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Quim. Nova, Vol. 30, No.

5, 1323-1338, 2007

ESPCIES REATIVAS DE OXIGNIO E DE NITROGNIO, ANTIOXIDANTES E MARCADORES DE DANO

Divulgao
OXIDATIVO EM SANGUE HUMANO: PRINCIPAIS MTODOS ANALTICOS PARA SUA DETERMINAO

Sandra Mary Lima Vasconcelos


Faculdade de Nutrio, Universidade Federal de Alagoas, Tabuleiro do Martins, 57072-970 Macei - AL, Brasil
Marlia Oliveira Fonseca Goulart*
Instituto de Qumica e Biotecnologia, Universidade Federal de Alagoas, Tabuleiro do Martins, 57072-970 Macei - AL, Brasil
Jos Benedito de Frana Moura
Hospital Universitrio, Universidade Federal de Alagoas, Tabuleiro do Martins, 57072-900 Macei - AL, Brasil
Vanusa Manfredini e Mara da Silveira Benfato
Departamento de Biofsica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Bento Gonalves, 9500, 91501-970
Porto Alegre - RS, Brasil
Lauro Tatsuo Kubota
Departamento de Qumica Analtica, Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13084-971
Campinas - SP, Brasil

Recebido em 1/2/06; aceito em 9/1/07; publicado na web em 2/7/07

REACTIVE OXYGEN AND NITROGEN SPECIES, ANTIOXIDANTS AND MARKERS OF OXIDATIVE DAMAGE IN HUMAN
BLOOD: MAIN ANALYTICAL METHODS FOR THEIR DETERMINATION. We review here the chemistry of reactive oxygen
and nitrogen species, their biological sources and targets; particularly, biomolecules implicated in the redox balance of the human
blood, and appraise the analytical methods available for their detection and quantification. Those biomolecules are represented by
the enzymatic antioxidant defense machinery, whereas coadjutant reducing protection is provided by several low molecular weight
molecules. Biomolecules can be injured by RONS yielding a large repertoire of oxidized products, some of which can be taken as
biomarkers of oxidative damage. Their reliable determination is of utmost interest for their potentiality in diagnosis, prevention
and treatment of maladies.

Keywords: biomarkers of oxidative stress; oxidative and nitrosative stress; antioxidants.

INTRODUO de reao com molculas-alvo e da compartimentalizao celular


destes processos, em que fatores de solubilidade e difusibilidade
O balano redox em lquidos biolgicos, organelas, clulas ou so determinantes2.
tecidos determinado pela presena de pares redox responsveis
pelo fluxo de eltrons. Esses sofrem freqentes interconverses ESTRESSE OXIDATIVO
entre o estado reduzido e o oxidado. Alguns desses pares redox so
interligados (redox cycling), outros constituem sistemas redox A produo de espcies reativas de oxignio (ERO), de nitrog-
independentes. O balano redox, na clula, relaciona-se soma nio (ERN), entre outras espcies reativas, parte integrante do me-
dos produtos do potencial de reduo e da capacidade redutora de tabolismo humano e observada em diversas condies fisiolgi-
uma srie de pares redox, acoplados, presentes. A capacidade re- cas. ERO e ERN tm importante funo biolgica, como na fago-
dutora pode ser estimada pela determinao da concentrao de citose, fenmeno em que essas espcies so produzidas para elimi-
espcies reduzidas em um par redox e, o potencial de reduo, nar o agente agressor. Por outro lado, quando sua produo exacer-
pelo emprego da Equao de Nernst1. Em termos matemticos, isto bada, o organismo dispe de um eficiente sistema antioxidante que
pode ser representado por: consegue controlar e restabelecer o equilbrio. O estresse oxidativo
resulta do desequilbrio entre o sistema pr e antioxidante1,3, com
predomnio dos oxidantes, com dano conseqente (Figura 1). A c-
lula, unidade da vida, uma verdadeira usina de pr e antioxidantes
(Figura 2).
onde Ei o potencial de reduo da semi-clula para um dado par A Tabela 1 traz um resumo da natureza das principais espcies,
redox e [espcie reduzida]i a concentrao das espcies reduzi- de sua gerao e destino.
das em um par redox.
Mudanas no balano redox de sistemas biolgicos podem cau- AO DE ESPCIES REATIVAS SOBRE
sar o estresse oxidativo1. A intensidade e patogenicidade destes MACROMOLCULAS
desequilbrios vo depender, naturalmente, das concentraes lo-
cais de espcies pr e antioxidantes, das constantes de velocidade Em sistemas biolgicos, a membrana celular constitui um dos
focos de atuao de ERO, de ERN e de outras espcies reativas
(Figura 1, Tabela 1) e sua funo vital para a clula (Figura 2).
*e-mail: mofg@qui.ufal.br Alm da membrana que envolve a clula, as membranas das
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Figura 1. Fontes e respostas celulares s Espcies Reativas (ER) de Oxignio


