ --.-.-.----- - ---.- :------------~~----- --- ----.--~---.--- --- .... - -,
70 Esterilizao de ar

Como se pode observar, o amostrador Shipe no conta com o tubo de entra-


da, e ainda lana as partculas contra a superfcie do lquido coletor que est em
movimento. Isso evita a mencionada reteno e tambm reduz :a possibilidade de
destruio de clulas vegetativas, sendo que testes comparativos indicaram cerca
de 23% a mais de clulas viveis no amostrador Shipe, em relao ao valor obtido
no AGI.
Os detalhes expostos acima servem para ilustrar os cuidados na constru-
o e operao desses amostradores, para se poder obter resultados satisfat-
rios e reprodutveis, mesmo no caso de se utilizar aerossis contendo clulas
conhecidas.

5.3.2 - Amostragem por filtrao


Existem vrios amostradores cujo princpio bsico da amostragem a filtra-
o, sendo, portanto, distintos dos amostradores mencionados. Consistem em fazer
passar o ar atravs de um elemento filtrante, o qual dever reter os microrganismos
suspensos. Posteriormente, pode-se colocar esse material filtrante em suspenso em
um volume conhecido de um lquido adequado, procedendo-se a uma agitao vi-
gorosa, a fim de propiciar a passagem dos microrganismos retidos para o lquido.
Finalmente, efetua-se a determinao da concentrao de microrganismos no lqui-
do, pelas tcnicas usuais de diluies e contagem em placas. Conhecendo-se o volu-
me de lquido sabe-se o nmero total de microrganismos retidos e, novamente,
conhecendo-se a vazo do ar amostrado e o tempo de amostragem, tm-se todos os
elementos para o clculo da concentrao de clulas no ar.
Alternativamente, pode-se aps a passagem do ar atravs do elemento filtran-
te dar condies para que as clulas proliferem no prprio coletor; efetuando-se en-
to a contagem de colnias. Esse procedimento, quando possvel, evita o trabalho
adicional de suspender as clulas em um lquido para posterior contagem.
Um amostrador tpico dessa categoria o amostrador de algodo, esquema-
tizado na Figura 5.3. Aps a sua montagem ele deve ser submetido a esterilizao,
preferencialmente por meio de calor seco (estufa), a fim de evitar o umedecimento
das fibras e a conseqente perda de eficincia de reteno de microrganismos.
A amostragem realizada conectando-se a extremidade 2 (Fig. 5.3) a uma
bomba de vcuo, intercalando-se um sistema para a medida da vazo de ar. Aps o
tempo de amostragem, o chumao de algodo retirado do amostrador e asseptica-
mente transferido para um recipiente contendo um volume conhecido de gua este-
rilizada. Procede-se, ento, a uma vigorosa agitao, objetivando a passagem dos
microrganismos retidos nas fibras para o lquido, efetuando-se a determinao da
concentrao de microrganismos no lquido por contagem de colnias em placas.
Esse amostr;1dor apresenta uma srie de inconvenientes, como a dificuldade
em suspender os microrganismos retidos, alm de provocar a destruio de clu-
las vegetativas, conforme apontado por TYLER; SHIPE.8 Alternativamente pode~se
eiilpregar l de vidro, mas de ' qualquer maneira a obteno de altas eficincias de
coleta depende de se ter o material filtrante muito bem compactado, de forma a se
observar uma rerda de carga, no leito filtrante, relativamente elevada e da ordem
de0,5kg*/cm .
-~- ----- ------ollll
Amestradores 71

13 em

8
Figura 5.3 - Amostrador de algodo. (I) Entrada do ar; (2) Safda do ar (bomba de vcuo).

Uma forma mais conveniente de se efetuar amostragens por filtrao con-


siste no emprego do amostrador proposto pela Millipore Ind. e Com. Ltda. Esse
amostrador consiste em urri suporte em ao inoxidvel, o qual abriga membranas
Millipore de 4Zmm de dimetro e poros de 0,22 J..Lm ou 0,8 J..Lm, devendo ser pre-
viamente esterilizado. O sistema dispe de uma bomba de vcuo, que succiona o
ar, obrigando-o a passar atravs da membrana e t:mbm atravs de um orifcio
crtico,. a .Jim de se ter uma vazo constante e conhecida. Terminada a amostra-
gem, a membrana deve ser retirada assepticamente e colocada sobre a superfcie
de um meio de cultura em pequenas placas de Petri. Aps tempo adequado de in-
cubao, contam-se as colnias que aparecem sobre a membrana, obtendo-se, as-
sim, a concentrao de microrganismos no ar amostrado. PARIS et al} cujos
resultados foram mencionados anteriormente, efetuaram determinaes com o
emprego desse tipo d~ amostrador.
Ao que tudo indica, o desenvolvimento de amostradotes que operam por fil-
trao atravs de membranas, teve seu incio com o trabalho de TORLONI;
BORZANI,12 empregando um sistema cujo elemento filtrante qmsistia em papel-
filtro Whatman 40 e 42. Esse original sistema, esquematizado na Figura 5.4, era
constitudo de um funil de alumnio, ao qual se adapta uma folha de papel-filtro
apoiado em uma grade de ao inoxidvel. Entre a grade e a folha de papel colo-
ca-se uma camada de algodo hidrfilo.
72 .Esterilizao de ar

entrada_.
do ar

12
Figura 5.4 - Amostrador de papel filtro.

Aps a esterilizao do sistema, ao se efetuar a passagem de ar atravs da


folha de papel-filtro, o que poderia ser feito acoplando-se um segundo cone aps
o elemento filtrante e este ligado a um orifcio crtico e a uma bomba de vcuo, os
microrganismos devem ficar retidos sobre esta folha. Terminada a amostrl,gem, o
sistema pode ser desmontado, adicionando-se a seguir um meio de cultura ao al-
godo hidrfilo, de forma a permitir, aps um certo perodo de incubao, a con-
tagem de colnias surgidas na superfcie do papel-filtro.
A partir dos resultados obtidos pelos mencionados pesquisadores, 12 com o
amestrador proposto pode-se estimar a concentrao de microrganismos no ar at-
mosfrico da cidade de So Paulo como estando entre 4 a 6xl0 3 partcttlas/m3, va-
lor este perfeitamente de acordo com os dados anteriormente mencionados.

5.3.3 - Amestradores de fenda ou orifcio


O princpio bsico de funcionamento desses amestradores consiste em se fa- .
zer com que o ar amostrado incida, a uma dada velocidade, sobre a superfcie de
um meio de cultura slido, havendo, em virtude de uma brusca mudana de dire-
o do ar, o choque das partculas suspensas que no acompanham as linhas de
corrente, ocasionando a reteno destas partculas nesta superfcie.
A Figura 5.5 mostra esquematicamente o amestrador de fenda desenvolvido
por Bourdillon e descrito por TORLONI. 9 Como se nota, consta de uma placa de Pe-
tri, contendo um meio de cultura slido preso a um disco horizontal giratrio, es-
tando todo este conjunto no interior de uma caixa metlica, provida de uma janela
que permite fechament hermtico. O ar entra por um tubo vertical que possui, na
extremidade inferior, uma fenda atravs da qual as partculas em suspenso no ar
Amestradores 73

so lanadas contra a superfcie coletora. Uma vez esterilizado todo o conjunto, a


sada de ar conectada a uma bomba de vcuo, intercalando-se um sistema para a
medida da vazo de ar.

!
3
-
4

Figura 5.5 - Amostradorde fenda. (I) Placa de Petri; (2) Disco giratrio; (3) Tubo e fenda (entrada do ar); (4) Sada
do ar para o medidor de vazo e bomba de vcuo; (5) Caixa metlica.

Durante o perodo de amostragem, o disco gira com velocidade angular re-


gulvel, em funo da contaminao do ar que se est tomando como amostra, po-
dendo-se imaginar valores desde 0,1 rpm at cerca de 2 rpm.
Aps a amostragem, a placa de Petri retirada do amostrador, fechada em
condies de assepsia e incubada. Decorrido um intervalo de tempo adequado,
conta-se -o nmero de colnias que parecem sobre o meio de cultura. Conhecen-
do-se a velocidade de rotao da placa; a vazo de ar e o nmero de colnias sobre
o meio, ou parte de sua superfcie, tm-se todos os elementos para quantificar a
contaminao do ar amostrado.
Note-se que no h como proceder desagregao dos aglomerados de clu-
las, o que tambm ocorre com os sistemas, anteriormente descritos, nos quais se
efetua a contagem diretamente sobre a superfcie coletora. Isso significa que cui-
dados devem ser observados, especialmente quando se trabalha com aerossis de
microrganismos definidos, a fim de evitar a presena de aglomerados, que podem
ser aleatoriamente desfeitos sobre a superfcie coletora durante a amostragem, ge-
rando contagens igualmente aleatrias.
Os autores tambm indicaram que a eficincia de reteno de aerossis de-
pende da vazo do ar, assim como da distncia da fenda ao meio de cultura. De-'
terminaram um valor mximo de 95% de reteno, quando empregavam vazes
superiores a 28 L/mine 2 mm de distncia da fenda ao meio. Essa reteno dimi-
~- -- -- -- -- --- ..... ----------------- ---------- -- ----- ----------- ------------------- -- ------- -- -- ---- ----
74 Esterilizao de ar

nua sensivelmente quando se reduzia a vazo do ar, sendo que obtiveram reten-
es inferiores a' 70%, operando corri uma vazo da ordem de 56 L/mine uma
distncia de 6 mm entre a fenda e o meio slido.
Para amostragens muito prolongadas pode ocorrer ainda o inconveniente da
perda de gua do meio de cultura slido, com a conseqente abertura de fendas
no meio, o que inutilizaria o ensaio efetuado.
Apesar dos inconvenientes e cuidados apontados no que se refere a esse tipo
de amostrador, ele apresenta certas vantagens sobre os demais. De fato, pode-se
imaginar a realizao de teste de um determinado sistema para a esterilizao do
ar, como por exemplo o teste de um determinado material filtrante, determinando
de forma contnua a eficincia de esterilizao ao longo do tempo de operao do
sistema. Pelo emprego de uma suspenso de um dado microrganismo conhecido,
marca-se no meio de cultura a posio da fenda no instante inicial. Aps a incuba-
o, pode-se proceder contagem do nmero de colnias existentes em determina-
dos setores da placa, os quais correspondero a certos intervalos de tempo
conhecidos, desde que se conhea a velocidade de rotao da placa. Como se conhe-
ce a vazo, sabe-se o volume de ar amostrado em cada setor da placa e, portanto, a
correspondente concentrao de microrganismos no ar que passou pelo elemento
filtrante em teste. Pode-se, assim, determinar a variao da eficincia de reteno
em funo do tempo de amostragem, ou de operao do sistema de esterilizao.
evidente que outros amestradores tambm permi~em esse tipo de determi-
nao, porm executada de forma intermitente, pois a cada amostragem h a ne-
cessidade de substituio do sistema de coleta do amostrador, para a realizao da
contagem de partculas. No caso do amostrador em questo, isso:no necessrio,
bastando providenciar a substituio da placa, aps um giro completo, por outra
esterilizada.
Na verdade, esses testes de sistemas de esterilizao de ar, destinados a pro-
cessos fermentativos, so de grande importncia, tendo em vista a ne~ssidade de
alta confiabilidade.
Um sistema desse tipo foi empregado por AIBA et al.,5' 13' 14 para a realizao
de testes em filtros de materiais fibrosos e filtros de placas porosas, empregando
porm um orifcio no lugar de uma fenda. Na Figura 5.6 encontra-se esquematiza-
do o sistema empregado pelos mencionados pesquisadores, observando-se que o
ar passa por medidores de vazo e, aps a nebulizao de uma suspenso do mi-
crorganismo utilizado como marcador (no caso Serratia marcescens), ele vai para os
amestradores. Quando a vlvula A estiver aberta, a B deve estar fechada, efetuan-
do-se, nestas condies, a determinao da concentrao de microrganismos no ar
a ser filtrado. Feito isso fecha-se o registro A e abre-se oB, permitindo~se que o ar
atravesse o filtro.
Encontram-se naliteratura vrios outros esquemas imaginados para a reali-
zao de testes de efetividade de sistemas para a esterilizao do arY15 Deve-se,
no entanto, acrescentar que testes em linha deveriam ser executados, efetuando-se
amostragens peridicas, ou at me$mo contnuas, de ar esterilizado ao longo do
Mtodos para a esterilizao de ar 75

tempo em que o processo fermentativo esteja ocorrendo, a fim de verificar a efi-


cincia da esterilizao do ar, tendo em vista os altos custos envolvidos na perda
de partidas em virtude de contaminaes. Isso normalmente no realizado, as-
sim como outras medidas nessa direo, o que torna sempre muito difcil a desco-
berta das causas de contaminaes em processos.

Derivao
para ensaio
Cmara em branco
de vidro
esterilizada

Placa de Petri
-
t
Rotmetro
Termmetro de Rotmetro
bulbo sec'o
e mido t
Compre~ _ _ _ ___._ ___;:;;....__ _.
de ar
Figura 5.6 - Sistema de teste de materiais filtrantes, empregando u~ amestrador de fenda.5

5.4 - Mtodos para a esterilizao de ar


A esterilizao de ar pode ser realizada por diversos processos. No entanto,
a filtrao , sem dvida, a soluo mais conveniente, motivo pelo qual se dar a
ela maior nfase . .

5.4.1 - Esterilizao por aquecimento


Sabe-se que a resistncia destruio de microrganismos, quando submeti-
dos ao calor seco, bem superior quando comparada resistncia ao calor mido.
Por esse motivo, a esterilizao do ar pelo calor seco exige temperaturas relativa-
mente elevadas, assim como tempos de permanncia nestas temperaturas tambm
elevados. Ainda, o transporte de microrganismos por partculas slidas de poeira,
em virtude da possibilidade de alguma proteo trmica, acaba contribuindo para
a necessidade de condies de esterilizao mais drsticas .
...___ _________ -- -- -- --- ------- --. --- - - ------ --- ----,...-~ .... --..- -..-'...,..~ - -,- ~-- ----------
76 . Esterilizao de ar

Quando se raciocina em termos de aplicao industrial, constituda de reato-


res de grande porte, h a necessidade de vazes de ar bastante elevadas (observe o
que foi descrito na Introduo). Isso dificulta imaginar o aquecimento de todo
esse ar para atingir essas elevadas temperaturas, assim como impossvel projetar
tubos de reteno ou de espera suficientemente longos, a fim de se contar com os
tempos de residncia prolongados a essas temperaturas.
Devido a esses problemas, a esterilizao de ar por calor seco encontra ape-
nas aplicao para pequenas instalaes, como caso da esterilizao do ar para
equipamentos de laboratrio ou escala piloto. Acrescente-se, ainda, que com o
surgimento de sistemas de esterilizao muito confiveis, como o caso das mem-
branas filtrantes (vide adiante), a esterilizao por aquecimento tornou-se alterna-
tiva muito pouco utilizada.
Para se ter uma idia mais concreta a respeito da possibilidade do uso dessa
tcnica, pode-se citar o trabalho de DECKER et al./ 6 que determinaram as condi-
es de esterilizao, trabalhando com esporos de Bacillus globigii e usando um es-
terilizador de ar por resistores eltricos. Os resultados obtidos pelos citados
pesquisadores encontram-se na Tabela 5.1.

16
Tabela S. I - Esterilizao de ar por calor seco. Ensaios com esporos de Bacillus globigii.

Temperatura CC) Tempo de permanncia* (s) f;

218 24
I

246 10
~

~
274 5

300
.;: .
3
. -
g
~
' nll; ~

*Para destruio superior a 99,9999%



Conforme pode ser observado, apenas temperaturas relativamente elevadas
permitem tempos de exposio da o:r:.d em de alguns segundos, o que claramente li-
mita a utilizao dessa tcnica, em se tratando de elevadas vazes de ar.
Em virtude da facilidade de construo e de controle, a esterilizao de ar
por aquecimento atravs de resistores eltricos ainda encontra possveis aplica-
es, para o caso de ar de exausto de cmaras asspticas, especialmente quando
se trabalha com microrganismos patognicos, ou para o fornecimento de ar esteri-
lizado para instalaes de laboratrio ou plantas piloto de pequenas dimenses.
O processo consiste em forar a passagem do ar atravs de resistores eltri-
cos, onde o ar aquecido e, atravs de sistema adequado, obrig-lo a permanecer
o tempo necessrio a altas temperaturas. Um exemplo desse tipo de equipamento
7
o proposto pela New Brunswick Sei. Co./ que permite vazes de at 200 litros
de ar/min, o que poderia satisfazer a necessidade de um reator de 100 litros aera-
do com at 2 min. tambm possvel esterilizar o ar que sai do reator, fazendo-o
passar por um segundo sistema, o que pode ser de interesse quando se trabalha
com patognicos.
Mtodos para a esterilizao de ar 77

Na Figura 5.7 encontra-se um desenho esquemtico de um equipamento desse


tipo, observando-se que o ar ao entrar no sistema preaquecido pelo ar que deixa o
equipamento, sendo, a seguir, conduzido para o contato direto com os resistores,
atingindo temperaturas da ordem de 370C. O ar esterilizado, alm de trocar calor
com o ar que entra, ainda resfriado por gua em uma serpentina adicional.

Controle de
Resistncias temperatura

Resfriamento

.,',

17
Figura .S.7 - Equipamento para a esterilizao de ar por aquecimento atravs de resistores eltricos.

Todo o trajeto do ar deve ser inicialmente esterilizado por vapor. Quando


em operao, o sistema controlado por pa res termeltricos que comandam vl-
vulas solenides, que apenas permitem a passagem do ar para o. tanque, ou a des-
carga de gases para a atmosfera, caso a temperatura das cmaras de esterilizao
. se mantenha em valores adequados.
Um aspecto interessante a ser abordado neste momento, em se tratando de
reatores de grande porte, diz respeito necessidade de se comprimir o ar que en-
2
viado aos reatores, at presses efetivas da ordem de 3 kg* I cm , a fim de vencer
uma srie de perdas de carga como a existente nos filtros para a esterilizao do
ar, no dispersar do ar no fundo do reator, altura da coluna lquida de meio de cul-
tivo e a sobrepresso mantida na "cabea" do reator (da ordem de 0,2 a 0,5
iI
kg* /em\ a fim de evitar a entrada do ar ambiente que proporcionaria contamina-
es (entende-se por "cabea" do reator o volume interno acima do lquido).
--~-- ----- ----- ----- ----
78 Esterilizao de ar

Essa compresso obrigatria do ar provoca inevitavelmente um aquecimen-


to do ar, atingindo-se valores que no so desprezveis. Assim, um compressores~
tacionrio, tipo helicoidal, provoca, para uma vazo de ar de 170 m 3 /min e
descarga a 3 kglcm 2, um aquecimento do ar de 20C a cerca de 180C, alm de ser
necessria uma certa filtrao do ar, na entrada do compressor, para evitar um
maior desgaste de suas partes mveis.
Justamente por esse motivo necessria a instalao de um sistema deres-
friamento do ar aps a compresso, para evitar a circulao do ar aquecido, assim
como evitar a introduo de ar quente nos reatores, o que complicaria o controle
de temperatura, alm de possivelmente causar gradientes de temperatura ao lon-
go da altura da coluna lquida em fermentao : Esse resfriamento efetuado logo
sada do compressor, de forma que o ar permanece aquecido por um pequeno
intervalo de tempo (freqentemente inferior a 1 segundo).
Conforme j mencionado, temperaturas inferiores a 200C so pouco efeti-
vas para a obteno de ar esterilizado. Sabe-se, no entanto, que as temperaturas ci-
tadas so suficientes para inativar clulas vegetativas, apesar do baixo tempo de
permanncia, restando desta maneira os esporos e as clulas que possam estar
protegidas de alguma forma . Por outro lado, caso se imaginasseatingir tempera-
turas da ordem de 300C, a fim de obter ar esterilizado em poucos segundos de
permanncia (videTab. 5.1), significaria, dependendo do tipo de compressor e da
vazo de ar necessria, comprimir o ar a presses bem mais elevadas (da ordem
de 10 a 12 kg* I cm2 ), o que traria um encarecimento ex~essivo tanto do equipamen-
to, quanto no que se refere ao consumo de energia, no sendo portanto uma solu-
o de interesse.
PARIS et ai} efetuaram a determinao da concentrao de microrganismos
aps a compresso e o resfriamento do ar, determinaes estas efetuadas em uma
instalao industrial dotada de um compressor helicoidal, operando, vazo de
145m3 lmin e presso de descarga de 2,5 kg* I cm2, o que permitia atingir cerca de
160C. Esses autores obtiveram valores mdios da ordem de 1 a 2 partculas/m3 .
Assim sendo, a reduo observada . extremamente significativa, quando
comparada ao valor da concentrao de microrganismos suspensos no ar (vide
item 5.2), o que sugere que o ar, aps a compresso em instalaes de grande por-
te, deve ser manuseado com certos cuidados, tendo em vista sua razovel desin-
feco, evitando~se que novamente venha a ser contaminado pelo ar atmosfrico.
Outra sugesto seria efetuar, quando possvel, o resfriamento do ar ein local n\ais
prximo de sua utilizao final e no imediatamente aps a compresso, aumen-
tando-se o tempo de residncia a altas temperaturas.
Existe, inclusive, meno na literatura a respeito da conduo de processos
fermentativos com sucesso, sem a presena de sistemas para a esterilizao do ar,
contando-se apenas com essa destruio de contaminantes durante a compres-
so.18 Isso, de forma alguma, deve significar que essa idia deva ser generalizada e
que seriam dispensveis os sistemas adicionais para a esterilizao do ar, especial-
mente quando se est diante de processos de longa durao e empregando condi-
es e meios de cultivo pouco seletivos. _
- ~--- ------ ---- -~
Mtodos para a esterilizao de ar 79

5.4.2 - Esterilizao por radiaes


Teoricamente, muitos tipos de radiaes podem ser utilizadas para a esteri-
lizao do ar. Entretanto, o emprego de urna determinada radiao deve levar em
conta urna srie de importantes fatores, tais corno: a eficincia na destruio de
microrganismos, o custo envolvido na obteno da radiao, a periculosidade ou
os efeitos colaterais de sua J.Itilizao. Assim excluem-se para esse tipo de aplica-
o as partculas a, prtons e nutrons, por serem excessivamente dispendiosos
quanto sua obteno e aplicao prtica, o mesmo ocorrendo com as radiaes y.
Quando se visa a esterilizao de ar, apenas as radiaes ultravioleta encon-
tram aplicao prtica. Em virtude de seu baixo poder de penetrao, os raios ul-
travioleta necessitam de tempos de exposio relativamente longos, fato este que,
novamente, impede o uso deste tipo de radiao para a esterilizao de ar para um
processo ferrnentativo.
Em se tratando do fornecimento de ar esterilizado para cmaras asspticas,
imaginou-se instalar lmpadas ultravioleta em certos trechos do duto que leva o
ar para a cmara. No entanto, mesmo para esse caso, dependendo das dimenses
dessa cmara, as vazes de ar j podem ser muito elevadas, no permitindo tempo
suficiente de exposio ao ultravioleta, havendo, assim, a necessidade da instala-
o de sistemas adicionais (filtros) para a efetiva esterilizao do ar.
Com freqncia observa-se a i'n stalaode lmpadas ultravioleta no interior
de salas asspticas, especialmente sobre os locais de trabalho, visando a esteriliza-
o do ar circundante e das superfcies das mesas e instrumentos empregados (por
exemplo, no preenchimento assptico de medicamentos). Corno o ar que se intro-
duz nessas cmaras previamente esterilizado e corno se procl,lra manter o ar o
menos movimentado possvel, o emprego da radiao ultravioleta, para este caso,
mais efetivo.

5.4.3 :. .: Esterilizao por filtrao


A esterilizao do ar por filtrao , sem dvida, a soluo mais adequada
para a obteno de altas vazes de ar esterilizado, em virtude dos baixos custos
envolvidos nesta operao, alm de se dispor, presentemente, de filtros bastante
confiveis. Por esses motivos, a filtrao encontrada em praticamente todas as
instalaes industriais, tendo tambm dominado as aplicaes em instalaes de
pequeno porte, corno o caso de instalaes piloto ou de laboratrio.
Historicamente, muitos materiais filtrantes foram empregados, tais corno
carvo, algodo ou papel. Posteriormente esses materiais foram substitudos por
outros materiais fibrosos, corno o caso de filtros de l de vidro. Estes ltimos en-
contraram enorme aplicao, constituindo-se na soluo mais adequada at rnea-
dos .ou o final da dcada de 70.
Mesmo no incio dos anos 70 surgiram os filtros de materiais sinterizados,
corno o vidro, metais (bronze, ao ,inoxidvel) e materiais cermicos, aparecendo
tambm os filtros de membranas ou placas porosas de materiais polirnricos, tais
corno o nilon, o teflon ou steres de celulose.
80 Esterilizao de ar

De fato, era possvel prever, em meados da dcada de 70, que os filtros de


membranas polimricas porosas poderiam dominar essa operao/ 9 o que de fato
acabou ocorrendo, havendo uma gradual substituio dos filtr.os de l de vidro
pelos filtros de membranas hidrofbicas, especialmente a partir de meados da d-
cada de 80.
Mencionando-se o passado e o presente, poder-se-ia tambm imaginar que,
no futuro, possivelmente se passe a empregar membranas seletivas, ou seja, mem-
branas que alm de esterilizar o gs a ser introduzido no reator, tambm possam
provocar um enriquecimento do gs em oxignio. 20 Na verdade, o principal objeti-
vo da aerao, em reatores aerados e agitados, consiste na transferncia do oxig-
nio da fase gasosa para a fase lquida, no tendo sentido a introduo no reator de
enormes quantidades de nitrognio. Assim, o uso de membranas polimricas
(como o polietileno ou o silicone), alm do possvel emprego de membranas lqui-
das, poder significar um enorme avano nesse campo, como j ocorre presente-
mente no cultivo de clulas animais.
Antes de se passar ao detalhamento dos filtros disportveis, convm alertar
q'!Je, qualquer que seja o sistema de esterilizao do ar que se pretenda empregar,
deve-se prever um filtro para cada reator, no se devendo optar, no projeto da ins-
talao, por um sistema centralizado de esterilizao, seguido da distribuio do
ar para os vrios reatores. Esse procedimento centralizado no conveniente, in-
dependentemente das dimenses dos reatores e, portanto, das vazes de ar neces-
srias, pois coloca-se em risco todo o conjunto de reatores, caso ocorra a falha do
sistem de filtrao. A eventual economia que se possa fazer, quanto ao investi-
mento inicial, no justifica o risco que se ir correr ao longo da operao da planta.

5.4.3.1 - Filtros de materiais fibrosos


Apesar de se observar uma aplicao industrial menos intensa, os filtros de
materiais fibrosos, particularmente os filtros de l de vidro, ainda so ,encontrados
em algumas instalaesi razo pela qual sero descritos no presente item.
Nesses filtros observa-se que os poros ou interstcios e~.1tre as firtras, atravs
dos quais ocorre a passagem do ar, so de dimenses maiores do que o dimetro
das fibras, empregando-se normalmente fibras com dimetro mdio da ordem de
3 f..tm, ou at mesmo fibras de 19 f.lm.
Por esse motivo a reteno dos microrganismos suspensos no ar no ocorre
apenas por impacto direto, ou reteno mecnica, havendo a participao de diver-
sos outros mecanismos para a observada eficincia global da camada fibrosa filtran-
te.19Tambm por essa razo a operao designada como filtrao em profundida-
de, pois as partculas so retidas ao longo de toda a altura da camada filtrante.
Na Figura 5.8 encontra-se o desenho esquemtico de um filtro de l de vi-
dro, assim como alguns detalhes necessrios para sua instalao.
Como se observa, consiste simplesmente num recipiente, normalmente em
ao inoxidvel, com dimenses da ordem de 2 a 3m de altura e 1 a 1,5 m de di-
metro, dimenses estas que so variveis, dependendo da quantidade de l de vi-
dro que deve acomodar. Na parte inferior conecta-se a tubulao de entrada do ar
e, na partesuperior, a de sada para o fermentador.
Mtodos para a esterilizao de ar 81

-Ar
esterilizado

-
Entrada
do ar

Salda de
condensados .

Figura 5.8 - Esquema de um filtro tradicional de l de vidro para a esterilizao do ar.

A camada filtrante ocupa a parte central do recipiente, apresentando dimen-


ses variveis dependendo de uma srie de fatores, tais como vazo de ar e di-
metro do recipiente (a eficinia de coleta de aerossis depende da velocidade de
passagem do ar atravs do leito filtrante e, portanto, depende da vazo do ar e do
dimetro do recipiente), compactao da camada filtrante (massa de fibras novo-
lume de filtrao), dimetro da fibra e eficincia de reteno desejada. 19 Apenas
para se ter uma idia a respeito da espessura de um leito filtrante desse tipo, po-
dem-se mencionar alturas da ordem de 1,3 a 1,8 m .
A camada de l de vidro sustentada por uma grade de ferro e comprimida
por uma segund~_ grade, colocada na parte superior da camada filtrante . Aps o
preenchimento do recipiente com a l de vidro, coloca-se a tampa que veda perfei-
tamente o sistema. Nessa tampa existem hastes que servem para fixar a grade su-
perior, impedindo que ocorra a movimentao da camada filtrante, quando
submetida a elevadas vazes de ar.
O preenchimento do filtro com a l de vidro deve ser feito de forma muito
cuidadosa, procurando-se distribu-la uniformemente em todo o volume dispon-
vel, buscando evitar a ocorrncia de zonas contendo menos fibras, o que propicia-
r a formao de caminhos preferenciais para a passagem do ar. Obviamente esses
caminhos preferenciais, com menor perda de carga, podero comprometer a efi-
cincia do filtro. Nesse sentido, um cuidado todo especial deve ser dedicado
zona prxima s paredes do recipiente, local especialmente propcio para a forma-
o destes caminhos preferenciais.
Justamente para diminuir a possibilidade de formao de cminhos preferen-
ciais, busca-se trabalhar com camadas filtrantes bastante compactadas e, por isso
mesmo, de menor espessura (menor altura da camada filtrante) . Ainda, no caso de
serem necessrias camadas filttantes muito espessas, pode-se providenciar a colo-
cao de grades intermedirias ao longo da altura do leito filtrante .
82 Esterilizao de ar

A fim de evitar o deslocamento de fibras, h a possibilidade do uso de l de


vidro embebida em resinas e cornpactada em mantas de pequena espessura (por
exemplo, mantas de cerca de 0,5 em de espessura). O emprego dessas mantas tor-
na o leito filtrante bem menos espesso, em virtude da maior compactao, obten-
do-se urna camada filtrante bem mais regular.
Essas mantas so colocadas em recipientes corno o esquematizado na Figura
5.8, se bem que de menores dimenses, sendo tambm comprimidas corno no caso
anterior. Para evitar o problema da zona perifrica, existem sistemas de vedao
atravs de flanges, de forma a impedir a passagem do ar.
Quando se trabalha com filtros de l de vidro, sempre se busca fazer com
que o ar passe atravs da camada filtrante a urna temperatura superior ambien-
te, de forma a manter a camada aquecida e evitar a condensao de umidade. Sa-
be-se que urna camada fibrosa umedecida apresenta urna menor eficincia de
reteno de aerossis, provavelmente em virtude de urna menor contribuio do
rnecani~rno de reteno devido atrao eletrosttica (cargas eltricas distintas
entre aerossis e as fibras, causando atrao que contribui para o choque das par-
tculas contra as fibras e sua reteno).
Por esse motivo, o ar aquecido pela compresso normalmente resfriado de
forma a passar pelo leito filtrante a 40 ou 50C. Alternativamente pode existir na
parte inferior do recipiente, que contm o leito filtrante, um conjunto de resistores
eltricos, com a finalidade de aquecer o ar. Esses resistores podem tambm ser
empregados para a esterilizao do filtro por calor seco, empregando-se, para esta
finalidade, temperaturas da ordem de 180 a 200C durante 2 horas.
Corno seria de se esperar, antes de iniciar o fornecimento de ar para o reator,
o filtro deve ser submetido a urna esterilizao, a fim de evitar que microrganis-
mos aderidos s fibras possam ser arrastados para o tanque.
Apesar de existir a possibilidade de executar essa esterilizao por calor
seco, conforme mencionado acima, o que evita o umedecimento das fibras, na
maioria das instalaes esta operao executada atravs de vapor saturado,
empregando-se vapor a urna presso efetiva de 1 kg* I cm2 durante 2 h, ou vapor
a 3 kg* I cm2 durante 1 h. Nesse caso~ fecha-se a comunicao entre o filtro e o re-
ator e o registro de entrada do ar, introduzindo-se o vapor pela parte superior do
recipiente (vide Fig. 5.8), deixando-se o registro de sada de condensados inicial-
mente aberto. Aps a completa expulso do ar, operao esta de fundamental
importncia para o sucesso da esterilizao, fecha-se esse ltimo registro, permi-
tindo que as condies mencionadas sejam atingidas.
Terminada a esterilizao, passa'-se ar aquecido atravs da camada filtrante,
a fim de secar completamente b leito fibroso, obtendo-se desta forma o filtro erri
condies de operao.
A esterilizao pelo vapor pode causar urna certa contrao do leito filtran-
te; especialmente no caso de filtros cjue tenham sido pouco cornpactados. Para
esse caso, antes de iniciar o fornecimento de ar estril para o processo, convm
proceder-se abertura do recipiente e observao da camada, cornpletando.;se
com quantidade adicional de l de vidro, caso seja necessrio. Obviamente o filtro
I
..L
deve ser submetido a urna nova esterilizao.
Mtodos para a esterilizao de ar 83

Alm desse problema, existem outros associados ao uso de vapor. Normal-


mente o filtro deve ser esterilizado ao final de cada processo fermentativo, de for-
ma a se iniciar o processo seguinte em perfeitas condies de segurana. Com isso
os filtros so esterilizados com muita freqncia (da ordem de uma vez por sema-
na), ocorrendo uma deteriorao da l de vidro, a qual vai se tornando opaca e
quebradia, havendo um ntido aumento da perda de carga e diminuio da efi-
cincia de coleta da camaida filtrante (formao de canais preferenciais). Esses fa-
tos tambm ocorrem com as fibras impregnadas com resinas.
A ocorrncia de fibras quebradias causa tambm o arraste de pequenos pe-
daos de fibras, juntamente com a corrente de ar. A perda de eficincia, o aumento
da perda de carga e esse arraste, obrigam a se providenciar a troca completa da ca-
mada filtrante aps algum tempo de operao. Esse tempo depende das condies
de utilizao do filtro, mas pode-se citar, como intervalo razovel, a troca do leito
filtrante a cada 4 meses, quando se executa uma esterilizao do filtro por semana.
Essa operao de troca do material filtrante sempre complicada na inds-
tria, pois, como se deve contar com um filtro para cada reator e freqentemente
dispe-se de vrios reatores, se estar manuseando l de vidro com muita fre-
qncia, o que no apreciado pelos operrios incumbidos desta tarefa, aumen-
tando as possibilidades de uma operao no adequada, o que coloca em risco a
conduo assptica do processo.
Todos esses problemas permitiram o surgimento de filtros mais adequados,
no caso os filtros de membranas polimricas~ porosas, que sero abordados no item
seguinte. Tais filtros encontram hoje grande aplicao, conforme j salientado an-
teriormente .
.Por essa razo no se pretende, no presente texto, apresentar mais detalhes
sobre os vrios mecanismos de coleta de aerossis por materiais fibrosos, assim
como no sero detalhad'os os procedimentos para o dimensionamento dos filtros
de l de vidro. Tais detalhes podem ser encontrados, caso o leitor tenha necessida-
de, no texto anterior a respeito desse tema. 19

5.4.3.2 - Filtros de membranas


Os filtros de membranas microporosas, elaboradas a partir de materiais po-
limricos, em geral apresentando carac.t ersticas hidrofbicas, pr9porcionam are-
teno dos aerossis microbianos na superfcie do elemento filtrante, havendo
portanto a reteno apenas por impacto cUreto das partculas contra o filtro, o qual
apresenta poros de dimenses menores do que os microrganismos a serem reti-
dos. Normalmente utilizam-se membranas com poros de 0,2 ou 0,22 jlm, ou ainda
membranas de 0,45 jlm. Essa a razo pela qual esses filtros so tambm chama-
dos de filtros absolutos.
Na realidade, no incio do surgimento de alternativas aos filtros de materiais
fibrosos, uma srie de outros materiais foram empregados, como o caso de metais
sinterizados (como o bronze e o ao inoxidvel), materiais cermicos e vidro sinte-
rizado. No entanto, com o decorrer do tempo; praticamente os materiais polimri-
cos dominaram esse tipo de aplicao, encontrando-se especialmente filtros
esterilizantes elaborados a partir do politetrafluoretileno (PTFE """"teflon"). 21
-----
. -- -- - - ----- ------- ------- ---- - ----.---- --------
84 Esterilizao de ar

O emprego de materiais polimricos hidrofbicos aspecto de importncia,


pois estes filtros tambm devem ser esterilizados por vapor, antes do incio da
operao de esterilizao d_o ar, havendo ainda a possibilidade da presena de
umidade no ar a ser esterilizado ..Assim; essa gua no deve permanecer no filtro,
pois isto poderia causar o crescimento de microrganismos na superfcie do ele-
mento filtrante, colocando em risco a obteno de ar esterilizado, alm de provo-
car um certo bloqueio passagem do ar pelos poros, o que significaria um
aumento inconveniente da perda de carga.6
Normalmente, esses filtros so fornecidos na forma de discos, ou, mais fre-
qentemente, para o caso de filtros para a esterilizao do ar para instalaes de
grande porte, na forma de cartuchos contendo a membrana filtrante montada so~
bre uma estrutura de polipropileno. A Figura 5.9 ilustra a proposta desses filtros
na forma de discos ou, cartuchos.

