INTOXICACION ETILICA Y ESTRES OXIDATIVO. MARIA CASCALES', E. MANUEL ROBLES-CHILLIDA*, CARMEN CASCALES' Y MIGUEL ANGEL SANTOS-RUIZ* " Instituto de Bioguimica, Facultad de Farmacia, Plaza Ramén y Cajal sn, 28040 Madrid Centro de Investigaciones Biol6gicas, Velazquez 144, 28006 Madrid » Hospital Gomer Lilla, Servicio de Farmacia Glorieta del Ejétcito sn, 28047 Madrid SUMARIO. 1. INTRODUCCION 2. METABOLISMO OXIDATIVO DEL ETANOL, 2.1. Efecto del etanol sobre la disminucién de NAD" 2.2, Induccién del sistema microsémico de oxidacién del etanol (SMOE) 2.2.1. Inducei6n del citocromo P-450 2E1 en células de Kupffer 3, ESPECIES REACTIVAS DE OXIGENO GENERADAS EN EL META- BOLISMO OXIDATIVO DEL ETANOL 4, OXIDO NITRICO E INTOXICACION ETILICA 5. ETANOL Y SISTEMAS DE DEFENSA ANTIOXIDANTE 6. BIBLIOGRAFIA 2671. INTRODUCCION Desde el punto de vista clinico, el etanol es Ia sustancia hepatotéxica més, cestudiada debido a su utilizacién de manera abusiva por el ser humano y al impacto del consumo del etanol en la incidencia de enfermedad hepética. El metabolismo del etanol comienza en la mucosa gastrica, pero es el higado el Srgano que se encarga principalmente de su metabolismo y eliminacién y el que més sufre sus efectos t6xicos. A pesar de que las influencias genéticas, inmunol6gicas y mutricio- nales juegan un papel importante en la patogénesis de la enfermedad hepstica al- coholica, se asume que el etanol es hepatot6xico per se, Buena parte de los meca- rnismos celulares que intervienen en la citotoxicidad del etanol permanecen aGn controvertidos, debido a la gran cantidad de modelos experimentales de hepatotoxi- cidad inducida por el etanol. El estrés oxidativo es el resultado de una alteracién en el equilibrio prooxidante/ antioxidante celular, en favor de ta oxidacién. El metabolismo del etanol en el higado puede inducir la produccién de radicales libres y especies reactivas de oxi- geno, capaces de oxidar Iipidos y ocasionar lesiones en las membranas celulares. Existen evidencias que demuestran la intervencién del etanol en la peroxidacién de lipidos y esta claro que el estrés oxidative originado como consecuencia de la oxidacién del etanol, juega un papel clave en la patogénesis de la lesién hepitica asociada al alcohotismo (1), Los factores que conducen a la enfermedad hepstica inducida por el etanol son muy diversos y entre ellos cabe citar, las alteraciones en el estado de oxido-reduc- cién celular, la induccién del sistema microsGmico de oxidacién del etanol depen- diente del citocromo P-450, la desviacién del metabolismo del etanol desde la alcohol deshidrogenasa (la via fisiol6gica normal) hacia el sistema de oxidacién ‘microsémico ubicado en el reticulo endoplismico, el mayor consumo de oxigeno por este sistema, la generacién disminuda de ATP y el bajo estado energ intracelular (2, 3) 2. METABOLISMO OXIDATIVO DEL ETANOL. En el hepatocito de los mamiferos, el etanol se oxida a acetaldehido por tres, vias: La alcohol deshidrogenasa (ADH), enzima citos6lica de importancia primor- 269dial cuando el etanol se ingiere de manera esporddica y en dosis moderadas (Figura 1, A); el. sistema microsémico de oxidacién del etanol (SMOE) dependiente del citocromo P-450, ubicado en el reticulo endoplismico, sistema adaptativo que jueza tun papel importante en Ia intoxicacién etilica crénica, (Figura 1, B); y el metabo- lismo peroxisémico del etanol, catalizado por la catalasa en presencia del H,O, generado por accién de la NADPH oxidasa. Este titimo sistema parece ser de menor importancia por su escaso grado de contribucién a 1a oxidacién del etanol (Figura 1, C) (1-3) ‘Alcohol deshidrogenasa A. Etanol + NAD” > Acetaldehido + NADH + H* SMOE B. Etanol + NADPH + H* + 0,——® Acetaldehido + NADP* + 2H,0 NADPH oxidasa NADPH + H* + 0, ——————- NADP* + H,0, c. catalasa, Etanol + H,0, ———> Acetaldehido + H,0 ABE siotetasa D. CHy-CH,OH + HOOC-R ———— CH,-CH,-OOC-R + H20 Figura 1. Metabolismo axidativo (A - C) y no oxidativo (D) det etanol La oxidacién del etanol a acetaldehido por la alcohol deshidrogenasa genera el coenzima nicotinamido adenin dinuclestido en su forma reducida (NADH) a expen- sas del mismo coenzima en forma oxidada (NAD"), y su actividad esté condiciona- da a