(ERO), de Nitrognio (ERN), derivados de Enxofre (ERS), de Cloro (ERCl), de Figura 2. A clula como fonte de espcies reativas (ER). (A) Fontes celulares
carbono (ERC) e metais de transio [M n+)]. Oxidantes so gerados do de ERO, ERN e outras, por ao de vrias enzimas. A capacidade de uma via
metabolismo normal como na mitocndria, em peroxissomas e em uma especfica produzir ER varia com o tipo de clula e com o dano em curso; p.
variedade de enzimas citoslicas. Existem diversas fontes exgenas de produo ex., na fagocitose, as NADPH oxidases da membrana de neutrfilos e
de ER. Os sistemas de defesa antioxidante enzimtico e no enzimtico, quando macrfagos so particularmente ativadas e reduzem O2 a O2, a partir de um
eficientes, mantm a homeostase fisiolgica e quando esto ineficientes, burst respiratrio necessrio para eliminar o agente agressor. (B)
permitem a instalao do estresse oxidativo, representado pelo dano celular Distribuio dos antioxidantes, enzimas de desintoxicao e protenas de
em macromolculas como o DNA, protenas e lipdios, que se expressam ligao a metais de transio que compreendem o sistema de defesa dentro
clinicamente como envelhecimento ou doena. Adaptado da ref. 3 das membranas e organelas celulares

Tabela 1. Natureza, gerao e destino de espcies radicalares (ou seus intermedirios) biologicamente importantes

Espcies derivadas do oxignio

nion-radical Gerado continuamente por diversos processos celulares (cadeia de transporte de eltrons na mitocndria, no
superxido O2 microssomo, atravs enzimas como xantina oxidase e NADPH oxidase), ou pela reduo monoeletrnica de
O2. Rapidamente desaparece em soluo aquosa por reao de dismutao:
O2 + O2 + 2H+ H2O2 + O2 Em soluo aquosa um forte agente redutor. Sua habilidade em reduzir Fe3+
a Fe2+ pode acelerar a reao de Fenton:
O2 + Fe3+ Fe2+ + O2 Em soluo aquosa um oxidante fraco, porm pode formar ERN:

O2 + NO ONOO permevel a membranas. Em fagcitos, como neutrfilos e macrfagos, um dos
microbicidas mais importantes.

Perxido de Intermedirio formado pela reao de dismutao de O2 catalisada pela enzima SOD, pela reduo de 2 e-
hidrognio H2O2 na molcula de O2 e pela ao de diversas enzimas oxidases in vivo, localizadas nos peroxissomas. muito
difusvel dentro e entre as clulas in vivo. um fraco agente oxidante e um fraco agente redutor, reage
lentamente com tiis, com sais de ferro e cobre reduzidos, com protenas heme e peroxidases para iniciar
reaes radicalares e peroxidaes lipdicas. Em presena de metal de transio gera OH, atravs da reao
de Fenton
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + -OH + OH
Vol. 30, No. 5 Espcies reativas de oxignio e de nitrognio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo 1325

Tabela 1. continuao

Radical hidroxila OH o mais reativo e mais lesivo radical conhecido e para o qual, uma vez formado, o organismo humano no
dispe de mecanismo de defesa, reage com uma srie de endobiticos, causa modificao no DNA (com
modificao das bases e quebras das fitas), danos nas protenas e inativao enzimtica, peroxidao lipdica.
mbito limitado de ao (poucos dimetros moleculares).