'

Figura 5.9 - Filtros de membranas polimricas mieroporosas{gentileza de CUNO INC. - Com. lntertech do Brasil

l Ltda.)
Mtodos para a esterilizao de ar 85

Conforme se pode observar, os elementos filtrantes so acomodados no inte-


rior de recipientes em ao inoxidvel, sendo que estes recipientes so construdos
a fim de abrigar um nmero varivel de elementos esterilizantes e, ainda, de di-
menses distintas. Como se nota na Figura 5.9, o recipiente maior destinado a
abrigar vrios cartuchos, cada um deles montados unindo-se trs cartuchos de
25,4 em (10") de comprimento. O ar entra e sai pela parte inferior do recipiente,
sendo que a entrada feita pela parte externa dos cartuchos, sendo o ar forado a
atravessar o elemento filtrante, saindo pela parte interna dos cartuchos.
Tratando-se de filtros absolutos, em princpio, a reteno dos microrganis-
mos independe da velocidade de passagem do ar, ao contrrio dos filtros de ca-
madas fibrosas, mas o aumento da velocidade superficial do ar acarreta um
aumento da perda de carga no elemento filtrante. Alm disso, velocidades exces-
sivas podem provocar vibraes inconvenientes, compromtendo os sistemas de
vedao.
O dimensionamento de um sistema: de filtrao tarefa bastante simplifica-
da, pois sabendo-se a vazo mxima de ar a ser empregada no processo (lembran-
do sempre a necessidade de se prever .um filtro para cada reator), pode-se
especificar um n4mero adequado de elementos filtrantes (cartuchos), que devero
ser acomodados no filtro, definindo desta forma uma rea adequada de passagem
deste ar, a fim de se ter baixa velocidade superficial e, portanto, baixa perda de
carga no filtro (lembrando, tambm, que a presso do ar, na descarga do compres-
sor, deve ser suficiente para vencer a coluna:. lquida no interior do reator, a sobre-
presso na cabea do reator e, ainda, as perdas de carga distribudas nas vlvulas
e tubulaes). Dessa forma, essa perda de presso no filtro deve ser a mnima pos-
svel, atravs da manuteno de v~locidades relativamente baixas (Q = V5 .S, onde:
Q=vazo de ar, V5 =velocidade superficial do ar e S=rea do(s) elemento(s) filtran-
te(s) para a passagem do ar).
As vrias empresas capacitadas para fornecerem esse tipo de filtro j dis-
pem de propostas adequadas para as necessida~es de uma determinada planta,
indicando-se nas Figuras 5.10 e 5.il alguns dados a respeito desta perda de pres-
so, em funo da vazo de ar, para elementos filtrantes de 25 em (10") ou 100 em
(40") de comprimento, respectivamente. 22

Conforme fica evidente nessas figuras, as perdas de carga so realmente re-


duzidas, e o aumento do comprimento do elemento filtrante, o que significa au-
mentar a rea de passagem do ar, permite o emprego de vazes mais elevadas
com menores perdas de carga. Observa-se, tambm, em ambas as figuras, que um
aumento da presso de entrada do ar para uma mesma vazo, acarreta uma menor
perda de presso, o que devido a um aumento da densidade do gs com o au-
mento da presso.
A Figura 5.12 permite uma idia simplificada a respeito da forma de instalar
um filtro de membrana em uma linha de fornecimento de ar esterilizado para .um
biorreator. Normalmente, com a finalidade de aumentar a vida til do filtro, suge-
re-se a instalao de pr-filtros, construdos com materiais mais grosseiros e de
baixo custo, a fim de retirar do ar partculas de poeira de maiores dimenses .
..___ _____ -- ---~----------------
. '-----~-~----- ---- - - --- - --
86 Esterilizao de ar

Perda de carga (mbar)


600 r-------~~--------~----------------.

500

400

300

200

100

50 100 150 200 250 300 350 400


Vazao de ar (Nm %>
Figura 5.1 O - Perda de carga em funo da vazo de ar (expressa em metros cbicos de ar, nas condies normais,
2
por hora), para filtro tipo cartucho de I O", da Millipore Co.

Perda de carga (mbar)


400

300

200

100

ot-~;=::::::=;;:._-----,------,-----.-----.----.--_j
o tO O 200 300 400 500 600 700 800
Vazao de ar (Nm %>
Figura 5.11 - Perda de carga em funo da vazo de ar, para fiH:ro tipo cartucho de 40" de comprimento, da Millipo-
re~.n o

Como se pode observar, deve-se prever a entrada de vapor a fim de esterili-


zar o filtro, devendo este vapor ser devidamente filtrado, para evitar o acmulo
de slidos na superfCie do elemento filtrante. Nos instantes iniciais, a vlvula de
dreno do recipiente que contm o filtro (detalhe 1 na Fig. 5.12), deve ser mantida
aberta para a expulso do ar, para que se possa atingir a temperatura adequada de
esterilizao. Tambm, aps a esterilizao, passa-se ar peio sistema, permitindo
que este ar saia pelo dreno de linha (detalhe 2 na Fig. 5.12), a fim de drenar a gua
que tenha ficado retida. Finalmente, pode-se fechar esse dreno e abrir a vlvula
que comunica o filtro com o reator.
~
o

L_____- ------------~------
,,

Mtodos para a esterilizao de ar 87

Vlvula

Reator
FiHro
absoluto

Figura 5.12 - Esquema geral para a instalao de um filtro de membrana polimrica (absoluto).

No se procede esterilizao de pr-filtros.


Os filtros existentes no mercado so bastante resistentes esterilizao, ha-
vendo menes da possibilidade de efetuar algo como 150 esterilizaes a 145C
por 30 min. Novamente, supondo-se a execuo de uma esterilizao por semana,
isto significaria algo como 3 anos de operao. No entanto, encontram-se suges-
tes na literatura6' 15'23 segundo as quais se deve providenciar a troca dos elementos
filtrantes uma vez por ano, o que significaria algo como 50 esterilizaes. Clara-
mente h a possibilidade de operaes mais prolongadas, mas deve ocorrer um
aumento da perda de presso nos elementos filtrantes, aumento este que depende
da qualidade do ar que chega membrana esterilizante.
A troca dos elementos esterilizantes muito simples, . requerendo pouco
tempo para a sua realizao. No entanto, tal operao deve ser efetuada com todo
cuidado, a fim de no se ,danificar a membrana filtrante, alm de posicionar ade-
quadamente os anis de vedao do sistema. Aps a operao de troca de cartu-
chos, deve-se efetuar testes de manuteno de presso interna, a fim de verificar a
existncia de vazamentos, assim como recomendvel a realizao de testes de
efetiva obteno de ar esterilizado, atravs do uso de amostradores.
As diversas empresas fornecedoras desse tipo de filtros, normalmente ga-
rantem a integridade dos seus produtos, pois efetuam testes antes da entrega do
material, de forma que falhas eventuais, mais freqentemente, so atribudas a um
manuseio no adequado dos elementos filtrantes.

5.4.3.3 - Filtros HEPA


Os filtros HEP A ("High Efficiency Particulate Air") so os filtros especial-
mente empregados em cmaras asspticas, .o u reas limpas. So placas de acetato
de celulose, apresentando 24 uma eficincia de 99,97% na remoo de partculas de
dimetro mdio 0,3 J,Lm, ou ainda elaborados a partir de fibra de vidro, apresen-
tando21 eficincia superior a 99,97% na remoo de partculas superiores a 0,5 J,Lm.
Normalmente esses filtros so montados com vrios elementos filtrantes se-
parados por folhas de alumnio, de forma a se obter uma grande rea para a passa-
88 Esterilizao de ar

gem do ar e, desta forma, possibilitar o uso de ventiladores, evitando a necessidade


de compressores, em virtude da baixa perda de presso atravs do leito filtrante.
Conforme salientado, esses filtros so empregados especialmente em c-
maras asspticas, registrando-se que presentemente predominam as chamadas
cmaras de fluxo laminar, ou seja, cmaras nas quais a velocidade de circulao
do ar baixa, de forma a se contar com um fluxo em regime laminar. Dessa forma,
imagina-se que os contaminantes gerados no interior da cmara possam ser retira-
dos deste ambiente pelo prprio fluxo de ar, impedindo que um fluxo turbulento
possa causar um acmulo de contaminantes.
Um exemplo de uma cmara desse tipo est indicado na Figura 5.13, a
qual ilustra um sistema com circulao vertical de ar. O ar penetra pelo teto da
cmara, saindo pelo piso da mesma, circulando a uma velocidade da ordem de
50 cm/s. 24

filtro HEPA

ventilador grade pr-filtro ventilador


24
Figura 5.13 - Cmara assptica com fluxo laminar vertical de ar.

Existem muitas outras idias a respeito do assunto, conforme o tipo de tra-



balho a ser executado. Assim, existem cmaras de fluxo horizontal, nas quais o ar
entra por uma das paredes e sai pelo lado oposto.
Em uma cmara de fluxo laminar, no se deve contar com a presena de um
nmero exagerado de equipamentos, ou mesmo de pessoas circulando, pois fcil
compreender que qualquer obstculo provoca turbilhes no ar, no se obtendo um
fluxo em uma determinada direo.
Por esse motivo, nas cmaras onde se execut a embalagem de produtos
com assepsia, no se podeimaginr um fluxo laminar em toda a cmara, em virtu-
de de suas .dimenses. Em alguns casos, tanto quanto possvel, introduz-se no in-
terior de uma cmara convencional, no local onde se executa uma determinada
operao mais delicada, um gabinete ou capela de fluxo laminar, o que torna a
operao mais segura.
Tais capelas de fluxo laminar de ar, So presentemente muito comuns em la-
boratrios que manuseiam culturas puras de microrganismos, ou mesmo para a
Mtodos para a esterilizao de ar 89

execuo de transferncias de meios de cultura previamente submetidos esterili-


zao. Na Figura 5.14 indica-se um esquema geral de uma capela desse tipo. 24
Em instantes anteriores utilizao da capela, recomenda-se efetuar uma
desinfeco das superfcies, empregando-se etanol ou outras solues desinfetan-
tes, permitindo-se ainda que a capela permanea fechada durante algum tempo e,
adicionalmente, ligando-se uma lmpada ultravioleta para a desinfeco do seu
interior. Ao iniciar a oper~o assptica, desliga-se a lmpada ultravioleta, acio-
na-se a circulao do ar, tomando-se sempre a precauo de evitar um excesso de
movimentao no interior da capela.
O conceito de fluxo laminar encontrou vrias aplicaes, havendo diferentes
sistemas operando em distintas condies, como o caso de operar com velocida-
des de circulao do ar muito baixas, da ordem de 0,1 m/s e at 0,075 m/s.25

ventilador

filtro
lbfd::ibf.~ffl~l ~~~-~HEPA

vidraa
corredia

ventilador
24
Figura 5.14 - Capela de fluxo laminar.

Pode-se, inclusive, contar com cmaras de fluxo laminar portteis, ou seja,


que podem ser facilmente deslocadas pp.ra locais da indstria onde seja necessria
uma dada operao assptica. Essas cmaras so fechadas por uma cortina de ma-
terial plstico, havendo no teto um sistema de distribuio do ar. Esse ar forneci-
do por uma unidade colocada ao lado da cabine, unidade esta que contm o filtro
HEPA. Dessa forma o ar circula verticalmente, saindo pela parte de baixo das cor-
tinas. Quando adequadamente operados, esses sistemas portteis permitem a ob-
teno de ambientes protegidos, em princpio em qualquer lugar da indstria.
i! I
li 90 Esterilizao de ar
:I
if
!i I 5.5 - Consideraes finais
,)
.[
Conforme descrito anteriormente, a esterilizao do ar para processos fer-
I
rnentativos que exigem urna rigorosa conduo em condies de assepsia, sem d-
i vida encontrou soluo mais adequada com o surgimento dos filtros de
:j
I membranas polirnricas hidrofbicas, que substituram os filtros de l de vidro
:i
'I anteriormente empregados.
:i
I'
No entanto, . deve-se lembrar que esses filtros devem ser adequadamente
., li
projetados, evitando-se o emprego de velocidades excessivas de ar atravs da
!
' t
membrana esterilizante, a fim de se contar com baixas perdas de presso. Igual-
mente, deve haver todo o cuidado com a instalao, buscando urna efetiva veda-
o do sistema, para que no ocorra contato entre o ar esterilizado e o ar
atmosfrico (perfeita vedao do recipiente que contm os cartuchos, perfeita ins-
talao dos cartuchos no recipiente, empregar cartuchos ntegros, utilizar regis-
tros apropriados no trajeto do ar esterilizado, etc.). sempre til o emprego de
pr-filtros, os quais devero ser substitudos com urna maior freqncia, a fim de
ampliar o tempo de operao da membrana esterilizante.
Deve-se, inclusive, lembrar que tanto os pr-filtros corno os filtros devero
ser substitudos, havendo a necessidade de um fcil acesso ao sistema, a fim de
que esta operao possa ser rpida e efetuada com segurana.
No caso dos processos ferrnentativos contnuos, nos quais espera-se opera-
o ininterrupta por vrias semanas, interessante a instalao de dois filtros em
paralelo para cada reator. Dessa forma, pode-se providenciar a esterilizao de
um filtro aps certo tempo de operao (urna ou duas semanas, por exemplo), sem
interromper o processo.
Finalmente, cumpre destacar a expectativa do surgimento de novos materiais
que permitam: a operao de separao dos contarninantes do ar atrno~frieo, mas
tambm proporcionem um enriquecimento desse gs, permitindo a passagem pre-
ferencial do oxignio, o que j possvel conforme salientado no textt>; seria po-
rm desejvel que pudessem ser aplicveis em instalaes de grande porte.

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L_ __- - - ----- - --- ---- ------~------- ----- ------ --,-- - ----------------- - - - - --------- ---------------- ------ - -
93

Haroldo Hiss

I
6.1 - Introduo j
O estudo cintico de um processo fermentativo consiste inicialmente na an- I

lise da evoluo dos valores de concentrao de um ou mais componentes do sis-


tema de cultivo, em funo do tempo de (ermentao. Entende-se como compo-
nentes, o microrganismo (ou a biomassa), os produtos do metabolismo (ou meta-
blitos) e os nutrientes ou substratos que compem o meio de cultura.
Tais valores experimentais de concentrao (X, P e S respectivamente),
quando representados em funo do tempo, permitiro os traados das curvas de
ajuste, conforme ilustrad'o na Figura 6.1 e indicados por X=X(t), P=P(t) e S=S(t).

0 L<: :. .- '- '- - -'~ -p


o
m__,___
..... Tempo

Figura 6.1 - Curvas de ajuste dos resultados de uma experincia idealizada de fermentao. X, P e S so as con-
centraes do microrganismo, do produto e do substrato residual no meio, respectivamente.

L_ - ~ ....- -----~----- - -------- ~--------- - -- -- -~- ---- ---- ------ -


94 Cintica de processos fermentativos

Dentre os produtos formados, escolhe-se para o estudo cintico, o produto


de interesse econmico. Quanto aos substratos, adota-seo denominado substrato
limitante (comentado no subitem 6.2.3).
Quando as concluses sobre um cultivo forem baseadas unicamente em dois
valores de X, S o~ P (como comum, por exemplo, sobre valores finais e iniciais),
no se pode afirmr que um estudo cintico do processo tenha sido realizado;
necessrio, outrossim, o conhecimento dos valores intermedirios, que permitam
definir os perfis dts curvas ou a forma matemtica destas, para uma anlise ade-
quada do fenmeno sob o ponto de vista cintico.
Assim, tais perfis representam o ponto de partida para a descrio quantita-
tiva de uma fermentao como, por exemplo, a identificto da durao do pro-
cesso, geralmente baseada no instante em que X e P apresentam valores mximos
(Xm e Prrv na Fig. 6.1).
Uma vez que esses valores representam parte de um conjunto de dados, ne-
cessrios ao dimensionamento de uma instalao produtiva, fica evidente que sem
o conhecimento da cintica torna-se invivel a transposio de um experimento de
laboratrio para a escala industrial.
Alm desse aspecto, cabe mencionar que a cintica possibilita tambm uma
comparao quantitativa entre as diferentes condies de cultivo (pH, temperatu-
ra, etc.), por intermdio de variveis, como: as velocidades de transformao (su-
bitem 6.2.1) e os fatores de converso (subitem 6.2.3), obtidos tambm a partir das
curvas de ajuste X = X (t), P = P (t) e S =S (t).
Afirmar que um determinado valor de pH, por exemplo, melhor que um
outro, equivale a dizer que o fator de converso (substrato em produto, por ~xem
plo) maior no primeiro que no segundo caso. O mesmo pode ser afirmado quan~
do se comparam os desempenhos de cultivos sob diferentes temperaturas,
diferentes variedades de uma dada espcie de microrganismo, diferentes compo-
sies de meio, etc.
Convm frisar, entretanto, que os critrios de comparao entre diferentes
condies so relativos, isto , dependem do que se espera obter de um determina-
do processo fermentativo. Assim, quando o tempo de durao da fermentao for
de primordial importncia por razes econmicas, as produtividades (subitem
6.2.1) devem ser empregadas como referncias numricas, em vez de algum fator
de converso.
Outro aspecto que merece ateno que os mtodos comumente utilizdos
para a medida da concentrao celular X, a saber: turbidimetria ou espectro~oto
metria, biomassa seca, nmero total de clulas, nmero de clulas viveis ou uni-
dades formadoras de colnias, volume do sedimento obtido por centrifugao,
teor de um componente celular etc., representam uma informao muito simples
do que ocorre em um fenmeno biolgico.
O microrganismo ou agente ativo promove a transformao dos componen-
tes do meio em produtos, graas s atividades de milhares de enzimas que, por
sua vez, so sintetizadas pelo prprio microrganismo. Sendo essas snteses contro-
ladas pelo meio externo (fenmenos de induo e represso), torna-se.assim muito
difcil, seno impossvel, identificar qual medida ou medidas so realmente repre-
sentativas da transformao em estudo.
Parmetros de transformao 95

Essa dificuldade ocorre mesmo nos sistemas mais homogneos, quando o


meio de fermentao for lmpido, com as clulas isoladas umas das outras e quan-
do s uma dada espcie de microrganismo estiver suspensa no meio aquoso.
A questo se complica ainda mais quando o sistema for constitudo por uma
cultura mista e, alm disto, contiver slidos em suspenso (alm do microrganis-
mo), como nos processos biolgicos de tratamento de resduos domsticos e in-
dustriais. Nesse caso, meddas de slidos suspensos volteis, durante tal processo,
so adotadas como uma avaliao indireta da biomassa presente. Os substratos a
serem decompostos so simplesmente avaliados pelas determinaes conhecidas
como demandas qumica e biolgica de oxignio (DQO e DBO, respectivamente).
Outros sistemas de fermentao, onde as medidas de biomassa so proble-
mticas, compreendem: clulas suspensas em meio aquoso, porm sob forma de
flocos ou clulas filamentosas; clulas imobilizadas na superfcie de materiais
inertes ou biodegradveis contidas no biorreator; clulas na presena de meio, co-
nhecido como semi-slido, onde a matria-prima constituda por .m,aterial amil-
ceo, por exemplo. Neste ltimo caso, a presena do microrganismo, traduzida pela
concentrao de algum componente do mesmo (como protena total), no pode ser
interpretada como se a clula estivesse suspensa no meio aquoso.
Finalmente, se o material a ser transformado pelo microrganismo (substrato)
for parcialmente insolvel no meio aquoso, como hidrocarbonetos lquidos ou s-
lidos, polmeros, minrios, etc., a concentrao do substrato no possui significa-
do. Juntamente com essa varivel ser necessrio avaliar a rea de interface do
material insolvel com o meio aquoso, bem como a sua variao, medida que o
microrganismo promove a degradao do mesmo. Trata-se de um aspecto at ago-
ra no resolvido satisfatoriamente, a despeito de alguns mtodo's propostos. 1

6.2 -:- Pa~metros de transformao


6.2.1 - As velocidades instantneas de transformao
A Figura 6.1 ilustra as definies das velocidades instantneas de crescimen-
to ou reproduo do microrganismo, consumo de substrato e formao de produ-
to, traduzidas respectivamente pelas seguintes expresses, para um tempo t:

dX
rx=- (6.1)
dt

(6.2)

\
'
dP
fp = - (6.3)
dt
96 Cintica de processos fermentativos

Tais velocidades, traduzidas pelos valores das inclinaes das tangentes s


respectivas curvas (Fig. 6.1) so tambm conhecidas como velocidades volumtri-
3
cas de transformao, cujas unidades correspondem a (massa) x (comprimentor x
1
(tempor
No item 6.3 apresentado um exemplo de clculo dessas velocidades.
Uma definio especial de velocidade, cujo interesse prtico est na avalia-
o do desempenho de um processo fermentativo, a produtividade em biomas-
sa, definida por:

- Xm -Xo
Px- (6.4)
tf
Os termos dessa equao, definidos na Figura 6.1, mostram que a produtivi-
dade representa a velocidade mdia de crescimento referente ao tempo _total ou fi-
nal de fermentao, tf.
A mesma definio pode ser aplicada concentrao do produto, denomina-
da produtividade do produto:

(6.5)

onde tfp no necessariamente igual a tf. A concentrao inicial do produto ge-


ralmente desprezvel frente ao valor final ou mximo, Pm

6.2.2 - As velocidades especficas de transformao


Devido ao fato de que a concentrao microbiana X aumenta durante um
cultivo descontnuo, aumentando conseqentemente a concentrao do complexo
enzimtico responsvel pela transformao do substrato S no produto P, mais
lgico analisar os valores das velocidades instantneas (eqs. 6.6, 6.7 e 6.8) com re-
lao referida concentrao microbiana, ou seja, especificando-as COwJll respeito
aovalor de X em um dado instante, conforme indicam as expresses:

(6.6)

(6.7)

_ ,.)
.= 1 dP
0Jlp--- --
X dt
(6.8)

Essas so denominadas velocidades especficas de crescimento,_consumo de


substrato e formao de produto respectivamente, tendo sido GADEN 2 o autor
destas definies.
Parmetros de transformao 97