la reoxidacién del NADH a NAD", Esto se consigue a través de diversos sistemas de oxido reduccién en el citoplasma del hepatocito y de la transferencia de los metabolitos reducidos a la mitocondria via los mecanismos de lanzadera (2 - 4). SSi se generan excesivas cantidades de NADH, que superen la capacidad del hepa- tocito de mantener la homeostasis redox NAD'/NADH, se suceden una serie de alteraciones, tales como: acumulacién de metabolitos reducidos en el citosol (glice- rol fosfato, malato y lactato (Figura 2)), con un incremento en la lactacidemia que contribuye a la acidosis y reduce la capacidad renal de excretar dcido trico (hipe- ruricemia); alteraciones en el metabolismo de la glucosa (5), generacién de purinas, deplecién del ATP, etc. El incremento en la sintesis de dcidos grasos (lipozéne sis), demostrada en casos de intoxicacié ies otra de las vias de utilizacién del exceso de equivalentes reductores (6) Existe una alcohol deshidrogenasa en la mucosa gdstrica que metaboliza el etanol cuando éste se ingiere unido a la dieta, en dosis denominadas «sociales» (7- 10). La ADH gastrica, ha sido ya aislada y existe en tres formas caracterizadas por 270ETANOL, ACETALDEHIDO ACETATO NAD* NADH NAD* NADH Diicerol-P) _Dihidroxiacetona-P Oxalacetato NADP* ACIDOS| |GRASOS| Piruvato 7 [Lactatd NADH = NAD* Figura 2. Interrelaciones del metabolism del etanol en el citoplasma del hepatocite presentar diferentes afinidades por el etanol (Km alta, baja e intermedia). La ADH sxistrica presenta una variabilidad étnica y se sabe que el 80% de los japoneses carecen de una de las isoformas. La ADH géstrica se inhibe por férmacos, no existe cen individuos que han sufrido Ia gastrectomia ni en alcohélicos erénicos y esta inhibida en casos de ayuno (11). La actividad de la alcohol deshidrogenasa gist es significativamente menor en el sexo femenino (12). Esta via primera del meta- bolismo del etanol puede llegar a metabolizar en el estémago una fraccién consi- derable del etanol ingerido, evitando su paso a la circulacion sistémica (13) Los sistemas enzimiticos implicados en la oxidacién del etanol antes mencio- nados presentan distinta afinidad por el etanol, calculada por la constante de Mi- chaelis (Km). En la ADH hepstica la Km fluctua entre 0,2 a 2. mM, en la ADH gistrica entre 40 a 100 mM (2) y en el SMOE entre 8 a 10 mM. Esto indica que a ADH hepitica, aunque sea Ii mas abundante, por su elevada afinidad por el etanol se satura a concentraciones muy bajas, mientras que la ADH géstrica al poseer una Km muy elevada (baja afinidad), puede actuar frente a concentraciones de alcohol més altas y actuar asf como mecanismo «protector» que previene del efecto de cantidades saturantes de etanol en la circulacién periférica, El SMOE, dependiente del citocromo P-450, es la via de emergencia que acta cuando la cantidad de etanol sobrepasa la capacidad de Ia ADH hepittica y se caracteriza por su capacidad de ser inducida en caso de alcoholismo crénico. La isoforma del P450 que se induce por el etanol es en su mayor parte la 2E1 codificada por el gen CYP2EI (14, 15). mmLa via no oxidativa del metabolismo del etanol (Figura 1, D) implica la forma- cién de ésteres etilicos de acidos grasos de cadena larga, catalizada por la acido ‘graso etil ester (FAEE = fatty acid ethyl ester) sintetasa. Esta via es muy operativa en fetos cuando se administra el etanol por via intraperitoneal a ratas prefladas en. determinados momentos de la gestacidn (16), y existe tambien en diversos érganos como miocardio, corteza cerebral, pancreas, higado y médula dsea (17). 2.1. Efecto del etanol sobre el NAD* A pesar de que uno de los requerimientos de la ADH hepatica para oxidar el ctanol es la recuperacién del nicotinamido adenin dinuclestido en forma oxidada, NAD’, se ha observado en cultivos de hepatocitos, que es el propio etanol a con- centraciones de 8 a 10 mM, el que promueve Ia disminucién del NAD" pot varias vias. Una de ellas es estimulando la formacién del NADP” mediante ta activacién de la NAD’ quinasa, la tnica reaceién conocida que, en presencia de ATP, convier- te el NAD" en NADP" (18, 19). El descenso en la concentracidn intracelular del NAD’ por esta via, puede llegar a ser del 