Radicais Formados durante a decomposio de perxidos orgnicos e reaes de carbono radicalar com oxignio,
peroxila (RO2) como na peroxidao lipdica.
alcoxila(RO)

Oxignio singlete 1O2* Estado eletronicamente excitado do oxignio, produzido por reaes fotoqumicas ou por outras radiaes;
reage com um grande nmero de molculas biolgicas, incluindo lipdeos da membrana, iniciando processos
de peroxidao. 1O2* pode ser gerado, entre outras reaes, por transferncia de energia a partir de um
sensibilizador S, no estado excitado tripleto (3S*) (porfirinas, clorofila e riboflavina) para o oxignio. O
sensibilizador S absorve energia e deixa o estado fundamental singlete (S), passando para o estado excitado
singlete (1S*), a partir do qual convertido, por cruzamento intersistema, para o estado excitado triplete.
(3S*): S 1
S* 3
S* ; 3S* + 3O2* S + 1O2*

Oznio O3 Produzido no ar atmosfrico poludo e por fonte de luz intensa de algumas fotocopiadoras e outros
equipamentos. extremamente danoso ao pulmo, oxidando rapidamente protenas, DNA e lipdeos.

Espcies derivadas do nitrognio e cloro

cido hipocloroso HOCl Espcie no radicalar, membrana-permevel, oxida um grande nmero de compostos biolgicos, como tiis
e tioteres, aminas, fenis e ligaes insaturadas, mais seletivo que o radical hidroxila, oxida ferro e protenas.
Produzido por fagcitos ativados, reage com O2 para formar OH
HOCl + O2
OH + OH + O2 produzido no miocrdio, como resultado de invaso de clulas
inflamatrias.

xido ntrico ou monxido Sintetizado nos organismos vivos pela ao da enzima xido ntrico sintase (NOS), que converte o aminocido
de nitrognio NO L-arginina a NO + L-citrulina (outro aminocido). um radical abundante que age em uma variedade de
processos biolgicos, incluindo relaxao muscular, neurotransmisso e regulao imune. Originalmente
identificado como fator relaxante derivado do endotlio (endothelium-derived relaxing factor: EDRF)
um potente vasodilatador, envolvido na regulao da presso arterial. Difunde-se rapidamente entre e dentro
das clulas. Quando exposto ao ar, reage com oxignio para formar NO2.
2NO + O2 2 NO2. Reage rapidamente com O2 e produz o intermedirio ONOO
O2 + NO ONOO

Dixido de nitrognio NO2 Formado a partir da exposio de NO ao ar ou da protonao de peroxinitrito 2NO + O2 2 NO2
Potente iniciador da peroxidao lipdica em fluidos biolgicos.

Cloreto de nitrila NO2Cl Formado a partir de misturas de NO2 e HOCl. Oxidante, agente de clorao e de nitrao, pode inibir
fosforilao dependente de quinase de resduos de tirosina, provoca a clorao de resduos de tirosina (3-
clorotirosina considerada biomarcador).

Peroxinitrito ONOO Intermedirio formado pela reao O2 + NO ONOO


Instvel, tempo de vida curto, oxidante potente, propriedades semelhantes ao radical hidroxila, causa danos
a muitas molculas biolgicas, inclusive a grupos S-H das protenas, provoca hidroxilaao e nitrao de
compostos aromticos. Forma OH independente da presena de metal de transio
ONOO + H+
OH + NO2 Aps protonao, rearranja-se para nitrato (NO3-) e interage com bicarbonato
(CO2/HCO3-), com alterao de sua reatividade.
ONOOH [NO2 OH] NO3
Em presena de CO2, o peroxinitrito forma o peroxicarboxilato nitroso, que rapidamente se decompe,
segundo as etapas 1 e 2. O CO2 est presente em elevada concentrao no compartimento intra e extracelular,
o que favorece a formao do CO3, em presena de ONOO-.
ONOO + CO2 ONOOCO2 NO2OCO2-

(1) NO2OCO2 NO3 + CO2 (65%)
(2) NO2OCO2 NO2 + CO3 (35%)
O nion radical carbonato formado mediador de diversas reaes de oxidao e nitrao