6.2.3 - Os fatores de converso e os coeficientes especficos


de manuteno
Com referncia Figura 6.1, considerando um determinado tempo t de fer-
mentao, os correspondentes valores de X, Se P podem ser relacionados entre si,
atravs dos fatores de converso definidos por:
. ~
~~~ ~ -X -Xo (6.9)
,J
"'-.._
~..~.."'::is o -s .

X-X
Yft~ = (6.10)
/ ._.,'))!_ p- p o
o

Y~'rs = - - o
P-P (6.11)
t'.t~;>_ 5 0 -S

Se tais fatores permanecerem constantes durante cultivo, o que no ocorre


com freqncia, as trs expresses ~nteriores podem ser aplicadas tambm no
tempo final de fermentao, ond ~-X~, ~~ S d, resultando:

(6.12)

y - Xm -Xo (6.13)
X/P- p -P
m o

Yp;s = pm -.Po (6.14)


so
Eliminando-se a grandeza X0 , pela combinao das eqs. (6.9) e (6.12), ob-
tm-se:
~ i x ~x
Y:J<"'= (6.15)
f';)
m
s .

como uma forma alternativa para a definio deste fator. A'eq; (6.15) poder ser
~mais conveniente para a avaliao de Y X I S' tendo em vista que as medidas de
X0 apresentam, na maioria dos casos, erros experimentais mais elevados do
que.Xm:;
. 1

Entretanto, nem sempre o substrato se esgota completamente quando a con-


centrao celular apresentar seu valor mximo, podendo ainda existir uma
98 . Cintica de processos fennentativos

concentrao residual daquela sbstncia no meio de cultura, ao trmino da fer-


mentao. Isso ocorre porque medida que o microrganismo se reproduz, so
formados produtos do metabolismo que inibem o crescimento celular, sem men-
cionar o prprio substrato, que pode dificultar a atividade microbiana (item 6.6).
O fator de converso Y XIS foi originalmente definido por MON00,3 tendo
sido til na anlise de alguns processos.como, por exemplo, na produo de pro-
tenas unicelulares a partir de carboidratos ou hidrocarbonetos. Desde que seu
valor seja conhecido, possvel calcular o valor de X, a partir de um valor conhe-
cido de S e vice-versa.
Igualmente tl o emprego do referido fator na definio do substrato, de-
,.
,.; nominado limitante.
Como o prprio nome indica, o valor da sua concentrao inicial S0 que
definir a concentrao mxima Xm da populao microbiana. Em outras palavras,
em uma outra experincia de um cultivo descontnuo, onde a concentrao S0 seja
inferior precedente, porm com concentraes idnticas dos demais componen-
tes (incluindo a concentrao inicial da biomassa, X0 ), resultar um valor de Xm
proporcionalmente menor, no final do cultivo. '
Isso equivale a colocar a expresso (6.12) sob a forma:
r---.. . -....,. ~ \. .
---~ \~)= Yx; s S' + X 0 (6.16)

No decurso de um cultivo descontnuo, sob condies especiais (meio tam-


ponado, concentrao de S no muito elevada, agitao perfeita do meio), poss-
vel verificar experimentalmente a constncia do valor de Y XI S com o auxlio da
expresso (6.15) sob a forma:
/ ,r ,-;; . . ~- ! .

'-~-5\'xm \ y XI S :,~ ) (6.17)


.. ..._
--- "" "
., I

Uma representao dos valores experimentais de X, em funo dos valores


experimentais de S, dever resultar em uma reta, com coeficiente angular igual
Y XIS e a ordenada na origem igual Xm.
As mesmas consideraes se aplicam aos demais fatores (eqs. 6.10 e 6.11) .
Contudo, se Y XIS' Y XIP ou Y p IS no forem constantes, ento somente seus
valores instantneos devero ser levados em conta, ou seja:
dX
Yx; s =-- (6.18)
-dS

dX
Yx; P = - (6.19)
dP

dP
Yp; s = - - (6.20)
-dS

. ____ .... --.- --------


Parmetros de transformao 99

Considerando as definies de velocidades (eqs. 6.1, 6.2 e 6.3) e velocidades


especficas (eqs. 6.6, 6.7 e 6.8), resultam as seguintes relaes:

. rx Jlx (6.21)
Yx;s =.- = -
rs Jls

rx Jlx (6.22)
Yx; r = - = -
rp Jlp

rp Jl p
Yr; s = - = -. (6.23)
rs Jls

Ainda, dessas expresses ou das igualdades (6.9),(6.10) e (6.11), tem-se:

y XIS = y X/P . y P/ S (6.24)

Em fermentaes industriais, dificilmente so observados valores constantes


desses fatores de converso. Embora dependam da espcie do microrganismo,
com relao a um determinado substrato, no dependem somente da natureza
deste; os demais componentes do meio tambm exercem influncia sobre tais con-
verses, bem como o tempo de mistura e a transferncia de oxignio do sistema de
agitao do biorreator.3
Alm dessas influncias, h de se considerar o fenmeno em que as clulas
utilizam a energia de oxidao do substrato, no somente para o crescimento, mas
tambm para finalidades de maimteno.
Em outras palavras,' um determinado consumo de substrato (5 0 -S), no pro-
duzir sempre um aumento proporcional na biomassa (X-X0 ), sendo que uma
parcela da energia, proveniente daquele consumo, destinada manuteno das
funes vitais do microrganismo.
Essas funes vitais compreendem: o trabalho osmtico para manter os gra-
dientes de concentrao de substncias entre o interior da clula e o seu meio am-
biente, as modificaes de componentes celulares que requeiram energia e a mobi-
lidade celular.
4
Esse conceito, introduzido por PIRT, atravs do consumo especfico para
manuteno m:

m = (rs)m (6.25)
X
onde (rs)m a velocidade de consumo de substrato devida a manuteno, permite
combin-lo com o balano material

(6.26)

no que resulta
L ___. .
I 00 Cintica de processos fermentativos

rs =(rs)c +m X (6.27)

onde (r5)c se refere ao consumo do substrato, destinado somente ao crescimento


ou reproduo microbiana. r 5 o consumo global observado, tal como definido
pela expresso (6.2).
Com a definio de um novo fator de converso:

, rx (6.28)
Y.X/S = - -
(rs)c

e sua introduo na eq. (6.27), tem-se

rx (6.29)
rs = - ,-+mX
Yx;s

ou, de acordo com as eqs. (6.6) e (6.7):

Jlx (6.30)
J.ls =--+m
YX:;s

Note que se m=O, Y'x;s coincide com a definio de Yx;s da eq. (6.21). Esse
fator, definido pela eq. (6.28) algumas vezes denominado fator de converso
"verdadeiro".
Se Y'x;s em forem constantes, a relao entre J.ls e Jlx dever ser linear. Esta
- nova definio do fator de converso, aliada ao coeficiente especfico de manuten-
o, mais geral do que a eq. (6.21), possibilitando assim que ~m maior nmero
de processos fermentativos apresentem valores constantes de Y'x;s em.
Uma generalizao mais ampla ainda, 5 pode ser introduzida no balano da
I eq. (6.26), ao ser considerada mais uma parcela de consumode substrfitO, ou seja,
I na formao de produto, (rs)p:

(6.31)

onde (rs)cp e (rs)!nP so as velocidades de consumo de substrato para o crescimen-


to e manuteno, respectivamente levando em conta a formao de produto.
Introduzindo:

, - rp . (6.32)
YPIS---
(rs)p

e um novo coeficiente especfico de manuteno

(rs)mP (6.33)
mp = X

bem como um novo fator de converso para o crescimento


Clculos das velocidades I OI

" rx
Y XI S = - - -
(6.34)
(rs)cp

resulta, com a (6.31) :

. rx rp (6.35)
-' 's =--+--+mp X
Yx;s Yr;s

ou, com as equaes 6.6, 6.7 e 6.8:

f.lx f.lr (6.36)


f.ls =--+--+mp
Yx;s Yr;s

Uma regresso linear mltipla com trs variveis {f.ls, f.lx e f.! r) poder ser
verificada, se os fatores e o novo coeficiente mp forem constantes ou se este ltimo
for desprezvel.
Pode-se, enfim, estender o balano com a incluso de termos adicionais,
referentes a outros produtos do metabolismo (incluindo aqueles presentes nos
gases de sada do biorreator), cujos valores experimentais sejam conhecidos, re-
sultando com isto novos valores dos fatores de converso e do coeficiente de
manuteno.
Do exposto, verifica-se assim que as concluses a respeito de um determina-
do cultivo dependem muito da quantidade de dados experimentais disponveis
sobre o sistema.

6.3 - Clculos das velocidades


Pelas definies apresentadas nos subitens 6.2.1 e 6.2.2, conclui-se que os
clculos das velcidades e velocidades especficas ' de transformao necessitam,
em primeiro lugar, dos traados das curvas a partir dos pontos experimentais (Fig.
6.1).
Esses traados ou ajustes podem ser realizados manualmente, com progra-
mas de computador ou atravs de curvas representadas por equaes conhecidas.
Iniciaremos pelas consideraes referentes aos traados manuais, ficando os
comentrios dos ajustes com equaes para o final deste item.
O traado manual exige um bom conhecimento do processo em estudo.
Como uma experWncia inicial, deve-se ter em mente que para um grande nmero
de casos os perfis apresentados na Figura 6.1 so caractersticos, isto , as curvas
de formao do microrganismo (X= X(t)) e do produto (P = P(t)) exibem a forma
"S" ou sigmoidal crescente, enquanto a do substrato residual no meio (S = S(t)) se
caracteriza pelo perfil em "S" decrescente.
Os instantes em que P e X so mximos podero no coincidir, isto , ambas
as curvas no sero necessariamente sempre semelhantes.
L __ -- . -- - ------~--------- ------c-
- -~---~-----,-- ---------~----- - ------. - - - -- ----- -- --- ---------
I 02 Cintica de processos fermentativos

100.-r-
- - - 40
s

~
80 20 ::::!
s
0..

o
x 4

40

20

o 2 4 s 6 8 10
Tempo (h)
Figura 6.2 - Resultados obtidos em uma fermentao alcolica. S, concentrao de acar; P, concentrao de
etano!; X , concentrao de levedura (expressa em gramas de matria seca por litro), segundo BORZANI. 6

Para exemplificar o clculo das velocidades (eqs. 6.1, 6.2 e 6.3) e velocidades
especficas (expresses 6.6, 6.7 e 6.8), esto representados na Figura 6.2 os resulta-
dos experimentais obtidos em uma fermentao alcolica descontnua.6 '
Para t = 5 horas, por exemplo, a velocidade de consumo de acar calcula-
da pela inclinao da reta tangente AB curvaS= S(t), a saber:

_ dS = 100-70 = 30g I L = 7, 9 g I L. h
dt 7,1-3,3 3,8h
onde os valores numricos de cada parcela co.r respondem s coordenadas dos

pontos arbitrrios A e B, escolhidos sobre a reta.
De modo semelhante, para as velocidades de produo de etanol e cresci-
mento da levedura, no instante t = 5 h tem-se, respectivamente:

dP = 20-0,0 =20giL = 4 ,0giLh


dt 8,3-3,3 5,0h

dX 4,0-2,0 2 ,0giL =045 IL h


dt 6,2-1,8 4 4h
I
Ig

calculadas com as coordenadas dos pontos arbitrrios sobre as retas C,D e E,F res-
pectivamente. .
~..,.:_.___ _ __ _____:,. _ ____________ __; __ ______ ___ ___..
A curva de cresdmento microbiano I03

Por outro lado, para t = 5,0 h tem-se X= 3,5 g/L (Figura 6.2). Assim, os valo-
. res das velocidades especficas de consumo de acar, produo de etanol e cresci-
mento da levedura, no instante t = 5 h, sero, respectivamente:

= 7,9 =2 3h-1 -4,0 -llh-1 - 0,45- o13h-1


J.l 5 3/5 I i J.lp - 3,5- I e J.lx- 3,5 - '

Esses clculos, aplicados em cada instante de fermentao, permitem deter-


minar as formas das funes J.ls = J.ls (t), J.lp = J.lp (t) e J.lx = J.lx (t), cuja utilidade ser
comentada no item 6.5.
Cumpre frisar que o clculo das mesmas depende no somente dos ajustes
manuais efetuados (Fig. 6.2), mas tambm do traado das retas tangentes, em um
dado instante t do cultivo,
Essa ltima operao, to subjetiva quanto os ajustes manuais, pode ser efe-
tuada por outros mtodos, que devem atenuar as discrepncias entre os resulta-
dos de clculo de um mesmo conjunto de dados experimentais, provenientes de
operadores diferentes.
O leitor interessado poder consultar a bibliografia especfica a respeito dos .
mtodos grficos para o traado das tangentes/o mtodo geomtrico 8 e os ajustes
baseados em equaes, cujas derivadas possibilitam tambm os clculos das velo-
cidades de transformao e velocidades especficas. 9' 10 Os critrios estatsticos
. para a escolha dessas equaes, 11 ' 12' 13 bem como os erros que afetam as medidas
dessas velocidades/ 4' 15' 16 so encontrados na literatura.
No final deste captulo, encontra-se no Apndice um exemplo de clculo
atravs do mtodo geomtrico} com auxlio de uma planilha eletrnica.

6.4 - A curva de crescimento microbiano


Aps a inoculao de um meio de cultura, favorvel ao desenvolvimento do
mi~rorganismo em estudo, sob temperatura controlada e agitao adequada, ob-
serva-se um comportamento nos valores da concentrao celular, conforme indica
a Figura 6.3.
As seguintes fases no crescimento so observadas:
Fase 1 -Conhecida como fase "lag" ou de latncia, que se segue imediata-
mente aps a inoculao do meio com o microrganismo em questo. Trata-se de
um perodo de adaptao durante o qual a clula sintetiza as enzimas necessrias
ao metabolismo dos componentes presentes no meio.
Purante essa primeira fase, no h reproduo celular e, assim, X = X0 =
constante.
A durao dessa fase varia principalmente com a concentrao do inculo (e.
portanto com o valor de X0 ), com a idade do microrganismo (tempo de pr-cul-
tivo) e com o seu estado fisiolgico.
../ ...
I 04 Cintica de processos fennentativos

Xd ---------------------------------------

A

Xc -----------------------------

X;----------------,
Xo i
o 1 i 2" i 3 i 4 i 5 j 6 7
xm - ---------------<- -------- rr- ----- -''--~

XC : : .
-~ --------~----r------- B

l l

~ +I
o
Figura 6.3 - Curva de crescimento do microrganismo em cultivo descontnuo, representada em ordenadas lineares
(A) e semilogartmica (8). As sete fases esto descritas no texto.

Com efeito, se as clulas forem pr-cultivadas em um meio de. composio


diferente, o tempo referente ao fenmeno de induo pode ser aprecivel; caso
contrrio, possvel que tal fase no exista. . .
Fase 2 -:- Essa a fase de transio (Fig. 6.3) em que se observa o incio da re-
produo microbiana propriamente dita.
H um aumento gradual, tanto da velocidade de reproduo (eq. 6.1) como
da velocidade especfica de crescimento (eq. 6.6), onde nem todos os microrganis-
mos completam a fase anterior simultaneamente. No fim dessa fase, a populao
inteira comea a se dividir em um intervalo regular mdio de tempo (eq. 6.41).
Fase 3 - denominada fase logartmica ou exponencial onde a velocidade
especfica de crescimento (J..tx =J..tm) constante e mxima. Nessas circunstncias, a
eq. 6.6 permite concluir que a velocidade de crescimento diretamente proporcio-
nal concentrao X, isto :

dX
-=J..t X (6.37)
dt m
A curva de crescimento microbiano I O5

Uma integrao da equao 6.37, entre o incio dessa fase (de coordenadas
(ti, Xi), Fig. 6.3) e um instante arbitrrio t, compreendido entre ti e te resulta em:
'
X
ln- = 11 o(t -to)
X rm 1.
(6.38)
I

ou

(6.39)

Desse modo, pela expresso 6.38, uma representao sem:ilogartmica da


concentrao celular com o tempo de cultivo dever resultar em uma reta (Fig.
6.3.:B), vlida at te, tambm denominado tempo crtico.
Ao lado da velocidade especfica f.!m, a fase exponencial tambm caracteri-
z~~a freqentemente pelo tempo de ge:ao tg, que o intervalo de tempo neces-
sano para dobrar o valor da concentraao celular.
Aplicando esta definio na eq. 6.38, tem-se:

2X
l n - -1 ::::11
X rm
t g (6.40)
I

ou

ln2 0,693
f.!m=--=-- (6.41)
tg tg

Da equao (6.41), conclui-se que o tempo de gerao constante, pelo fato


de f.!m ser constante nesta fase.
Para certas bactrias o tempo de gerao relativamente curto, como no
caso da Escherichia coli, que pode apresentar um valor da ordem de 20 minutos na
temperatura de cultivo em 37C. Outras bactrias, do tipo termfilas, cultivadas a
55C, chegam a apresentar um tempo de gerao de cerca de 15 minutos.
Para as leveduras, o valor mnimo est compreendido entre 1,5 e 2 horas.
Uma interpretao para a existncia da fase logartmica ou exponencial de .
crescimento, apresentada no subitem 6.6.1.
Fase 4 - Conhecida como fase linear de crescimento, por apresentar a veloci-
dade de reproduo constante(rx = rk, na eq. 6.1). Essa fase pode ocorrer sem a pr-
via existncia da fase logartmica, como o caso de microrganismos filamentosos,
onde h limitao no transporte de nutrientes do meio para o interior da clula.
Integrando a referida equao a partir do incio dessa fase (de coordenadas
(te, Xc), Fig. 6.3) e um instante arbitrrio t, compreendido entre te e td, tein-se:
X t
f dX =rk. f dt (6.42)
X, t,
....____--:_ ----- ---- -- -- . ------------- -.--------------- - --- - - - -v--__:_---- -:-----:-- ---------- ___________ .: .. ---------- ----- "'7''''''' ' -- - - -- - -- - - - - -- - -- - - - - -------- --- -- - - - ---- ---- -- -
I06 Cintica de processos fermentrtivos

ou

(6.43)

Da equao 6.43, deduz-se que a concentrao celular X uma funo linear


do tempo de cultivo t (Fig. 6.3-A), justificando-se assim a denominao de cresci-
mento linear para esta fase.
Contrariamente fase exponencial antes comentada, a velocidade especfica
de crescimento no constante na fase linear, conforme se pode deduzir das equa-
es 6.6 e 6.43:

_!_ dX=~= rk o (6.44)


X dt X rk t+Xc -rk te

De acordo com essa equao, a velocidade especfica decresce com o aumen-


to da concentrao celular e, portanto, com o tempo t de cultivo.
A existncia do crescimento linear indica, conforme mencionado, a presena
de certas limitaes no transporte de nutrientes interface microrganismo-meio
como, por exemplo, com respeito ao oxignio dissolvido no meio.
REUSS e WAGNER10 verificaram que um aumento no coeficiente volumtri- -
co de transferncia do oxignio dissolvido, entre o meio e a citada interface, pro-
vocava o desaparecimento do crescimento linear.
Outro caso de limitao do transporte de nutrientes ao microrganismo ocor-
re quando este se desenvolve na forma de um biofilme, imobiliz~do na superfcie
da parede do reator, ou sobre partculas slidas em suspenso, empregadas como
suporte.
Modelos que interpretam o crescimento celular nesses _sistemas so encon-
trados na literatura.10

Fase 5 - Desacelerao. Devido ao esgotamento de um ou mais componentes
do meio de cultura, necessrios ao crescimento e, tambm, devido ao acmulo de
metablitos inibidores, ambas as velocidades (de crescimento, eq. 6.1 e especfica,
eq. 6.6) diminuem at se anularem, no tempo tf.
Durante essa fase, o tempo de gerao aumenta no decurso do cultivo, pois
nem todos os microrganismos se reproduzem em intervalos regulares de tempo.
Fase 6- Estacionria. Nessa fase, X atinge o valor mximo e constante Xm
(Fig. 6.3), onde h um balano entre a velocidade de crescimento e a velocidade de
morte do microrganismo, ocorrendo tambm modificaes na estrutura bioqumi-
ca da clula.
Fase 7- Declnio ou lise. O valor da conce;ntrao celular dimiimi a uma ve-
locidade que excede a velocidade de produo de clulas novas.
Pode-se observar, s vezes, entre a fase anterior e a de declnio, um perodo
de transio apresentando uma diminuio logartmica na referida concentrao. -
Ocorre, durante o declnio, uma "lise" celular, autlise ou rompimento dos
microrganismos, provocado pela ao de enzimas intracelulares.
_______ ______..
Classificao dos processos fermentativos I 07

6.5 - Classificao dos processos fermentativos


Os comportamentos relativos das funes J! = J!(t), fornecem a base para
uma importante classificao dos processos fermentativos proposta por GADEN 2
(subitem 6.2.2).
As Figuras 6.4, 6.5 e 6.6 representam, esquematicamente, a variao das ve-
locidades especficas para t;rs tipos caractersticos de fermentaes .
No primeiro caso (Fig. 6.4), as velocidades especficas de consumo de acar
(J!s) ~ a produo de etanol (J!p), apresentam perfis semelhantes, correlacionando-se
assim muito bem. A veloc;idade especfica de crescimento (J!x) do microrganismo
apresenta, aproximadamente, o andamento das outras duas curvas. Diz-se ento que
a formao de produto (o metablito primrio) est associada ao crescimento.
Essa configurao representa o caso em que o produto formado (o metabli- 1

to primrio) est diretamente ligado s reaes do catabolismo ou decomposio


do substrato (os acares).

Consumo de
acar
~

Crescimento

Tempo

Figura 6.4 - Variao das velocidades especficas em uma fermentao alcolica.

As produes de certas vitaminas e aminocidos tambm se enquadram nes-


se tipo de cintica de fermentao.
No segundo caso (Fig. 6.5), observam-se duas fases distintas: uma 1- fase,
onde a velocidade especfica de consumo do acar est diretamente relacionada
de crescimento do microrganismo, no havendo praticamente formao do produ-
t~ (cido ctrico); uma segunda fase, em que h unia boa semelhana entre os per-
fs das trs velocidades especficas e que portanto se correlacionam bem. Esse o
caso conhecido como formao do produto parcialmente associada ao cresCimen-
to; sua formao no est diretamente ligada ao caminho metablico produtor de
energ"ia.
L __ -------- ---------~-----'------- --------------------------- - - -- ---.---------------- ----- .--- . . ----- ------ -----
. I 08 Cintica de processos fermentativos

Produo
de cido
~
li=
uQ)
c.
C/)
Q)
/
Q)
-o
ro
-o
c:;
o
~

Tempo
Figura 6.5 - Variao das velocidades especficas em uma fermentao ctrica.

B
""'
'
Q)
o.
Ul
Q)
Q)
'C
. lll
'C

"
o
~

Tempo
Figura 6.6 - Variao das velocidades especficas em uma fermentao penicilnica. Curva I -produo de antibi-
tico; curva 2 - consumo de acar; curva 3 - consumo de oxignio; curva 4 - crescimento do microrganismo.

Alm da produo do cido Ctrico por fermentao, pode-se incluir a do ci-


do ltico comopertencente a este grupo.
Neste particular foi obtida uma expresso emprica por LUEDEKING; PI-
RET/7 que relaCionaram a velocidade especfica de formao do cido ltico (J..Lp),
-- -- -~-'--- ------- - ---- __ ,____ _ A
Classificao dos processos fermentativos I 09

com a velocidade especfica de crescimento do microrganismo (f.lx), na produo


descontnua desta substncia pelo Lactobacllus delbrueckii em pH consta_Iite, a sa-
ber: .

Jlp=aJ.lx+~ (6.45)

Essa equao, onde 0; e ~ so constantes empricas funes do pH, indica a


existncia de dois mecanismos de produo de cido ltico: um deles associado
reproduo de bactrias (representado pela parcela a f.l x) e outro independente
do crescimento do microrganismo (representado pelo termo~).
Finalmente, no terceiro caso, se enquadram as fermentaes complexas, aqui
exemplificadas pela produo de penicilina (Fig. 6.6). A mxima velocidade espe-
cfica de produo do antibitico ocorre quando as demais velocidades especfi-
cas, indicadas na Figura 6.6, sofreram uma reduo significativa. No comeo da
fermentao predominam transformaes produtoras de energia com formao de
biomassa, sendo que o antibitico formado quando o metabolismo oxidativo se
encontra atenuado.
Obviamente, nesse grupo de fermentaes no h uma associao clara en-
tre as referidas velocidades que permita estabelecer alguma relao cintica defi- I
!
nida, como no caso da eq. (6.45). O produto formado historicamente denomina- l
do como metablito secundrio.
Alm dos antibiticos, as toxinas microbianas pertencem a esse grupo.
importante frisar que esta classificao no enquadra, de um modo abso-
I
luto, um determinado processo fermehtativo em um dos trs grupos antes citados.
Como exemplo, merece ser comentado novamente o caso da fer~entao al-
colica onde, dependendo das condies de operao, a produo do etanol pode-
I ~ !

r no estar inteiramente associada reproduo do microrganismo e ao consumo !


~
de acar, enquadrando-se' assim no segundo caso 18 (Fig. 6.5) em vez de no prime- ~

!
iro (Fig. 6.4). !

Caso semelhante observado na produo do butanodiol por Klebsiella pneu-


moniae, em cultivo contnuo 19 a partir da glicose onde, dependendo do valor da ve-
locidade especfica de crescimento (abaixo ou acima de 0,18 h-l),o processo do
tipo inteiramente associado ao crescimento ou independente do mesmo, respecti-
vamente.
Outra classificao, baseada nas associaes entre formao do r,roduto com
mic~~mismos em reproduo ou no, devida a KONO; ASAI/0' 2 ' 22 que apre-
sentam tr~s grupos caractersticos:
processos em que a formao de produto est associada apenas ativida-
de de clulas em reproduo como, por exemplo, na produo de sorbose.
processos em que a formao de produto est associada atividade de to- !i
. '!
das as clulas, em reproduo ou no, citando-se como exemplo a produ-
o de cido ltico.
processos em que a formao de produto est associada apenas ativida-
de das clulas que no se reproduzem, como no caso da produo de ci-
do ctrico e novobiocina.

L __ ....... --- -------- -;-----------'-----.---- o ---;- - - -- - - - - - . - - - -- - - - - - - - -- - - - - - - - - - - ;


I IO Cintica de processos fermentativos .

6.6 - Influncia da concentrao do substrato sobre


a velocidade especfica de crescimento

6.6. I - A equao de Monod: interpretao da fase exponencial


de crescimento
A seguinte equao emprica, proposhipor MONOD/3 tem sido comumente
empregada para explicar a relao entre a concentrao S do substrato limitante
no meio, com a velocidade especfica ~xde reproduo do microrganismo:

. (6.46)

onde ~m representa a mxima velocidade especfica de crescimento ou reprodu-


o, e Ks a constante de saturao, cujo significado ser comentado a seguir.
Na Figura 6.7 est representada a eq. de Monod. O significado de Ks pode
ser deduzido fazendo-se S = Ks na eq. (6.46). Resulta imediatamente que: ~X =
~m/2, isto ~ a referida constante representa a concentrao do substrato na qual a
velocidade especfica de crescimento a metade do seu valor mximo.

~m ------- ---------- --- ------------------~ --- -

0,10

o~-.-.-.-.--.-+-.--.-.-.----
0 0,50 1,00
S(mg/L) .

Figura 6.7 - Equao 6.46 para Jlm = O, 14 h-1 e Ks = 0,60 mg/L (valores hipotticos).

Esta condio est assinalada na Figura 6.7 onde, para Ks = 0,60 mg/L,
tem-se ~X= ~m/2 = 0,07 h~l.
A expresso de Monod formalmente igual expresso de Michae-
lis-Menten (captulo 7, volume 1).
No incio do cultivo, onde S alto, o microrganismo apresenta uma velo-
cidade especfica prxima mxima, podendo a mesma situar-se nesta regio
durante uma boa parte do processo, mesmo que o metabolismo celular provoque
uma diminuio aprecivel no valor de S.
li
I

Influncia da concentrao do substrato sobre a velocidade especfica de crescimento III

. Quanto menor for o valor da constante de saturao K5, tanto mais amplo
ser este " patamar" quase horizontal da curva e que se encontrar mais prximo
do valor de J.lm, conforme ilustra a Figura 6.8 (curva A).
Embora, a rigor, pela equao 6.46, nunca seja atingido o valor de J.lm, por
mais alta que seja a concentrao inicial S, na prtica, os valores experimentais po-
dem ser considerados como tal, tendo em vista os erros que afetam os valores cal-
. culados da velocidade espe.cfica de crescimento. 15' 16 . .

Nessas circunstncias, a curva apresentada pela velocidade especfica de


crescimento em funo do tempo (Figura 6.9), poder apresentar um trecho mxi-
mo constante (AB), aps um curto perodo inicial de transio ou adaptao do
microrganismo ao meio.
Essa fase inicial do crescimento (O a 4 horas, Fig. 6.9), corresponde fase 1
("lag") e fase 2 (de transio) da Figura 6.3, no previstas pela expresso de Monod.
A citada expresso (6.46) considera J.lx elevado e prximo do valor mximo,
logo que o microrganismo colocado na presena de um meio, com uma concen-
traap inicial de substrato relativamente elevada. O microrganismo , nessas cir-
cunstncias, considerado adaptado.
Uma baixa constante de saturao K5 implica em uma maior durao da fase
exponencial, conforme ilustra a Figura 6.8: para Ks = 0,60 mg/L, os valores de J.lx
logo se distanciam de J.lm, medida que o substrato vai sendo consumido; para K5
= 0,030 mg/L, J.lx praticamente igual J.lm para uma mesma variao de S (entre
1,20 e 0,50 mg/1).
Assim, a durao do "patamar" AB (Fig.-6.9), depender da magnitude desta
constante de saturao,

---- ---- ---- -------- ----- -- ------- -- -- ----- ------ -- --


A

0,10

~mn- --- ---------- --- -- -- -:

'
'
o ~~~~r-.-.--.-+-.,-.-.--.-.-.--.-~
.: Kss
o 0,50 1,00
S(mg/L)

. Figura 6.8 - Equao 6.46 para os valores hipotticos de: Jlm =O, 14 h- 1, K5 = 0,60 mg/l. (curva 8), Ks 0,030 =
mg/l.(curva A).
- --- -- -------- . - __ __ L
I 12 Cintica de processos fermentativos.

tg
A B (h)

0,10 50

O~o--T-.;--.-l~O
o 4 8 12
t (h)

Figura 6.9 - Variao da velocidade especfica de crescimento (J..lx) e do tempo de gerao (tg),
no cultivo descontnuo.

6.6.2 - Outros modelos


A expresso de Monod (eq. 6.46) um modelo que no leva em conta o efei-
to inibidor, tanto pelo substrato como pelo produto formado. Essa, porm, no
a nica interpretao referente a uma tal condio ideal de cultivo.
Outras equaes foram propostas 10 e que merecem ser citadas:

equao de Teissier (6.47)

Moser (6.48)

Contois e Fujimoto (6.48)

Powell
s
Jlx =Jlm - - - - - - (6.50)
, (Ks +K 0 )+S

H pelo menos mais seis outras expresses, propostas por outros autores,
tambm citadas na mesma referncia 10 e que no levam em conta o fenmeno da
inibio.
A ausncia da inibio , na verdade, uma situao pouco comum na prti-
ca, principalmente durante um cultivo descontnuo, onde h um crescente acmu-
lo de metablitos que acabam interferindo desfavoravelmente sobre o metabolis-
mo e crescimento microbianos.
O problema poderia ser atenuado se fosse, por exemplo, utilizado um valor
inicial relativamente baixo da concentrao de substrato e que assim resultasse em
baixas concentraes de produtos inibidores.
Influncia da concentrao do substrato sobre a velocidade especfica de crescimento I 13

Essa , entretanto, uma alternativa pouco interessante do ponto de vista in-


dustrial, onde baixas concentraes de produtos acarretariam custos elevados, na
fase posterior de separao e purificao da substncia de interesse.
Nessas circunstncias, a inibio pelo substrato um fenmeno que no
pode ser ignorado.
O efeito do substrato se manifesta quando um valor alto da concentrao
inicial S pode, ao invs de proximar flx de flm (como nas Figs. 6.7 e 6.8 ), provocar
um efeito contrrio, ocasionando uma inibio no crescimento celular. 1!
Este fenmeno est ilustrado na Figura 6.10, onde se pode verificar que a ex-
presso de Monod (eq. 6.46) somente se aplica para valores relativamente baixos
de S, menores ou iguais a K 5 . Acima deste, onde a inibio pelo substrato se mani-
f~s~, a curva tende para flm at um certo valor de S, para depois se afastar, a par-
tu .deste valor.

,....m - - - - - :... =- -=- --- -

IA-m __ __ --------------
2

ks ..J k~ . kl,s k.s S


Figura 6.10 - Cintica de inibio pelo substrato (curva A) e sem inibio(---; eq. 6.46).

Com o objetivo de explicar essa reduo na velocidade especfica de cresci-


mento (!lx), provocada pelos altos valores iniciais da concentrao de substrato
(S), uma modificao na expresso de Monod (eq. 6.46), foi proposta:10

S KI,s
(6 .51)
flx =flm. Ks +S KI,S +S

Nessa nova expresso, que traduz o andamento da curva A (Fig. 6.10), K 5 a


constante de saturao definida pela eq. (6.46).
K1 5 , por outro lado, a constante de inibio pelo substrato que se refere,
como K~, ao valor de S para o qual flx = flm/2, porm para um valor de S que pro-
voque a inibio, sendo assim superior ao correspondenteS da equao de Monod.
Para uma melho; compreenso da influncia do valor de K1,5 sobre o efeito
inibidor do substrato, oportuno analisar o fator K1,5 / (K1,5 + S), da equao 6.51
sob a forma:

1 (6.52)
s
1+ - -
Kr ,s
----=---~-----:- ___ .. _____ __ __,_
lior.......___ ____............ , _____ ___________
I 14 Cintica de processos ferrnentativos

Se K1,s >> S, ento: SI K 1,s =O e a equao anterior se reduz unidade. Con-


seqentemente a eq. 6.51 se transforma na 6.46, no existindo assim o efeito inibi-
dor do substrato sobre o crescimento.
Em outras palavras, um valor relativamente alto dessa constante (K1,5 ) re-
quer igualmente valores muito altos de S para que o efeito inibidor se manifeste
(eq. 6.52, menor do que um), ou seja, a inibio pelo substrato poder ser pouco
pronunciada. Inversamente, valores baixos de K1,5, representam um substrato
muito inibidor perante uma dada espcie de microrganismo.
Quanto inibio pelo produto, um equacionamento semelhante foi realiza-
do por JERUSALIMSKY e NERONOV A: 10 .

s Kl,P
(6.53)
f.lx =f.lm. K +S Kl,P +P
5

sendo que as consideraes prvias, referentes eq. (6.52), tambm se aplicam


nesta expresso, mas levando em conta unicamente o efeito inibidor pelo produto,
representado pela sua concentrao P, n,o meio. Mais informaes sobre as expres-
ses (6.51) e (6.53), assim como outros modelos de inibio, podero ser encontra-
dos na literatura. 10

Agradecimentos
O autor agradece aoEngenheiro (Mestre em Engenharia Qumica) Andreas
Karoly Gombert pela elaborao do Apndice e Engenheira (Mestre em Enge-
nharia Qumica) Jlia Baruque Ramos, pelo trabalho de datilografia.

Apndice Andreas Karoly Gombert

. Para ilustrar uma forma bastante prtica e simples de calcular velocidades


especficas a partir de dados experimentais de cultivos de clulas, ser apresen-
tada uma planilha em Microsoft Excel que contm as equaes do mtodo geo-
mtrico de clculo de derivadas proposto por LE DUY; ZAJIC. 8 O objetivo no
apresentar detalhes sobre esse mtodo, mas apenas ilustrar como o mesmo pode
ser utilizado; para obter detalhes do mtodo, sugere-se consultar a referncia
original.
Apndice I I5
I
I;

A) Apresentao da planilha
No artigo original escrito por LE DUY; ZAJIC,8 apresentada uma sub-rotina
em Fortran para o clculo de velocidades especficas. No entanto, em funo da fa- I
cilidade e praticidade no uso de planilhas eletrnicas, como o caso do Microsoft
Excel, torna-se bem mais simples calcular velocidades especficas lanando mo
--~deste tipo de planilha. No Quadro 6.1, so apresentadas as equaes de uma plani-
, lha que executa o clculo de velocidades especficas.
Alguns cuidados devem ser tomados para o bom funcionamento da planilha:
1) A primeira linha de equaes diferente das outras. A partir da segunda linha
de equaes, existe repetio das mesmas. Portanto, basta copiar a segunda li-
nha de equaes para o nmero de linhas que forem necessrias ao nmero de
dados de entrada disponveis.
2) Deve-se manter uma linha em branco aps a ltima linha de entrada de dados,
sendo esta a forma utilizada pela planilha para que possa ser calculada aderi-
vada no ltimo ponto.
3) A coluna B dever conter sempre dados de concentrao celular. A coluna C
poder conter dados de concentrao celular, caso se deseje calculara veloci-
dade especfica de crescimento; dados de concentrao de substrato, caso se
deseje calcular a velocidade especfica de consumo de substrato; dados de con-
centrao de produto, caso se deseje calcular a velocidade especfica de forma-
o deste produto.
4) Aps a entrada das equaes (conforme Quadro 6.1), pode-se iniciar a utiliza-
o da planilha, devendo-se utilizar apenas as colunas A, B e C para entrada de
dados numricos. A velocidade especfica para cada instante aparecer auto-
maticamente na coluna E.
5) Os dados de f.ls aparecero com sinal negativo na planilha, por causa do sinal
negativo da derivada dS I dt. No entanto, como 1-ls deve assumir valores positi-
vos, deve-se fazer a correo necessria, multiplicando-se os valores obtidos
na plri~lha por -1.

Sugere-se acompanhar o seguinte exemplo de caso para verificar o bom fun-


cionamento da planilha.

B) Exemplo de caso: dados de um cultivo descntnuo de Saccharomyces cerevisiae


Na Tabela 6.1 so apresentados os dados de concentrao celular, de subs-
trato e de produto obtidos num cultivo descontnuo de Saccharomyces cerevisiae.24
Esses dados, obtidos ao longo do cultivo a cada 4 horas e sujeitos a alguma flutua-
o experimental, devem ser ajustados a uma tendncia que represente bem o fe-
nmeno em questo, ajuste este que pode ser denominado "alisamento". O
alisamento dos pontos experimentais, que pode ser realizado por ajuste manual
em papel milimetrado ou pelo ajuste por uma ou mais equaes polinomiais, deve
ser feito anteriormente ao clculo das velocidades especficas de crescimento, de
consumo de substrato e de formao de produto. Os dados resultantes do alisa-
mento dos pontos apresentados na Tabela 6.1 encontram-se na.Tabela 6.2 (no caso,
foi feito um ajuste por polinmios de 4. o grau) .
l
I 16 Cintica de processos fermentativos

Tabela 6 ..1 - Dados experimentais de um cultivo descontnuo de S. cerevisiae. 24

Tempo (h) X (g/L) S (g/L) P(gtp

o 0,91 106,9 0,0 I ~


4 0,91 106,9 0,0
~~
8 1,61 96,8 6,2 i~f~~ '
1

12 2,42 83,6 15,0


:~

~
16 3,59 59,9 23,5
..
20 4,71 31,6 34,3 '

'lfij
24 5,51 10,6 42,2 .....
~-.,

28 5,56 7,0 42,8


~
, "''~\.:~/~. ,. --.. ,, . ::., . .... ~ \'{\~t~~;
~~.f J' tfj ' .
~':/.~~,;-~: K6' .....}~ .,. ~~ -;.-i-j_..,..!/.!,.\..-.:;:sy:,r. .. L~ ._...,.,.._.f~l.o~":
.:,\ . ' '".. . . . ... ' . . ~
'C.
;
'.ut'-l~J.-
;r, ... ~l
'.,.
'""

Tabela 6.2 - Dados resultantes do alisamento de dados experimentais de um cultivo descontnuo


de S. cerevisiae (ver Tabela 6. 1).

Tempo (h) X (g/L) S (g/L) .P (g/L) Tempo (h) X (g/L) S (g/L) p (g/L)

o 0,89 106,9 0,00 15 3,31 65,7 21 ,8

1 0,89 106,9 0,00 16 3,60 59,2 24,4

2 0,89 106,9 0,00 17 3,89 52,5 27,0

3 0,91 106,3 0,04 18 4,18 45,7 29,6

4 0,97 105,6 0,68 19 4,45 38,9 32,1



5 1,07 104,6 1,59 20 4,71 32,2 34,4

6 1,19 103,1 2,76 21 4,95 25,9 36,6

7 1,35 101,1 4,17 22 5,17 20,0 38,6

8 1,52 98,6 5,80 23 5,35 14,8 40,3

9 1,73 95,6 7,65 24 5,49 10,5 41,7

10 1,95 91,9 9,68 25 5,57 7,4 42,7.

11 2,20 87,7 11,9 26 5,57 7,0 42,8

12 2,46 82,9 14,2 27 5,57 7,0 42,8

13 2,73 77,6 16,7 28 5,57 7,0 42,8

14 3,01 71,9 19,2


Apndice I 17

importante observar que o intervalo de tempo entre dois pontos consecuti-


~ vos resultantes do alisamento, os quais sero utilizados no clculo das_velocida-
/ -
des especficas, deve ser adequado ao caso em estudo. No presente exemplo,
foram utilizados dados de 1 em 1 hora, pois verificou-se que este intervalo sufi-
ciente para que fossem obtidas boas curvas de velocidades especficas.
Utilizando os dados da Tabela 6.2 para o clculo de velocidades especficas,
obtm-se os dados constarites da Tabela 6.3. Para ilustrar o aspecto da planilha no
momento de sua utilizao, apresentado no Quadro 6.2 o clculo das velocida-
des especficas de crescimento (dados de concentrao celular na coluna C) .

Tabela 6.3 - Velocidades especficas de um cultivo descontnuo de S. cerevisiae .

Tempo (h) J.lx (h- 1) J.ls (h-1) J.lp (h-1) Tempo (h) J.lx (h-1) J.ls (h-1) J.lp (h-1)