15% (19). Otra via utilizada por el etanol para consumir NAD" es mediante la activacién de otras enzimas, como la NAD*- hidrolasa y la poli (ADP ribosa) polimerasa, ambas necesarias para ADP-ribositar Jas proteins nucleares implicadas en el proceso de reparacién del DNA (Figura 3) (20). La deplecién del NAD* presenta alteraciones metabélicas importantes, entre elas la de limitar, no sélo la oxidacién del etanol por la via de la alcohol deshidro- genasa, sino tambien la de bloquear la formaciGn de los resfduos de ADP-ribosa de las proteinas nucleares con consecuencias sobre la reparacién y proliferacién celular (21). NAD* quinasa NAD’ + ATP ————» NADP* + ADP (15%) NAD* hidrolas ADP-tibosa, ADP boss polimerasa ADP-ribosilacién proteinas (reparacién DNA) Figura 3.- Vias inducidas por el etanol que consumen NAD* 2.2, Induccion del sistema micros6mico de oxidacion del etanol (SMO) EI mecanismo que conduce « Ia lesién hepatica inducida por alcohol es bastante complejo y se encuentra sujeto a muchos factores, entre los que cabe destacar: (a) alteraciones en el estado redox det hepatocito, (b) induccién del SMOE, (c) elevada mmconcentracién de etanol en sangre y (4) disminueci6n del oxfgeno hepitico. Por otra parte, la ingestién erdinica de etanol al inducir el SMOE en el hepatocito, promueve tuna serie de alteraciones debidas al incremento del consumo de oxigeno, al incre- mento en el gradiente de tensién del O, en el sinusoide y al estado resultante de hipoxia en los hepatocitos perivenosos (14, 15). La isoforma del citocromo P-450 que se induce predominantemente por efecto del etanol es la CYP2EI, la cual se eleva de 5 a 10 veces, por activaciGn transcrip- cional del gen CYP2EI 0 por estabilizacién del mRNA CYP2EI. A dosis bajas de ‘anol la inducci6n se verifica a nivel post-traducional, mientras que @ dosis ele- vadas la induccién se verifica en la transcripcién (2, 15). El citocromo P450 2E1 se encuentra distribufdo de manera heterogénea en el espacio acinar siendo mas abundante en la regiGn perivenosa del acino. Su induc- cidn en la vecindad del terminal venoso, unida a la menor presién de oxigeno existente en esta zona, son factores que impiden la recuperacién del NAD". Todo ello, si va asociado ademds, con una prolongada ingestién de etanol, favorece la iniciacién de la secuencia de eventos que va a conducir al estrés oxidativo y a la peroxidacién lipidica (22 - 24). Por tanto, la desviacién del metabolismo del etanol, desde la alcohol deshidrogenasa citos6lica al sistema microsémico de oxidaciGn del ctanol, es lo que va a producir la hipoxia relativa en la regién perivenosa del acino, la cual va unida a un descenso en la generacién del ATP y en el estado energético celular. En condiciones de maxima induccién, el citocromo P450 2B] llega a alcan- zar en las células perivenosas, concentraciones entre 50 y 100 uM. Esta isoforma P450 2E1 cataliza tambien la oxidacién de diversas hepatotoxinas y solventes y exhibe en presencia de NADPH una elevada capacidad de consumir ‘oxigeno, Los dcidos grasos de la dieta ejercen gran influencia sobre la induccién de la expresin del CYP2E1 por el etanol, de manera, que una dieta rica en dcidos _grasos poliinsaturados (linoleico), estimula dicha induccién, Por ejemplo, al com- parar la adicién a la dieta de grasa de buey (0,7% linoleic) de aceite de maiz (58% linoleico), se ha observado que el aceite de maiz, por su mayor contenido en linoleico, es el que produce una estimulacién mayor sobre la induccién, dependiente del etanol, del sistema microsémico de oxidacidn en general y del CYP2E1 (24). La evidencia de que el sistema CYP2E1 sea capaz de inducir la peroxidacién lipi- dica en las areas perivenosas en momentos previos al desarrollo de la lesiGn alco- hélica hepatocelular ha logrado convencer de la implicacién de la lipoperoxidacién cn la enfermedad hepatica alcohslica (25-27). La peroxidacién lipidica inducida por el etanol es el resultado, no séto de la clevada generacién de radicales libres y especies reactivas de oxfgeno, sino tambien de la actividad deficitaria de los mecanismos de defensa responsables de la elimi- naci6n de dichos radicales. Los mecanismos implicados en la generacién de espe- cies activas