Cloraminas Oxidantes mais suaves e de vida mais longa que HOCl, reagem com tiis, tioteres e centros metlicos de ferro.
Toxicidade varivel, dependendo da polaridade e da permeabilidade da membrana. Cloraminas de -aminocidos
sofrem degradao para aldedos potencialmente txicos
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Tabela 1. continuao

Espcies derivadas do enxofre

Radical tila Denominao genrica para um grupo de radicais com o eltron desemparelhado residindo no enxofre.
RS Formado quando um grupo tiol (RSH) reage com uma espcie radicalar (C, OH, RO, RO2, O2 , NO2 ou
com metais de transio).

Miscelneos e metais

Fe, Cu, Mn, etc Catalisam reaes de radicais livres.


Fe2+ em presena de O2 gera O2 que, por sua vez, pode reduzir Fe3+ a Fe2+
Fe2+ + O2 Fe3+ + O2
Fe2+ em presena de H2O2 gera OH (reao de Fenton)
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH
Fe3+ em presena de H2O2 gera O2

organelas intracelulares, tais como mitocndria, retculo endoplas- de estudos de marcadores de dano oxidativo e de substncias
mtico, ncleo etc., apresentam uma estrutura bilipdica e uma antioxidantes em sistemas biolgicos.
variedade de protenas e acares4,5 (Figura 2). O dano celular re-
sulta basicamente de ataque de ERO e ERN sobre as macromo- BIOMARCADORES
lculas, tais como acares (CHOH)n, DNA, protenas e lipdios,
conforme mostrado na Tabela 2. Segundo Zwart e colaboradores8 e LaBaer11, os biomarcadores
H fortes evidncias de que o estresse oxidativo tem importn- tm caractersticas passveis de avaliao e mensurao, como
cia capital nos processos de envelhecimento, transformao e mor- indicadoras de processos biolgicos normais, processos patognicos
te celular, com conseqncias diretas em muitos processos patol- ou de resposta farmacolgica a uma interveno teraputica. Como
gicos, entre eles, a induo do cncer e a propagao de AIDS em tal, refletiriam mudanas em sistemas biolgicos relacionadas
pacientes soropositivos (HIV+), bem como na fisiopatologia de exposio ou aos efeitos de xenobiticos, ou outros tipos de fato-
muitas doenas crnicas, entre elas, doenas auto-imunes, cardio- res (aqui incluiramos aqueles relacionados a doenas). Eles po-
patias, cncer, doenas do pulmo, intoxicao por xenobiticos e dem ser classificados, segundo os mesmos autores 8,11 , como
muitas outras (Tabela 3)6-10. Por outro lado, tambm fato reco- biomarcadores: de exposio, de efeito e de susceptibilidade. O
nhecido que ERO e ERN desempenham papis fisiolgicos impor- biomarcador ideal deve reunir as seguintes caractersticas: mostrar
tantes como o controle da presso sangnea, na sinalizao celu- alta especificidade para o efeito de interesse; refletir o efeito desde
lar, na apoptose, na fagocitose de agentes patognicos, na fertiliza- o incio; ser passvel de determinao e anlise fceis e de baixo
o de ovos e no amadurecimento de frutos. Esse tpico ser reava- custo; ser analisado por tcnica no invasiva, de alta sensibilidade,
liado no final deste artigo. no fluido biolgico escolhido. Deve existir uma relao bem estabe-
O reconhecimento dessa relao estimulou o desenvolvimento lecida entre a concentrao do biomarcador e a exposio ao agen-

Tabela 2. Atuao das principais espcies radicalares (ou seus intermedirios) sobre endobiticos
Endobitico Sumrio das reaes mais importantes

Acares OH reage com (CHOH)n por abstrao randomizada de um tomo de H de um dos tomos de C, produzindo um
(CHOH)n radical centrado no carbono. Isto leva quebra da cadeia de importantes molculas, tais como o cido hialurnico.

cidos nucleicos ERO, principalmente OH, ataca o acar desoxirribose (principalmente em 4 e/ou 5) e as bases purnicas
(adenina e guanina) e pirimidnicas (timina, citosina e uracila), com ataque preferencial guanina, gerando 8-
hidroxi- ou 8-oxoguanina5, mutagnicas. Como resultado, ocorre a quebra da cadeia do DNA, a ligao cruzada
entre as fitas e modificaes nas suas bases levando a mutaes e apoptose.