o 0,00 0,00 0,00 15 0;09 1,92 0,79 1 ;~5j~


1 0,00 0,11 0,00 16 0,08 1,83 0,72

2 0,01 0,33 0,02 17 0,07 1,74 0,67

3 0,04 0,58 0,32 18 0,07 1,63 0,61 :_:>;:

4 0,08 0,85 0,78 19 0,06 1,52 0,54

5 0,10 1,11 0,96 20 0,05 . 1,38 0,48

6 - 0,12 1,43 1,07 21 0,05 1,23 0,42


i<
\
..
-
7 0,12 1,63 1,12 22 0,04 1,07 0,35
:' ;
8 0,12 1,78 1,14 23 0,03 0,87 0,29

10
0,12

0,12
1,90

2,01
1,12

1,09
24

25
0,02

0,01
0,64

0,12
0,21

0,07
.~
11 0,12 2,03 1,03 26 0,00 0,03 0,01
~
12 0,11 2,04 0,97 27 0,00 0,00 0,00 .$'

13 0,10 2,01 0,92 28 0,00 0,00 0,00 f\t


.,

14 0,10 1,97 0,85


. ,, .. { ; ' 4 ,;. ,; . - ;J'{. ~~ : ht., ~.-~."''"...ti'~\#~- ' :. -: ~- --..-~--.J;..,J.''
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j
. . --.
.
----- -- ----
I!
i
118 Cintica de processos fermentativos

Quadro 6.1 - Organizao da planilha para clculo de uma determinada velocidaae especfica
(observe tambm o Quadro 6.2).
A) Para deixar um espao razovel para a caracterizao dos clculos que sero efetuados, imagina-se a entrada
de dados a partir da linha 8 da planilha:

Clula da Planilha Dados de entrada Tipo

tempo (h) ''


},Q:
A8 texto
:~
~
88 X (g/L) texto '[{'\
~
C8 M (g/L) texto ~-
'4

. .
D8 dM/dt texto ~-&

E8 texto IJ~
1-LM --
-~
-,~
.~
F8 i texto
"'
G8 mAB texto -~
'1
H8 mBC texto
:'#_.;
18 dCX texto ~
.\1

J8 mNO
lr----------------,r---------------~----------------~~~
texto ~
K8 nNO texto lj;
~--------------~r---------------_,----------------~

__o______,_______te_x_to_______
lr-------1_8______-+______m_M ll~
M8 nMO
~~-----N-8------+------t-(c-)------~----t-ex_t_o----~i
texto t,
08 cxcr texto ,~
lr-------------~---------------+--------"----__,1~ __
P8 dX/dt texto ~

B) Para os clculos relativos ao primeiro ponto, o mtodo obtm a derivada traando uma reta entre o segundo
e o primeiro ponto, devendo-se, portanto, entrar com os seguintes dados na linha 9:

Clula da
Dados de entrada Tipo
Planilha

A9 tempo inicial nmero

89 concentrao celular inicial nmero

C9 concentrao inicial do composto M nmero

09 = +(ClO - C9) I (AlO - A9) equao

E9 = +09/89 equao

F9 1 nmero
Apndice I 19

C) Para os demais pontos, o clculo feito atravs das equaes abaixo (esto indicadas as entradas da linha I0).
Quando da utilizao da planilha, aps a entrada dos dados numricos (resultantes do alisamento) nas colunas
1 , A, B e C, deve-se preencher as colunas D a P copiando as clulas da linha IOat a ltima linha de entrada de
dados:

Clula da
Dados de entrada Tipo
Planilha

AlO segundo dado de tempo nmero

BlO segundo dado de cone. celular nmero

C lO segundo dado de cone. do composto M nmero

010 =SE (ABS (GlO-HlO) <=0,001 ; IlO;PlO) equao

ElO =+DlOIBlO equao

FlO =+F9+1 equao

GlO =+ (Cl0-C9) I (A10-A9) equao

H lO =+ (Cll-ClO) I (All-AlO) equao

110 =SE (A11<>0;0,5* (GlO+HlO); (Cl0-C9) I (Al0-A9)) equao

JlO =SE ( (Cll-Cl0)<>0; (AlO-All) I (Cll-ClO) ;99000000000) equao

KlO =0,5* (ClO+Cll)- (Jl0*0,5* (Al0+Al1) ) equao

LlO =SE ( (Cl0-C9) <>0; (A9-Al0) I (Cl0-C9) ; 99000000000) equao

MlO =0,5* (C9+Cl0)- (L10*0,5* (A9+Al0) ) equao

NlO = (KlO-MlO) / (LlO-JlO) equao

010 =+LlO*NlO+MlO equao

PlO =SE (All<>O; (NlO-AlO) I (Cl0-010); (C10-C9) I (Al0-A9)) equao

'I

~
......_ _____ -
ii, . - --- . -- - --------- ---------- ----- - ---------- --- -----------
. .. -- - ---
Quadro 6.2 Exemplo de clculo de velocidade especfica de crescimento para dados de um cultivo
de S. cerevisiae.

A B c I D I E F G H I I L K L M I N o p
1 Planilha para o clculo de velocidades especficas pelo mtodo proposto por LE DUY; ZAJIC8
2 I I
3 Exemplo de aplicao; dados de um cultivo descontnuo de S. cerevisiae
4 I
5 Entrar somente com os dados de temp_o (coluna A), de concentrao celular (coluna B) e de concentrao do comp_osto M
6 (clulas, substrato ou produto), cuja velocidade especfica de consumo ou de produo se desea determinar (coluna C):
7
8 tempo (h) X(g/L) M(g / L) dM/ dt 11m i mAB mBC dCX mNO nNO mMO nMO t(c) exc r dX / dt
9 o 0,89 0,89 0,00 0,00 . 1
10 1 0,89 0,89 0,00 0,00 2 0,00 0,00 0,00 1E+11 -1E+11 1E+11 -5E+10 #DIV /0! #DIV / 0! #DIV / 0!
11 2 0,89 0,89 0,01 0,01 3 0,00 0,02 0,01 -50,00 125,90 1E+11 -1E+11 1,50 50,90 0,01
12 3 0,91 0,91 0,04 0,04 4 0,02 0,06 0,04 -16,67 59,27 -50,00 125,90 2,00 25,96 0,04
13 4 0,97 0,97 0,08 0,08 5 0,06 0,10 0,08 -10,00 46,02 -16,67 59,27 1,99 26,!'4 0,08
14 5 1,07 1,07 0,11 0,10 6 0,10 0,12 0,11 -8,33 46,96 -10,00 46,02 -{),57 51,68 0,11
15 6 1,19 1,19 0,14 0,12 7 0,12 0,16 0,14 -6,25 41,90 -8,33 46,96 2,43 26,69 0,14
16 7 1,35 1,35 0,16 0,12 8 0,16 0,17 0,17 -5,88 45,55 -6,25 41,90 -9,95 104,08 0,16
17 8 1,52 1,52 0,19 0,12 9 0,17 0,21 0,19 -4,76 42,10 -5,88 45,55 3,08 27,43 0,19
18 9 1,73 1,73 0,21 0,12 10 0,21 0,22 0,22 -4,55 45,02 -4,76 42,10 -13,49 106,36 0,21
19 10 1,95 1,95 0,23 0,12 11 0,22 0,25 0,24 -4,00 44,08 -4,55 45,02 1,74 37,13 0,23
20 11 2,20 2,20 0,25 0,12 12 0,25 0,26 0,26 -3,85 46,56 -4,00 44,08 -16,16 108,71 0,25
21 12 2,46 2,46 0,26 0,11 13 0,26 0,27 0,27 -3,70 48,89 -3,85 46,56 -16,36 109,48 0,26
22 13 2,73 2,73 0,27 0,10 14 0,27 0,28 0,28 -3,57 51,08 -3,70 48,89 -16,58 110,30 0,27
23 14 3,01 3,01 0,29 0,10 15 0)8 0,30 0,29 -3,33 51,49 -3,57 51,08 -1,72 57,22 0,29
24 15 3,31 3,31 0,29 0,09 16 0,30 0,29 0,30 -3,45 56,90 -3,33 51,49 47,07 -105,39

- -
0,29
25 16 3,60 3,60 0,29 0,08 17 0,29 0,29 0,29 -3,45 60,64 -3,45 56,90 #DIV / 0! #DIV / 0! #DIV / 0!
26 17 3,89 3,89 0,29 0,07 18 0,29 0,29 0,29 -3,45 64,38 -3,45 60,64 0,29
27 18 4,18 4,18 0,28 0,07 19 0,29 0,27 0,28 -3,70 72,83 -3,45 64,38 33,10 -49,75 0,28
28 19 4,45 4,45 0,26 0,06
.. .... . 20 0,27 0,26 0,27 -3,85 79,58 -3,70 72,83 47,36 -102,57 0,26
29 20 4,71 4,71 0,25 0,05 2L 0,26 0,24 0,25 -4,17 90,25 -3,85 79,58 33,28 -48,42 0,25
30 21 4,95 4,95 0,23 0,05 22 o,24 0,22 0,23 -4,55 102,79 -4,17 90,25 33,11 -47,70 0,23
31 22 5,17 5,17 0,202 0,04 23 0,22 0,18 0,20 -5,56 130,26 -4,55 102,79 27,20 -20,84 0,20
32 . 23 5,35 5,35 0,16 0,03 24 0,18 0,14 0,16 -7,14 173,28 -5,56 130,26 27,10 -20,30 0,16
33 24 5,49 5,49 0,11 0,02 .. 25 0,14 0,08 0,11 -12,50 311 ,78 -7,14 173,28 25,85 -11,39 0,11
34 25 5,57 5,57 0,04 0,01 26 0,08 0,00 0,04 1E+11 -3E+12 -12,50 311,78 25,50 -6,97 0,04
35 26 5,57 5,57 0,00 0,00 27 0,00 0,00 0,00 lE+ll -3E+12 lE+ll -3E+12 IIDlV / 01 IIDIV / 0! IIDIV/01
36 27 5,57 5,57 0,00 0,00 28 0,00 0,00 0,00 1E+11 -3E+12 1E+11 -3E+12 #DIV / 0! IIDIV / 0! #DIV/01
37 28 5,57 5,57 0,00 0,00 29 0,00 0,20 0,00 -5,03 73,16 1E+11 -3E+12 27,50 -65,08 0,00

l
Referncias bibliogrficas 121

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123
I -

Antonio Bonomi
Willibaldo Schmidell

7 .I - Introduo
Apesar de a engenharia bioqumica compreender diferentes tipos de proces-
sos, englobando transporte de calor e massa e recuperao de produtos, incluindo
vrios constituintes e fenmenos dominantes, _a pesquisa em modelagem matem-
tica reportada na literatura tcnica especializada refere-se basicamente s reaes
biolgicas e, recentemente, s reaes que ocorrem no interior das clulas. Dessa
forma, a modelagem matemtica de processos fermentativos pode ser definida
como a tentativa de representar, atravs de equaes matemticas, os balanos de
massa para cada componente no biorreator, associados s complexas transforma-
es bioqumicas que ocorrem no processo e s velocidades com que essas trans-
formaes se processam. Em razo da complexidade do processo real (que envolve
leis fsico-qumicas, bioqumicas e genticas), somad s limitaes matemticas, os
modelos so baseados, geralmente, na idealidade e, em geral, fornecem uma repre-
1
sentao fiel de apenas algumas das propriedades do processo. A formulao de
um modelo matemtico deve, segundo os autores, possuir um comprom~timento
entre grau de complexidade razovel e soluo (esforo computacional) economi-
camente desejvel. Por sua vez, a simulao do processo corresponde sua an-
lise (por exemplo, s':la otimizao) atravs da utilizao do modelo matemtico
proposto.
Do ponto de vista da engenharia bioqumica, o desenvolvimento da mo-
delagem matemtica dos processos fermentativos permite atingir, entre ou-
tros, os seguintes objetivos: organizar informaes desconexas a respeito dos
fenmenos biolgicos num conjunto coerente; pensar (e calcular) logicamente
a respeito de quais componentes e interaes so importantes num sistema
complexo; descobrir novas estratgias para explicar b comportamento das c-
lulas submetidas a determinados ambientes; corrigir falhas eventualmente
124 Modelagem matemtica e simulao de proc~ssos fermentativos

existentes no entendimento convencionado de determinados fenmenos e, fi-


nalmente, entender as caractersticas qualitativamente essenciais de determi-
nados processos. 2
O objetivo principal da modelagem matemtica e simulao, como ferra-
menta do desenvolvimento tecnolgico de processos fermentativos, prever o
comportamento dinmico e estacionrio do processo, inclusive em condies no
testadas empiricamente, possibilitando a determinao das condies operacio-
nais economicamente timas do sistema, auxiliando no projeto e ajuste de algorit-
mos de controle, no qual o modelo matemtico formulado passa a ser parte
integrante do mesmo. 3
Os processos fermentativos incorporam uma srie de caractersticas que os
diferenciam dos processos qumicos, o que pode explicar as dificuldades encontra-
das na formulao de modelos matemticos que representem adequadamente es-
tes processos, ao contrrio do que ocorre com os processos qumicos
convencionais. Entre essas caractersticas podem ser citadas as seguintes: baixas
concentraes e baixas velocidades de reao, como resultado da utilizao de um
meio diludo; complexidade da mistura reagente e capacidade do sistema (clulas
microbianas) de sintetizar seu prprio catalisador; conhecimento insuficiente de
vrios dos fenmenos limitantes das velocidades de produo e falta de sensores
para automao on-line; problemas de esterilidade, segurana e eventualmente da
toxicidade dos processos fermentativos. 4
Neste captulo sero apresentados os principais tipos de modelos empre-
gados para representar os processos fermentativos, destacat:tdo as estratgias
empregadas na formulao dos modelos matemticos conhecidos como feno-
menolgicos, no estruturados, bem como as metodologias utilizadas no ajuste
desses modelos a um conjunto de experimentos realizados. Posteriormente, se-

. .
ro introduzidas e aplicadas tcnicas estatsticas, que permitem discriminar di-
versos modelos ajustados, definindo sua validade. Finalmente, ser discutida
brevemente a utilizao dos modelos matemticos visando otimizar um proces-
so, atravs da definio de uma funo objetivo e o emprego de diversas tcni-
cas de otimizao.

~ 7.2 - Formulao dos modelos matemticos de processos


fermentativos
Inicialmente, deve-se reconhecer que, num processo fermentativo, esto en-
volvidos dois sistemas que interagem continuamente: a fase biolgica (ou bitica)
composta pela populao microbiana ou pela cultura de clulas animais ou vege-
tais e a fase ambiental (ou abitica) ou o meio de cultura, como comumente co-
nhecido e que contm os substratos e produtos do processo. A Figura 7.1 resume
os principais parmetros, fenmenos e interaes que influenciam o comporta-
mento cintico de uma populao microbiana ou de clulas na presena do seu
meio de cultura. 5
Fonnulao dos modelos matemticos de processos fennentativos 125

AMBIENTE POPULAO
(meio de cultura) (clulas)

Multicomponentes

Reaes em soluo
Nutrientes/Substratos
.. Multicomponentes

Heterogeneidade entre
clulas
Equilbrio inico Produtos M ultirreaes

pH, T, ... variveis Controle interno

Propriedades reolgicas Calor Adaptabilidade


variveis (viscosidade)

Sistema multifase (G-L;


L-L; G-L-L; G-L-S) Sistema estocstico
Interaes Mecnicas
No uniformidade Variaes genticas

Figura 7 .I - Esquema das principais caractersticas da interao populao microbiana/clulas animais ou vegetais
e o meio de cultura.

As clulas consomem nutrientes e convertem substratos do ambiente em


produtos. As clulas geram calor, que dissipado para o meio e, em contraparti-
da, a temperatura do meio define a temperatura das clulas. Interaes mecnicas
ocorrem atravs de presso hidrosttica, de efeitos do fluxo do meio para as clu-
las, de choque entre partculas (clulas ancoradas em suportes) e de mudanas na
viscosidade do meio em funo do acmulo de cl4las e de produtos metablicos.
H .que se considerar ainda que as caractersticas de operao do processo
fermentativo empregado, tais como:
batelada, contnuo, batelada alimentada, etc.;
submerso e semi-slido;
alta densidade celular (reciclo, imobilizao de clulas, etc.);
entre outras, permitem interferir na relao populao microbiana - ambiente, no
sentido de controlar e, se possvel, aumentar as velocidades e os rendimentos des-
ta interao.
Pelo exposto, fica claro que num desenvolvimento de processo, quando se
utilizam as tcnicas de modelagem matemtica e simulao para o projeto e di-
mensionamento de biorreatores otimizados, dever-se- analisar, da forma mais
abrangente e integrada possvel, os principais fenmenos que caracterizam as in-
teraes populao microbiana- meio ambiente- tipo de processo fermentati-
vo. A seguir listamos alguns desses fenmenos caractersticos:
126 Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

influncia da "histria" da populao microbiana no processo (fase lag e


de adaptao, mutaes, perda de viabilidade, etc~);
influncia da composio do meio de cultivo nas velocidades de cresci-
mento ou de produo da populao microbiana (um nico ou mltiplos
substratos limitantes, substratos inibitrios, substratos que provocam os
fenmenos de induo e represso, etc.);
consumo de substratos para crescimento e tambm, na maioria dos casos,
para manuteno da vjabilidade celular;
gerao de produtos associada ou no ao crescimento celular;
transferncia de substratos do meio para o interior das clulas e de produ-
tos da clula para o meio;
velocidades de respirao em processos aerbios (transferncia de oxi-
gnio da fase gasosa para a fase lquida atravs da agitao e aerao
do biorreator);
tipo de processo (submerso ou semi-slido, batelada ou batelada alimen-
tada ou contnuo, com e sem reciclo, clulas imobilizadas ou livres, uma
ou mltiplas fases de processo, etc.);
influncia de variveis fsico-qumicas no processo (temperatura~ pH,
presso interna do biorreator, viscosidade, densidade, umidade do meio
de cultivo, umidade relativa do ar, etc.);
influncia das variaes na sntese dos componentes celulares- necessida-
de de incluir "estrutura" nos modelos matemticos dos processos;
homogeneidade ou heterogeneidade do processo;
influncia das condies operacionais na morfologia da populao micro-
biana.
Admite-se, idealmente, que a modelagem de uma fermentao deveria pre-
dizer o r~sultado das milhares de transformaes qumicas que ocorrem pela
ao de uma populao microbiana, ou de uma cultura de clulas animais ou ve-
getais. Sem dvida, uma descrio completa de todas as vias e intera~es meta-
blicas pertinentes ao desenvolvimento microbiano seria extremamente comple-
xa e mesmo impossvel. Felizmente, sabe-se que, ao menos na rea das cincias
exatas, muitos problemas podem ser estudados usando uma mdia das vrias
propriedades das diversas entidades em questo. Nesse sentido, importante
lembrar que o modelo ainda pode ser vlido se somente um nmero limitado de
mecanismos governantes so considerados em detalhe. Portanto, na elaborao .
de modelos de processos fermentativos so, geralmente, introduzidas simplifica-
es, de maneira a se obter modelos passveis de serem manuseados e generali-
zados.6

7.2.1 - Classificao dos modelos matemticos de processos


fermentativos
Vrios autores apresentam classificaes para os diversos tipos de modelos
comumente usados em engenharia bioqumica. 5' 6' 7 Iniciaremos essa ~lassificao
pela definio de dois grandes grupos de modelos matemticos de processos fer-
mentativos, definidos a seguir.
Formulao dos modelos matemticos de processos fermentativos 127

Modelos fenomenolgicos: baseiam-se na formulao de hipteses e correla-


es tericas ou empricas para explicar os fenmenos e o comportamento das va-
riveis do processo observados experimentalmente;
Modelos entrada-sada: estabelecem relaes empricas para correlacionar o
efeito de lr'ariaes nas variveis de entrada ou manipulveis (caso, por exemplo,
das concentraes iniciais em sistemas operados em batelada ou das concentra-
es e vazes de alimenta~o nos sistemas operados de forma contnua) nos valo-
res das variveis de sada ou medidas do processo (caso do perfil de
concentraes possveis de serem medidas no interior do biotreator, ou no seu
efluente, ao longo do tempo).

7.2.1.1. Modelos fenomenolgicos


Um modelo fenomenolgico constitudo por um conjunto de relaes ma-
temticas entre as variveis de interesse do sistema em estudo.
desejvel que os modelos sejam, na medida do possvel, fundamentais, ou
seja, baseados nas equaes de conservao de massa, energia e quantidade de mo-
vimento e em princpios fsico-qumicos, uma vez que isto confere maior confiana
em interpolaes e extrapolaes, quando comparado com modelos puramente
empricos. Entretanto, mesmo em modelos fundamentais, freqente que o clcu-
lo de um ou mais parmetros seja baseado em equaes empricas. .
Na formulao de um modelo matemtico fenomenolgico convencional
so, normalmente, utilizadas equaes que podem ser classificadas em:
equaes de balano ou de conservao (de massa, energia, quantidade de
movimento), baseadas em princpios fsico-qumicos fl;lndamentais;
equaes de velocidade, que podem ser: (a) equaes' de velocidade de
transporte de massa, energia e componentes ou espcies qumicas, atravs
das fronteiras do 's istema considerado ou (b) equaes de velocidade de
gerao ou consumo de espcies dentro do sistema; as equaes de veloci-
dade so normalmente equaes empricas, construdas a partir do conhe-
cimento advindo de ensaios realizados no laboratrio;
equaes termodinmicas, que relacionam propriedades termodinmicas
do sistema (presso, temperatura, densidade, concentrao), por exemplo,
equaes de estado e relaes de equilbrio termodinmico (como o caso
da lei de Henry para transferncia de oxignio da fase gasosa para a fase
lquida).
Enquanto as equaes de balano, de velocidade de transporte e termodin-
micas so passveis de pdronizao atravs de estudos tericos de fenmenos de
transporte e termodinmica aplicados h dcadas na engenharia qumica, as equa-
es de velocidade de transformao, ou equaes cinticas, so especficas para
os processos fermentativos e constituem os chamados modelos cinticos.
Freqentemente, em processos com clulas livres; as informaes sobre a ci-
ntica de fermentao so obtidas a partir de ensaios em laboratrio realizados em
reatores operados de forma descontnua, descontnua alimentada ou contnua. Na
proposio de um modelo Cintico para um processo fermentativo, diversos nveis
128 Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

de detalhamento podem ser adotados. Algumas das aproximaes, permitem sim-


plificar a representao da cintica dos processos ferrnentativos:
consideranili>-se que, na formulao do meio de cultura, todos os com-
ponentes, menos um nmero preestabelecido, esto em concentraes
suficientemente elevadas (mas no inibitrias), de modo que apenas as
concentraes destes outros componentes, previamente escolhidos, sejam
limitantes e/ ou inibitrias-para a velocidade do processo; eventualmente,
necessrio incluir no equacionarnento outros componentes do meio, por
exemplo, um produto inibidor que se acumula no meio de cultura ao lon-
go do processo;
considerando-se, em geral, que alteraes em outras variveis detectadas
num experimento de um processo tpico no afetam significativamente a
cintica no intervalo de tempo escolhido para a modelagem; alm disso,
controles do biorreator podem regular e manter constantes alguns par-
metros do ambiente, por exemplo, pH, temperatura e concentrao de oxi-
gnio dissolvidO';
introduzindo-se no modelo, se necessrio, urna descrio rnulticornponen-
te e rnultivarivel da populao rnicrobiana ou de clulas, para represen-
tar adequadamente o comportamento cintico desejado.
Os modelos cinticos de processos ferrnentativos podem ser classificados,
quanto ao nmero de componentes usados na representao celular, em dois ti-
pos, conforme se detalha a seguir.
Modelos no estruturados: o material celular representado por urna nia va-
rivel, por exemplo, a massa celular ou o nmero de clulas, sem considerar varia-
es . de componentes intracelulares, ou usar tais variaes ria previso do
comportamento cintico do processo;
Modelos estruturados: as clulas so descritas com maiores detalh~s, conside-
rando, por exemplo, componentes intracelulares, perrnitindo~descrever o estado
das clulas e sua adaptao s mudanas do meio ambiente.
Quanto heterogeneidade da populao rnicrobiana, os modelos cinticos
tambm so classificados em duas categorias, descritas a seguir.
Modelos no segregados: a populao celular considerada homognea, isto ,
todas as clulas apresentam o mesmo comportamento;
Modelos segregados: as clulas so consideradas discretas, corno indivduos
de urna populao heterognea, com distribuio de idade, de tamanho e de pro-
priedades celulares.
Obviamente, os modelos segregados e estruturados oferecem urna descrio
mais detalhada do comportamento cintico do processo ferrnenhitivo que os no
segregados e os no estruturados, mas custa de maior complexidade e maior es-
foro computacional requerido- em muitos casos a qualidade e a reprodutibili-
dade dos resultados obtidos no justificam a complexidade e a perda de
generalidade introduzida.
possvel encontrar na literatura algumas tentativas de generalizar a mode-
lagem matemtica de processos ferrnentativos, utilizando proposies no estru-
1.:

Formulao dos modelos matemticos de processoS fermentativos 129

turadas de modelos, visando a utilizao em mdulos da etapa de fermentao em


simuladores de processo. 8 Verifica.:se, entretanto, que essas proposies, por no
acoplarem etapas de ajuste de parmetros e de otimizao de processo, so extre-
mamente limitadas, urna vez que exigem do usurio um conhecimento aprofunda-
do do processo o que, geralmente, no ocorre;

7.2.1.2 - Modelos entraqa-sada


Denomina-se modelo entrada-sada de um processo correlao que permi-
te calcular urna ou mais respostas do sistema (suas sadas), a partir de um nmero
definido de variveis de entrada medidas. O principal exemplo de modelos entra-
da-sada, muito estudado hoje para representar sistemas complexos (caso dos pro-
cessos ferrnentativos), so as redes neurais. Essas redes foram concebidas a partir
de urna analogia com o funcionamento do crebro humano. Neste, a informao
processada em unidades chamadas neurnios. Cada neurnio recebe a informa-
o proveniente de inmeros outros neurnios atravs de terminais de entrada
chamados dendritos. Essas informaes so sintetizadas no ncleo e, se forem
suficientemente fortes, produziro um sinal que se propaga atravs do axnio at
seus terminais de sada, chamados de sinapses. Finalmente, estas se ligaro a urna
nova camada de neurnios.
As redes neurais artificiais tm urna estrutura anloga descrita, sendo que
I
a sntese das informaes de entrada feita por urna ponderao dos diversos si- i~
!'
nais, atravs de ajustes de coeficientes e urna posterior transformao no linear, l
comumente do tipo sigrnide. H diversas proposies de corno interconectar os i
diversos neurnios, cada urna definindo urna arquitetura de rede. A escolha de jl
qual arquitetura, bem corno o nmero de neurnios e de camadas intermedirias, l
i
ser feita sempre ernpiricarnente a partir dos resultados fornecidos pela rede. 9
A rede passa a descrever o .sistema corretamente quando o erro entre o re- i!
!;
i
sultado medido e o_calculado por ela, a partir dos mesmos dados de entrada, es-
tiver dentro do especificado. Para urna predio correta ' necessrio que se
fornea antes rede um conjunto casado entrada-sada, onde se faro ajuste dos
coeficientes descritos anteriormente. Esse ajuste, que terncorno critrio a rninirni- :I:
zao do erro medida-predio, tambm designado por fase de treinamento. Fin- I'
da essa etapa, faz-se sua validao submetendo-se anlise um conjunto de dados !(
ainda no apresentados rede.
Devido ao escopo introdutrio do presente captulo, no se pretende
apresentar em detalhe a aplicao de redes neurais modelagem de processos
ferrnentativos . O leitor interessado poder encontrar na literatura vrias aplica-
es: SYU; TSA0/ 0 na modelagem do crescimento de clulas em processo batela- i
I

da; WILLIS et al ., 11 na modelagem da produo de penicilina via fermentao;


BHAT et al. ,12 no controle de urna torre de destilao; ZORZETT0, 13 na utilizao
de redes neurais hbridas para modelar a: etapa ferrnentativa do processo de
produo de vitamina C e SIMUTIS et al./4 na utilizao de diferentes redes neu-
' rais para representar fases distintas da fermentao alcolica na produo de
if"- cerveJa.
;
130 Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

7.2.2 - Formulao dos modelos fenomenolgicos no estruturados


O primeiro passo na formulao de um modelo rnaterntic fenomenolgico
o estabelecimento das variveis de estado d processo, isto , aquelas variveis
que definem em cada instante o estado do sistema (por exemplo, concentraes de
substratos e produtos). Inclui-se tambm na definio do estado de um processo
ferrnentativo a capacidade (velocidade) das clulas presentes de executar suas
funes vitais, quais sejam: o crescimento ou morte celular, a gerao de produtos
e o consumo de substratos. Em sistemas mais complexos o estado de processos
ferrnentativos pode incluir a frao de clulas que preservam a capacidade de ge-
rar um determinado produto (capacidade esta introduzida, por exemplo, atravs
de tcnicas de engenharia gentica e que pode ser perdida em funo da instabili-
dade do microrganismo gerado), a concentrao de um substrato necessrio ao
crescimento celular e que gerado pela ao de urna enzima introduzida no pro-
cesso, a ao de populaes mistas de clulas, entre outros fenmenos.
Para estudar a dinmica de um processo ferrnentativo, deve-se buscar:
. identificar os processos que alteram o estado das populaes envolvidas
(crescimento celular, reproduo celular, manuteno da viabilidade celu-
lar, morte celular, lise celular, rnotilidade celular, alteraes morfolgicas
das clulas, corno o caso da formao de esporos e finalmente os proces-
sos fsicos que incluem entre outros a aderncia das clulas a superfcies
slidas);
identificar os fenmenos ambientais que afetam as velocidades de altera-
o do estado das poplaes;
identificar corno as velocidades de alterao do estado das populaes so
afetadas;
identificar corno o ambiente afetado pelos processos de alterao do es-
tado das populaes.

7.2.2.1 - Equaes de balano


As equaes de balano do processo devem ser formuladas para cada vari-
vel de estado e para o volume de controle do sistema em estudo. Para os processos
ferrnentativos realizados em biorreatores homogneos, o volume de controle cor-
responde ao prprio volume til do biorreatcir.
Corno a formulao e detalhamento das equaes de balano ser vista nos
captulos que tratam dos biorreatores, ser apresentada apenas a equao geral do
balano a ttulo de reviso:

Velocidade de Velocidade de Velocidade de


acmulo no volume entrada no volume sada do volume
de controle de controle de controle
Fonnulao dos modelos matemticos de processos fennentativos I 3I

Termos de entrada:
fluxo global atravs das fronteiras geomtricas;
difuso atravs das fronteiras geomtricas (importante apenas para bior-
reatores heterogneos, onde os volumes de controle so infinitesimais);
transporte atravs das fronteiras entre fases (caso do transporte de oxig-
nio da fase gasosa para a fase lquida);
I
gerao dentro do volume de controle (geralmente crescimento celular e
produo de produtos metablicos).

Termos de sada:
fluxo global atravs das fronteiras geomtricas;
difuso atravs das fronteiras geomtricas;
transporte atravs das fronteiras entre fases;
consumo dentro do volume de controle (geralmente morte celular ou con-
sumo de substratos).

Dessa forma, para um processo fermentativo homoneo, as equaes de ba-


lano podem ser escritas na seguinte forma generalizada: 5

1 d (Vy)
--- = Lrger - Lrcons + Dye - yDy (7.1)
v dt

onde: V ... volume de controle;


y ... concentrao da varivel de estado no biorreator;
rger ... velocidades de 9erao do componente representado pela varivel de
estado;
rcons ... velocidades de consumo do componente representado pela varivel
de estado;
D ... vazo especfica de alimentao;
Ye ... concentrao na alimentao;
r ... relao entre a vazo de alimentao e de retirada do biorreator.

Em funo dos balanos de conservao de massa, os modelos matemticos


fenomenolgicos de processos fermentativos podem ser constitudos pelos seguin-
tes tipos de equaes:
equaes algbricas: neste caso, os modelos representam apenas os estados
estacionrios de sistemas homogneos;
equaes diferenciais ordinrias: neste caso, os modelos representam o compor-
tamento dinmico de sistemas homogneos ou os estados estacionrios de
sistemas heterogneos numa nica direo do espao;
equaes diferenciais parciais: neste caso, os models representa!TI o compor-
tamento dinmico de sistemas heterogneos.
132 Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

7.2.2.2 - Identificao do sistema de reaes metablicas


Inicialmente, para a construo das equaes de balano de massa do pro-
cesso e posteriormente na elaborao das equaes cinticas, que representam a
influncia das variveis de estado nas suas velocidades de gerao e de consumo,
fundamental identificar o sistema de reaes metablicas inerente ao processo
em estudo. 16' 17 Por sistema de reaes metablicas entende-se o conjunto simplifi-
cado de reaes que permite correlacionar os substratos consumidos aos produtos
gerados (entre os quais est includa a populao microbiana).
Considere-se, a ttulo de exemplo, um processo fermentativo no qual foram
identificadas, a partir de um conjunto de experimentos realizados, 6 variveis de
estado: a concentrao celular (X), as concentraes de 3 substratos (5 1, 5 2 e S3) e
as concentraes de 2 produtos (P1 e P 2). Pode-se formular 3 proposies de mo-
delo de reaes metablicas, conforme indicado a seguir.

Proposta 1
Nesta proposta assume-se que o substrato 5 1 consumido pela populao
microbiana para crescer e, juntamente com o substrato 5 2, produzir o produto me-
tablico P 1; o substrato 53 consumido pela populao microbiana para produzir o
produto P 2 Os parmetros k1 a k4 representam os coeficientes estequiomtricos
desse sistema de reaes metablicas, que ilustrado a seguir:

k 1S 1 ~X
kzSl + k3S2 ~ P1
k4S3~P2

Nas propostas 2 e 3, detalhadas a seguir, so apresentadas outras duas alter-


nativas para o sistema de reaes metablicas representativas do processo.

Proposta 2
k1S1 + k2S2 ~X
k 3S 1 + k 4 S 2 + ksS3 ~ P1
k6S3~P2

Proposta 3

k 1 S 1 + k 2S 2 + k 3 S 3 ~X

k 4 S 1 + k5 S 2 ~ P1
k6S3~P2

Para as 3 propostas de modelo de reaes metablicas elaboram~se. os balan-


os para os 3 substratos.
'~ i

FOill1Uiao dos modelos matemticos de processos fermentativos I 33

Proposta 1:
dS 1 dX 1 dP
1
-= - - - - - - - - -1 (7.2)
dt Y x/51 dt Y Pl/51 dt

dS .1 1 dP (7.3)
- 2= - - - -
dt YPl/52 dt

dS 1 dP2 (7.4)
- 3= - - - -
dt YP2/S3 dt

e integrando as eqs. (7.2) a (7.4) do instante "O" at o instante "i" correspondente a


um ponto experimental, obtm-se:

Proposta 2:
dS 1 dX 1 dP (7.8)
1
-= - - - - - - - - -1
dt Y x/51 dt Y P1/51 dt

dS 1 dX 1 dP (7.9)
2
-= - - - - - - - - -1
dt Y x/52 dt Y Pl/52 dt

dS 1 dP1 1 dP2 (7.10)


- 3= - - - - ----
dt Y Pl/53 dt Y P21S3 dt

e integrando, novamente, .as eqs. (7.8) a (7.10) do instante "O" at o instante "i"
correspondente a um ponto experimental, obtm-se:
134 Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

Proposta 3:

dS
1 1 1 dX 1 dP
-= --------- (7.14)
dt Y x/ 51 dt Y Pl/ 51 dt

dS
2 ,
1 1 dX 1 dP
-= --------- (7.15)
dt Y x/ 52 dt Y Pl/52 dt

dS 1 dX 1 dP
- 3= - - - - - - - - 2 (7.16)
dt Y X/ 53 dt Y P2/ 53 dt

e integrando, mais uma vez, as eqs. (7.14) a (7.16) do instante "O" at o instante "i"
correspondente a um ponto experimental, obtm-se:

Para cada proposta e para cada uma das 9 eqs . lineares (7.5) a (7.7), (7.11) a
(7.13) e (7.17) a (7.19), obtidas para as 3 propostas de modelo metablico formu-
ladas, calcula-se a regresso linear ou multilinear, dependendo do caso, obten-
do-se os coeficientes de correlao para cada ensaio e para o conjunto de ensaios
disponveis. Escolhe-se, como a mais apropriada, a proposta que apresenta o me-
lhor conjunto de coeficientes de correlao, analisando as duas situaes (por en-
saio e global) .
Formulao dos modelos matemticos de processos fermentativos I35

EXEMPLO NUMRICO
Ser desenvolvido ao longo deste captulo, como estudo da modelagem ma-
temtica de processos fermentativos, a modelagem do processo de produo de
etanol a partir de hidrolisado de mandioca. 18' 19
Nesse processo foram identificadas 3 variveis de estado: a concentrao de
leveduras (X), a concentra9 de etanol (P) e a concentrao de substrato limitan-
te, a glicose de hidrolisado do amido de mandioca (S). So apresentados na Tabela
7.1 os dados experimentais obtidos em 4 ensaios realizados no laboratrio, num
biorreator operado em batelada, partindo de diferentes concentraes iniciais de
acares redutores.' Observe-se que esses dados experimentais foram ligeiramente
modificados, em relao aos originais (reportados nos trabalhos referenciados),
com o intuito de tornar mais didticos alguns aspectos dos exemplos apresentados
ao longo deste captulo.

EXEMPLO NUMRICO-ETAPA 1
Considerem-se duas propostas de modelo de reaes metablicas para re-
presentar o processo em estudo:

Proposta 1: k 1 S~ X
k 1 S~P

Nessa primeira proposta, considera-se que a glicose consumida pela leve-


dura para crescer e para produzir etano!.

Proposta 2: k 3 S ~ P
Nessa segunda proposta, as leveduras no consomem glicose para o seu
crescimento (crescem a partir de outra fonte de carbono no limitante no processo
e portanto no includa como varivel de estado caso, por exemplo, do extrato de
levedura). .
Elaborando os balanos de massa do substrato S para as 2 propostas de mo-
delo metablico, obtm-se:

Proposta 1: .S = -aflX: - MP

Proposta 2: .S =-eM

Realizando a regresso multilinear para balano de massa obtido com a


Proposta 1 e a regresso linear para a Proposta 2 com os dados experimentais
apresentados (Tab. 7.1), obtm-se o resultado sintetizado na Tabela 7.2. Essas
regresses so realizadas considerando, em cada instante de tempo "i", o subs-
trato consumido e as clulas e produto produzidas desde o instante "O" at o
instante " i" .
136 Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

Tabela 7.1 - Dados experimentais() do processo de produo de etano! a partir de hidrolisado de mandioca-
Exemplo numrico.

Ensaio 1 Ensaio 2
t (h) X (g/L) p (g\L) S (g/L) t (h) X (g/L) p (g/L) S (g/L)
0,0 0,378 1,92 20,8 0,0 0,845 2,44 85,1
1,0 0,652 2,54 17,6 1,0 1,08 2,88 76,8
2,0 1,17 3,54 14,8 2,0 ' 1,88 3,54 76,3
3,0 1,54 4,65 10,3 3,0 2,98 5,34 74,8
4,0 1,84 5,96 5,80 4,0 3,92 7,52 56,9
5,0 2,36 6,64. 2,34 5,0 5,77 10,5 42,2
6,0 2,20 7,19 0,512 6,0 7,14 17,6 28,8
7,0 2,23 6,74 0,088 7,0 10,6 22,8 7,65
8,0 10,3 24,7 0,198
9,0 7,70 24,4 0,002

Ensaio 3 Ensaio 4
t (h) X (g/L) p (g/L) S (g/L) t (h) X (g/L) p (g/L) S (g/L)
0,0 0,410 2,71 136 0,0 1,12 - 2,02 227
1,0 0,819 2,78 130 1,0 1,29 2,56 236
2,0 1,14 3,06 131 2,0 2,29 2,90 221
3,0 1,72 3,43 134 3,0 2,68 3,82 213
4,0 2,57 4,78 130 4,0 4,36 4,44 198
5,0 4,01 6,78 120 5,0 6,18 6,69 198
6,0 4,68 8,34 106 6,0 7,70 9,31 195
7,0 6,60 11,7 100 7,0 11,1 11,3 178
8,0 9,51 15,4 69,8 8,0 13,6 15,2 160
9,0 12,6 23,0 47,5 9,0 18,3 21,0 123
10,0 12,3 28,1 18,3 10,0 18,6 31,2 76,4
11,0 14,2 38,2 0,812 11,0 22,3 39,4 46,2
12,0 15,2 37,7 0,003 12,0 29,9 53,8 11,9
13,0 25,2 54,4 0,054 .

(*) Dados experimentais foram gerados considerando um erro experimental aleatrio obedecendo uma
distribuio normal (mdia = 0,0 e desvio padro = I ,0) de I 0% para as medidas de X e 5% para as me-
didas de S e P.
Formulao dos modelos matemticos de procssos fermentativos 137

Pelos resultados obtidos, verifica-se que a Proposta 1 a mais adequada,


pois todos os coeficientes de correlao obtidos para cada ensaio so melhores ou
iguais (caso do Ensaio 1), o mesmo ocorrendo com o coeficiente de correlao obti-
do quando considerado o conjunto dos 4 ensaios. A discrepncia dos valores de
a e b obtidos para o Ensaio 1 (estimativas de 1/Yx;s e 1/Yp;s respectivamente) em
relao aos outros 3 ensaios explicada pelo erro experimental introduzido nos
dados. Urna possvel estirnat~va preliminar dos valores de Yx;s e Yp;s num futuro
ajuste de um modelo matemtico aos dados apresentados na Tabela 7.1, sero os
valores de a e b ajustados na regresso obtida com o conjunto de 4 ensaios. De-
ve-se destacar que, na presente anlise, considerou-se que o erro experimental e as
ineficincias do processo esto distribudas entre X e P, o que explica porque o va-
lor de Yp;s obtido no o valor estequiorntrico 0,511.

Tabela 7.2 - Resultado das regresses multilinear e linear para as 2 propostas do Exemplo numrico - Etapa I.

ENSAIO PROPOSTA I PROPOSTA2


.S = -a .X - b t:J' .S =-c t:J' '
H'~
.~
a = 0,745; b = 3,66 c= 3,95
1
R= 0,992 R= 0,992
~:.
.~

I.
~.J ..
.~.,;
a= 2,31; b = 2,94 c= 3,90 .:"fJ
2 .')

R= 0,987 R= 0,983
..
~~~)
!r.
a = 2,73; b = 2,84 c= 4,11
3
R= 0,994 R= 0,989
I ~.
! ~'
a = 2,39; b = 3,19 c= 4,53 '
,.n;
,..
4
R= 0,993 R= 0,988 -..'r,