de oxigeno durante el metabolismo del etanol incluyen los siguientes: {a) la cadena mitocondrial de transporte electrénico (28), (b) el sistema microsSmi- 273co CYP2EI y Ia citocromo P450 NADPH reductasa (29, 30) (c) la xantina oxidasa, aldehido oxidasa, NADP oxidasa, ete, (1-3) Las evidencias sugieren que los sistemas microsGmicos son la fuente mas im- portante de especies reactivas de oxigeno en casos de intoxicacién ettlica crénica debido a la induccién del sistema CYP2E1 y de la citocromo P-450 NADPH reduc- tasa (31-33), El CYP2EI posee una actividad NADPH oxidasa muy clevada y se encuentra poco acoplado a la NADPH citocromo P-450 reductasa. Se ha deserito {que los microsomas de higado de ratas inducidos con etanol generan més activa- mente el radical hidroxilo (OH), en presencia de NADPH como reductor microsé- ico (31) y se ha observado que dicho radical ataca al DNA produciendo roturas fen sus cadena. La cadena respiratoria mitocondrial es una de las fuentes fisiol6gicas del anién supetéxido, La mitocondria posee una superdxido dismutasa activa que destruye dicho anién con produccién de persxido de hidrégeno, el cual, a su vez, es elin nado por la glutation peroxidasa mitocondrial. El incremento de equivalentes reduc tores inducido por el etanol puede exacerbar la actividad mitocondrial incremen- tando el flujo de electrones a través de la cadena respiratoria y elevar con ello la zgeneracién del anién super6xido en la mitocondria (28). A pesar de los mecanismos de defensa, parte del perdxido de hidrégeno puede escapar de su climinacién enzi- mitica y reaccionar, en presencia de hicrro (34), generando radicales més agresivos, como el radical hidroxilo, que alteran Ia funcién y estructura de la mitocondria. El ‘metabolismo heptico del etanol puede originar una situaciGn de estrés oxidativo y peroxidacién lipidica (26, 27). El estrés oxidativo originado, en casos de intoxica~ cién aguda, afecta particularmente a la mitocondria ya que la oxidacién del etanol por la alcohol deshidrogenasa hace que la mitocondria genere mayor cantidad de especies reactivas de oxigeno, Estas especies reactivas afectan a la membrana mi- tocondrial aumentando su susceptibilidad a la lipoperoxidacién y disminuyendo los niveles mitocondriales de GSH (35). Tambien estas especies y los productos deri- vados de Ia peroxidacién lipidiea pueden lesionar el DNA mitocondrial que se encuentra menos protegido que el nuclear (36, 37) La xantina oxidasa puede jugar tambien un papel en la generaci6n de especies activas de oxigeno especialmente en casos de baja tensién de oxfgeno en las areas perivenosas (32, 38). La elevacién del NADH y la degradacién de los nuclestidos de adenina favorecen la formacién de radicales libres via xantina oxidasa (39). Por otro lado, el hierro juega un papel destacado en los mecanismos de peroxidacién ya {que el acetaldehido por accién de la aldchido oxidasa inicia la movilizacién del hierro a partir de la ferrtina (34). El incremento del cociente NADH/NAD” favo- rece esta movilizacin y el hierro libre acttia como catalizador importante en la generacién del radical hidroxilo mediante la reaccién de Fenton (29) El radical hidroxilo ( OH) presenta una agresividad mucho més elevada que el ani6n super6xi- do y el perdxido de hidrSgeno, y al contrario que estos dos tiltimos, no se conoce hasta la fecha ningtin sistema enzimitico que bloquee su accidn. 274Se ha considerado que son los hepatocitos la fuente primaria de los radicales de oxfgeno en los alcohélicos, dado su papel preponderante en el metabolismo del etanol, pero otras células hepaticas pueden tambien contribuir a este proceso. Asi, Jas células de Kupffer son una fuente importante de radical superéxido en casos de intoxicacién etflica (40, 41), debido a la induccién del CYP2E1 en ellas, por efecto del etanol. La consecuencia de la generacién de especies reactivas de oxigeno en las células de Kupffer ha de ser diferente si se la compara con los hepatocitos, ya que una de tas funciones de las células de Kupffer es actuar como modulador de la activacién de las células Ito para la produccién de colgeno. Se sugiere, por tanto, ue la generacién de especies activas de oxigeno inducida por el etanol en