Protenas As protenas tm muitos stios reativos5. Durante o estresse oxidativo, o primeiro evento a formao de um
radical centrado no carbono, por extrao de H do carbono , em uma ligao peptdica, da, ocorre fragmentao
das cadeias e oxidao de quase todos os tipos de aminocidos, com produo freqente de compostos carbonilados,
particularmente a partir de prolina, arginina e lisina (Figura 8). Essa modificao (contedo em protenas
carboniladas) facilmente mensurvel. Adicionalmente, protenas podem conter stios de ligao com metais
que so especialmente susceptveis a reaes reversveis de oxidao e reduo, as quais podem produzir uma
seqncia de sinais que podem ser reconhecidos por proteases celulares especficas que degradam tais protenas.
Muitas protenas intracelulares tm grupos sulfidrila reativos em resduos de cistena, que podem ser oxidados a
dissulfeto ou cidos cisticos, que podem ser novamente reduzidos metabolicamente. Similarmente, muitas
protenas tm um aminocido metionina que pode sofrer modificao reversvel a sulfxido ou sulfona. Os
aminocidos aromticos formam quinurenina, grupos cateclicos e polmeros. H formao de produtos de
adio com perxidos lipdicos e com hidroxialdedos derivados de lipdeos insaturados.
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Tabela 2. continuao
Endobitico Sumrio das reaes mais importantes
Lipdeos A peroxidao lipdica causada pelo ataque de uma ER (geralmente OH), que abstrai um tomo de hidrognio
(H) de um grupo metileno allico, normalmente, de um cido graxo poli-insaturado, deixando um eltron
desemparelhado no carbono, caracterizando a etapa de iniciao. Este radical usualmente estabilizado por
rearranjo molecular, formando um dieno conjugado. Sob condies aerbicas, o carbono radicalar do dieno
conjugado reage com O2 (que uma molcula hidrofbica e, portanto, se concentra no interior das membranas)
e forma o radical peroxila. Este radical peroxila capaz de abstrair H de molculas de lipdeos adjacentes, cujo
carbono radicalar sofre novo rearranjo, reage com O2 e forma outro radical peroxila e assim sucessivamente,
caracterizando a reao em cadeia da etapa de propagao. O radical peroxila combina-se com o H abstrado,
gerando o lipdeo hidroperxido (LOOH) que ao sofrer quebra, forma aldedos como malonaldedo e 4-
hidroxinonenaldedo, entre outros. Na decomposio dos hidroperxidos lipdicos so gerados radicais peroxila
e alcoxila atravs da reao de Fenton. A terceira e ltima etapa da peroxidao lipdica, a etapa de terminao
instala-se com a neutralizao dos radicais formados por ao de antioxidantes lipossolveis (-tocoferol, -
caroteno, NO) ou pela reao de dois radicais lipdicos formando produtos no radicalares. Nos sistemas biolgicos,
a peroxidao lipdica pode ocorrer por via enzimtica (ciclooxigenases e peroxidases) e por via no enzimtica
(auto-oxidao) cujo mecanismo supracitado envolve a participao de espcies reativas de oxignio, metais e
outros radicais livres. Pode ocorrer peroxidao de estruturas supramoleculares, como em fosfolipdeos e em
agregados de lipoprotenas5. Todas estas modificaes oxidativas causam mudanas nas propriedades fsicas e
qumicas das membranas, alterando sua fluidez e permeabilidade, com expanso do lquido intracelular e risco
de ruptura das membranas da clula e das organelas, com conseqente morte celular. Reaes envolvendo os
vrios intermedirios entre si levam a novos produtos, por ex., malondialdedo (MDA) reage com o grupo amina
de purinas e HNE reage com guanosina, entre outras reaes.