a = 2,81; b = 2,88 c= 4,33


Global
...

R= 0,993 R= 0,987
sl
r} . ~t,~,,.~ ;'r. ~~?~ r. . ~~~"".:~~;;:~~ - ..
'
}! 'c'J; ,,.:. ' !:1 ~ .
~ ~.
~ ~~
~~~' : ~

7.2.2.3 - Equaes cinticas


Conforme j indicado anteriormente, na construo das equaes cinticas
que reside toda a dificuldade e, portanto, toda a arte da formulao dos modelos
fenomenolgicos dos processos ferrnentativos. So as equaes cinticas que indi-
cam corno as variveis de estado do processo em estudo interferem nas velocida-
des de crescimento e morte celular, de gerao de produtos metablicos e de
consumo de substrato.
Para formular os modelos cinticos, a partir de dados experimentais, ne-
cessrio executar trs etapas bsicas, descritas a seguir.
Tratamento dos dados experimentais
Entende-se por tratamento dos dados experimentais, medidos em laborat-
rio, a correo ou transformao dos mesmos buscando adequ-los anlise dese-
138 Modelagem matemtica e simulao de processos ferrnentativos

jada. Quando os ensaios so conduzidos em processos batelada e contnuo, a


volume constante, deve-se trat-los, por exemplo, desprezando pontos experimen-
tais que apresentem erros grosseiros, podendo-se, geralmente, trabalhar na anli-
se dos dados experimentais com base nas concentraes dos componentes (ou
seja, as prprias variveis de estado medidas). Em processos fermentativos, onde
se obtm altas concentraes celulares de microrganismos em biorreatores, so
empregados processos operados em bateladas sucessivas ou bateladas alimenta-
das (volume varivel) e, neste segundo caso, costuma-se tratar os dados, medidos
em concentrao, transformando-os em massa. Para o clculo das velocidades es-
pecficas e dos fatores de converso, utiliza-se, efetivamente, a massa consumida
ou produzida ao longo do processo. Normalmente, quando realizada uma corre-
o dos valores medidos, corrige-se apenas o volume do reator considerando ovo-
lume evaporado, alimentado, da amostragem e da adio de cido ou base para o
controle de pH. Contudo, no considerado que, com a retirada de meio para
amostragem, ocorram modificaes no estado do processo, pois as massas de to-
dos os componentes do biorreator (substratos, produtos e clulas) so alteradas.
Para tanto, necessita-se corrigir os valores experimentais das variveis de
estado, reproduzindo uma situao de ausncia de perturbaes, ou seja, a situa-
o na qual nenhuma massa de produto, substrato e clula estivesse sendo retira-
da. Por meio de balanos de massa, aplicados a cada varivel de estado inerente
ao processo, obtm-se os valores em massa destas variveis, j devidamente corri-
gidos. TAKANO et al. 20 mostram em seu trabalho que, quando ocorrem grandes
perturbaes do sistema, deve-se corrigir os dados experimentais antes de proce-
der ao clculo das velocidades especficas e dos fatores de converso, pois o erro
destes parmetros do processo torna-se significativo, podendo causar problemas
quando da formulao e do ajuste dos parmetros do modelo matemtico, ou
quando estes parmetros do processo forem utilizados para o projeto do biorrea-
tor em escala industrial.
Uma vez tratados os dados experimentais, procede-se identificao do sis-
tema de reaes metablicas, obtendo-se uma primeira estimativa do~ fatores de
converso, conforme ilustrado na Etapa 1 do exemplo numrico.

Clculo das velocidades especficas


Nessa etapa so calculadas as velocidades especficas de crescimento e de
gerao de produtos necessrias para identificar o comportamento cintico da po-
pulao microbiana; o clculo das velocidades especficas de consumo dos subs-
tratos limitantes do processo importante para identificar possveis consumos
desses substratos para manuteno. O clculo das velocidades especficas de cres-
cimento e produo o primeiro passo para uma boa formulao ajuste de um
modelo matemtico de processos fermentativos. Sua importncia reside funda-
mentalmente em dois aspectos:
formulao de relaes cinticas que, juntamente com os balanos de mas-
sa, so a base para a construo do modelo;
obteno de estimativas preliminares dos parmetros por meio de simpli-
ficaes e linearizaes do modelo a serem usadas, posteriormente, como
ponto de partida nas metodologias para ajuste de parmetros/l
Fonnulao dos modelos matemticos de processos fennentativos IJ 9

Dessa forma, caracteriza-se a importncia do clculo cuidadoso das veloci-


dades especficas de crescimento e de produo de produtos metablicos a partir
dos dados experimentais, clculo este que dificultado pela forte influncia que
pequenas alteraes das variveis exercem sobre o clculo da sua velocidade. A
seguir so listadas as etapas de uma metodologia que pode ser empregada para o
clculo da velocidade especfica de crescimento. 22
(a) Deteco da fase de Crescimento exponencial. Traa-se o grfico (ln X) vs. (t)
para diferentes limites iniciais e finais de tempo, determinando-se, atravs do melhor
coeficiente de correlao, o incio e a durao da fase exponencial de crescimento; o
coeficiente angular da melhor correlao fornecer o valor de 1-lm - velocidade espec-
fica mxima de crescimento.
(b) Aprimoramento da curva de (X) vs. (t). Recuperando-se os valores de X que
satisfazem a regresso linear escolhida na etapa anterior, aprimora-se a curva de
(X) vs. (t) durante a fase exponencial.
(c) Clculo da velocidade especifica de crescimento. Com a nova curva (X) vs. (t)
obtm-se a curva da velocidade especfica de crescimento, utilizando-se um dos
trs mtodos descritos a seguir:
Mtodo de ajuste polinomial. Ajusta-se um polinmio de grau n no tempo aos
valores de X disponveis, obtendo-se, desta forma, a funo de X com o tem-
po. Anlises visuais e quantitativas (atravs do coeficiente de correlao) de-
finem o grau do polinmio a ser ajustado. Obtido o polinmio, sua derivada
fornece os valores da velocidade de crescimento, permitindo o clculo das
velocidades especficas no instante. 23
Mtodo "spline". Existem diferentes mtodos ditos "spline" na literatura tc-
nica. Um dos mtodos "spline" que pode ser empregado ajusta um polin-
mio de grau n a um intervalo de dois pontos de X, incorporando um nmero
de pontos " frente" do intervalo a ser definido; alm disto, o mtodo obriga
a que a derivada do polinmio _a justado no intervalo anterior seja igual de-
rivada do polinmio ajustado no novo intervalo, no ponto de interseco
(caracterstica dos mtodos "spline"). Atravs de testes visuais define-se o
grau do polinmio a ser ajustado, bem como o nmero de pontos " frente"
includos no ajuste. 24
Mtodo geomtrico. Esse mtodo calcula a circunferncia que passa por trs
pontos (o valor de X correspondente ao instante de tempo no qual se quer
calcular a velocidade de crescimento, o anterior e o posterior). A derivada
calculada pela tangente circunferncia no ponto 25 -vide; neste mesmo vo-
lume, o Adendo ao Captulo 6: Cintica de Processos Fermentativos .
Para o clculo das velocidades especficas de gerao de produtos meta-
blicos, utiliza-se um procedimento semelhante ao descrito para o clculo da
velocidade especfica de crescimento. .evidente que, quando a gerao do
produto no totalmente associada ao crescimento, no possvel realizar as
etapas (a) e (b) descritas para o crescimento, na m~dida em que no existe
uma fase de produo exponencial.
140 Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

EXEMPLO NUMRICO-ETAPA 2
Ser exemplificado o clculo da velocidade especfica de crescimento para o
Ensaio 1, cujos dados foram fornecidos na Tabela 7.1. Sendo que 'o Ensaio 1 , dos
quatro ensaios fornecidos, aquele em que a quantidade de produto formada me-
nor, ser tambm o ensaio com possibilidade de apresentar o mais prximo de
uma fase exponencial de crescimento. A seguir, sero aplicadas as trs etapas des-
critas anteriormente para o clculo da velocidade especfica de crescimento.
(1) Determinao da fase exponencial de crescimento- regresso linear dos
dados de (ln X) vs. (t)- Figura 7.2.

Ensaio 1


0,5
o ?
><

t/'
.f: 4 6 8
-0,5-

-1 -i
y =0,5649 X- 0,9795
R2 =0,9996
-1,5
Tempo (h)
Figura 7.2 - Definio da fase exponencial de crescimento para o Ensaio I (X= concentrao celular em g/L) . .

Para a definio da fase exponencial de crescimento assumiu-se que ela tem


incio no instante t =O h, na medida em que o Ensaio 1 foi realizado com 50 baixo,
portanto, sem inibio pelo substrato. Assumiu-se tambm como desprezvel a fase
de adaptao. .
A Tabela 7.3 apresenta o resultado da determinao da fase exponencial de
crescimento.

Tabela 7.3 - Resultados da determinao da fase exponencial de crescimento para oEnsaio I (Tabela 7. I).
Durao da fase exponencial 1
llm (h- ) R
(h)

2 0,565 0,9998

3 0,480 0,989

4 0,402 0,975

Pelos resultados apresentados na Tabela 7.3, evidente que uma possvel


fase exponencial para o Ensaio 1 tem a durao de 2 h e uma estimativa preliminar
de flm 0,565 h- 1 . .
Formulao dos modelos matemticos de processos fermentativos 14 I

(2) Determinao da curva de (X) vs. (t), obtendo-se um melhor detalhamen-


to ao longo da fase exponencial, utilizando sua definio (regresso linear) obtida
na etapa anterior. O grfico de (X) vs. (t) apresentado na Figura 7.3 .

3
2,5
2
:::J
::9 1,5
><
1
0,5
o
o 2 4 6 8
Tempo (h)

Figura 7.3 - Grfico de X em funo do tempo, onde () representa, alm dos valores experimentais, os valores
obtidos da definio da fase exponencial (Fig. 7.2) e(-) representa a curva traada visualmente.

(3) A partir dos dados de (X) vs. (t) obtidos com base na curva traada na Fi-
gura 7.3, obtido o grfico de (J..l) vs. (t), utilizando o mtodo geomtrico, descrito
anteriormente, utilizando a planilha apresentada no Adendo ao Captulo 6 deste
volume. A Figura 7.4 apresenta o resultado dos valores de Jl calculados, verifi-
cando-se a concordncia da fase exponencial previamente definida, com o valor
de Jl = Jlm (patamar da Fig. 7.4).

0,7
0,6
0,5
: 0,4
-..--
:(
0,3
0,2
0,1
o
o 2 4 6 8
Tempo (h)
Figura 7.4 - Grfico da velocidade especfica de crescimento calculada a partir da curva de X (Fig. 7 .3) utilizando o
Mtodo Geomtrico2s.

Identificao dos fenmenos.


Nessa etapa busca-se definir os principais fenmenos que interferem no pro-
cesso produtivo em anlise: limitaes e inibies por substratos, principalmente
no que se refere existncia e ao nmero de substratos limitantes e/ ou inibidores,
tipo de produto gerado- existncia ou no de associao com o crescimento, entre
outros.
142 Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

Uma vez obtidos grficos que permitem analisar o comportamento das velo-
cidades especficas de crescimento, de gerao de produto metablico e de consu-
mo de substratos, possvel identificar os principais fenmenos l serem includos
na construo de um modelo matemtico no estruturado de processos fermenta-
tivos. O Quadro 7.1 sintetiza os modelos cinticos mais empregados para repre-
sentar os fenmenos comumente identificados em processos fermentativos, alguns
dos quais j foram abordados em detalhe no Captulo 6: Cintica de Processos Fer-
mentativos.

EXEMPLO NUMRICO- ETAPA 3


Com o intuito de exemplificar a identificab dos fenmenos, necessria
construo do modelo matemtico, ser identificado qual tipo de inibio do cres-
cimento celular pelo produto (etanol) ocorre na fermentao alcolica utilizada
como caso estudo neste Captulo. A Tabela 7.4 apresenta os dados de f.lx e P obti-
dos (por interpolao) para os ensaios definidos na Tabela 7.1, no instante em que
a quantidade de 5 residual no biorreator igual para todos os 4 ensaios - foram
consideradas duas situaes 5 = 20,0g/L e 10,0 g/L.

Quadro 7 .I - Modelos cinticos no estruturados, descritos na literatura, para representao


de diversos fenmenos identificados em processos fermentativos.

(1) Crescimento num nico substrato limitante:

26
(MONOD) (7.20)

27
(MOSER) (7.21)

(CONTOIS) 28 (7.22)

(2) Morte celular:


15
f.lct = -Kd (SINCLAIR; KRISTIANSEN) (7.23)

(3) Crescimento num nico substrato limitante e inibidor:

f-laS (ANDREWS/
9
(7.24)
f-l x = . 2
5
K +5+-
s K-

Formulao dos modelos matemticos de processos ferrnentativos 143

Quadro 7.I - (continuao)

0
(WU et al/ (7.25)

(4) Crescimento com mltiplo substrato limitante (uso preferencial de 51):

5 5
J.l = J.lm1 1 + J.lm2 2 (DUNNETetal.). 31 (7.26)
X K si + 5 1 5 12
Ks2 +52+-
Ki

(5) Crescimento com mltiplo substrato limitante (uso simultneo de 5 1 e

32
(MEGEE et al.) (7.27)

33
(TSAO; HANSON) (7.28)

(6) Consumo do substrato limitante para manuteno:

34
(PIRT) (7.29)

35
=--
1
+m +Ll max - - - -
5 -5* (ZENG; DECKWER) (7.30)
J.l s Y x/ s J.l X s J.l s K *+5 - 5 *

(7) Produo de produto metablico associado e no associado


ao crescimento:

(LUEDEKING; PIRET modificado) 36 (7.31)


144 Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

Quadro 7.1 -(continuao)


(8) Produo de produto metablico inibitrio:

(7.32)

f.l =~
IK'
p
s (AIBA; SHODA)
37
(7.33)
P K'+SK'+P
s p

(7.34)

f.l~S
f.l - e- KP
p (AIBA et al.)
38
(7.35)
P- K's +5

(7.36)

39
(GHOSE; TYAGI) (7.37)

onde: f.lx .. ... velocidade especfica de crescimento


f.lct ..... velocidade especfica de morte
f.lp .... . velocidade especfica de produo
f.ls .. ... velocidade especfica de consumo de substrato
S, Sv 5 2 , 5 3 concentraes de substratos limitantes
5* .... . concentrao de S para manter f.lx
X ..... concentrao celular
P ..... concentrao de produto
Yx/s ... fator de converso de substrato em clulas
m ... .. consumo de substrato para manuteno
flm, K., n, Kct, f.la, Ki, f.lmv flmz, K.v K.z, K.3,
f.lo, fll, flz, l1f.l :;ax , K*, O., 13m, K~., KP, f.l ~,
K s, , K'p, Pmt P'rn .. .. .. ~
param e t r os Cine
. 't"lCOS
Formulao dos modelos matemticos de processos fermentativos 145

Tabela 7.4 - Valores de llx e P quando Sresiduat = 20 e I Og/L


,_
Sresidual = 20,0 g/L Sresidual = 10,0 g/L
Ensaos
p (g/L) f.!x (h-l) p (g/L) f.!x {h-l)

1 2,12 0,565 4,78 0,255


2 1&,0 0,219 21,2 0,161
3 30,0 0,129 33) 0,0901
4 50,5 0,0523 54,7 0,0364
-~ - .. -- '. '- 1 - , . T'<;-i T
---
l ' ,,.

As Figuras 7.5 a 7,7 apresentam a representao das formas linearizadas das


3 diferentes alternativas de modelo para a inibio do crescimento celular pelo
produto consideradas neste Captulo (vide Quadro 7.1),

(1) Inibio hiperblica: 37

1 1 1
- = - + --- P (7,38)
1-l x 1-l s 1-ls*K p

onde

(2) Inibio exponencial: 38

(7,39)

(3) Inibio linear: 39

(7,40)
11 = 11 - 1-ls P
r- x r-s p
m

Pelos resultados apresentados nas Figuras 7.5 a 7,7, evidehte que o modelo
cintico de inibio do crescimento microbiano pelo produto, que representa ade-
quadamente os dados experimentais de fermentao alcolica, o modelo de ini-
bio exponencial38 (Fig, 7.6).
146 Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

(A) S =10 g/L (B) S = 20 g/L


30 25
25 y =0,4773x- 1,4723 20 y =0,3597x- 0,745
20 R2 =0,8937 R2 = 0,9277
:2
....... . 15
;s 15
X
.l 10
~ 10

5
o
5

o 20 40 60 oo 20 40 60
p (g/L) p (g/L)

37
Figura 7.5 - Tentativa de representao da inibio pelo produto atravs do modelo hiperblico.
(A) S,esidual = I 0,0 g/L e (B) S,.,;dual = 20,0 g/L.

(A) S =10 g/L (B) S =20 g/L


3,5 3,5
3 3
2,5 2,5
~ 2 ~
c 2
.E:
' 1,5 1,5
y =0,0397x + 1 ,094 1 y =0,0486x + 0,5484
0 ,5 R2=0,9897 0,5 R2 =0,9933
00 20 40 60 00 20 40 60
p (g/L) p (g/L)

38
Figura 7.6 - Tentativa de representao da inibio pelo produto atravs do modelo exponencia1.
(A) s,.,;dual = I 0,0 g/L e (B) S,esidual = 20,0 g/L.

(A) S =10 g/L (B) S =20 g/ L


0 ,3 0,6

0,25 y =-0,0044x + 0,2615 0,5 y =-0,0101 X + 0,496


R2 = 0,9612 0,4 R2 = 0,8325
0,2
,s 0,15 ,s 0,3
X
:S.
X
:S.
0,2
0,1 0,1
0,05 o
o -0,1 o
o 20 60 20 40 60
p (g/L) p (g/L)

39
Figura 7.7 - Tentativa de representao da inibio pelo produto atravs do modelo linear
(A) S ,.,;dual = I 0,0 g/L e (B) S,.,;dua = 20,0 g/L.
Formulao dos modelos matemticos de processos fermentativos 147

7.2.2.4 - Modelos fenomenolgicos no estruturados com culturas mistas


A existncia de mltiplas populaes de microrganismos num processo fer-
mentativo provocar o aparecimento de interaes, nas quais uma populao
exercer algum efeito sobre as outras. Considerando duas espcies microbianas A
e B, trs tipos de interaes podero ocorrer entre elas: um efeito positivo(+) (be-
nfico), um efeito negativo(-) ou um efeito neutro (0). O Quadro 7.2 ilustra as di-
ferentes alternativas de interaes entre as diversas populaes microbianas
presentes num processo fermentativo.
A formulao dos modelos no estruturados com culturas mistas segue a
mesma estratgia j apresentada para os modelos com culturas puras, sendo a b-
via e nica dificuldade adicional a necessidade de medir e identificar os fenme-
nos inerentes a cada populao integrante do sistema. O leitor interessado poder
encontrar mais detalhes sobre modelos no estruturados com culturas mistas em
7
FREDRICKSON; TSUCHIYA.

Quadro 7.2 - Diferentes interaes entre populaes microbianas.

Populao microbiana
Tipo de interao
A B

Neutralismo o o
Mutualismo + +
Competio

Comensalismo o +

+ o
Parasitismo ou Predao +

Amensalismo o
o

7.2.3 - Modelos fenomenolgicos estruturados


Entende-se por crescimento balanceado o crescimento microbiano no qual a
velocidade de produo de um componente da biomassa por unidade de biomassa
constante, igual para todos os componentes da biomassa e igual velocidade es-
pecfica de crescimento da prpria biomassa. Somente nessa condio de cresci-
mento que a formulao de modelos no estruturados perfeitamente
justificada. Na prtica o crescimento balanceado s ocorre no estado estacionrio
em fermentaes contnuas e durante a fase exponencial de crescimento em fer-
148 Modelagem matemtica e simulao de processos fennentativos

mentaes em batelada. Dessa forma, na maioria dos casos, a caracterizao da


atividade biolgica simplesmente pela concentrao total de biomassa insufici-
ente para uma representao adequada de dados experimentais pelo modelo ma-
temtico formulado. 40' 41 ' 42 Vrios experimentos tm mostrado que a composio da
biomassa de uma populao microbiana varia em resposta a alteraes nas condi-
es do ambiente. Variaes na composio da biomassa so acompanhadas por
alteraes na natureza de processos subcelulares. Essas variaes na atividade da
biomassa por unidade de concentrao de biomassa podem ser causadas por:
perda de plasmdeos;
induo e represso de genes;
variao no contedo de RNA da clula microbiana;
variao no contedo enzimtico da clula microbiana;
acmulo de materiais de reserva da clula microbiana;
alteraes morfolgicas, por exemplo ramificao de organismos filamen-
tosos, relao volume/superfcie de clulas de leveduras e bactrias, etc.
Essas variaes na atividade e composio da biomassa microbiana reque-
rem uma descrio mais complexa do metabolismo celular e uma estratgia mais
estruturada para modelar a cintica microbiana. Em geral, muito difcil obter ex-
perimentalmente um conhecimento mecanstico, a respeito do metabolismo celu-
lar, para o desenvolvimento de um modelo estruturado "realista" . A estimativa de
parmetros pode ser muito difcil e a aplicao de mtodos numricos complexos
pode facilmente levar a resultados sem significado fsico. Por esse motivo, mode-
los estruturados de processos fermentativos raramente so utilizados com vistas
utilizao no projeto de biorreatores e na implementao de uma estratgia de
controle.
Alm das dificuldades acima expostas, um cuidado adicional deve ser toma-
do na formulao dos modelos estruturados, quando da montagem das equaes
de balano para os componentes intracelulares - deve ser considerado um termo
de diluio do componente provocado pelo crescimento celular. 43

No sero apresentados mais detalhes dos modelos estruturados de proces-


sos fermentativos, em funo da sua complexidade e das questes prticas j
apontadas, que dificultam sua utilizao. O leitor interessado poder encontrar na
literatura especializada excelentes revises e textos que lhe permitiro aprofundar
seus conhecimentos nessa categoria de modelos.43

7.3 - Ajuste de parmetros do modelo formulado


Em um processo fermentativo, conduzido num biorreator homogneo, o
modelo formulado, conforme detalhado no item anterior, representado por
equaes matemticas do tipo equaes diferenciais ordinrias de condio inicial
(EDO). O ajuste do modelo aos dados feito pelo clculo do melhor conjunto de
parmetros, que tornam mnima a diferena entre os dados previstos pelo modelo
e os dados experimentais.
O problema de estimao de parmetros em EDO pode ser resolvido, em
princpio, por duas abordagens distintas:44
Ajuste de parmetros do modelo formulado 149

diferenciao dos dados experimentais, para obteno direta dos valores


das velocidades de reao; neste caso, transforma-se o problema em um de
estimao com equaes algbricas- o chamado "mtodo diferencial";
dependendo do modelo, as equaes podem ser linearizadas, facilitando a
obteno dos parmetros (vide item 7.3.1);
integrao analtica (quando o modelo simples) ou numrica das EDO
do modelo, ajustando-se o modelo aos dados diretamente medidos- o
chamado "mtodo integral indireto" (vide itens 7.3.2 e 7.3.3).
A primeira tcnica conceitualmente simples, mas apresenta um inconveni-
ente bastante srio na operao de diferenciao de dados experimentais. Essa
operao costuma ampliar drasticamente os erros experimentais, levando a valo-
res pouco confiveis das derivadas, especialmente se o conjunto de dados no for
denso e se a disperso dos dados no for pequena. A segunda tcnica conceitual-
mente mais adequada, mas requer maior esforo computacional.

7.3.1 - Linearizao do modelo


Essa tcnica, conceitualmente simples, de ajuste de parmetros de um mode-
lo matemtico de um processo fermentativo, exige a diferenciao dos dados ex-
perimentais, obtendo-se valores das velocidades especficas de crescimento e/ ou
produo. Se for tomado como exemplo um crescimento microbiano num biorrea-
tor operado em batelada e que obedece cintica de Monod, obtm-se o seguinte
modelo matemtico:

(7.41)

dS 1 dX (7.42)
dt = ; Yx;s dt
Nesse modelo existem 3 parmetros a serem ajustados a um conjunto de da-
dos experimentais: Jlm, K 5 e Yx;s Esse ajuste pode ser obtido atravs de 2 regres-
ses lineares. A primeira correlaciona o inverso da velocidade especfica de
crescimento (1/J.t)o com o inverso da concentrao de substrato (1/5) 0 no instante
inicial, conhecido como o grfico de Lineweaver-Burk, onde o coeficiente angular
igual a (K5 /Jlm) e o coeficiente linear a (1/J.tm) (Fig. 7.8).
Geralmente, sugere-se construir o grfico de Lineweaver-Burk a partir de
valores iniciais de 1 I Jl e 1 I S obtidos para diferentes ensaios (nos quais determi-
nada a velocidade especfica de crescimento inicial para diferentes valores de S no
instante inicial), visando reduzir possveis efeitos inibitrios de produtos metab-
licos gerados durante o crescimento microbiano, na velocidade especfica calcula-
da. claro que, se o intuito for determinar a existncia ou no desses efeitos,
interessante traar o grfico de Lineweaver-Burk a partir de um ou mais ensaios,
mas considerando relaes entre 1/Jl e 1/S em diferentes tempos de crescimento.
I S Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

A partir do grfico da Figura 7.8 possvel obter a estimativa dos valores de


1

J.lmeKs.

25.----------------------------.

20

~ 15

....! 10
y = 1,7112x + 3,3244
5
R2 = 0,992
o +---------.----------.--------~
o 5 10 15
1/S (Ug)
Figura 7.8 - Grfico de Lineweaver-Burk para o clculo de llm e Ks para o crescimento em batelada segundo o mo-
delo cintico de Monod. Os dados do grfico so apenas ilustrativos, no refletindo valores obtidos experimentalmente.

1
= =0 301 h-11
J.lm 33244
I '

Ks =1~7112 *J.lm =0~515g/L

A segunda regresso linear para ajuste dos parmetros do modelo proposto


correlaciona os dados disponveis de X produzido em relao ao consumo de S
para diferentes intervalos de tempo. O coeficiente angular dessa correlao igual
ao parmetro Yx 1s (Fig. 7.9).
A regresso linear representada no grfico da Figura 7.9 permite obter o va-
lor de Y x15 :

Yx; s = 01545g I g
obtido
sendo que o coeficiente linear da regresso deveria ser nulo; o valor 0 076 1

reflete imprecises do modelo e erro experimental inerente a dados obtidos em la-


boratrio.
120
100
:::J
: 80
o
X 60
'
>< 40
y = 0,545x + 0,076
20 R2 = 0,991
o
o 100 200 300

SO- Si (g/L)

Figura 7.9 - Grfico para obteno de Yx;s Os dados do grfico so apenas ilustrativos, no refletindo
valores obtidos experimentalmente.
Ajuste de parmetros do modelo formulado I5 I

DOWD; RIGGS 45 avaliaram estatisticamente qual a melhor forma de lineari-


zar a equao de Michaelis-Menten para a cintica enzimtica, aplicvel, por ana-
logia, ao ajuste do modelo de crescimento segundo Monod. Propuseram 3 formas
diferentes de linearizao:

(7.43)

(7.44)

(7.45)

Nesse estudo estimativas de K5 e J.lm, obtidas a partir de "dados experimentais"


(construdos introduzindo um erro aleatrio em dados simulados), so compara-
das em cada caso com os seus valores verdadeiros (utilizados na simulao para
obteno dos dados sem erro), de modo que o comportamento das transformaes
(7.43) a (7.45) foi avaliado. O resultado dessa anlise pode ser assim sintetizado:
obter estimativas de J.lm e K 5 pelo mtodo de Lineweaver-Burk (3." transfor-
mao) eram destacadamente as menos confiveis, qualquer que fosse o erro
na determinao de J.l; .
plotar (SI Jl) contra (S) ligeiramente melhor do que plota~ (J.t) contra (J.t/ S),
quando o erro nos valores de J.l pequeno, mas o inverso ocorre quando o
erro de J.l grande (situao que geralmente ocorre nos processos fermentati-
vos);
plotar (J.t) contra (J.t/ S) tem a vantagem adicional de avisar o pesquisador
quando os seus dados desviam da relao terica visto que, normalmente,
este ajuste exagera esse desvio;
utilizar a transformao de Lineweaver-Burk leva obteno de um bom
ajuste, mesmo com pontos no confiveis - esta pode ser a justificativa
para a popularidade desta transformao.

EXEMPLO NUMRICO- ETAPA 4


Ajuste para o modelo de fermentao alcolica 18' 19 a partir de hidrolisado de
mandioca em um sistema batelada. O modelo matemtico no estruturado, pro-
posto aps a identificao dos principais fenmenos envolvidos no processo (vide
discusses nas etapas 2 e 3), composto pelas eqs. (7.46) a (7.50).

dX
-=J.l X (7.46)
dt X
I 52 Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

dS=
-
dt
{1 --flxX +--f.lpX
Yx;s Yr;s
1 ) (7.47)

dP (7.48)
-=f.LpX
dt

onde:

(7.49)

flraS -K' P
(7.50)
fl p = 52 e "
K 5' +5+-
K~
I

A seguir ser exemplificada a obteno da estimativa preliminar dos par-


metros atravs da linearizao e simplificao do modelo, e seu ajuste aos dados
experimentais (Tab. 7.1) .

(1) Estimativa de KP e K~

A partir das equaes (7.49) e (7.50), obtm-se:



(7.51)

(7.52)

onde: f.L : e fl~ so os termos funes de Sem flx e f.Lp, quando S constante.
Para um valor de S constante, por exemplo, S = 10g/L (utilizando o mes-
mo procedimento exemplificado na Etapa 3 para identificao do tipo de inibi-
o pelo produto) so traados os grficos de ln(f.Lx) vs. P (Fig. 7.6(A)- Etapa 3)
e ln(f.Lr) vs. P (Fig . 7.10) com os dados de fl x, f.Lr e P correspondentes a esse valor
de S nos 4 ensaios disponveis . Os coeficientes angulares das retas ajustadas
so as estimativas de KP e K~. Pela metodologia proposta, torna:-se evidente
que a estimativa obtida ser to mais precisa quanto maior for o nmero de en-
saios disponveis.
Ajuste de parmetros do modelo formulado 153

0,8 - , - - - - - - - - - - - - - - - ,
0,7
0,6
~ 0,5
~ 0,4
0,3
0,2
y = 0,0142 X+ 0,0219
01
R2 = 0 ,9674
o+----.~~~~~-~
o 20 40 60
p (g/L)

Figura 7.I O - Grfico para obteno da estimativa de K~ .

(2) Estimativa de 1-lxa, K5, 1-lPa e K ~


Para um ensaio com valores de 5 suficientemente baixos (Ensaio 1, por
exemplo), possvel desconsiderar a existncia dos termos de inibio das veloci-
d ades especficas de crescimento e produo pelo substrato (eqs. 7.49 e 7.50, ter-
mos 5 2 /K; e 5 2 /Ki). Dessa forma, possvel linearizar essas equaes.

e -KPP Ks 1 1 (7.53)
--=---+--
1-l x 1-l xa 5 1-l xa

e -K~ P
--=---+ --
Ks 1 1 (7.54)
1-l p 1-lPa 5 1-l Pa
Com os valores de KPe K~ estimados no item ,anterior, possvel traar os gr-
ficos de (e- KPP I 1-lx) vs. (1/5)- Fig. 7.11(A) e (e -KPP /~-tp) vs. (1/5)- Fig. 7.11(B),
com os dados de P, 5, 1-lx e 1-lP disponveis para o Ensaio 1. Os coeficientes lineares e
angulares das retas ajustadas fornecero as estimativas de 1-lx., K5, 1-lPa e K ~.

(A) (B)
160 70
g 140 n. 60
)( 120 ~ 50
~ 100 fl-~
a.. Q.OJ
::.:::-- 40
a. 80
f 60 l~ 30
a. a.
)(
40 X
Ql
20
Ql
y = 8,3514x + 2,2624 y = 3,3837x + 0,9144
20 10
R2 = 0,9975 R2 = 0,9978
o o
o 10 20 o 10 20

1/S (Lig) 1/S (Lig)

Figura 7.I I - Grficos para obteno das estimativas de (A): f.ix. e Ks e (B): f.ira e K~ .
154 Modelagem matemtica e simula~o de processos fermentativos

(3) Estimativa de Ki e Ki
Para um ensaio com valores de S suficientemente elevados (incio do Ensaio
4, por exemplo), possvel desprezar os valores de K 5 e K~ nas equaes das velo-
cidades especficas (eqs. 7.49 e 7.50). Dessa forma, possvel linearizar essas equa-
es.

e~KPP 1 1
--- S+- (7.55)
f.lx Kiflxa f.lxa

e -K~P 1 1 (7.56)
--=--5+-
f.lp Kiflra flPa

Com os valores de Kp e K~ estimados anteri9rmente, possvel traar os gr-


ficos de (e -K.P I f.lx) vs. S - Figura 7.12(A) e (e -K.P I f.lp) vs. S - Fig. 7.12(B) com
os dados de P, S, f.lx e f.lp disponveis para valores elevados de S no incio do Ensaio
4. Os coeficientes angulares das retas ajustadas fornecero as estimativas de Ki e
Ki, considerando os valores de f.lxa e f.!Pa estimados novamente atravs dos coefici-
entes lineares das retas ajustadas.

(A) (B)
3 4
;s 3,5

~
/.
2,5
>< a. 3
:I.
~ 2 2,5
0..
~Oi
~ 1,5 ~:c; 2
...!,...
ICl 1,5
a. ~~

X
y = 0,0037 X + 1 ,6498 a. 1
Q) X y = 0,0123x + 0,6599
0,5 Q)
0,5 .
R2 = 0,9541 R2= 0,9151
o o
o 100 200 300 o 100 200 300
S (g/L) S (g/L)

Figura 7.12 - Grficos para obteno das estimativas de (A): K; e (B): K.

(4) Estimativa de Y x1s e Yp1s


Na construo do modelo assumiu-se que Yp 15 um parmetro fixo e igual a
0,511 (converso estequiomtrica de glicose em etanol). Dessa forma, todas as
"ineficincias" do sistema estaro includas no valor de Yx 1s estimado. A estimati-
va de Y x1s obtida correlacionando o L1X produzido com o l1Sx consumido (subs-
trato consumido para produzir X, obtido descontando do total de substrato
consumido o substrato consumido para produzir P) para os 4 ensaios disponveis.
Ajuste de parmetros do modelo formulado 155

A Figura 7.13 apresenta o grfico de (L1X) vs . (L1Sx), cujo coeficiente angular da reta
que passa pela origem, fornece a estimativa de Yx;s
A Tabela 7.5 apresenta o resultado da estimativa dos parmetros para o mode-
lo matemtico da fermentao alcolica do hidrolisado de mandioca operada em ba-
telada, ajustado preliminarmente aos dados experimentais disponveis (Tab. 7.1).

i 35

~
30
25

-9
20
>< 15
'
8. 10 y = 0,2158 X
5 R2 = 0,9399
o
o 50 100 150
(S 0 - S;).(g/L)

Figura 7.13 - Grfico para obteno da estimativa de YXJS

7.3.2 - Integrao analtica do modelo


Essa tcnica para estimativa de parmetros s aplicvel para casos em que
o modelo matemtico bastante simples, permitindo uma integrao analtica do
seu sistema de equaes diferenciais ordinrias. ONG46 desenvolveu o ajuste de
parmetros para um crescimento microbiano num biorreator operado em batelada
e que obedece cintica de Monod (eqs. 7.41 e 7.42).
Integrando a eq. (7.42) obtm-se:

X=X 0 +Yx;s (5 0 -S) (7.57)

Substituindo as eqs. (7.41) e (7.57) na eq. (7.42), rearranjando e integrando,


obtm-se:

s s t
(7.58)
J Ks+ dS=-J.lm Jdt
s o S[Xo +Yx;s (So -S)] Yx;s o

!1n~ = b
t 50
{ln [1 + a(S 0
t
- S)]} _ d (7.59)

onde:

Yx;s (7.60)
a=--
Xo
156 Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

b =1 + _(X_o:_+_Y_.:.x;-=-sS_o:_) (7.61)
Yx;sKs

d = llm (Xo + Y x;sSo) (7.62)


Yx;sKs
Portanto, b e d podem ser obtidos por regresso linear (da eq. 7.59) desde que
se conhea a.

Tabela 7.5 - Estimativa preliminar dos parmetros do modelo obtidos por linearizao e simplificao do modelo.

Parmetro Valor estimado


...
~x.
(h-1) 0,524() ,;

~Pa
(h-1) 1,305()
I
Ks (g/L) 3,69

K's (g/L) 3,70

Ki (g/L) 446 '


Kr1 (g/L) 53,7 )::

KP (L /g) 0,0442
'" r
K'p (L /g) 0,0142
~~
Yx/s (g/g) 0,216

Yp/s (g/g) 0,511 (fixo)


.~"
(a) Mdia dos valores estimados quando da estimativa
de K5 , K~ e Ki, Kj. '
:. - .. " .. -

Estatisticamente, uma regresso linear pode ser avaliada pelo valor do coefi-
ciente de correlao r, dado por:

(7.63)

onde: n ... nmero de pares de pontos (x, y) a serem ajustados

ln [1 +a(5 0 - S)] (7.64)


X=-------'---
t .
Ajuste de parmetros do modelo formulado I 57

ln (S- 5
0 ) (7.65)
y=--______;;-
t

A soluo do ajuste de parmetros do modelo (J..lm, K5 e Yx;s) reduz-se, ento,


soluo do seguinte problema de otimizao: "Minimizar a funo objetivo: -r2 =
f (a), sujeita s condies a > Oe eq. (7.64) e (7.65)".
Os valores de b e d sb obtidos pelas equaes:

b = (nLxy- LXLY)
(7.66)
nLx 2 -(LX) 2

d = (Ly- bLx) (7.67)


n
Assim como o mtodo de ajuste do modelo por linearizao, esse mtodo
por integrao tambm deve ser utilizado com muito cuidado, pois tambm resu-
me o problema de estimativa de parmetros numa linearizao por transforma-
o de variveis. H alguns srios inconvenientes em usar transformaes de va-
riveis, entre os quais podemos destacar:
as faixas de variaes de logaritmos (por exemplo, utilizados na transfor-
mao de variveis) podem ser muito diferentes das faixas de variaes
das variveis de origem (no caso dos logaritmos, muito menores);
ao utilizar a equao linearizada, o que estar sendo minimizado a dife-
rena quadrtica (quando esta for a forma de clculo dos resduos) entre a
forma transformada "experimental" e a calculada; os parmetros assim
obtidos no sero 'n ecessariamente timos em relao aos desvios da va-
rivel original;
. --.

as variveis transformadas podem no preservar as propriedades da dis-


tribuio de erros das variveis originais do problema, o que pode consti-
tuir uma objeo muito sria sobre a validade do procedimento.
47
AUGUSTO et al. tentaram utilizar o ajuste de parmetros por regresso linear
a partir da integrao do modelo, aplicado ao crescimento microbiano obedecendo
cintica de Andrews, sem conseguir bons resultados pelos motivos expostos aci-
ma.

7.3.3 - Integrao numrica e ajuste por regresso no-linear


A estimao de parmetros recai, na grande maioria dos casos, em problema ~
de regresso no-linear, envolvendo o uso de mtodos numricos de minimizao
da funo objetivo atravs de procedimentos iterativos. 48 No caso do ajuste de pa-
rmetros, a funo objetivo a ser minimizada reflete o resduo calculado entre os
valores experimentais e os valores simulados das variveis de estado. Os proble-
mas freqentemente encontrados ao efetuar regresses no-lineares so:
aproximao numrica de derivadas parciais;
158 Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

obteno de uma estimativa inicial adequada dos parmetros;


existncia de mnimos locais na funo objetivo, isto , a funo resduo
apresenta diversos valores mnimos, que atraem a soluo do mtodo
de regresso empregado, dificultando a convergncia para o mnimo
absoluto;
a prpria escolha da funo objetivo mais adequada (mnimos quadrados,
mxima verossimilhana, etc.);
interao entre parmetros, o que pode levar a grandes intervalos de con-
fiana dos parmetros.
Este ltimo problema ainda mais acentuado quando o modelo contm ex-
presses hiperblicas, e este freqentemente o caso em processos fermentativos
-por exemplo, modelos derivados da expresso de MONOD. 49
Entre os mtodos disponveis para resolver problemas de ajuste de parme-
tros por regresso no-linear podem ser citados:50' 51
Mtodos de ordem "0". Mtodos que no exigem o clculo das derivadas
das EDO em relao aos parmetros do modelo. O mtodo de ordem "O"
mais utilizado o de Nelder & Mead ou mtodo dos poliedros flexveis.
Mtodos de 1." ordem. Mtodos que necessitam do clculo das derivadas das
EDO em relao aos parmetros do modelo. Os mtodos de 1. ordem
mais conhecidos so os de Gauss-Seidel, Gradiente e Marquardt, 52 sendo
este ltimo o mais empregado no ajuste de parmetros de modelos mate-
mticos pela sua alta eficincia computacional.
Entretanto, o mtodo de Nelder & Mead tem se mostrado mais efetivo em
comparao ao mtodo de Marquardt, quando o nmero de parmetros a serem
estimados muito grande, cas c:,ios modelos matemticos de processosfermenta-
tivos. Por es~e motivo, ser detalhado apenas o mtodo de Nelder & Mead de oti-
mizao para estimativa de parmetros por regresso no linear.

7.3.3. 1 - Mtodos dos poliedros flexveis (NELDER & MEAD?'


H muito tempo sabe-se que determinar o mnimo de funes de n variveis
pelo conceito mais simples- caso do estabelecimento de uma rede de pontos em
e e valorando-se a funo em cada ponto desta rede, ou a busca de um mnimo
atravs de movimentos randmicos - extremamente ineficiente. O mtodo de
Nelder & Mead um mtodo simplex geomtrico flexvel, conhecido como o m-
todo dos poliedros flexveis. O mtodo dos poliedros flexveis minimiza uma fun-
o de n variveis independentes, usando (n+l) vrtices de um poliedro no espao
En ~ Cada vrtice definido por um vetor x (neste caso, por um conjunto de par-
metros). O vrtice em e
que fornece o maior valor da funo objetivo (neste caso
o maior resduo entre as variveis calculadas e as variveis experimentais) proje-
tado atravs do centro de gravidade dos vrtices remanescentes. Melhores (meno-
res) valores da funo objetivo so obtidos, substituindo, sucessivamente, o ponto
com maior valor de f(x) por pontos melhores, at se obter o mnimo de f(x).
Ajuste de parmetros do modelo formulado I 59

Sejam:

i=1, ... ,n+1


i-simo vrtice em e no k-simo estgio da busca

f [!~k) ] valor da funo objetivo no vrtice <k)

!~~)2 centro de gravidade de todos os vrtices excludo !hk)