las células de Kupffer, puede jugar un papel en la expresién del TGFBI y en la fibro- Benes 2.2.1, Induccién del CYP 2E1 en células de Kupffer Las células de Kupffer, los macréfagos residentes en higado, intervienen de manera importante en la patogénesis del aleoholismo (42). Estas células poseen cuando se activan, ademds de su misicn de defensa inmunolégica, funciones modu- ladoras de otras células hepiticas mediante la secrecién de mediadores tales como citoquinas y especies reactivas de oxigeno. El etanol actia sobre las células de Kupffer alterando su funcién celular a nivel de fagocitosis (43, 44) y produciendo cambios en la liberacién de citoquinas (TNFa, y TGFB) (45-47) y en la generacion del anién superéxido. Estas alteraciones son importantes porque pueden contribuir ala iniciaciGn de la fibrogénesis alcohélica, ya que el TGFB, las especies reactivas de oxigeno y los productos de la peroxidacién lipidica, inducen la sintesis de las proteinas de la matriz. por los fibroblastos y las células Ito (48). Aunque el CYP2E1 se encuentra mayoritariamente en los hepatocitos, se ha descrito la presencia de este sistema inducible en células de Kupffer (2). Un reciente estudio de Koivisto et al, (41), ha demostrado la induceién del CYP2E1 en células Kupffer de rata con intoxi cacién etflica erénica. La induccién relativa fué de 1a misma magnitud que en hepatocitos, pero el contenido en CYP2EI fué 10 veces menor. La induccién del CYP2E1 en células de Kupffer por el etanol provoca en estas ccélulas serias consecuencias debidas a la elevacién intracelular de acetaldehido. Se ha observado que la contribucién relativa del CYP2EI de estas células a la gene- racién total de acetaldehido puede ser més elevada que en los hepatocitos (49). En células Kupffer de murinos los inhibidores del citocromo P-450 inhiben el metabo- lismo del etanol en mas de un 50%, mientras que los inhibidores de la alcohol deshidrogenasa y de la catalasa lo inhiben menos de un 10% (50). Tambien se ha descrito que el alcoholismo crénico tiende a elevar el metabolismo del etanol en estas células, lo cual sostiene la hipétesis de que el CYP2E1 inducible por etanol es el principal sistema operativo. De ser asi, una induccién que eleve varias veces la cantidad de CYP2E1 supondrfa una produccién de acetaldehido en las células de Kupffer incluso superior que en hepatocitos. El acetaldehido es capaz. de unirse 275covalentemente a las proteinas, incluso al propio CYP2El (51), y formar aductos estables con las proteinas, los cuales pueden actuar como neoantigenos. Como las ccélulas de Kupffer son capaces de presentar antigenos a los linfocitos (52), es posible que Ia formacién de estos aductos origine una respuesta inmunolégica, Esto es importante porque existen evidencias de que los anticuerpos producidos frente a los aductos acetaldehido-proteina contribuyen al desarrollo de la hepatitis alcohdlica (53). La produccién de IgE anti-aductos del acetaldehido-proteina puede conllevar reacciones de hipersensibilidad al etanol (54). Otro mecanismo por el cual cl acetaldehido puede afectar la funcidn de las células de Kupffer se basa en su capacidad para unirse a la cisteina y al glutation, disminuyendo asf la concentracién de glutation (55), El CYP2EI al oxidar el etanol a acetaldehido genera especies reactivas de oxigeno las cuales pueden iniciar a peroxidacién lipidica microsémica (56, 57). Cuantitativamente la peroxidacién lipidica dependiente del CYP2E1 es mucho ms pronunciada en hepatocitos que en células de Kupffer. Sin embargo, el incremento en la lipoperoxidacién en las células de Kupffer puede dar lugar a fendmenos diferentes. Las células de Kupffer se sabe que son importantes moduladores de la activacién de las células Ito y los productos de la peroxidacién lipdica estimulan la produccién de coligeno por estas células (58). Ademas, se ha demostrado que la expresién de un importante mediador de la fibrogénesis hepitica, el TGFB, se inhibe por Ia accién antioxidante del c-tocoferol (59), sugiriendose un posible papel de las reacciones de peroxidacién en la regulacién de la expresién génica del TGFB. El que el CYP2EI de las eélulas de Kupffer influya en tal regulacién y juegue un importante