x<k) .
-n+2,]
=_!_~(~x~k))-x<~>]
n L. IJ hJ
j = 1, ... 'n (7.68)
i=l

onde o ndice "j" designa cada coordenada do vrtice.

O procedimento para obter um vrtice em En no qualf(x) tem um valor "me-


lhor", envolve 4 operaes descritas a seguir.

(1) Reflexo: Refletir !hk) atravs do centro de gravidade !~~)2

x<k) = x<k) +a(x(k) - x<k)) (7.69)


-n+3 - n+2 -n+2 -h

onde a > O ... o coeficiente de reflexo.

x<k) =x(k) +y(x(k) -x(k)) (7.70)


-n+4 - n+2 -n+3 -n+2

onde y > 1 ... o coeficiente de expanso.


Se f [!~:_>4 ]<f [!\k) 1 substituir!~) por !~l 4 e continuar do passo (1) com k =
k+l. Caso contrrio, substituir!~) por !~l 3 e continuar do passo (1) com k = k+l.
I 60 Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

3
(3) Contrao: Se f [!~:) ]>f [!~k) 1 para todo i =t h, contrair o vetor (!hk) - !~:)2 ), cal-
culando:

x(k) = x(k) + A(x(k) _ x(k) ) (7.71)


-n+S -n+2 1-' -h -n+2

onde O < p < 1 ... o coeficiente de contrao.


Substituir !hk) por !~:ls e continuar do passo (1) com k = k+l.

( 4) Reduo: Se /[!~:!3 ]> /[!hk)] reduzir todos os vetores (!~k) - !\k) ), i = 1, 2, ... ,
n+1, por um fator de meio, a partir de !\k), calculando:

x\k) =x(k) +0 S(x\kl -x(k)) i= 1, ... , n+1 (7.72)


-1 -1 I -1 -1

e continuar do passo (1) com k = k+l.


O critrio usado por Nelder & Mead para trmino da busca, consiste em ve-
rificar se:

(7.73)

isto , a convergncia ocorre se a raiz quadrada da mdia dos quadrados das dife-
renas entre a funo objetivo calculada em cada vrtice e a funo objetivo calcula-
da no centro de gravidade for menor que um determinado valor s. A Figura 7.14
apresenta um fluxograma que ilustra a aplicao do mtodo dos poliedros flexveis
para a soluo de um problema de otimizao.
Os valores de a, p e y recomendados por Nelder & Mead so: a = 1, p = 0,5 e
y = 2. Na prtica observa-se, entretanto, que seria necessrio ajust-los caso a caso.
PICCOLI et al. 53 estabeleceram os seguintes valores ao ajustar modelos com 9, 13 e
24 parmetros: a= 1,0, p = 0,8 e y = 1,5.
47
Trabalho recente de AUGUSTO et al. buscou comparar a aplicao do mto-
do de regresso no-linear sem clculo de derivadas (poliedros flexveis de Nelder
& Mead), e com clculo de derivadas (Marquardt), ao ajuste dos parmetros de
dois modelos de processos fermentativos. Para um processo descontnuo de cres-
cimento microbiano com um nico substrato limitante e inibitrio (modelo com 4
parmetros), a metodologia de Marquardt levou a um ajuste satisfatrio para um
maior nmero de casos (por "caso" entendem-se diferentes formas de clculo do
resduo e diferentes estimativas iniciais dos parmetros) em relao ao mtodo
dos poliedros flexveis; no que se refere ao tempo de processamento, o mtodo de
Marquardt, como era de se esperar, mostrou ser muito mais eficiente na grande
maioria dos casos testados. Para um processo que, alm dos fenmenos descritos
no caso anterior, apresenta tambm a formao de um produto metablico asso-
ciado e no associado ao crescimento, e que inibe o processo (modelo com 8 par-
Ajuste de parmetros do modelo formulado I6I

metros), quando a mesma forma de clculo dos resduos for empregada, o mtodo
dos poliedros flexveis produziu um maior nmero de ajustes satisfatrios em re-
lao ao mtodo de Marquardt. Como os modelos matemticos de processos fer-
mentativos tm, geralmente, um nmero de parmetros maior do que 8, a metodo-
logia apresentada para ajuste, por regresso no linear, dos parmetros (poliedros
flexveis), est de acordo com este resultado.

maior F.O. = Pior vrtice


menor F. O. = Melhor vrtice

Parmetro
Substituir o pior vrtice 0,1 <Beta< 0,9
pelo vrtice da reflexo

Figura 7.14 - Fluxograma ilustrativo do mtodo dos poliedros flexveis

Um aspecto que se tem mostrado crucial no ajuste de parmetros por dife-


rentes mtodos de regresso no linear o da definio da funo objetivo, isto ,
162 Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

a forma de calcular o resduo entre os valores calculados pelo modelo e os valores


experimentais. 54 A Tabela 7.6 apresenta vrias formas possveis para o clculo dos
resduos entre os valores calculados e os valores experimentais indicando, quando
for o caso, os problemas observados quando da sua utilizao. Na Tabela 7.6 so
indicadas as frmulas para clculo dos resduos que apresentaram melhores resul-
tados. Sabe-se, entretanto, que a melhor frmula para clculo do resduo depende
do mtodo de ajuste e tambm da estimativa inicial dos parmetros empregada.

Tabela 7.6 - Diferentes frmulas para clculo dos resduos .

Nmero Frmula de clculo Problemas na utilizao

R= Lli -yY Variveis com elevado valor ab-


1 i soluto privilegiadas no ajuste.

Tendncia a ajustar melhor as va-


R = L ( __jfj__
- - __jfj__r
2 i (yi )m (y; )m riveis prximas aos valores m-
ximos.

Resduos muito elevados para va-


3
R=L(Yi:Y;r lores muito pequenos da varivel
i Yi
calculada

Resduos muito elevados para va-


4
R=L(yi-Yir lores muito pequenos da varivel
i Yi
experimental.

5
R=
~ [ J
y~ -yi
(y' t )
Resduos elevados para valores
muito pequenos e diferentes das
variveis calculada e experimen-
tal.
'

Idem frmula "5", R s calculada


6 -
quando Yi > e(yi )m

R = :E /r -1/ + :E/a -1/


7 (r e a so calculados para cada va- -
rivel e para cada ensaio)

R =/r -1/+ ja-1/


(r e a so calculados com todas as
8 variveis normalizadas e todos os -
ensaios ajustados por uma nica
reta.)

R ... resduo
Yi ... valor experimental da varivel
Yi ... valor calculado da varivel
(yi)m ... mximo valor da varivel experimental
r ... coeficiente de regresso linear entre as variveis experimentais e calculadas
a ... coeficiente angular combinado entre as variveis experimentais e calculadas.
Ajuste de parmetros do modelo formulado 163

EXEMPLO NUMRICO-ETAPA 5
Nessa etapa do exemplo apresentado o ajuste, por regresso no-linear,
utilizando o mtodo dos poliedros flexveis, do modelo matemtico (eqs. 7.46 a
7.50- etapa 4 do exemplo numrico) da fermentao alcolica de hidrolisado de
mandioca em um sistema batelada. O modelo ajustado simultaneamente ao con-
junto de 4 ensaios experimentais, ilustrados na Tabela 7.1.
O ajuste global dos ehsaios 1 a 4 (Tabela 7.1) ser realizado pelo mtodo de
regresso no-linear de ordem "O" - mtodo dos poliedros flexveis, utilizando
um software desenvolvido em linguagem Fortran. As principais caractersticas do
ajuste realizado e o resultado obtido so listados a seguir.

(1) Parmetros do mtodo:


a= 1,0
f3 = 0,8
y = 1,5
e< 10-5 (convergncia).
(2) Parmetros ajustados: 9 (t-tx., llPa' K5, K~, Ki, Kj, KP, K~, Yx 15 ).

(3) Parmetros fixos do modelo: 1 (Yr 15 ).


(4) Estimativa inicial dos parmetros empregada: resultado do ajuste preliminar
dos parmetros (Tab. 7.5).
(5) Frmula de clculo do resduo empregada: "frmula 6" (Tab. 7.6).
(6) Valor do resduo com a estimativa preliminar dos parmetros - condio
inicial do programa de ajuste:
Resduo= 24,1
Coeficiente angular da regresso linear entre todos os valores calculados e
experimentais= 0,923
Coeficiente de correlao da regresso linear entre todos os valores calcu-
lados e experimentais= 0,928.
(7) Resultado do ajuste obtido:
Nmero de iteraes = 971
Resduo = 1,43
Coeficiente angular da regresso linear entre todos os valores calculados e
experimentais = 1,00
Coeficiente de correlao da regresso linear entre todos os valores calcu-
lados e experimentais = 0,990.
Valores dos parmetros (Tab. 7.7)

A Figura 7.15 ilustra a qualidade de ajuste obtido para o Ensaio 4. Para os


outros 3 ensaios o resultado semelhante, como pode ser atestado pelo valor do
resduo obtido.
164 Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

Tabela 7.7 - Valores dos parmetros do modelo obtidos por regresso no -linear aplicando o mtodo
dos poliedros flexveis.

;
Parmetro Valor estimado
.
:~
:1.
:..
1
J..lxa (K ) 0,672 >1
.!

1
f..lpa (h- 2,08 ~-.1~
..
)

K5 (g/L) 6,16
Ks (g/L) 7,88 t1

Ki (g/L) 347, t
37,4 ,:i
Ki (g/L)
KP (l/g) 0,0436
)!
K~ (l/g) 0,0153
Yx;s (g/g) 0,215
-
.,,,XJ?/5(g!g) 0,511 (fixo) -
, .. ,.,,,... -
' '
... ' .
. -~-~ ... ;\
'i ,;;c;, .,_\ /-" ~"!!'-
-:r:::_;,, ~A":- ,'.1.!;>!

7.4 - Avaliao do modelo matemtico


A ltima etapa do processo de formulao e ajuste de um modelo matemti-
co fenomenolgico consiste na realizao de uma anlise estatstica que visa vali-
dar o modelo, seguida da identificao da necessidade de realizar novos
experimentos no laboratrio, para aprimorar o conhecimento do processo, visan-
do melhorar a qualidade do modelo.

Ensaio 4
70 250
60 * 200
50
:::J
: 150
ll..
40 :::J
:
30
x 100 (/)

20
50
10
o. o
o 5 10 15
Tempo (h)

Figura 7 .I S - Resultado do ajuste global dos ensaios (Tab. 7 .I) utilizando o mtodo dos poliedros flexveis ilustrado
*
para o Ensaio 4. Os pontos indicados so os pontos experimentais (+ X, .. P, S) e as curvas foram traadas utilizan-
do o modelo (equaes 7.46 a 7.50) com os parmetros indicados na Tab. 7.7.

7.4. I - Anlise estatstica


O ajuste dos parmetros do(s) modelo(s) proposto(s) a um conjunto de ensaios
experimentais normalmente avaliado e considerado satisfatrio ou no, por
simples inspeo visual do conjunto de ensaios, alm da anlise do resduo mni-
mo obtido (conforme descrito no item anterior deste captulo). Essa avaliao
Avaliao do modelo matemtico 165

tanto mais vlida, na medida em que for levada em conta a falta de reprodutibili-
dade e o grande erro experimental inerente aos processos biolgicos. Apesar dessa
constatao, importante submeter os ajustes obtidos a uma anlise estatstica es-
pecfica, com dois objetivos bsicos:
verificar se possvel discriminar um ou mais modelos propostos em rela-
o aos outros, nos casos em que foi possvel ajustar mais de um modelo
matemtico ao conjri.nto de dados experimentais disponveis (teste do x2
de Bartlett);
verificar se o(s) modelo(s) remanescente(s) representam adequadamente o
conjunto de dados experimentais disponveis (teste F e teste de randomici-
dade).

7.4.1 . 1 - Teste do X2 de BARTLETI55


Para saber se h modelos no adequados, entre um conjunto de modelos
ajustados, testa-se a homogeneidade das estimativas do erro experimental, ou
seja, testa-se se o valor da varincia de algum modelo estatisticamente diferente
dos demais. Isso feito usando o teste do x2, calculando o x ~ale atravs da frmula
de Bartlett:

I I
m m
ln(s ) ~)d. f.L - ~)d.f. )i (st)
2

2 i=l i=l (7.74)

Xcalc =
1+ 1 ! - 1 _ m 1
3(m -1) i=l (d.f.L tt(d.f.)i

onde: sf ... estimativa da varincia do Modelo "i"

y <k) ... valor experimental


y~k) ... valor calculado (Mod."i")
2
5 estimativa combinada da varincia
m
~)d.f. ) i sf
52 = .: . i=. .:ol_ __
m
~)d. f.) i
i=l

(d.{); = n- p; ... graus de liberdade Modelo "i';


n .. ... nmero de pontos experimentais
166 Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

Pi .... nmero de parmetros Modelo "i"


m ..... nmero de modelos ajustados.

Se X ~ale > x ~ab (a, m - 1) ... o modelo ao qual corresponde o maior valor de s ~
descartado, e assim sucessivamente, at restar apenas 1 modelo; o valor de
X~ab(a, m-1) obtido em tabelas estatsticas onde o nvel de significncia esco-
56

lhido (geralmente 5%).


Se x ~ale <X ~b (a, m -1) ... nenhum dos modelos pode ser descartado; faz-se
novos experimentos, at ser possvel definir a no adequao de algum modelo
pelo critrio do x2

7.4.1.2 - Teste F51


A anlise estatstica realizada no item anterior no garante que o(s) mode-
lo(s) aprovados representem satisfatoriamente o conjunto de ensaios ajustados.
Para obter esse resultado utiliza-se o Teste F, que se baseia na obteno do chama-
do "erro experimental", obtido a partir de uma srie de repeties do mesmo en-
saio (ensaio padro). Essa estimativa do "erro experimental" deve levar em conta,
entre outros, a falta de reprodutibilidade de processos fermentativos (devida prin-
cipalmente influncia da "histria" da populao microbiana), a dificuldade em
manter condies homogneas dentro do biorreator e os prprios erros analticos
e de amostragem comuns na atividade laboratorial. Para a avaliao do erro expe-
rimental, deve ser feito um certo nmero de experimentos repetidos, em pelo me-
nos uma condio experimental.
Assim, definindo~se F caic como a relao entre o erro obtido pela falta de
ajuste e a estimativa do erro experimental, obtm-se para a formulao do Teste F:

(7.75)

onde: s~ ... estimativa da varincia do erro do Modelo

n ... nmero de pontos por varivel


v ... nmero de variveis (concentraes de clulas, produtos e substratos)
(nv) c ... nmero de pontos ajustados (para todos os ensaios e variveis)
p ... nmero de parmetros do Modelo
yij valor da varivel calculado pelo Modelo
y ij ... valor experimental da varivel.
Avaliao do modelo matemtico 167

s; ... estimativa da varincia do erro experimental

(nv)e ... nmero de pontos experimentais (para todos os ensaios repetidos


e variveis)
yi ... mdia da varivel para os ensaios repetidos.

Como o valor da distribuio F, Ftab[a,(nv)c -p,(nv)e -v]:=1 (quando a=


5%, (nv)c ~ oo e (nv)e ~ oo) 56 uma vez que (nv)c e (nv). so, normalmente elevados,
ento para que o modelo represente adequadamente os dados experimentais ajus-
tados (ou, em outras palavras, no apresente falta deajuste), necessrio que:

ou

7.4.1.3 - Teste de randomicidade 57


O teste de randomicidade til na verificao de eventuais tendncias no
ajuste de um modelo matemtico a um conjunto de dados experimentais. Os res-
duos verificados entre os dados experimentais e os dados do modelo podem ser
positivos ou negativos, mas se eles so verdadeiramente aleatrios, o sinal dos
mesmos deve mudar de maneira randmica. Essa randomicidade, ou ausncia da
mesma, pode ser detectada visualmente plotando, por exemplo, os resduos versus
a varivel independente (tempo), ou versus as variveis dependentes (variveis de
estado). A seguir, revisaremos alguns conceitos estatsticos necessrios para o en-
tendimento do teste.

Distribuio normal: distribuio contnua de probabilidades, tambm cha-


mada de distribuio gaussiana; dada por:

_ - 1- e -(y-YJ' /2crz
f( y) - (7.76)
cr..ffit
onde: y ... mdia da distribuio
cr ... desvio padro da distribuio.

Varivel Z: varivel padronizada correspondente a y; que possui mdia O e


desvio padro 1 e, portanto, dada por:

y-y (7.77)
Z=--
cr
168 Modelgem matemtica e simulao de processos fermentativos

Nvel de significncia: ao testar uma hiptese, a probabilidade mxima com


que desejamos arriscar um erro do tipo 1 (rejeitamos a hiptese quando ela deve-
ria ser aceita) chamada nvel de significncia do teste; na prtica costuma-se
adotar um nvel de significncia de 0,05 ou de 0,01, embora outros valores possam
tambm ser usados; no caso do teste de randomicidade ser adotado um valor de
0,05 para o nvel de confiana.

Regio crtica: conjunto de valores de Z exteriores ao intervalo de -1,96 a


1,96.

Regio de aceitao: conjunto de valores deZ interiores ao intervalo de -1,96 a


1,96.
A randomicidade dos resduos entre os valores das variveis calculadas, uti-
lizando o modelo ajustado e os valores experimentais quantificada, medida e
testada segundo o procedimento descrito a seguir.
Definindo: N 1 . nmero de resduos positivos (Ycalc > Yexp);
N 2 nmero de resduos negativos (Ycalc < Yexp);
R ... nmero de vezes que a sequncia de resduos muda de sinal.
A distribuio de R ento aproximada pela distribuio normal. A mdia e
o desvio padro desta distribuio so calculados atravs das eqs. (7.78) e (7.79),
apresentadas a seguir.

(7.78)

2N 1 N 2 (2N 1 N 2 -N 1 -N 2 ) (7.79)
2
(N 1 +N 2 ) (N 1 +N 2 -1)

A forma padronizada (Z) da varivel (R) dada ento pela eq. (7.80)

Z=R-R (7.80)
crR

sendo distribuda com mdia Oe desvio padro 1.


Para testar a hiptese de que os desvios so randmicos, Z comparada com
a distribuio normal padro. Se o valor de Z muito baixo, b modelo inadequa-
do; por outro lado, se o valor deZ muito alto, os dados experimentais contm os-
cilaes que precisam ser consideradas pelo modelo. Se o valor de Z cair na regio
de aceitao, ento a hiptese de randomicidade pode ser aceita. Dessa forma,
existem 3 casos possveis exemplificados a seguir.
Caso Randmico: N 1 = 21; N 2 = 30; R= 29; R= 25,7; crR = 3,42
Z = 0,965 (dentro da regio de aceitao)- ajuste satisfatrio.
Avaliao do modelo matemtico 169

Caso Oscilante: N 1 = 26; N 2 = 25; R = 50; R = 26,5; crR = 3,5


Z = 6,7 (fora da regio de aceitao) .
primeira vista, esse seria um bom ajuste. Entretanto, um exame mais crite-
rioso detectaria urna oscilao padro do resduo em relao a zero. A adi-
o de um termo que introduza comportamento oscilatrio ao modelo em
questo, poderia melhorar consideravelmente o ajuste do modelo aos dados
experimentais. 1

Caso positivo/negativo: N 1 = 32; N 2 = 19; R= 3; R= 24,8; crR = 3,3


Z = -6,6 (fora da regio de aceitao).
Clara tendncia dos resduos de positivo para negativo ou vice-versa, detec-
tada pelo fato de R ser baixo. Por exemplo, para baixos valores da varivel
independente, o resduo positivo e para altos valores da varivel indepen-
dente, o resduo negativo. O modelo deve ser corrigido para minimizar
essa distoro.

EXEMPLO NUMRICO-ETAPA 6
Nessa etapa apresentada a anlise estatstica do modelo ajustado (Etapa 5)
para a fermentao alcolica de hidrolisado de mandioca em um sistema batelada
ao conjunto de 4 ensaios (Tab. 7.1).
Na medida em que existe um nico rnoqelo ajustado aos dados experimen-
tais, sero aplicados apenas os testes estatsticos para verificar a adequao deste
modelo.
(1) Teste F. Para aplicar o Teste F calculada a estimativa do erro do modelo
ajustado na Etapa 5 deste exemplo numrico (Tab. 7.7 e Fig. 7.15). Calcula-se a es-
timativa da varincia do erro do modelo (s~) comparando os valores das variveis
de estado obtidas pelo modelo ajustado em relao aos dados experimentais dis-
ponveis:
v n
2
LLlij- Yij) = 3023,74
i=l j=l

(nv)c = 135 (nmero total de variveis de estado medidas nos 4 ensaios)


p = 9 (parmetros ajustados do modelo)

s2 = 3023,74 = 24 0
C 135-9 I

Na medida em que no se dispe de urna medida precisa da estimativa do


erro experimental, urna vez que no foram fornecidas repeties de um mesmo en-
saio, a partir das quais esta estimativa seria obtida, a aplicao do teste F ser mo-
dificada, calculando-se o erro experimental que, se existente, garante que o
modelo ajustado representa adequadamente os dados experimentais disponveis.
I 7O Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

Para tanto obtm-se, a partir dos valores das variveis de estado medidas experi-
mentalmente, a somatria do quadrado de todas elas:

(nv)e = 135
v= 3 (nmero de variveis de estado)
e a estimativa da varincia do erro experimental (s;) dada ento, por:

58155& 2
s2 =----
e 135-3
onde t ... estimativa do erro experimental.
Como necessrio para que o modelo seja adequado para representar os da-
dos experimentais disponveis, que s~ < s;, ento:

t> 24,0 * (135- 3) >o 074


581555 '

O resultado obtido indica que, se o erro experimental dos dados disponveis


for maior do que 7,4%, o modelo ajustado adequado, segundo o teste F modifica-
do. Na medida em que 7,4% um erro experimental baixo para variveis medidas
em processos fermentativos (principalmente se for levada em conta a falta de re-
produtibilidade inerente a estes processos), conclui-se que modelo ajustado
adequado.
(2) Teste de Randomicdade. Para aplicar o teste de randomicidadE!, descrito
em detlhe neste captulo, verifica-se o nmero de resduos <Ycalc- Yexp) positivos e
negativos alm do nmero de vezes em que o resduo troca de sinal (nesta anlise,
considerou-se o resduo "O" equivalente a uma troca de sinal em relao aos resduos
positivos e negativos). Vrias formas de aplicao desse mtodo so possveis- na
presente etapa do exemplo numrico verifica-se a randomicidade das 3 variveis
de estado do processo (X, P e S) separadamente, considerando-se, na anlise de
cada uma a seqncia de 4 ensaios da Tabela 7.1. Repete-se o teste para as 3 vari-
veis de estado de forma conjunta, ainda seguindo a seqncia de ensaios da Tabe-
la 7.1. A Tabela 7.8 apresenta o resultado dessa anlise.
Pelo resultado apresentado na Tabela 7.8, pode-se concluir -na medida em
que o valor deZ caiu na regio de aceitao (-1,96 < Z < 1,96) em todos os casos-
que a hiptese de randomicidade dos desvios entre os valores das variveis de es-
tado do processo calculadas pelo modelo e os valores medidos experimentalmente
pode ser aceita, indicando, mais uma vez, a adequao do modelo formulado e
ajustado.
Avaliao do modelo matemtico 17 I

Tabela 7.8 - Resultados do teste de randomicidade.

Teste por varivel de estado


Teste conjunto
X p s
..
N 1 =24 N 1 = 26 N 1 = 14 N 1 =64 .
'-t:
N 2 = 16 N 2 =114 N 2 = 25 N 2 =55
'~
"O"= 5 "O"= 5 "O"= 6 -~
"O"= 16
1
R= 18
-
R= 20,2
R= 16
-
R =19,2
R= 17
-
R =18,9
R= 53
-
R= 60,2
F~:

<JR = 2,99 <JR = 2,83 <JR = 2,83 = 5,4 r:~.


<JR
li..ii
z = -0,736 z = -1,13 z = -0,67 z = -1,33 ~ .
~ H~-1:, -'"""':. ' ,. ,. '. . \. :~ ..-....., ~--~ ,~.: ' :' .~ ... ~ . :'- :\i! . ..' : . . , o: :

7.4.2 -Projeto de experimentos


Esta tcnica relaciona o procedimento para estimar parmetros e o trabalho
experimental de obteno das medidas a serem usadas naquele procedimento,
bem como na prpria proposio e principalmente confirmao dos modelos ma-
temticos.
"Projetar" um experimento significa escolher, de forma organizada e siste
mtica, as condies experimentais que sero usadas nos experimentos, visando
um dado objetivo.
Esse planejamento de experimentos pode ser feito a priori, como no projeto
fatorial, ou seqencialmente (e iterativamente) com os experirpents, como no
projeto seqencial.
No projeto de experimentos, o que se procura fazer otimizar o trabalho ex-
perimental, ou seja, minimizar o nmero de experimentos necessrios para se ob-
ter uma dada informao. Portanto, procura-se diminuir o esforo de
experimentao e os custos envolvidos na sua execuo (sejam estes realizados em
laboratrio, em planta piloto ou no equipamento industrial). A tcnica permite
tambm planejar experimentos sob condies tais que levem a uma melhora na in-
formao procurada.
O mais utilizado dentre esses projetos o planejamento fatorial, seja como
um planejamento fatorial completo, quando o nmero de variveis do processo a
serem testadas relativamente pequeno, ou como um planejamento fatorial fracio-
nai, quando o nmero de variveis maior. 58' 59' 60 Essa tcnica no ser detalhada
neste texto, pois existem vrias publicaes especializadas que tratam esse assun
to em grande profundidade, e a sua utilizao no apresenta qualquer especifici-
dade para o caso dos processos fermentativos. 61
O projeto seqencial feito iter:ativamente com a experimentao, ou seja, a
escolha das condies do prximo experimento feita a partir da anlise de todos
os ensaios at ento realizados e das primeiras verses do modelo elaboradas
(uma vez que esta tcnica exige a existncia de um modelo matemtico). A infor-
172 Modelagem matemtica e simulao de processos fennentativos

mao obtida em cada ensaio adicionada s informaes anteriores e toda a an-


lise refeita, para projetar o novo experimento. O objetivo a ser buscado pode ser:
a discriminao entre modelos rivais;
a estimao precisa dos parmetros de um dado modelo.
Na elaborao de um modelo matemtico so testados vrios possveis mo-
delos cinticos para os processos em estudo, buscando-se aquele que melhor re-
presente as condies reais na faixa operacional de interesse. Para o modelo
cintico mais adequado, busca-se ento que seus parmetros sejam estimados com
a mxima preciso possvel.
As ferramentas estatsticas envolvidas em um projeto seqencial de experi-
mentos so: .
um critrio de projeto, isto , como escolher adequadamente as condies
do prximo experimento;
um critrio de parada, ou seja, quando o programa de experimentos pode
ser interrompido em virtude de j se ter atingido o objetivo desejado.
As tcnicas de projeto seqencial de experimentos foram aplicadas princi-
palmente no estudo da cintica de reaes catalticas heterogneas . No entanto,
tm sido pouco exploradas no mbito dos processos fermentativos, onde pode-
riam ser muito teis, dado o grande esforo envolvido na parte experimental
do estudo destes processos. 62
Exemplos de aplicao dessas tcnicas, apresentadas por FROMENT;
BISCHOFF;51 FROMENT; HOSTEN55 e HIMMELBLAU, 50 entre outros, mostram uma
reduo significativa (em torno de 50%) no nmero de experimentos necessrios
para a discriminao entre modelos rivais ou para a estimao precisa dos par-
metros.

7.5 - Simulao de processos fermentativos


Simular, nada mais do que utilizar os modelos gerados, de man~ira que os
mesmos reproduzam o comportamento real do sistema, com vistas sua otimiza-
o e ainda permitam extrapolaes vlidas deste comportamento. A simulao
por computador pode ser de dois tipos, conforme definido a seguir.
Simulao analgica. feita por meio de circuitos eletrnicos. Tem como van-
tagem a facilidade com que resolve equaes diferenciais, produzindo uma sada
em forma grfica. Tem como grande desvantagem a velocidade de processamento
lenta. Foi muito utilizada nas dcadas de 50 e 60. 63
Simulao digital. feita por meio de computadores digitais. Tem como gran-
de vantagem em relao analgica a velocidade de processamento e uma grande
capacidade de memria. Torna possvel a abordagem de problemas muito mais
sofisticados. Tem como desvantagem a necessidade de se implementar ou criar
tcnicas numricas de integrao, diferenciao, convergncia, etc. Atualmente,
todo o trabalho de simulao , praticamente, feito em computadores digitais.
Dessa forma, quando algum se refere simulao em computador, .est sempre
se referindo simulao digital. 63
Avaliao do modelo matemtico 173

Do ponto de vista do problema matemtico a ser resolvido, existem dois ti-


pos bsicos de simulao, descritos a seguir.
Simulao esttica. Simulao esttica refere-se a sistemas que esto operan-
do em regime permanente, isto , independentes do tempo. Por exemplo, a simu-
lao ou o projeto de uma planta de processo ou de um equipamento (biorreator),
operando em regime contnuo, so realizados em regime permanente, ou seja,
atravs de uma simulao es1ttica.
Simulao dinmica. Neste caso, a preocupao com a representao desiste-
mas que variam no tempo. Normalmente, trabalha-se com equaes diferenciais or-
dinrias no tempo para biorreatores operando em batelada ou durante o transiente
de sistemas contnuos; pode-se trabalhar, ainda, com equaes diferenciais parciais
no tempo e no espao, quando analisado o comportamento de biorreatores tubula-
res ou mesmo de biorreatores completamente heterogneos.
Evidentemente, a qualidade da simulao realizada vai depender dos se-
guintes aspectos:
qualidade dos modelos utilizados na simulao;
confiabilidade das propriedades fsicas e biolgicas empregadas na for-
mulao dos modelos;
bom senso na seleo dos mtodos numricos a serem empregados, bem
como com a anlise dos resultados de uma simulao - muitas vezes os
modelos so confiveis, as condies operacionais so adequadas, mas um
problema numrico qualquer gera res~ltados inconsistentes.

7.5.1 - Tcnicas matemticas


Na simulao de processos fermentativos homogneos e heterogneos, exis-
tem 4 tcnicas matemticas de clculo numrico largamente empregadas e que so
adequadas para resolver a maioria dos problemas a serem enfrentados:
mtodos de soluo de equaes algbricas no lineares (mtodos de con-
vergncia);64
65
mtodos de soluo de sistemas de equaes algbricas no lineares;
mtodos de soluo de sistemas de equaes diferenciais ordinrias de 1.
ordem - problemas de valor inicial/6
mtodos de soluo de sistemas de equaes diferenciais parciais - mto-
do de colocao ortogonal. 57
Por fugirem do escopo deste captulo, no sero detalhadas essas tcnicas, mas
o leitor interessado poder encontrar as informaes necessrias sua adequada uti-
lizao na soluo de problemas de simulao, nas referncias apresentadas:

7.5.2 ~ Otimizao de processos fermentativos


Muitas vezes a etapa de fermentao a crtica no estabelecimento dos par-
metros econmicos de um processo biotecnolgico; entretanto, isto nem sempre
verdadeiro, o que complica sobremaneira a definio da funo objetivo a ser oti-
mizada. Entende-se por funo objetivo a representao atravs de uma funo
matemtica do objetivo a ser buscado na operao do processo em estudo. Po-
174 Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

de-se, ento, definir uma funo com objetivo tcnico (maximizar a produtivida-
de, por exemplo) ou econmico (maximizar o lucro, por exemplo) ou, ainda, mis-
67
turando critrios tcnicos e econmicos. Uma vez definida essa,funo, preciso
um mtodo de otimizao de funes (ou otimizao de parmetros ou otimiza-
o esttica), para obter-se um ponto mximo ou mnimo. Existem vrios mto-
68
dos de otimizao descritos e periodicamente melhorados na literatura. Esses
mtodos podem, ou no, fazer uso de derivadas (da funo objetivo ou do mode-
lo) em relao s variveis de otimizao, sendo usualmente preferidos os mto-
dos que no usam derivadas -chamados mtodos de pesquisa direta- pela fa-
cilidade da sua execuo. Nesta categoria de mtodos de otimizao destaca-se o
mtod~ dos poliedros flexveis de Nelder & Mead, j utilizado para o ajuste de
parmetros.

EXEMPLO NUMRICO-ETAPA 7
Nessa etapa apresentada a otimizao da produtividade da fermentao
alcolica de hidrolisado de mandioca operada num sistema em batelada, utilizan-
do o modelo ajustado no Etapa 5.
No caso do sistema operado em batelada as variveis operacionais possveis
de serem manipuladas, com vistas a maximizar a produtividade, so as concentra-
es iniciais de clulas e substrato, fixada a concentrao inicial de produto pro-
duzido durante a fase de preparo do inculo. Entretanto, uma anlise do processo,
a partir do seu modelo, permite concluir que a produtividade, funo objetivo es-
colhida, monotonicamente crescente com a concentrao inicial de clulas, isto ,
a produtividade do processo cresce indefinidamente com o aumento de X0 Na
medida em que, operacionalmente, existem limitaes quanto concentrao ini-
cial de clulas que pode ser empregada, sero considerados valores fixos de X0 (X0
= 2,0 g/L) e P 0 (P0 = 2,0 g/L) e variaremos apenas 5 0 na busca do valor mximo da
produtividade.
Dessa forma, o problema de otimizao proposto resolvido, integrando o
sistema de equaes diferenciais, que compem o modelo do processo para dife-
rentes valores de 5 0, at se obter a produtividade mxima correspond~nte a cada
operao. A Figura 7.16 apresenta o resultado dessas simulaes, sendo possvel
concluir que a produtividade mxima do processo estudado de 5,26 g/L.h, obti-
da numa operao com 5 0 =260,0 g/L.
6
oc
iil
E
5
4
/
r -

Q)~



Q).c:
-o ....I 3
~s
:~
:5
"O
2
e
Q.
o
o 200 400 600

S0 (g/L)

Figura 7.16 - Produtividade em etanol em funo da concentrao inicial de substrato num processo em batelada.
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processos biotecnolgicos. In: SINAFERM - Simpsio Nacional de Fermentaes, agosto,
Uberlndia, MG. Anais em CD-ROM.
(68) EDGAR, T.F. and HIMMELBLAU, D.M., 1989. Optimization of Chemical Proces-
ses. McGraw-Hill, Inc., Nova York.


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! ;

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--------- - --
Willibaldo Schmidell
Maria Cndida Reginato Facciotti

8.1 - Introduo
Denominam-se "biorreatores", "reatores bioqumicas", ou ainda "reatores
biolgicos", os reatores qumicos nos quais ocorrem uma srie de reaes qumi-
cas catalisadas por "biocatalisadores". Esse~ .biocatalisadores podem ser enzimas
ou clulas vivas (microbianas, animais ou vegetais). Assim, logo de incio, pode-se
classificar os biorreatores em dois grandes grupos:
Grupo 1: Biorreatores nos quais as reaes ocorrem na ausncia de clulas
vivas, ou seja, so tipicamente os "reatores enzimticos";
Grupo 2: Biorreatores nos quais as reaes se processam na presena de
clulas vivas".
Embora no seja totalmente generalizado, h alguns autores, porm, que uti-
lizap:t a denominao "reatores bioqumicas" para se referirem apenas ao primeiro
grupo, restringindo assim a denominao "reatores biolgiCos" apenas aos reato-
res que operam com clulas vivas.
Com relao aos reatores com clulas vivas, pode-se afirmar que os mais
amplamente conhecidos e com uso bastante difundido, so os reatores com mi-
crorganismos, os quais vm sendo empregados desde a dcada de 1940 para a pro-
duo industrial de uma grande diversidade de produtos, tais como enzimas,
antibiticos, vitaminas, cidos orgnicos, solventes, ou ainda no tratamento de re-
sduos orgnicos industriais ou domsticos.
Embora se fale globalmente em "reatores com microrganismos", muito im-
portante destacar que, do ponto de vista da engenharia, dependendo do tipo de
microrganismo utilizado, tais reatores podem ter caraCtersticas bastante distintas
no que se refere aos fenmenos de transporte que ocorrem no reator (calor, massa
e quantidade de movimento). Assim, por exemplo, reatores que operam com orga-
I 80 Biorreatores e processos fermentativos

nismos unicelulares como bactrias e leveduras possuem, em geral, um comporta~


mento reolgico bastante distinto .daqueles que empregam fungos filamentosos
(bolores).
Deve~se mencionar ainda os biorreatores que operam com elevadas concen~
traes celulares ("high cell density cultures"), o que propicia altas velocidades de
converso do substrato em produto. Um exemplo dessa situao a fermentao
alcolica, na qual se opera com cerca de 30g clulas/litro de meio (matria seca).
Particularmente, no caso de biorreatores que empregam microrganismos i"ecombi~
nantes, em virtude de uma possvel baixa produo especfica da protena heter~
Ioga de interesse, busca~se operar com concentraes celulares da ordem de
lOOg/L/ o que e?Cige condies especiais de operao.
Outro campo de recente desenvolvimento o cultivo de clulas animais e ve~
getais, tendo alcanado rpido progresso nos ltimos dez anos, constituindo~se hoje
num dos grandes temas de aplicao da Biotecnologia Moderna. Assim, pode~se ci~
tar o emprego de biorreatores com clulas animais para a produo de uma srie de
produtos ligados sade humana e animal, tais como vacinas virais, anticorpos
monoclonais, hormnios e fatores de crescimento.2' 3' 4 No que se refere s clulas ve~
getais, h exemplos de produo de princpios ativos de medicamentos, como mor~
fina e quinina, e outros produtos de utilizao na indstria cosmtica.5 Os reatores
que empregam clulas animais ou vegetais, em geral possuem vrias particularida~
des, tendo em vista as diferentes caractersticas apresentadas por este tipo de clu~
las em relao s clulas microbianas, destacando~se entre elas a elevada
sensibilidade ao cisalhamento, caracterstica que, em casos extremos, leva nec~ssi~
dade da utilizao de biorreatores no~convencionais, como reatores "air~lift", ou
ainda os reatores com membranas, nos quais no se tem agitao mecnica e, conse~
qentemente as tenses de cisalhamento so menores. 6' 7

8.2 - Classificao dos biorreatores


Encontram~seindicadas na literatura vrias formas possveis de classificar
os biorreatores, como por exemplo:
quanto ao tipo de biocatalisador (clulas ou enzimas);
quanto configurao do biocatalisador (clulas/enzimas livres ou imo~
bilizadas);
quanto forma de se agitar o lquido no reator.
Dentre as vrias classificaes encontradas nos livros~textos que abordam o
tema biorreatores, uma das mais abrangentes a de KLEINSTREUER, 8 que apresen~
ta. uma classificao mista, com base no tipo de biocatalisador empregado (enzi~
ma, microrgarsmo aerbio ou anaerbio) e na configurao deste (livre,
imobilizado ou confinado entre membranas).
Considerando~se, pois, as vrias propostas usualmente encontradas, pro~
pe~se no presente captulo uma classificao mista, a qual pretende ser mais
abrangente que as anteriormente citadas, conforme esquematizado a seguir.
Classificao dos biorreatores 18 I

CLASSIFICAO GERAL DOS BIORREATORES

(I) Reatores em fase aquosa (fermentao submersa)


(1.1) Clulas/enzimas livres
Reatores agitados .p1ecanicarnente (STR: "stirred tank reactor")
Reatores agitados pneumaticamente .
Coluna de bolhas ("bubble colurnn")
Reatores "air-lift"
Reatores de fluxo pistonado ("plug-flow")

(1.2) Clulas/enzimas imobilizadas em suportes


Reatores com leito fixo
Reatores com leito fluidizado
Outras concepes

(1.3) Clulas/enzimas confinadas entre membranas


Reatores com membranas planas
Reatores de fibra oca ("hollow-fiber")

(11) Reatores em fase no-aquosa (fermentao semi-slida)


Reatores estticos (reatores com bandejas)
Reatores com agitao (tambor rotativo)
Reatores.com leito, fixo
Reatores com leito fluidizado gs-slido

Conforme se pode verificar, a partir da classificao proposta, h uma gran-


de variedade de configuraes possveis para os biorreatores mas, no entanto, po-
de-se afirmar que os mais amplamente empregados so os reatores agitados
mecanicamente (STR), conhecidos tambm como reatores de mistura, constituindo
cerca de 90% do total de reatores utilizados industrialmente.
A capacidade dos biorreatores bastante varivel, conforme o processo
em questo, podendo-se distinguir trs grandes grupos no que se refere escala
de produo industrial. Reatores da ordem de algumas centenas de litros at 1 a
2 rn 3 de capacidade, so empregados no cultivo de microrganismos patognicos,
ou para o crescimento de clulas animais ou vegetais, em geral objetivando a
produo de produtos ligados rea de sade. Urna escala intermediria, na
qual se opera com reatores da ordem de algumas dezenas de metros cbicos at
100 a 200 rn 3; especialmente empregada na produo de enzimas, antibiticos e
vitaminas. Finalmente, para processos q ue exigem poucos ou at mesmo ne-
nhum cuidado de assepsia, corno o caso da fermentao alcolica ou do trata-
182 Biorreatores e processos fermentativos