papel en la iniciacién de Ia fibrogénesis hepiitica supone un avance en cl conocimiento de la patogénesis alcohslica, que necesita ser mis estudiado. ESPECIES REACTIVAS DE OXIGENO GENERADAS. EN EL METABOLISMO OXIDATIVO DEL ETANOL Las especies reactivas de oxigeno se generan como subproductos en el proceso de reduccién del oxigeno molecular que tiene lugar para la formacién de HO. El proceso requiere Ia adicién secuencial de electrones. La figura 4 muestra la forma- in del anién superdxido, el persxido de hidrégeno y el radical hidroxilo (60). La formacién de estas especies de oxigeno, especialmente el anién supersxido, ‘curre en condiciones normales en la cadena respiratoria mitocondrial, a nivel de la NADH deshidrogenasa y la ubiquinona. La administracién aguda de etanol eleva significativamente la generacin de este anién debido a que el exceso de NADH producido en la oxidacién del alcohol, via alcohol deshidrogenasa, promueve la actividad de Ia cadena electronica mitocondrial (28). Otro sistema enzimitico, ya citado anteriormente, que genera anién superéxido en higado por efecto de la ad- ministraci6n aguda de etanol, es la xantina deshidrogenasa/oxidasa citosélica (61). La xantina deshidrogenasa, dependiente de NAD" se inhibe en presencia de los 276e + 2H" e@ + 2H" e+ 2H” NON NON 0, ——» OF —+ H. Pa -OH ——> H,0 | L. | ‘Yo o-oo oo SOD catalasa + peroxidasa a ~- oO Oea OO > complejo citocromo oxidasa Figura 4. Formacién de especies activas de oxigeno por adicién de electrones al oxigeno molecular elevados niveles de NADP' generados por el etanol en su metabolismo microsémi- 0, con Io cual el sistema enzimético se comporta como xantina oxidasa. El m bolismo de las purinas, via xantina oxidasa, produce radicales de oxigeno y a ello ccontribuye el estado de hipoxia relativa inducida por el propio etanol en Ios he tocitos perivenosos, la cual activa las proteasas en las células de esta acino. El acetaldehido influye tambien en la activacién de la xantina oxidasa por su efecto sobre los grupos -SH libres. La superproduccién de anién superéxido por efecto del etanol, se debe a lx mayor afinidad de la xantina oxidasa por sustratos como la hipoxantina y la xantina, generados en la degradacién de los adenin nucled- tidos, que se activa, a su vez, en presencia de etanol (62). El sistema microsémico de oxidacién del etanol dependiente del citocromo P- 450 es un sistema generador de especies reactivas de oxigeno. El funcionamiento de esta monooxigenasa de funcién mixta implica, en primer lugar, la unién del citocromo P-450 con el sustrato lo cual perturba el equilibrio de la molécula y facilita la entrada del primer electrén, con la intervencién de la NADPH citocromo P-450 reductasa. Esto hace que el Fe’ del citocromo P-450 pase a Fe" (Figura 5). La oxigenacién se inicia por unidn del O, al Fe", 1o que da lugar a un intermediario que se encuentra en equilibrio con su forma resonante Fe"? (O; ). Se verifica enton- ces la transferencia del segundo electrén con Ia intervencidn del citocromo b,. El siguiente paso implica la rotura del enlace oxigeno-oxigeno, la incorporacién de dos protones y la generacién de un axfgeno activo. La insercién del oxigeno en el Prsustrato puede ir unida a la sustraccién de hidrégeno del sustrato y la recombinacién de los radicales hidroxilo y el radical R para dar el producto. La disociacién del producto restaura el citocromo P-450 en su estado férrico inicial (15, 62). La iso- forma del citocromo P-450 implicada en el metabolismo microsmico del etanol, la CYP2EI, presente una elevada actividad oxidasa y juega un papel importante en la generacién micros6mica de especies reactivas de oxigeno (1, 63). La contribucién de la via mictos6mica dependiente del CYP2E1 al metabolismo oxidativo del etanol es mayor en casos de alcoholismo crénico, ya que en estas condiciones se induce su actividad en el proceso de adaptacién Los microsomas hepaticos de ratas tratadas con etanol generan, en presencia de NADPH, el radical OH, debido a la reaccién del anidn superéxido y el perdxido de hhidrdgeno, en presencia de metales, por la reaccién de Fenton. La intervencién ROH RH Devd, (ROH)Fe?* (RH)Fe** oN (R+)(Fe-OH)** 430, [o3] (RH)Fe?* f 0 RH(Fe-O)?