rnento biolgico de resduos, pode-se atingir reatores com alguns milhares de


metros cbicos de capacidade. 9
Conforme indicado na Figura 8.1(a), o reator do tipo STR consiste em um
tanque cilndrico, no qual so comuns relaes entre a altura e o dimetro de 2:1
ou 3:1. 10 Normalmente o reator equipado com chicanas ("baffles"), cuja funo
evitar a formao de vrtice durante a agitao do lquido. O agitador monta-
do num eixo central ao ferrnentador, possuindo, ao longo de sua altura, urna s-
rie de turbinas, as quais podem ser de diferentes tipos, sendo porm a mais
amplamente utilizada a turbina de ps planas ("flat blade"), tambm conhecida
corno turbina "Rushton". As razes que fazem com que este tipo de turbina seja
a mais amplamente empregada em processos ferrnentativos, sero discutidas
adiante, no Captulo 14.
Os reatores agitados pneumaticamente se caracterizam basicamente pela
ausncia do agitador mecnico, sendo a agitao do lquido efetuada apenas
pelo borbulharnento de um gs (normalmente ar) no reator. Corno conseqncia
da ausncia do agitador mecnico, resultam, nesse tipo de reator, menores ten-
ses de cisalharnento, o que os torna atraentes para o cultivo de clulas animais e
vegetais. 6' 7
H na literatura urna considervel diversidade de nomenclaturas para de-
signar os reatores agitados pneumaticamente, no havendo urna clara diferencia-
o entre eles. Segundo MERCHUK, 11 a diferenciao bsica entre os reatores
coluna de bolhas ("bubble colurnn") e os reatores "air-lift", que nestes ltimos
tem-se urna movimentao cclica do fluido, bem definida, atravs de dispositiyos
e arranjos internos construdos especialmente para este propsito, enquanto que
na coluna de bolhas tem-se um movimento aleatrio do lquido no reator. As Figu-
ras 8.1(b) e 8.1(c) ilustram esquematicamente tais tipos de reatores, os quais pos-
o - 12'13'14 c onvern
suem urna grand e vaned a d e d e conf'tguraoes. , amd a menciOnar que
o o

os reatores tipo coluna de bolhas so freqentemente chamados de reatores tipo


torre, enquanto que os reatores "air-lift" so designados "loop reactors".
Nos reatores de fluxo pistonado ("plug-flow"), conforme indicado esquema-
ticamente na Figura 8.1(d), o inculo e o meio de cultura so misturados na entra-
da do sistema, sendo que idealmente a cultura flui com urna velocidade constante,
sem ocorrer mistura longitudinal ("backrnix").15' 16 H, portanto, urna variao da
concentrao dos nutrientes e das clulas ao longo do comprimento do reator, sen-
do este sistema comparvel a um processo contnuo realizado em mltiplos est-
gios, com um elevado nmero de reatores ligados em srie, conforme ser visto no
Captulo 12.
Conforme indicado na classificao geral dos biorreatores, apresentada an-
teriormente, possvel dispor de reatores nos quais o biocalisador se encontra
imobilizado em um suporte inerte, corno, por exemplo, alginato, K-carragena, pec-
tina, ou ainda materiais cermicos, vidro, slica e outros.17

A finalidade bsica do emprego de clulas imobilizadas num biorreator a


manuteno de elevadas concentraes celulares, podendo-se atingir, conseqen-
temente, elevadas produtividades no processo em questo. Dependendo da movi-
Classificao dos biorreatores 183

rnentao relativa das partculas ("pellets"), distinguem-se os reatores de leito


fixo, onde a movimentao praticamente inexistente, e os de leito fluidizado,
onde h urna movimentao intensa das partculas, sendo qe a fluidizao do lei-
to pode ser provocada pela injeo de ar, ou de um gs inerte, ou ainda pode ser
obtida por urna corrente de recirculao de lquido no reator. As Figuras 8.1(e) e
8.1(f) ilustram as configuraes mencionadas. Deve-se mencionar, ainda, o desen-
volvimento recente de alguns biorreatores que empregam clulas e enzimas
co-imobilizadas, corno descrito por exemplo no trabalho de GIORDANO, 18 no qual
se empregou a co-imobilizao de glicoarnilase e clulas de Saccharomyces cerevisi-
ae para a produo contnua de etanol.
Por sua vez, os reatores com lminas de membranas planas e os reatores de
fibra oca ("hollow-fiber"), caracterizam-se por manterem as clulas confinadas en-
tre membranas semipermeveis ("entrapped biocatalyst"), as quais permitem o
fluxo de lquido, mas no a passagem de clulas. ~ Esse tipo de reator normal-
1 9 20

mente prev a separao entre os fluxos de nutrientes e produtos metablicos,


conforme se pode visualizar nas Figuras 8.l(g) e 8.l(h), o que permite imaginar
urna primeira operao de separao do produto desejado, podendo contribuir
para a simplificao das etapas de purificao do produto ("downstrearn").
Corno ocorre a passagem de nutrientes e produtos atravs de membranas,
esse tipo de reator costuma ser designado por "reator de perfuso". No entanto,
o termo reator ou sistema de perfuso, tem sido empregado de forma mais gen-
rica, incluindo a situao de um reator STR com reciclo externo de clulas por fil-
trao em membranas, ou ainda, simplesmente designando ti.rn reator com
clulas irnobilizadas.21
Nesse tipo de reatores com membranas, as tenses de cisalharnento so m-
nimas, inferiores quelas obtidas nos reatores "air-lift", o que os torna indicados
para utilizao com alguns tipos de clulas animais extremamente sensveis ao ci-
salharnento. Comparativamente aos tpicos reatores com clulas imobilizadas em
suportes inertes, fein-se neste tipo de reatores menores obstculos difusionais, po-
dendo-se igualmente rnan~er elevadas concentraes celulares. 22 Particularmente,
o reator de fibra oca consiste em um feixe de fibras capilares de material semiper-
mevel, no interior das quais ocorre escoamento laminar do meio de cultura, per-
manecendo as clulas retidas na regio anular entre as fibras, conforme indicado
na Figura 8.l(h).
Todos os tipos de reatores mencionados at o presente so ditos reatores em
fase aquosa, ou seja, empregados nos processos de fermentao submersa. Entre-
tanto, h ainda os reatores em fase no-aquosa, empregados para os processos de
fermentao semi-slida, os quais se caracterizam pela ausncia de "gua livre",
podendo o teor de umidade variar de 30 a 80%, dependendo das caractersticas de
reteno de gua do substrato slido empregado, embora o processo semi-slido
apresente urna srie de dificuldades, especialmente no que se refere ao controle
das condies de operao; por outro lado, este processo apresenta urna srie de
aspectos interessantes, os quais podem torn-lo, em alguns casos, mais econmico
do que o tradicional processo subrnerso.23' 24 Dentre os itens que necessitam de um
maior desenvolvimento, encontra-se o estudo de novas concepes de reatores
184 Biorreatores e processos fermentativos

para a fermentao semi-slida, encontrando-se na literatura um grande nmero


de trabalhos nos quais se emprega o "reator de bandejas" ("stationary trays"), o
qual bastante limitado no que se refere s condies de transferncia de oxignio
e controle das condies ambientais. Nesse sentido possvel obter-se uma melho-
ria, quando se procede agitao do meio de cultivo, por exemplo, empregan-
do-se tambores rotativos. 25' 26 Mais- recentemente, foram propostos os reatores de
leito fixo ou de leito fluidizado gs-slido/7' 28 nos quais se promove a passagem
de ar ou de um gs inerte atravs de um leito de partculas slidas. No caso do lei-
to fluidizado, a vazo do gs suficientemente elevada, de maneira a propiciar a
suspenso dos slidos na corrente gasosa, promovendo desta maneira, uma me-
lhor condio de transferncia de massa no sistema (nutrientes, oxignio) e ainda
auxiliando no controle da temperatura.

: ...... . ... ...


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(a) (b) (c)

Meio

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00000000 o o o o
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inculo '-----(d_)_ ___, 000000000
00000000 o o o 9 o
000000000 o o o o
00000000
000000000 o o o o o
Meio 00000000 o o o o
Q9_0_QQ.9_<~Q9
o o o o o

(e) (f)

00000000000000
00000000000000 f--

(00000000000000
00000000000000 1-'
ro o o o o o o o o o o o o o
00000000000000 r-
loo o o oooo oo oOo ooo oo oooooooo o r-

looooo ooo oo ooo ooo oooooo o o o o ooi----

(h)
(g) Produto Produto
Figura 8.1 - Tipos de biorreatores (a) STR; (b) coluna de bolhas; (c) "air-lift"; (d) "plug-flow" ; (e) com clulas imobili-
zadas (leito fixo); (f) com clulas imobilizadas (leito fluidizado); (g) reator com membranas planas; (h) "hollow-fiber".
Formas de conduo de um processo fermentativo 185

Conforme visto no presente item, h uma grande diversidade possvel de


biorreatores a serem empregados em um determinado processo fermentativo, sen-
do que a melhor opo depender das caractersticas do processo em questo, bem
como do microrganismo utilizado.
Convm salientar que alguns dos tpicos abordados no presente item sero
melhor detalhados em outros captulos, tais como:
Captulo 13: Fermentao em estado slido
Captulo 16: Reatores com clulas imobilizadas
Captulo 17: Reatores com enzimas imobilizadas
No item seguinte pretende-se mostrar que existem numerosas opes quan-
to forma de conduo do processo, ou seja, quanto forma de operao de um
dado biorreator, e que a forma ideal de operao, isto , aquela que conduzir a
um desempenho timo do processo, ser funo novamente das partiCularidades
do material biolgico empregado.

8.3 - Formas de conduo de um processo fermentativo


Quando se pensa em executar um processo fermentativo, normalmente se
imagina preparar um certo meio de cultura que seja adequado nutrio e desen-
volvimento do microrganismo, bem como ao acmulo do produto desejado; colo-
car este meio de cultura em um biorreator (fermentador); adicionar o
microrganismo responsvel pelo processo biolgico (inocular) e aguardar que o
processo ocorra, Aps um determinado tempO de fermentao, imagina-se retirar
o caldo fermentado do reator e executar as operaes unitrias necessrias para a
recuperao do produto.
A descrio acima aquela tpica de um processo descontnuo simples, ou
descontnuo tradicional, q~e tamb, m designado como processo em batelada.
No entanto, essa descrio tambm tpica de pessoas no ligadas Enge-
nharia Bioqumica, ou com experincia em processos fermentativos, pois, sem
querer recair em_afirmaes dotadas de extremo exagero, pode-se dizer que exis-
tem infinitas formas de se conduzir Um reator biolgico, dependendo das caracte-
rsticas prprias do microrganismo, meio de cultivo e dos objetivos especficos do
processo que se pretende executar.
Inclusive, ao se imaginar o descontnuo com nica alternativa para a con-
duo do processo fermentativo, pode-se incorrer no engano de concluir, precoce-
mente, sobre a inviabilidade do processo produtivo, em virtude de sua baixa
produtividade.
Com base nessas consideraes iniciais, fica clara a necessidade de uma
maior reflexo sobre os reatores biolgicos, tendo em vista sua enorme flexibilida-
de de operao, bem como sua incidncia imediata quanto economicidade de um
dado processo fermentativo.
Pode-se afirinar que, a partir da dcada de 1950, ocorreu um maior desen-
volvimento da rea de reatores, encontrando a mesma, desde ento, um formid-
vel avano, sendo responsvel pelo sucesso de muitos processos fermentativos,
obviamente ao lado dos demais desenvolvimentos das reas mais bsicas, como
por exemplo a microbiologia destes processos.
186 Bioireatores e processos fermentativos

No objetivo do presente texto abordar todas as formas de operao de um


biorreator, mesmo porque isto seria invivel, tamanha a diversidade hoje observa-
da, dependendo das caractersticas prprias de cada processo. O que se pretende
abordar as formas mais gerais, entendendo que tal estratgia permitir as particu-
larizaes que se fizerem necessrias.
Com essa idia em mente, pode-se dizer que, de uma forma geral, um reator
biolgico pode ser operado das seguintes formas:
-Descontnuo
com um inculo por tanque
com recirculao de clulas

- Semicontnuo
sem recirculao de clulas
com recirculao de clulas

- Descontnuo alimentado
sem recirculao de clulas
com recirculao de clulas

-Contnuo
executado em um reator (com ou sem recirculao de clulas)
executado em vrios reatores (com ou sem recirculao de clulas)
O processo descontnuo simples, ou seja, aquele efetuado com um inculo
por tanque, j foi descrito no incio deste item. No entanto, cabe ainda acrescentar
que esse processo o mais seguro quando se tem o problema de manuteno de
condies de assepsia, pois ao final de cada batelada imagina-se que o reator de-
ver ser esterilizado juntamente com o novo meio de cultura, recebendo pm novo
inculo, o qual poder sofrer todos os controles necessrios, a fim de assegurar a
presena nica do microrganismo responsvel pelo processo.
Deve-se salientar que o conhecimento do processo descontnuo simples sig-
nifica o conhecimento bsico da cintica do processo, sendo, portanto, de extremo
interesse, no se recomendando o estudo dos reatores alternativos sem que se do-
mine razoavelmente bem o descontnuo, mesmo porque as demais alternativas
pressupem este conhecimento cintico. Nessa direo, o Captulo 6 justamente
dedicado ao estudo da cintica de processos fermentativos.
Por outro lado, no nvel de aplicaes prticas, pode-se dizer que, para um
processo fermentativo razoavelmente evoludo, dificilmente ele ser conduzido
como um reator descontnuo simples, havendo com muita freqncia alguma ela-
borao adicional. O descontnuo ser sempre a base para as comparaes de efi-
cincias atingidas nessas elaboraes, mas a sua baixa eficincia estimula o
surgimento das formas alternativas.
A primeira dessas alternativas , quando o microrganismo permite, recircu-
lar as clulas, ou seja, ao se encerrar a batelada efetua-se a separao das clulas
Formas de conduo de um processo fennentativo 187

por centrifugao ou mesmo sedimentao no interior do prprio reator, enviando


apenas o lquido fermentado para a recuperao do produto. Com isso se busca
evitar o preparo de um novo inculo para cada batelada, o que sempre significa
custo adicional para o processo, alm de significar tambm um certo tempo para a
obteno de altas concentraes celulares no reator, bem como consumo de subs-
trato para isto. Essa estratgia de operao freqentemente designda como ba-
telada repetida.
Assim, a idia de se recircular as clulas, mesmo para um processo descont-
nuo, possvel e mesmo interessnte, desde que se possa manter as condies de
assepsia, e igualmente se possa manter o microrganismo suficientemente ativo
para a sntese do produto.
Se um processo descontnuo entendido como um sistema fechado, devido
s suas caractersticas, um processo contnuo, por outro lado, o exemplo tpico
de um sistema aberto. No processo contnuo procura-se estabelecer um fluxo con-
tnuo de lquido atravs do reator, ou reatores dispostos em srie. Claro est que,
caso o processo assim o exija, o meio a ser introduzido no reator deve ser devida-
mente esterilizado, assim como se deve manter as condies de assepsia nestas
operaes de alimentao e retirada do.produto fermentado.
A opo pela operao de um sistema contnuo, constitudo por vrios rea-
tores em srie, no qual a alimentao de um dado reator da srie o efluente do
reator anterior, visa freqentemente o estabelecimento de diferentes condies
nos vrios biorreatores da srie. Inclusive, nessa opo de operao, abre-se a pos-
sibilidade de distribuir a alimentao do meio de cultura inicial entre reatores da
srie, o que pode justamente contribuir para o aparecimento destas diferentes con-
dies entre os vrios reatores.
Ainda, o reator contnuo permite visualizar o reciclo de clulas. De fato, o l-
quido fermentado, efluente de um dado reator, pode ser submetido a um sistema
de separao dos microrganismos (por sedimentao, centrifugao ou ,separao
por membninas), -s quais podem ser retornados ao volume de reao, sendo o l-
quido enviado para a recuperao do produto. Em .se tratando de reatores em s-
rie, essa operao pode ser efetuada em qualquer reator da srie, retornando-,se o
microrganismo para o fermentador mais adequado, evidenciando, assim, a enor-
me flexibilidade de operao disponvel.
O reator descontnuo alimentado ("fed batch") aquele no qual se imagina
inicialmente introduzir o inculo, o qual dever ocupar uma frao do volume til
da ordem de 10 a 20%, iniciando-se ento a alimentao com o meio de cultura,
empregando uma vazo adequada, sem ocorrer a retirada de lquido fermentado.
Essa operao prolonga-se at o preenchimento do volume til do reator, quando
ento inicia-se a retirada do caldo fermentado para a recuperao do produto.
Essa forma de operao tpica da rea de Engenharia Bioqumica, e foi pra-
ticamente desenvolvida para os processos fermentativos, sendo muito pouco fre-
qente para os reatores qumicos no biolgicos.
A descrio acima para o reator "fed batch", consiste- na verdade- na for-
ma mais simples de operao deste reator. Pode-se imaginar a separao das clu-
las e retorn-las ao volume de reao, a fim de se iniciar um novo perodo de
188 Biorreatores e processos fermentativos

alimentao, o que evita o preparo de um novo inculo. A idia acima tambm su-
gere que se alimente o reator com vazo constante, o que no necessariamente
obrigatrio.
As alternativas mencionadas indicam a grande flexibilidade de operao,
que tambm se observa para o "fed batch", a exemplo do reator contnuo.
No entanto, cumpre destacar que se pode ainda, ao terminar o preenchi-
mento do reator, proceder-se retirada de uma certa frao do lquido fermenta-
do, iniciando-se ento um novo perodo de alimentao. Essa alternativa
freqentemente indicada na literatura como descontnuo alimentado repetido.
Novamente convm esclarecer que esse estilo de conduo do reator depende fun-
damentalmente das caractersticas do microrganismo, que dever permanecer su-
ficientemente ativo no sistema. Caso o microrganismo apresente sintomas de
atenuao quanto sua capacidade de sntese do produto, o processo dever ser
interrompido, para se reiniciar com um novo inculo.
Assim, fcil compreender que o interesse por um processo contnuo, ou
descontnuo alimentado repetido, depende da possibilidade de se prolongar ao
mximo o tempo de operao, mantendo-se o processo em condies de elevado
desempenho, quanto ao produto desejado e isento de contaminaes.
Finalmente, o sistema de reao semicontnuo, diferencia-se do descontnuo
alimentado, pelo fato de se retirar o lquido fermentado e se proceder ao preenchi-
mento do reator empregando-se uma vazo muito elevada, de forma a se imaginar
que o reator esteja sendo preenchido instantaneamente. Ao final do novo perodo
de fermentao, procede-se novamente retirada de uma dada frao do volume
(30 a 60%, por exemplo) e se preenche o reator instantaneamente. '
Na verdade, como- do ponto de vista prtico- trabalhando-se com reatores
de dezenas de milhares de litros, este preenchimento dificilmente pode ser efetua-
do instantaneamente, com freqncia acaba-se recaindo no reator descontnuo ali-
mentado, motivo pelo qual alguns autores no utilizam a designao de
semicontnuo. De qualquer maneira, trata-se de uma tcnica distinta, n~ qual est
embutida a idia da operao por choques de carga de substrato, o que pode ser
interessante em algumas situaes, como na produo de enzimas sujeitas ao con-
trole por induo.
Da mesma forma, um reator descontnuo alimentado, dependendo da vazo
empregada, que po_ssibilite um certo acmulo do substrato limitante quando do
trmino do perodo de alimentao do reator, pode ter seu tempo de fermentao
concludo em sistema descontnuo, a fim de que o substrato residual possa ser to-
talmente consumido.
Essas ltimas consideraes pretendem alertar para as possibilidades de uti-
lizao de misturas de conceitos (descontnuo, contnuo, descontnuo alimentado),
a fim de se conseguir o mximo de desempenho de um dado sistema biolgico.
Elas tambm reforam a idia sobre a enorme flexibilidade que se dispe para a
operao de um biorreator.
Alguns processos tradicionais servem como exemplo dessa afirmao, omo
o caso da fermentao alcolica executada segundo o processo Melle-Boinot.
Nesse processo; ao trmino de uma fermentao, o vinho centrifugado, retornan-
Exemplos de compa(ao de desempenho de biorreatores 189

do-"se as clulas ao reator aps tratamento adequado. A seguir inicia-se a alimenta-


o do mosto a ser fermentado (na verdade, a introduo do inculo e a alimenta-
o de mosto ocorrem simultaneamente desde o incio do processo), operando-se
grande parte do tempo na forma de um reator descontnuo alimentado. Quando
as dornas encontram-se preenchidas, aguarda-se tempo suficiente para o consumo
dos acares fermentescveis, operando-se, portanto, na forma descontnua.
Os sistemas de tratamento de resduos tambm podem ser considerados
como exemplo, pois os enormes volumes de reao, freqentes nesta rea, exigem
que sejam preenchidos de forma controlada segundo o sistema descontnuo ali-
mentado, mesmo que sua operao em regime seja obrigatoriamente em sistema
contnuo. Freqentemente a operao em descontnuo alimentado importante,
pois espera-se atingir o completo preenchimento do reator contando-se com um
sistema biolgico equilibrado, a fim de se poder iniciar a operao contnua em
condies de estabilidade (ausncia de matria orgnica acumulada, ou de produ-
tos intermedirios no completamente convertidos a gs ou biomassa).
Cabe, finalmente, comentar que as diferentes formas de operar um certo bior-
reator so, em princpio, aplicveis a qualquer tipo de reator dentre os mencionados
no item 8.2, ficando esta flexibilidade mais ou menos evidente, dependendo do tipo
de reator considerado.
Analogamente ao indicado no item anterior, vrios conceitos aqui introduzi-
dos sero melhor detalhados em captulos seguintes, tais como:
Capt_ulo 9: Fermentao descontnua
Captulo 10: Fermentao descontnua alimentada
Captulo 11: Fermentao semicontnmi.
Captulo 12: Fermentao contnu

. .. .,8 .4 - Exemplos de comparao de desempenho de biorreatores


Encontram-se na literatura alguns trabalhos recentes, os quais apresentam
estudos comparativos do desempenhei de biorreatores, como por exemplo, o tra-
balho de MANOLOV, 29 relativo produo de ribonuclease por Aspergillus clavatus,
onde se empregou um reator tipo coluna de bolhas com clulas imobilizadas, ten-
do-se obtido produtividades em enzima significativamente superiores ao se con-
duzir o processo tanto na forma de bateladas repetidas, bem como na forma cont-
nua, em comparao com o descontnuo tradicional.
Da mesma forma, o tn:tbalho de Guo et al.,30 sobre a produo de al-
fa-amilase por Bacillus subtilis em reator "air lift", indica a obteno de uma pro-
dutividade em enzima cerca de 5 vezes superior do descontnuo, quando se ope-
rou o .reator na forma contnua com elevados valores da vazo especfica de ali-
mentao.
Por sua vez, o artigo de MOSER 31 apresenta dados comparativos na produo
de etanol, em reatot:: agitado operado de forma contnua (CSTR) e em reator tubu-
lar ("plug-flow"), indicando situaes em que se obtm produtividades mais ele-
vadas para o reator tubular em relao ao CSTR.
190 Biori-eatores e processos fermentativos

J no trabalho de MULLIGAN et al.32 encontram-se dados comparativos sobre a


produo de lactato de amnio por Streptococcus cremoris, em sistema contnuo em
mltiplos estgios, com ou sem reciclo de clulas, em relao ao descontnuo.
Pode'-se citar ainda o artigo de BAYER et al./3 relativo produo de cefalos-
porina em reatores "air lift", comparando-se o desempenho deste reator com
aquele obtido em reator agitado mecanicamente (STR).
O trabalho de RANE et al./ 4 por sua vez, compara a produo de cido ctrico
por Candida lypolitica em reator tipo STR, operando-se o mesmo na forma contnua
com reciclo de clulas e na forma descontnua alimentada.
Deve-se mencionar ainda os trabalhos de SCHMIDELL; F ACCIOTII/5
6 37 38
FACCIOTTI et al./ KILIKIAN e TONS0, os quais se referem ao estudo da sntese
de amiloglicosidase por Aspergillus sp em diferentes tipos de processos, como o
descontnuo simples, contnuo, semicontnuo e descontnuo alimentado, em reator
tipo STR, buscando-se comparar as produtividades em enzima obtidas. Assim, ve-
rificou-se a possibilidade de obteno de uma produtividade em glicoamilase cer-
ca de 2,5 vezes superior no processo contnuo em relao ao descontnuo, ao se
empregar elevados valores da vazo especfica de alimentao. 35 J no caso do rea-
tor semicontnuo, dependendo da frao de corte empregada, bem como da con-
centrao de polissacardeo alimentada no instante de realizao dos cortes,
conseguiu-se obter produtividades em enzima aproximadamente o dobro da obti-
da no descontnuo, mantendo-s~ praticamente a mesma atividade enzimtica no
caldo. 36 J no caso do reator descontnuo alimentado, verificou-se igualmente a
possibilidade de obteno de uma produtividade em enzima cerca do dobro da
obtida no descontnuo mas, diferentemente do processo semicontnuo, em d~cor
rncia do aumento da atividade enzimtica no caldo fermentado/ 7 o que alta-
mente interessante do ponto de vista das operaes de recuperao e purificao
da enzima ("downstream'').
Assim, conforme se verifica a partir dos exemplos citados, a forma de opera-
o do biorreator de fundamental importncia no desempenho de um determi-
nado processo fermentativo, devendo-se destacar, ainda, que todos os trabalhos
acima mencionados so relativamente recentes (de 1989 a 1996), indicando, por-
tanto, uma grande atualidade do tema abordado no presente captulo.

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193

~--~~].~--:=-
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__ =-_- -=~=-'=-=a"_Ei S==i i:ri-=-Jilil"li:" .=:i iH~;i i i i i~&~-c;'i i:: -=-~==----_
......

Joo Carlos Monteiro de Carvalho


Sunao Sato

9.1 - Introduo
As fermentaes descontnuas clssicas, ou simplesmente, fermentaes
descontnuas, vm sendo utilizadas pelo homem desde a Antigidade e, ainda
hoje, so as mais empregadas para obteno d~ vrios produtos fermentados. So
tambm conhecidas por fermentaes por batelada ou processo descontnuo de
fermentao.
Seu modo de operao pode ser descrito assim: no instante inicial a soluo
nutriente esterilizada no fermentador inoculada com microrganismos e incuba-
da, de modo a permitir que ' a fermentao ocorra sob condies timas. No decor-
rer do processo fermentativo nada adicionado, exceto oxignio, no caso de
processos aerbicos (na forma de ar), antiespumante, e cido ou base para contro-
le do pH. 1 . .

Terminada a fermentao, descarrega-se a dorna, e o meio fermentado segue


para os tratamentos finais. Ento, deve-se lavar a doma, esteriliz-la e recarreg-la
com mosto e inculo. Algumas variaes dessa definio, no entanto, podem ocor-
rer e sero comentadas no item "Classificao".
Conclui-se, pela descrio acima, que se no houver adio de solues para
controle do processo, nem perda de lquido por evaporao, o volume no decorrer
da fermentao permanece constante, o que pode ser considerado mais uma das
caractersticas do processo descontnuo de fermentao.
A fermentao descontnua pode levar a baixos rendimentos e/ ou produti-
vidades, quando o substrato adicionado de uma s vez no incio da fermentao
exerce efeitos de inibio, represso, ou desvia o metabolismo celular a produtos
que no interessam. Alm disso, apresenta "tempos mortos", ou seja, tempos em
que o fermentador no est sendo usado para o processo fermentativo propria-
mente dito, tais como tempo de carga e descarga de dorna e perodo correspon-
dente lavagem e esterilizao do fermentador.
194 Fermentao descontnua

Por outro lado, apresenta menores riscos de contaminao (se comparados


com processos contnuos de fermentao), grande flexibilidade de operao, devi-
do ao fato de poder utilizar os fermentadores para a fabricao de diferentes pro-
dutos, a possibilidade de realizar fases sucessivas no mesmo recipiente, condio
de controle mais estreito da estabilidade gentica do microrganismo, assim como
a capacidade de identificar todos os materiais relacionados quando se est desen-
volvendo um determinado lote de produto, o que vital para a indstria farma-
cutica.2 .
Ademais, o mais utilizado na indstria de alimentos. Alguns dos alimen-
tos e bebidas produzidos por esse processo fermentativo so iogurte, chucrute, pi-
cles, cerveja, vinho, entre outros.
Neste captulo abordaremos alguns itensque julgamos oportuno destacar,
quais sejam: inculo, mosto, classificao das diferentes modalidades de processo
descontnuo, bem como o nmero de domas de uma indstria de fermentao.

9.2 - lnculo
Chama-se inculo, p-de-cuba ou p-de-fermentao um volume de suspen-
so de microrganismo de concentrao adequada capaz de garantir, em condies
econmicas, a fermentao de um dado volume de mosto. 3
Para que se obtenha um inculo com capacidade produtiva elevada, deve-se
dar condies para que o microrganismo desejado seja propagado, que incluem
desde sua manuteno at a propagao propriamente dita.
H muitas tcnicas para o armazenamento de microrganismos, 4' 5 send que
cada uma delas pode ser indicada levando em conta a cepa do microrganismo e as
condies laboratoriais disponveis para mant-la. Tm por finalidade conservar a
cepa vivel e com capacidade produtiva, mantendo-a, portanto, dentro do poss-
vel, com o mnimo de divises celulares, 1 uma vez que, quando estas ocorrem, h
possibilidade de haver mutaes .. Algumas delas so: secagem de micrm;ganismos
em terra, areia, slica ou outro material slido, conservao em gar inclinado ou
outras que limitem o metabolismo e respirao microbiana (aqui se incluem con-
gelamento em congeladores ou em nitrognio lquido, e manuteno de esporos
ou clulas em gua) e remoo da gua de clulas ou esporos por liofilizao e ma-
nuteno do material seco sob diferentes condies. A recuperao do microrga-
nismo feita de diferentes maneiras, dependendo da tcnica que se adotou para
preserv-lo.1' 4
To importante a manuteno da cepa, que muitas empresas de fermentao
possuem centros especializados que tm esta funo, distribuindo os microrganismos
para suas fbricas localizadas nacionalmente ou, mesmo, internacionalmente. Parale-
lamente, fazem testes de viabilidade, de estabilidade gentica, alm de empregar me-
todologias para melhoramento gentico. Dessa forma, garantem a qualidade e a
reprodutibilidade das cepas microbianas, o que no significa que as fbricas no te-
nham o seu prprio controle na propagao desses microrganismos.
Durante a fase de propagao do inculo deve-se tornar cuidados especiais
de modo a evitar contaminao, pois comprometeria a produo industrial. Nessa
lnculo 195

fase, em processos aerbios, um foco potencial de contaminao o ar fornecido


ao sistema, o qual deve ser esterilizado.
Quando o microrganismo produtor uma espcie mutante, se ele for auxo-
trfico, deve-se garantir o suprimento de substncias requeridas para crescimen-
to no meio durante a propagao do inculo. 6 Alm disso, deve-se acompanhar se
os microrganismos continuam com capacidade produtiva durante a fase de propa-
gao, pois mutaes no so sempre estveis e eles podem perd-la, deixando de
apresentar capacidade produtiva.
O volume de inculo introduzido no fermentador de produo est comu-
mente ao redor de 10% de sua capacidade til. No entanto, pode variar de 0,5 a
50%, como assinala BORZANe Afirma, ainda:, que a tcnica de preparo do inculo
compreende duas fases: a de laboratrio e a industrial (ver Fig. 9.1) .

. ~~~ lorubo~o~~ lncubaao

Cultura Volume de Volume de


pura meio = V1 meio= V2 >V1

Volume de

. ., ~ laboratrio
----------------- -~ - --- ----- ~ -'- ___ --------------------------t ------
Fase
industrial

Volume de Volume de
meio= V4>V3 meio= V5 >V4
3
Figura 9.1 - Representao esquemtica do preparo do inculo.

A partir da cultura estoque, propaga-s o microrganismo por meio de meto-


dologia conveniente. Normalmente na fase inicial passa-se do meio slido, em
condies asspticas, para um tubo de ensaio contendo 'meio lquido .e sterilizado,
adequado para o desenvolvimento microbiano. Aps incubao por um determi-
196 Fermentao descontnua

nado tempo, que depende do tipo de microrganismo cultivado (pois cada espcie
microbiana possui velocidade de crescimento diferente), transfere-se o contedo
desse tubo a frascos apropriados para agitadores rotativos ou reCprocos- "sha-
kers"- contendo meio esterilizado (podem ser erlenmeyers lisos ou chanfrados,
sendo que estes so utilizados quando se tm microrganismos mais exigentes
quanto aerao).
Aps incubao, transfere-se a suspenso microbiana para frascos maiores
contendo meio nutriente esterilizado. O nmero de transferncias vai depender
do volume til do pr-fermentador (germinador). Todas as transferncias devem
ser feitas em condies asspticas (cujos cuidados variam com o processo fermen-
tativo que se deseja realizar) e os frascos devidamente fechados, mas permitindo
entrada de ar para microrganismos aerbios, de modo a evitar contaminao. De-
pendendo do volume do fermentador de produo, poder ser necessrio mais de
um germinador.
A cada passo, os organismos devem crescer rapidamente, sendo as transfe-
rncias feitas na fase logartmica de crescimento. Apenas na fase que corresponde
ao inculo que ser adicionado ao fermentador de produo, pode-se deixar que a
cultura atinja a fase de declnio de velocidade de crescimento, caso seja interessan-
te iniciar a fase de produo com clulas de um estgio mais avanado da curva de
crescimento microbiano .
. Sugestes para relao entre volume que receber a suspenso microbiana e
o volume desta nas vrias etapas de propagao de inculo so da ordem de 10
vezes/ 20 vezes, 8 mas h indicaes para valores possveis de 100 a 200 vezes.6' 9
Muito importante, pois, desenvolver um protocolo para a propagao do
in culo. PARTON; WILLIS 4 apresentam casos interessantes, mostrando que deter-
minados autores conseguiram o aumento de produo de um metablito secund-
rio quando utilizaram. um pr-fermentador para inocular o fermentador de
produo, em vez de utilizar inculo oriundo de cultivo em agitador rotativo.
Tambm relataram que outros autores conseguiram produzir mais cJulas num
cultivo para obteno de biomassa quando utilizaram, como inculo do fermenta-
dor de produo, clulas na fase logartmica de crescimento, em vez daquelas em
estado de autlise. Assim, o protocolo para propagao, desenvolvido para cada
processo, indicar qual a melhor metodologia para se obter o inculo no menor
tempo possvel e que leve a maiores rendimentos e/ ou produtividades no proces-
so industrial.

9.3 - Mosto
Como j se sabe, cada microrganismo possui condies timas de cresCimen-
to tais como: temperatura, pH, nvel de oxignio dissolvido, entre outras. O meio
de cultivo, por sua vez, tem influncia marcante nesse processo. Em microbiolo-
gia, chamado de meio de cultura. Aqui, na rea de fermentaes industJ;iais,
chamado de mosto ou meio de fermentao. Deve possuir nutrientes requeridos
para o crescimento celular, que PIRT, 10 parte das fontes de energia, classifica nos
seguintes grupos: a) fontes dos elementos "principais" -C, H, O e N; b) fonte
dos ~lementos "secundrios" -'---'- P, K, S, Mg; c) vitaminas e hormnios; d) fontes
Mosto 197

de "traos" de elementos, ou seja, requerimentos de elementos em quantidades


mnimas para o crescimento microbiano (por exemplo, Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn so
freqentemente essenciais para o crescimento microbiano).
Na formao de um meio de fermentao (mosto) deve-se levar em conta a
necessidade desses nutrientes, lembrando que o meio, alm de propiciar o desen-
volvimento microbiano, deve favorecer a formao do produto que se deseja.
W ANG et al. 11 sugerem! que a formao de um meio de cultivo leve em conta
a composio celular, o requerimento energtico e a necessidade de substncias
especficas.
A composio elementar de uma clula microbiana depende de muitos fato-
res, como condies de cultivo, espcie do microrganismo, e at mesmo do subs-
trato utilizado para seu crescimento. Porm, a ttulo de orientao, apresentada
na Tabela 9.1 a composio elementar tpica de um microrganismo.

11
Tabela 9.1 - Composio elementar tpica de microrganismos.

ELEMENTO PORCENTUAL DA CLULA SECA f1;'


Carbono 50
l"' l
lt,_,
Nitrognio 7-12 -i-;l
\")

. l-
Fsforo 1-3
Enxofre 0,5-1,0
Magnsio 0;5 .
. ..
~=--"-...;...:;.:.,_.. ~'hfli:!~...l$;;. r:,.ii_ : ;-'
--
l;
.. .,
..i~>\""" .. .
.,_ : . i"Ui<J>,_
..i:j
C-"

Um meio para crescimento microbiano deve, no mnimo, conter os elemen-


tos presentes na clula na proporo correta. Exceto para carbono, oxignio e hi-
drognio, a formulao de meio nutriente baseada na Tabela 9.1. As fontes de
nitrognio podem_$er orgnicas ou inorgnicas e de modo algum devem faltar na .
composio do meio de cultivo, sob pena de limitar o crescimento celular. Traos
de elementos (Cu, Co, Fe, Ca, Zn, Mo, Mn), em princpio, podem ser utilizados em
concentraes da ordem de 10-4 e 10-5 M para concentraes de 30 g de clulas se-
cas/L e 3 g de clulas secas/L, respectivamente. No entanto, alguns microrganis-
mos necessitam de concentraes maiores de alguns desses elementos, e
adaptaes devem ser feitas nesse sentido.
Quanto a substncias orgnicas, tais como vitaminas e aminocidos, devem
fazer parte da constituio do mosto se os microrganismos no os sintetizarem, a
menos que se opte pela adio parcelada deles.
Os micror ganismos, para seu crescimento, coordenam eficientemente o cata-
bolismo (que tem como funes principais fornecer energia - em clulas hetero-
trficas - e intermedirios de vias metablicas) e o anabolismo (onde se d a
formao de biomolculas que faro parte da constituio do microrganismo, tais
como polissacardeos, lipdeos, protenas e cidos nuclicos). O substrato limitan-
te para microrganismos heterotrficos, alm de ser a: fonte de energia para essas
vias do metabolismo, normalmente supre necessidades da clula de carbono, oxi-