* aur 2+ H,0 (RH)Fe?*(O2) ant (RH)Fe?"(03) (RH)Fe>*(O5 ) e Figura 5. Mecanismo de accién del citocromo P-480 y generacidn de las especies reactivas de oxigeno (0; H.0,). RH, sustrato; ROH, producto de ta monoosigenacién activa del CYP2E1 en la produccién del OH inducida por el tanol (15) puede evaluarse fécilmente por su capacidad para promover la rotura de las cadenas del DNA (Figura 6), Se ha utilizado esta capacidad de rotura del DNA por los micro= soma hepiiticos inducidos por etanol e incubados en presencia de etanol y NADPH, 278como medio de evaluar la cantidad de radicales de oxigeno (31). Este método es mis sensible atin que el de espectroscopia de resonancia electrénica y requiere cantidades relativamente mis pequefias de proteina microsémica. Microsomas hepaticos inducidos por etanol ‘SMOE (CYP2E1) + etanol, NADPH y 0, | ANION SUPEROXIDO (0,) + PEROXIDO DE HIDROGENO (H,0,) (eaccidn de Fenton en presencia de hier) \ Radical hidroxilo (OH) | Rotura del DNA Figura 6. Accién de las especies actvas de axigeno producidas en el metabolismo microsémico del eranol sobre ta molécuta del DNA 4. OXIDO NITRICO E INTOXICACION ETILICA El 6xido nitrico es otra especie quimica reactiva y citotéxica, ubicua y multire- gulada, que posee una vida extremadamente corta, Este radical deriva de la oxida- cién del tomo de nitrégeno terminal del grupo guanidino de la L-arginina por acci6n de la Gxido nitrico sintasa (NOS) (64), etanol ——» ——» ——» al @ ‘xido nitico simtasa (NOS) to monometil arginina citrulina + NO* L-arginina Figura 7. Formacién del dxido nitrico (NO) por accidn catatitica de ta xido nitro sinasa (N05). La monometit arginina actia como intubidor de ta reaccién por su analogia con el sustrato L-arginina 279Se ha demostrado (65) que el Gxido nitrico se encuentra involucrado en Ia pato- zgénesis de la lesi6n hepatica alcohdlica. Mediante infusién de etanol en higado de ata (25 a 100 mM), por perfusién a través de la vena porta y recogiendo los perfusatos a través de una cénula inserta en 1a vena cava, se ha observado que la presidn portal se eleva inmediatamente por efecto del etanol y después disminuye gradualmente manteniéndose un poco por encima de los valores basales. La infu- sin simultinea de un inhibidor de la sintesis del 6xido nitrico, ta N°-monometil arginina elev6 hasta cuatro veces el incremento de la pre inducido por el ceuanol y esta elevacién pudo ser revertida mediante la coinfusién de un exceso de L-arginina, Sobre las bases de los efectos inhibidores del Sxido nitrico sobre la sintesis proteica y la respiracién mitocondrial en el hepatocito, una elevacién en la produc cién de NO se asume que ejerce efectos citotdxicos sobre el higado. Sin embargo, en hepatitis alcohélica este incremento del Gxido nitrico debe considerarse como un ‘mecanismo hepatico adaptativo, para paliar los efectos vasoconstrictores del etanol (66). En la regulacién del tono hepitico vascular actiian dos sustancias vasoactivas, la endotelina I y el 6xido nitrico. La accién vasoconstrictora de Ia endotelina | activada por el etanol se contrarresta, al Ilegar a un maximo, por efecto del éxido ico que comienza a actuar como un vasodilatador disminuyendo gradualmente 1a presion portal (67-69). No es arriesgado especular que el etanol activa indirec- tamente la produccién de 6xido nitrico mediante la induccidn de la expresién de la NOS hepatica en su forma inducible (Figura 7). Se ha descrito (66) que los monocitos de pacientes con hepatitis alcohética exhibjan una produccién basal de NO significativamente elevada. Aunque se ha propuesto repetidas veces que una elevada produccién de NO ejerce efectos cito- t6xicos sobre el higado, el caso descrito por Hunt debe ser considerado como un mecanismo adaptativo del higado que genera mayores cantidades de NO para con- trarrestar el efecto vasoconstrictor del etanol. ETANOL Y SISTEMAS DE DEFENSA ANTIOXIDANTE La situacién de estrés oxidativo en casos de enfermedad hepitica alcohélica puede tener su origen en defectos en los mecanismos celulares de defensa antioxi- dante, los cuales implican sistemas enziméticos y no enziméticos. Para evitar las lesiones inducidas por las especies aetivas de oxigeno, el higado posee una serie de enzimas, estratégicamente compartimentalizados, que actiian concertadamente con- virtiendo el anién superéxido en perdxido de hidrégeno, por accién de la superdxi- do dismutasa, y el perdxido de hidrogeno en agua, por accién de Ia catalasa. Por otro lado, la giutation peroxidasa, utiliza el poder reductor del glutation reducido (GSH) para eliminar los peroxidos. En esta reaccién el GSH se oxida a GSSG. La i6n concertada de estos enzimas impide la formacién del radical hidroxilo (70, 72). La glutation peroxidasa, a su vez, se acopla a la glutation reductasa para 280regenerar el GSH y para ello la glutation reductasa requiere Ia presencia de un equivalente reductor en forma de NADPH. Este equivalente lo proporcionan los sistemas citosdticos del hepatocito que generan NADPH a expensas del NADP", como la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y el enzima milo. La glutation-S-trans- ferasa es otro sistema enzimético involucrado en la eliminacién de radicales libres catalizando la conjugacidn de dichos radicales libres con el residuo SH de la cis- tefna del glutation, El esquema de la Figura 8 muestra el acoplamiento de estas reacciones con el metabolismo del etanol por el SMOE dependiente del citocromo P 450 261. GS-conjugados 0; S H,0; GSH NADP’ cep ‘SMOE etanol (gex] ePoH) cyp2et H,0; a H.0) Ss NADPH 6PG coe bilis Figura 8. Reacciones enzimaticas acopladas al metabolismo det etanol por ef SMOE, para celiminar las especies activas de oxigeno. SOD superdxido dismutasa; CAT catalasa; GPX glu tation peroxidasa; GRED glutation reductasa: GOPDH glucosa-6-fosfaio deshidrogenasa; GST glutation S-transferasa tra linea de antioxidantes. no enziméticos est representada por aquellos que actian interfiriendo en la cascada peroxidativa inducida por los radicales libres. Entre éstos se encuentra la vitamina E que es capar de reaccionar con los radicales lipoperéxidos de tos dcidos grasos poliinsaturados de la membrana. Durante esta reaccidn el «-tocoferol se convierte en su radical. La regeneracién del a-tocoferol se consigue por reduccién de dicho radical mediante el ascorbato (73). Tambien el glutation representa un sistema auxiliar para la regeneracién del ci-tocoferol. Con- siderando la diversidad de mecanismos de defensa antioxidantes, el estrés oxidativo sélo ocurrird cuando estos sistemas protectores sean superados por una generacién excesiva de especies reactivas. Esto se ha demostrado recientemente mediante in- fusi6n intragdstrica continuada de etanol a ratas (74). En estas condiciones la dis- minucién de la defensa antioxidante juega un papel importante en la severidad de la lesién hepatica alcohdlica, la cual se relacioné de manera significativa con el grado de peroxidacién lipidica, de oxidatién tidlica y con la formacién de grupos carbonilos en proteinas especificas 281Una serie de agentes protectores se utilizan en clinica en casos de patologia hepatica alcohélica ya que pueden actuar previniendo la situacién de estrés oxida tivo inducida por etanol a la vez que disminuyendo los efectos de su hepatotoxici- dad. Por ejemplo la administracién de S-adenosil metionina al elevar el nivel de GSH hepatico, atentia la lesién hepatocelular alcohética y moviliza los Iipidos acu- mulados (75-77). De igual manera se ha observado que suplementos a la dicta de vitamina E pueden ser beneficiosas ya que previenen la peroxidacidn lipidica indu- ccida por etanol (73). Kato e af. (38) han demostrado que sustancias como el alo- purinol inhiben Ia peroxidacisn lipidica inducida por etanol probablemente a través de la inhibicién de la xantina oxidasa, 6. BIBLIOGRAFIA 1. Albano E, Tomasi A, Parola M, Comoglio A, Ingelman-Sundberg My Dianzani MU (1993), Mechanisms responsible for free radical formation during ethanol metabolism and their role in causing oxidative injury by alcohol. en Free radicals and antioxidants in nutrition (eds Corongui F, Banni $, Dessi MA y Rice-Evans C). pp 77-96. Richelieu Press Londres. 2. Lieber CS (1994), Alcohol and the liver: 1994 uptodate, Gastroenterology 106. 1085-1105, 3. Cascales M (1987), Metabolismo del etanol y aspectos energéticos, en’ Aspectos bisicos el aleoholismo. 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