gnio e hidrognio, que integraro a composio celular e/ou o produto.
198 .fermentao descontnua

Portanto, sua quantidade no meio de cultivo ser uma funo de quanto se


deseja produzir de microrganismo, ou de produto, levando em conta a relao es-
tequiomtrica entre substrato e quantidade possvel de se produzir de clulas ou
de produto. No entanto, conveniente lembrar que no se pode ter um mosto com
concentraes elevadas de substrato, pois, nestas condies, pode se tornar inibi-
trio para o crescimento microbiano. Quanto ao oxignio, de importncia funda-
mental s clulas aerbias, considerado como um nutriente especial devido s
suas particularidades, ser comentado em separado (Captulo 14).
Sabendo quais os componentes que devem estar presentes num meio, po-
de-se lanar mo de dois procedimentos para obt-lo: a partir de extratos de plan-
tas ou animais, chamados de meios "naturais" (suco de uva, leite, gua de
macerao de milho, etc.), ou a partir da elaborao de meios quimicamente defi-
nidos, chamados de meios "sintticos". Com a finalidade de elucidar efeitos nutri-
cionais, medida do possvel, estes devem ser os escolhidos, pois aqueles tm a
desvantagem de seremde composio indefinida e varivel. 10 Por outro lado, po-
dem ser meios bastante ricos e que geralmente no necessitam de complementa-
o para sua utilizao como mosto.
Do ponto de vista industrial, vrios fatores devem ser considerados.12 O cus-
to do substrato pode ser crucial, devendo tambm ser levada em conta a quantida-
de de carbono disponvel, bem como as exigncias para sua fermentao (por
exemplo, o fornecimento de oxignio ao sistema deve ser aumentado, caso utilize
um substrato de cadeia carbnica em menor grau de oxidao, como na utilizao
de hidrocarbonetos como fonte de carbono). O custo o fator limitante da utiliza-
o de meios sintticos em escala industrial. Outros fatores incluem: suprimento
do substrato (a maioria das empresas opta por comprar o substrato no mercado
aberto, com possibilidade de comprar de vrios fornecedores), disponibilidade
(onde se considera se a matria-prima sazonal ou no e a possibilidade de seu
armazenamento), variabill.dade na composio da matria-prima, condies de
armazenamento, dificuldades de esterilizao do mosto, fermentescibil\dade (aqui
se deve lembrar que uma aparente no fermentescibilidade no necessariamente
uma restrio se microrganismos alternativos puderem ser encontrados), exign-
cia de tratamentos para tornar o substrato presente na matrii:1-prima fermentesc-
vel (por exemplo, num processo de fermentao alcolica com levedura como
inculo, materiais amilceos devem ser hidrolisados a fim de se obter acares de
pequena cadeia carbnica, que sero fermentados) e comportamento do mosto du-
rante e aps a fermentao (por exemplo, produo excessiva de espuma e possi-
bilidade de reciclar gua residuria). Ainda .importante destacar que o melhor
substrato para uma indstria no necessariamente o melhor para outra que pro-
duz o mesmo produto, pois cada uma tem seu microambiente, onde o custo de
transporte, combustvel e potncia, disponibilidade de gua, entre outras, d~ter
minam a escolha do substrato.
Alguns dos substratos e/ou matrias-primas, possveis para utilizao em
cultivos microbianos, so: acares, melaos, soro de leite, celulose,. amido, res-
duos como liquor sulftico e ga de macerao de milho, metanol, etanol, alca-
nos, leos e gorduras, etc.
Classificao 199

9.4 - Classificao
Em escala industrial, muitos processos so adaptados com vistas a otimizar
a produo. O processo descontnuo, por sua vez, tambm foi sendo adaptado de
modo a atender ao objetivo de diferentes indstrias. BORZANI3 classifica os pro-
cessos descontnuos em trs grandes grupos: aqueles em que cada dorna recebe
um inculo, processos com recirculao do microrganismo e processo por meio de
cortes.
O primeiro grupo consiste na inoculao de urna dorna com um microrga-
nismo que foi propagado a partir de uma cultura pura, como j comentado ante-
riormente. Oferece poucos riscos de contaminao se a propagao do inculo foi
feita em boas condies de assepsia. Nas fermentaes em que o meio rico e o
microrganismo altamente suscetvel a contaminao, a utilizao deste processo
indicada, a menos que o substrato adicionado de uma s vez no incio da fer-
mentao leve a resultados insatisfatrios.
Os processos com recirculao do microrganismo, como o prprio nome in-
dica, reaproveitam como inculo o microrganismo da batelada anterior. Para tan-
to, ou se espera que o microrganismo sedimente no fermentador (como o caso de
cervejarias), ou se centrifugao meio fermentado, separando assim as clulas e reu-
tilizando-as. Esse procedimento comum em destilarias de lcool. No entanto,
como h tendncia de aumentar o nmero de contaminantes a cada nova batelada,
as usinas normalmente empregam uma metodologia com vistas a elimin-los.
Consiste num tratamento do leite de lvedo (suspenso de leveduras altamente
concentrada, obtida a partir da centrifugao do meio fermentado) com gua e ci-
do sulfrico. Deixado nessas condies, sob agitao por 2 a 3 horas, proporciona
a eliminao de contaminantes, bem como de clulas que j se apresentem em fase
de degenerao.
O ltimo grupo da classificao apresentada assim descrito: 3 "Na fermen-
tao por meio de cortes, opera-se do seguinte modo: inicia-se o trabalho inocu-
lando-se uma dorna (que ser chamada de dorna A) com p-de-cuba; quando a
fermentao atinge um estgio apropriado, passa-se parte do contedo do fermen-
tador A para um fermentador vazio (que ser chamado de dorna B) e, em seguida,
enchem-se as duas dornas com meio a fermentar. Essa operao recebe o nome de
corte. Diz-se que adorna A foi cortada para adorna B ou, ainda, que B recebeu um
corte de A" .
Esses cortes podem ser feitos na fase de crescimento mais intenso quando se
deseja propagar o inculo, ou aps o trmino do processo fermentativo.
A sucesso decortes pode acarretar srias quedas no rendimento, principal-
mente quando se trabalha com meio no esterilizado. Alm disso, o nmero de
cortes sucessivos no pode ser previsto, sendo que o controle do rendimento po-
der indicar em que momento deve-se suspender o trabalho por meio de cortes e
se iniciar nova fermentao com inculo novo. 3
No entanto, a produo de cada produto tem suas particularidades e a expe-
rincia adquirida ao longo do tempo na fbrica leva o pessoal a decidir quais as
modificaes que devem ser feitas no processo, aumentando, dia aps dia, o ren-
dimento e/ou a produtividade do mesmo.
200 Fennentao descontfnua

9.5 - Nmero de dornas


Tendo em vista o alto custo de um fermentador, bem como o espao que
ocupa, desnecessrio justificar a importncia para uma empresa determinar o
nmero de fermentadores que necessita para produzir o que deseja.
BORZANe sugeriu uma metodologia para o clculo do nmero de fermenta-
dores, a qual pode ser utilizada como caminho para se chegar ao nmero ideal de
fermentadores numa empresa que trabalha com processo descontnuo e que ser
transcrita a seguir. As pequenas modificaes, em relao a seu trabalho original
publicado, so, basicamente, algumas passagens matemticas que sero aqui apre-
sentadas.
Consideremos uma instalao de fermentao, funcionando por processo
descontnuo, que deva fornecer, de maneira ininterrupta, lquido fermentado ao
setor encarregado dos tratamentos finais. Suponhamos, ainda, para simplificar,
que no esteja sendo utilizado o processo de cortes. Sejam dados:
F = vazo mdia de lquido fermentado que deve ser fornecido ininterrupta-
mente ao setor de tratamentos finais;
t 1 = tempo necessrio para que o contedo de uma dorna fermente completa-
mente;
V= capacidade til de cada dorna;
D =nmero de domas, de capacidade til V, necessrio para garantir a
vazo F de lquido fermentado;
td = tempo necessrio para se descarregar uma dorna;
te = tempo necessrio para se' limpar e carregar uma dorna.
O valor da vazo F depende dos seguintes fatores:
a) da quantidade de produto final que se deseja obter na unidade de tempo;
b) do rendimento dos tratamentos finais que devem conduzir ao produto
desejado;
c) da concentrao do produto final no lquido fermentado que, pr sua vez,
funo do processo de fermentao.
Se indicarmos com Ma massa de produto final que interessa prpduzir em
um tempo t, com r o rendimento dos tratamentos finais e com C a concentrao de
produto final no lquido fermentado, teremos: MJ t, l/ { 1,1 ' ) J; Vjf
F=~ / )
4
ft\,
J: : ) 5 I
~t MMe ?
C tr i

/
O valor mdio de t1, por sua vez, depende do /;ocesso de fermentao, en-
quanto que o tempo de descarga td ~o~e-se.r~u~o por:

' t,d =v~~ (9.1)


A capacidade til de cada dorn~-~ prtica, no pode ser escolhida de ma-
neira completamente arbitrria. H fabricantes que fixam os tamanhos de domas _
Nmero de domas 20 I

que podem oferecerdentro de sua linha normal de trabalho. H, por outro lado,
experincia relativamente pequena na construo de fermentadores de grandes
capacidades (diversas centenas de metros cbicos), principalmente nos processos
que exigem borbulhamento de ar e agitao mecnica. Torna-se muito difcil esta-
belecer, nesse caso, recomendaes gerais. A experincia j adquirida no funciona-
mento de instalaes anlogas constitui critrio mais seguro de escolha de um
valor adequado de V dentrt1 os possveis.
O valor de te (tempo necessrio para limpar uma doma descarregada e car-
reg-la novamente) varia de caso para caso. Quando se pretende, no dimensiona-
mento de uma instalao, calcular o nmero de domas, toma-se como ponto de
partida:

te == td
Essa igualdade, totalmente arbitrria, facilita a avaliao de D e pode ser,
em muitos casos, obedecida na prtica industrial. Feitas essas observaes iniciais,
necessrias para que se possam interpretar com cautela os resultados obtidos no
clculo de D, passemos a esse clculo.
Consideremos uma dorna, que ser chamada de doma nmero 1, em incio
de trabalho; no intervalo de tempo te == td, ela ser limpa e carregada; decorrido
um intervalo de tempo t1, o lquido nela contido estar completamente fermeptado
e, aps outro intervalo de tempo td, ela se encontrar vazia e em condies de reini-
ciar seu ciclo de trabalho. Para que no haja interrupo de fornecimento de mate-
rial fermentado ao setor dos tratamentos finais, quando terminar a descarga da
doma nmero 1 dever existir uma outra (que ser indicada por doma nmero 2)
pronta para ser descarregada. Quando a doma nmero 2 tiver sido descarregada,
dever existir uma terceira em condies de iniciar sua descarga. Essa seqncia
de operaes pode ser visualizada na Figura 9 .2.

Figura 9.2 - Cronograma de funcionamento de domas em umlrocesso descontnuo. (I) Incio do preparo da dor-
na; (2) fim da carga; (3) fim da fermentao; (4) fim da descarga.
202 Fermentao descontnua

Dever existir, portanto, um intervalo de tempo td separando o incio de ftm-


cionamento de duas dornas consecutivas. Nessas condies, tomando-se conven-
cionalmente como instante zero oincio de trabalho da dorna nmero l, a doma D
dever comear a funcionar no instante (D-l)td. Por outro lado, com-indica a Fi-
gura 9.3, a doma D dever iniciar seu funcionamento no instante td + tf. Logo, po-
demos escrever:

(D -1) ;td =td +tf (D;;:: 3)

:.D=2+tf /td

:. D = 2 +(F tf I V) (9.2)

expresso que nos permite calcular o nmero de domas, desde que conheamc_>s F,
V e tf.

(4) ---------------------

(3) --------------------- :------f---------------


'
n"1

(2) ----------------'


Figura 9.3 - Cronograma de funcionamento das domas nmero I e nmero D. (I) Incio do preparo da doma; (2)
3
fim da carga; (3) fim da fermentao; (4) fim da descarga.

Ao procurarmos dimensionar uma instalao, os valores de F e de t so co-


nhecidos, mas os de V podem variar em intervalos muitos mplos. Surge, portan-
to, a necessidade de escolher um valor de V para podermos dar andamento ao
projeto que nos interessa.
Desde que no exista um critrio que nos leve a atribuir a V determinados
valores, poderemos, com o objetivo de iniciar o dimensionamento que temos
em vista, calcular o chamado nmero econmico de dornas, definido como sendo
o nmero de dornas de custo total mnimo capaz de atender s necessidades da
instalao. Esse nmero econmico, indicado por E, pode ser calculado como
segue: sendo p o custo de um fermentador de capacidade til V, vlida a -~
equao emprica
Nmero de domas 203

p=kVa (9.3)

sendo k e a dois parmetros que dependem das condies econmicas locais no


momento considerado, e O< a< 1. Indicando com P o custo de D fermentadores,
temos, combinando as Eqs. (9.2) e (9.3):

(9.4)

Derivando essa equao e igualando a derivada a zero, obtm-se o ponto de


mnimo (menor valor de P), caso em que D , por definio, igual a E.
Como os termos k, F, t1 e a so constantes, pode-se substitu-los por K, que
uma constante fruto das operaes que envolvem as constantes acima. Portanto,
chega-se a:

P=K D /(D-2t (9.5)

Derivando a Eq. 9.5, tem-se:

dP KDa(D-2)a- 1 -(D-2)aK
dD (D-2) 2a

Considerando (dP/dD) =O, obtm-se:

D =E= 2 I (1- a) (9.6)

Substituindo a Eq. 9.6 na Eq. 9.2, calcula-se a capacidade til de cada um dos
E fermentadores (Ve). Ou seja,

Ve =Ftf (1-a)/2a (9.7)

Pode-se tambm avaliar o nmero econmico de dornas, sem determinar os


parmetros da correlao emprica (Eq. 9.3), da seguinte maneira: tendo-se uma
lista de preos de domas de diversas capacidades, calcula-se, para cada valor de V
desta lista, o correspondente D pela Eq. 9.2; tendo-seDe o preo unitrio,calcu-
la-se o preo das D dornas; escolhe-se ento, entre os diversos valores calculados,
o valor de V, e conseqentemente de D, que tenha conduzido ao custo total mni-
mo.
Convm salientar que o valor de E poder no atender a outros requisitos
do processo. Quandotal fato acontecer, escolher-se- ento um valor de D que sa-
tisfaa a esses outros requisitos e que se situe to prximo de E quanto possvel.
Finalizando, as dimenses comumente utilizadas industrialmente para al-
guns processos fermentativos so apresentadas na Tabela 9.2.
204 Fermentao descontfnua

1
Tabela 9.2 - Dimenses de fermentadores para alguns processos fermentativos

3
VOLUME DO FERMENTADOR (m ) PRODUTO o ~
~

1-20
Enzimas de diagnstico, substncias
para biologia molecular.
lt,.~
~ft
40-80 Algumas enzimas e antibiticos.
'o

Penicilina, antibiticos aminoglicos-


100-150 dicos, proteases, amilases, transfor-
mao de esterides, aminocidos.

450 Aminocidos (cido glutmico).


. .. ;. ;t. .
-:.~.,
y o

:. :~ -~~-~;,_i. ~ . ~ ' \ "'; ... ~- r-'- r .. .... .. ft, l ., ...... ' "\t

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205

Joo Carlos Monteiro de Carvalho


Sunao Sato

I O. I - Introduo
Vrios processos fermentativos tm sido desenvolvidos em funo de dife-
rentes aplicaes. Um desses, que tem importncia tanto em escala industrial
como em nvel de pesquisa, o processo descontnuo alimentado, tambm conhe-
cido como processo por batelada alimentada ou, simplesmente, fermentao des-
contnua alimentada.
Embora a utilizao desse processo venha desde cerca de 1900 para regular
crescimento de Saccharomy~es cerevisiae} os primeiros . a utilizarem o termo "cultu-
ra por processo descontnuo alimentado" a ttulo de catalogao foram YOSHIDA
et al.,Z para se referirem a uma fermentao descontnua continuamente alimenta-
da com meio nutriente.

F
mosto

Figura I O. I - Esquema ilustrativo do modo de operao


de uma fermentao descontnua alimentada. inculo
206 Fermentao descontnua alimentada

Basicamente, o processo descontnuo alimentado definido como uma tc-


nica em processos microbianos, onde um ou mais nutrientes so adicionados ao
fermentador durante o cultivo e em que os produtos a permanecem at o final da
fermentao. Em alguns casos, todos os nutrientes so gradualmente alimentados
dorna 3 (Fig. 10.1). Adicionalmente, outros ~utores 1 A estendem esse conceito para
o acrscimo de aditivos, tais como precursores de produtos. A vazo de alimenta-
o pode ser constante ou variar com o tempo, 5 e a adio de mosto pode ser de
forma contnua ou intermitente. Mudana de volume pode ou no ocorrer, depen-
dendo da concentrao de substrato e da taxa de evaporao do sistema.
Devido flexibilidade de utilizao de diferentes vazes de enchimento de
domas com meio nutriente, possvel controlar a concentrao de substrato no fer-
mentador, de modo que, por exemplo, o metabolismo microbiano seja deslocado para
uma determinada via metabl~ca, levando ao acmulo de um produto especfico:
Cada condio de trabalho pode levar a diferentes perfis de concentrao
no s de substrato, mas tambm de clulas e produto. Uma representao esque-
mtica de um comportamento possvel para o processo pode ser observada nas Fi-
guras 10.2 e 10.3. Num cultivo, sabe-se que crescente o nmero de
microrganismos ao longo do tempo, o que leva ao aumento da massa celular na
dorna. No entanto, a concentrao de microrganismos pode ter um perfil decres-
cente durante o perodo correspondente ao enchimento da dorna (Fig. 10.2). Isso
pode ocorrer, pois a concentrao celular no depende somente da massa de mi-
crorganismos, mas tambm da variao de volume decorrente da adio de mosto
dorna. Por outro lado, deve-se lembrar que, aps a fase de enchimento da dorna,
o processo passa a ter caraCterstica de processo descontnuo clssico (sem entrada
ou sada de fluido da dorna) e a fermentao termina no instante a partir do qual a
massa de produto na dorna permanece constante (Fig. 10.3).

X.
'
'
,'

t
TE
t
TF
Figura I 0.2 - Massa celular (Mx) e concentrao celular (X) em funo do tempo para um proceso descontnuo ali-
mentado (curvas hipotticas. pois X. por exemplo. poderia ser constante ou crescente no perodo de enchimento da
doma).
Aplicaes 207

Deve-se salientar que parte do desenvolvimento do processo descontnuo


alimentado tem se dado empiricamente em escala industrial,6 e estas informaes,
quase sempre determinantes da viabilidade da produo industrial, constituem
segredo industrial e dificilmente so divulgadas.

.. v' ,Vf

(/)

::::.
--- -- Vi
s:' o
o
o

+
TF
Figura I 0.3 - Volume de meio (V), concentrao de substrato (S) e massa de produto (Mp) na doma em funo do
tempo para um processo descontnuo alimentado (curvas hipotticas, neste caso, com vazo constante de alimentao).

Ao longo deste captulo, abordaremos alguns casos onde a aplicao do pro-


cesso descontnuo alimentado possa ser indicada, bem como uma classificao e
alguns modelos matemticos para represent-lo .

I 0.2 - Aplicaes
Antes de 1940 a maioria dos processos fermentativos envolvia a converso
de carboidratos a outros compostos orgnicos simples. Seguindo o sucesso da
aplicao das fermentaes, descontnuas alimentadas para produo de levedura,
tentou-se a utilizao destas (com adio de um ou mais componentes necessrios
ao metabolismo do microrganismo) para a produo de glicerol, acetona, butanol,
cido ltico e outros materiais, resultando, em muitas ocasies, em um melhor
controle do processo de fermentao e mais eficientes utilizaes dos componen-
tes do meio. 4
Esse xito se deve a inmeros fatores, discutidos amplamente na literatura,
que podem agir isoladamente ou em conjunto para os mais diversos tipos de pro-
dutos e/ ou clulas obtidos por fermentao .
Algumas das finalidades ao se empregar as fermentaes descontnuas ali-
mentadas so relacionadas a seguir.

I 0.2.1 - Minimizao dos efeitos do controle do metabolismo celular


Para que um microrganismo tenha sua sobrevivnciagarantida no meio am-
biente, ele tem necessariamente de ser eficiente, ou seja, no deve desperdiar
energia. Devido a isso, dispe de mecanismos regulatrios em seu metabolismo,
que previnem que no haja superproduo de um determinado produto ou sntese
de uma enzima desnecessria, entre outros. A utilizao do processo descontnuo
208 Fermentao descontnua alimentada

alimentado de fermentao pode ser til quando se procura contornar alguns des-
ses mecanismos.
Em microrganismos, glicose ou outras fontes de carbono rapidamente meta-
balizveis reprimem a expresso de genes qU:e codificam enzimas relacionadas ao
metabolismo de outras fontes de carbono. Esse fenmeno conhecido como re-
presso catablica. 7 Muitas enzimas, especialmente aquelas envolvidas em cami-
nhos catablicos, esto sujeitas a essa regulao repressiva. Uma importante
tcnica p~ua superar represso catablica na biossntese de enzimas a cultura por
batelada alimentada em que a concentrao de glicose no meio em fermentao
mantida baixa, onde o crescimento restringido, e a biossntese de enzima desre-
primida.3,8
Na produo de levedura de panificao procura-se minimizar o efeito gli-
cose atravs da utilizao de diversas tcnicas de alimentao de domas/ manten-
do-se baixos os nveis de concentrao de acar no meio em fermentao.
Evitando que esse substrato seja deslocado para produo de etanol, aumenta-se a
eficincia de transformao da fonte de carbono em clulas.
Muito ligado represso catablica est um mecanismo de regulao deno-
minado induo. Tambm chamado de desrepresso, uma vez que os genes que
. codificam a sntese de enzimas induzidas esto usualmente reprimidos e, em pre-
sena de um substrato e/ ou indutor, so desreprimidos, liberando a sntese da
respectiva enzima. Diversas enzimas do catabolismo tm sua biossntese regulada
desse modo. 10 Por exemplo, em processos fermentativos cujo produto seja uma
protena recombinante, a induo de proteases se d quando ocorre a diminuio
da concentrao de nitrognio no meio. 11 Trabalhando com E. coli recombinante
para produo de somatotropina bovina, YOON et al. 11 conseguiram evitar que
esta fosse degradada por proteases, por meio da adio de extrato de levedura
como fonte de nitrognio orgnica, o que evitou a induo (desrepresso) dos ge-
nes que controlam a formao de proteases.
Represso catablica tambm tem influncia na produo de metablitos se-
cundrios. Glicose tem efeito repressor na formao de alcalides de ergot, cefalos-
porina C, indolmicina, bacitracina, estreptomicina, neomicina, novobiocina,
penicilina, entre outras. 10 Tambm nesses casos a utilizao do processo descont-
nuo alimentado com a finalidade de manter baixas concentraes de glicose pode
ser indicada, em vez de se utilizar uma fonte de carbono que no seja repressora.
Como normalmente as maiores velocidades de crescimento microbiano
ocorrem com valores de concentrao de substrato no meio em fermentao maio-
res que aqueles onde os efeitos de represso catablica so minimizados, h su-
gesto que se conduza o processo fermentativo em duas fases: a primeira, onde se
fornea mais substrato e se obtenha o aumento da biomassa e outra, onde se dimi-
nua o fornecimento de substrato de tal .forma a lintar a concentrao de substrato
e a velocidade do crescimento celular, de modo que haja desrepresso e a enzima
e/ou produto desejado seja produzido.8 Essa tcnica permite, portanto, que al-
guns processos fermentativos, principalmente aqueles em que a formao de pro-
duto no seja associada ao crescimento, sejam estendidos, trabalhando por um
perodo maior com as clulas em condies onde ocorra a produo do produto
desejado.
Aplicaes 209

Outro mecanismo de regulao que a clula microbiana possui, especial-


mente til no anabolismo, a .inibio por "feedback" (retroinibio). Muitas enzi-
mas biossintticas so inibidas por produtos finais. 10 Um meio de reduzir a
formao de produtos finais indesejveis (que exercem inibio e/ ou represso
das enzimas que levam formao do produto desejado) trabalhar com mutan-
tes auxotrficos (mutantes nutricionais), controlando a alimentao do nutriente
requerido para seu crescimento. Essa tcnica comumente utilizada na produo
industrial de aminocidos. 3

I 0.2.2 - Preveno da inibio por substrato ou precursores


Nutrientes tais como metano!, etanol, cido actico e compostos aromti-
cos inibem o crescimento de microrganismos, mesmo a concentraes relativa-
mente baixas. 3 Por outro lado, qualquer fonte nutriente pode se tornar inibitria,
dependendo de sua concentrao no meio, do m icrorganismo e das condies de
fermentao. Por exemplo, muitos pesquisadores concordam, de um modo geral,
que a inibio pelo substrato comea a ~er significativa para valores superiores a
100 g/L em fermentaes alcolicas com Saccharomyces cerevisiae e glicose como
Ad'Icwna
su b strato. 121314 . 1mente, em mmtas
. fermentaoes,
- d eve-se a d'Icwnar
. pre-
cursores para se obter maior quantidade de produto, os quais, muitas vezes, so
txicos para a microrganismo a partir de determinadas concentraes no caldo de
cultivo.
Em todos esses casos, o controle da vazo de alimentao permite que se
evite o trabalho em condies inibitrias, melhorando a produtividade e/ou ren-
dimento desses processos fermentativos.

I 0.2.3 - Minimizao da formao de produtos de metabolismo txicos


A produo de produtos de metabolismo txicos particularmente crtica
em processos onde se deseja a obteno de altas densidades celulares. Alguns dos
casos onde se visa tais nveis de concentraes ceh.~lares so fermentaes com mi-
crorganismos recombinantes e com clulas animais, uma vez que, geralmente, es-
ses agentes de fermentao produzem pouco produto. O aumento do nmero de
clulas compensaria essa deficincia. Para se conseguir tal objetivo necessrio
restringir a velocidade de crescimento devido a limitaes de transferncia de oxi-
gnio, bem como transferncia de calor. 15 Em E. coZi, fonte de carbono em excesso,
mesmo em aerobiose, leva formao de cido actico 16 (inibidor de crescimento),
que de certa forma est relacionada ao aumento da velocidade de crescimento do
microrganismo. 11 Por outro lado, no cultivo de clulas animais, os produtos txi-
cos mais comuns so lactato e amnia. 17
Em ambos os casos acima, o controle da velocidade de fornecimento de
substrato ao sistema permite que se mantenha a velocidade de crescimento celular
em intervalos desejados e/ ou minimize a formao de produtos txicos para as
clulas, possibilitando que se consiga altas concentraes destas e, tambm, au-
mentei na quantidade de produto formado.
2 IO Fermentao descontnua alimentada

I 0.2.4 - Superao de problemas freqentes de estabilidade em


processo contnuo
Contaminao, mutao e instabilidade de plasmdeo so algumas das difi-
culdades de manter estvel um processo contnuo. Nesses casos, utiliza-se o pro-
cesso descontnuo alimentado com a finalidade de super-las. 1

I 0.2.5 - Adequao do processo fermentativo a condies operacionais


No Brasil, o aumento da capacidade de produo de etanol das unidades in-
dustriais forou o aumento da capacidade volumtrica e do nmero de fermenta-
dores.18 Apesar de grande parte das instalaes industriais anteriormente virem
trabalhando com o processo descontnuo clssico, no foi mais possvel mant-lo,
devido a problema de intensa formao de espuma, que era menos significativo
quando se operava com dornas de pequena capacidade volumtrica, sem levar em
conta efeitos de inibio pelo substrato, que pode ocorrer quando a concentrao
de substrato atinge maiores valores no meio de fermentao. Surgiu, ento, a apli-
cao do processo descontnuo alimentado para contornar esses problemas. Em
estudo de vazes de enchimento de dornas, vazes decrescentes levaram a maio-
res produtividades em etanol. 19 '20'21 '22 AQUARONE et al. 19 concluem que vazes de-
crescentes levam a maiores produtividades em etanol e minimizam problemas
com espuma, pois a velocidade de adio de acar mxima no incio, quando se
tm menores volumes de meio em fermentao e ainda no h inibio por etanol,
e mnima no final da fase de enchimento.
No caso de ter-se um nutriente que seja instvel nas condies de fermenta-
o, e cujo custo justifique sua utilizao, ele pode ser usado, desde que seja adici-
onado aos poucos, ajustando a velocidade de adio velocidade de consumo
pelo microrganismo.
Tambm em processos aerbios de perodos mais extensos, tais como em
fermentaes de antibiticos (1 a 2 semanas), pode-se incorporar o substrato a ser
adicionado no lquido de reposio de perda por evaporao. 3'23 Aqui o processo
descontnuo alimentado concatena dois objetivos: repe lquido que o sistema per-
de e alimenta-o com o substrato.

I 0.2.6 - Estudo de cintica de processos fermentativos


Processo descontnuo alimentado til para o estudo de cintica de proces-
sos fermentativos, pois permite a manuteno de baixos nveis de substrato por lon-
go perodo de tempo, que favorvel estimao de parmetros cinticos}4
permite manter concentrao celular constante e controlar velocidade de crescimen-
to em condies transientes. Ademais, h evidncias que as mximas velocidades
de alguns processos podem ser encontradas somente nessas circunstncias. 25

I0.3 - Classificao
Devido diversidade de aplicaes do processo descontnuo alimentado, al-
gumas variaes podem decorrer com a finalidade de ajust-lo produo de di-
Classificao 2I I

versos produtos obtidos por fermentao, sendo qualificados na literatura por


terminologias complementares.
Processo descontnuo alimentado ,r.ep.eti-tUm-- aquele em que uma frao
constante de volume de cultura removida a intervalos de tempo fixos, podendo
ser mantido indefinidamente. 6' 26 Em outras palavras, de tempos em tempos, reti-
ra-se rapidamente um determinado volume de meio fermentado da doma (o qual
ser destinado separao do produto fermentado), sendo recomposto at seu va-
27
lor mximo atravs da adio de mosto com vazo de alimentao conveniente.
Terminada a fermentao, repete-se o procedimento, que ser interrompido se cair
a produtividade e/ ou rendimento do sistema, que podem ocorrer, por exemplo, se
houver contaminao. Enchimentos e esvaziamentos repetidos de volumes espec-
ficos resultam numa operao cclica de variao de volume/8 sendo designado
por estes autores como processo descontnuo alimentado cclico, como assinalam
29
MORI et al. Esse tipo de processo tem sido utilizado industrialmente para produ-
o de levedura e de antibiticos/8 com o intuito de aproveitar como inculo o mi-
crorganismo que est crescendo com alta velocidade de crescimento e de trabalhar
com as clulas que esto na fase produtiva por mais tempo, respectivamente, le-
vando ao aumento de produtividade do sistema.
Processo descontnuo alimentado -~t~ndido descreve o modo de operao
em que a concentrao de substrato limitante mantida constante no meio em fer-
mentao pelo suprimento contnuo do nutriente.30'31 Como o prprio nome suge-
re, tem por finalidade estender o perodo de fermentao; mantendo nveis de
concentrao de substrato no reator adequados para que as clulas continuem com
atividade fermentativa direcionada para a formao do produto desejado.
Tanto a fermentao descontnua alimentada como a descontnua alimentq.-
da estendida usualmente cobrem somente um ciclo de operao e diferem do pro-
cesso descontnuo alimentado repetitivo 32 (cclico) quanto durao da
periodicidade aplicada cultura.
O processo descontnuo alimentado pode ser dividido em dois grupos, ba-
seados no fato de a adio de substrato ser ou no controlada por um mecanismo
de retroalimentao 1' 3 (Tab. 10.1).
I
No modo de operao com controle por retroalimentao, o fornecimento de
substrato pode ser controlado em funo da concentrao deste no meio de fer-
mentao (controle direto) ou em funo de outros parmetros (controle indireto),
tais como densidade ptica, pH, quociente respiratrio, entre outros.
Por outro lado, o suprimento de substrato ao sistema feito intermitente-
mente ou de forma ininterrupta at o final da fase de enchimento da doma nos
processos no sujeitos ao controle por retroalimentao. Alm disso, pode-se ali-
mentar com vazes constantes ou variveis.
Em ambos os modos de operao, o que se visa a otimizao dos valores
da concentrao de substrato no fermentador, com vistas a aumentar o rendimen-
to e/ ou produtividade do processo fermentativo. H casos em que se visa manter
uma determinada concentrao de nutriente no caldo em fermentao e outros em
que se deseja que ela oscile de acordo com um perfil definido, considerado como
timo.U
212 Fermentao descontfnua alimentada

1
Tabela I 0.1 - Classificao de tcnicas de processo descontnuo alimentado.

TCNICA EXEMPLO
>

Parmetro Substrato/
Condio Mtodo Produto l\1
de controle aditivo

Quociente '
Indireto Melao Levedura f.'''
Com controle respiratrio ~-
por retroali- '
mentao Protena ';o-
Direto Etanol Etanol
microbiana

In termi tente t..,..


cido
ou Nenhum Penicilir1a
fenilactico .-,
incrementos

Sem controle Adio I

por retroali- com taxa Nenhum Glicerol P-galactosi- 1.


das e '
mentao constante
<

Adio : ~
Protena
com taxa Nenhum Etanol
microbiana
exponencial
:
...... . . .iil~.. ~,:~~~;:..:: <-' ""._..(. j'-!~-;'.!. ~" ,,.l..,J ., - i_'.o' . ..,. .......
.l . 1 .'! -

I0.4 - Modelos matemticos


A utilizao de equaes que representam um processo pode permitir a esti-
mao de parmetros, bem como sua otimizao.
Consideraremos aqui modelos que foram desenvolvidos para fermentadores
agitados (homogneos), alimentados com mosto constitudo de um substrato limi-
tante.33

I 0.4.1 - Modelo para clulas
Tem-se que a velocidade de variao de massa de clulas no reator corres-
ponde massa celular formada decorrente do crescimento microbiano. Algebrica~
mente:

(10.1)

dMx
--=11 VX (10.2)
dt

d(V . X) = ll V X (10.3)
dt
Modelos matemticos 213

dV dX
- . X + - . V = J.!. V . X (10.4)
dt dt
Considerando que a variao de volume na doma deve-se exclusivamente
alimentao:

dX
FX+-V=J.!VX (10.5)
dt

F dX
-X+-=J.!X (10.6)
v dt

dX
: . DX+-=J.lX (10.7)
dt

dX
-=(J.t-D)X (10.8)
dt

Notar, pela eq. 10.8, que se no houver variao da concentrao celular no


decorrer do tempo, isto , dXI dt =O, tem-se a igualdade J.! = D. Nessa condio, a
velocidade especfica de crescimento celular numericamente igual vazo espe-
cfica de alimentao.
Exemplificando: Num processo onde o volume varie de V; a Vf e se alimen-
te a dorna com vazo constante F ternos que V= V;+ F t. Assim, D decresce
com o tempo de acordo orn a expresso:

D =F I (Vi +F . t) (10.9)

Desta forma, se dXI dt =O, J.! = D =F I (V; + F t), decrescendo, neste caso, ao
longo do tempo.

I 0.4.2 - Modelo para substrato


A velocidade de variao da massa de substrato no ferrnentador correspon-
de diferena entre a massa de substrato adicionada por tempo e a utilizada para
o crescimento celular. Pode ser representada pela expresso:

dMsr =F S - dMsc (10.10)


dt m dt

d(V, S) =FS dM s_c


___ (10.11)
dt m dt
2 14 Fermentao descontnua alimentada

_dv_.5 +-d5. v =F 5 - d.Msc (10.12)


dt dt m dt
Considerando que a variao de volume na dorna deve-se exclusivamente
alimentao:

~ - f+-dS =.f .s _..!._ d.Msc (10.13)


V dt V m V dt

dS
05+-=D S -rs (10.14)
dt m

onde: rs =velocidade de consumo de substrato

dS=D (5 -5)-r (10.15)


dt .m s.

Sabendo que Yx/s = rxfrs , chega-se a:

dS 1
- =D (S - 5 ) - - r (10.16)
dt m Yx;s X

dS 1 (lq.17)
-=D(5m -5)--J..LX
dt Yx;s

A eq. 10.17 uma equao simplificada, estando de acordo com trabalhos


descritos na literatura. H autores, entretanto, que sugerem equaes mais com-
pletas, onde consideram que uma parcela do substrato vai para crescimento celu-
lar e outra para a manuteno,3.6 e at parcela que considera substrato deitinado
formao de produtos complexos. 34 Tambm aqui, vale lembrar que o valor de D
varivel com o tempo, diferenciando a equao acima daquela proposta para ba-
lano de substrato de um processo contnuo com doma nica/5 onde o valor de D
fixo.

I 0.4.3 - Modelo para produto


A velocidade de variao de massa de produto no fermentador depende da
massa que formada devido ao metabolismo microbiano. Ou seja:

(10.18)

d(V . P) = ll .V . X (10.19)
dt p .
Modelos matemticos 215

Considerando que a variao de volume na doma deve-se exclusivamente


alimentao, tem-se:

dP
FP+-V=~p VX (10.21)
dt

dP
D P+-=~p X (10.22)
dt

dP
-=~p X-DP (10.23)
dt
onde: ~p X = rp

Nomenclatura:
D: Vazo especfica de alimentao (h-1)
F: Vazo volumtrica de alimentao (L/h)
MP: Massa de produto no fermentador (g)
M .c: Massa de substrato consumida pelo microrganismo (g)
M .r: Massa de substrato (residual) no fermentador (g)
M,: Massa celular no fermentador (g de matria seca)
P: Concentrao de produto no fermentador (g/L)
rP: Velocidade de formao de produto (g/L.h)
r.: Velocidade de consumo de substrato (g/L.h)
r,: Velocidade de crescimento celular (g de ~atria seca/L.h)
S: Concentrao de substrato residual no fermentador (g/L)
Sm: Concentrao de substrato no mosto de alimentao (g/L)
t : Instante t (h)
TE: Tempo de enchimento do fermentador (h)
TF: Tempo de fermentao (h)
V: Volume de meio no fermentador (fase lquida+ fase slida) (L)
V ;: Volume de inculo (L)
V f: Volume final de meio no fermentador (mximo valor de V)(L)
. X: Concentrao celular no fermentador (g de matria seca/L)
~:Velocidade especfica de crescimento celular (h- )
1

1
~P: Velocidade especfica de formao de produto (h- )
Y , 1.: Fator de converso de substrato limitante em clulas (g de massa
celular seca formada/ g de substrato consumido)
2 16 Fermentao descontnua alimentada

(dMP/dt): Velocidade de variao da massa de produto


no fermentador (g/h)
(dMP/ dt)c: Velocidade de formao de produto em termos mssicos (g/h)
(d.M.cl dt): Velocidade de consumo de substrato em termos mssicos (g/h)
(d.M.rfdt): Velocidade de variao da massa de substrato residual
no fermentador (g/h)
(dMx/dt): Velocidade de variao de massa celular seca no fermentador
(g de matria seca/h)
(dMxfdt)c: Velocidade de crescimento celular em termos mssicos
(g de matria seca/h)
(dP /dt): Velocidade de variao da concentrao de produto
no fermentador (g/L h)
(dS/dt): Velocidade de variao da concentrao de substrato residual
no fermentador (g/L h)
(dV I dt) : Velocidade de variao de volume na doma (L/h)
(dX/ dt) : Velocidade de variao da concentrao celular no fermentador
(g de matria seca/L h)

Referncias bibliogrficas
(1) BROWN, A. Fed-batch and continuous culture. In : MCNEIL, B.; HARVE