Tabela 3. Doenas selecionadas, relacionadas ao estresse oxidativo


Doena Natureza do envolvimento com ER
Aterosclerose, Sndrome de Bloom, Sndrome de Down, Kwa- Falha ou consumo excessivo de defesas antioxidantes.
shiorkor, Doena de Keshan
Doena de Parkinson, estados txicos causados por lcool, fumo, Uso de drogas e toxinas. Na doena de Parkinson as toxinas
CCl4 etc. produzidas estariam envolvidas com a produo de radicais livres.
Doena de Alzheimer, Asma, Artrite reumatide, asbestose, Produo de O2, H2O2 e HClO por clulas fagocticas ativadas.
Sndrome de Insuficincia Respiratria do Adulto
Esclerose mltipla Perturbao estrutural da clula. As hemcias tornam-se mais
susceptveis ao dos radicais livres.
Doena granulomatosa crnica Defeito gentico no sistema antioxidante.
Diabetes mellitus, anoxia, injria da reperfuso, pr-eclmpsia Oxidao anormal de substratos ou mudanas na concentrao de
oxignio.
Hipertenso arterial sistmica Produo de O2 por NADPH/NADP oxidase.
Hemocromatose idioptica, talassemia, anemia falciforme, doena Transferncia de eltrons ao oxignio por metais de transio.
de Wilson
Doena granulomatosa crnica, Deficincia de enzimas antioxi- Defeito gentico no sistema antioxidante, especificamente o sistema
dantes (Acatalassemia, por ex.) NADPH oxidase.

te, ao dano induzido e susceptibilidade pesquisada. A Tabela 4 quisa de marcadores de balano redox em sangue, plasma e urina
exemplifica alguns biomarcadores para doenas selecionadas12. de ratos tratados com esse xenobitico, segundo protocolos bem
til ressaltar que a rea de biomarcadores se encontra em estabelecidos13.
desenvolvimento exponencial e no h qualquer pretenso, no pre- Neste trabalho, dar-se- nfase caracterizao de alguns
sente artigo, de esgot-la em profundidade. biomarcadores quantificveis em sangue humano e s tcnicas mais
empregadas para sua anlise. Vale salientar que outros fluidos bio-
ANLISE DE BALANO REDOX DE UM ORGANISMO lgicos, como urina, saliva, suor e at mesmo o ar expirado, que
EM AMOSTRAS DE SANGUE trariam informaes de produtos volteis de peroxidao lipdica8,
so tambm utilizados para anlise de biomarcadores de balano
No caso de estresse oxidativo, os marcadores de balano redox, redox; contudo, no fazem parte do escopo dessa reviso.
no invasivos, refletiriam o dano causado pelas ERO e ERN sobre O sangue total constitudo de elementos figurados que so
o sistema biolgico e a eficincia da defesa antioxidante de contra- eritrcitos e leuccitos, soro e plaquetas ou elementos da coagula-
partida. Tratando-se desses biomarcadores, h um esforo mundial o. O plasma compe-se da parte lquida do sangue, separada das
para sua validao multilaboratorial. Trabalhos de colaborao in- clulas sanguneas e o soro constitui-se do plasma sem os fatores
ternacional, em andamento, liderados por Kadiiska13,14, utilizaram de coagulao, tais como fibrina15.
um modelo murino, aps injeo intraperitoneal de CCl4, com pes- O sangue humano uma excelente fonte de marcadores in vivo
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Tabela 4. Biomarcadores de dano oxidativo associado com algumas tanos, lipoperxidos e outros derivados da peroxidao lipdica das
doenas humanas membranas celulares.
Doenas Biomarcadores de dano
Cncer MDA, razo GSH/GSSG,
NO2-Tyr, 8-OH-dG
Doena cardiovascular HNE, razo GSH/GSSG, acrolena,
NO2-Tyr, F2-isoprostano
Artrite reumatide razo GSH/GSSG, F2-isoprostano
Doena de Alzheimer MDA, HNE, razo GSH/GSSG,
acrolena, NO2-Tyr, F2-isoprostano,
AGE
Doena de Parkinson HNE, razo GSH/GSSG, protenas
carboniladas, nvel de ferro
Figura 3. Reao utilizada no ensaio TEAC ou Teste do ABTS. A capacidade
Isquemia reperfuso razo GSH/GSSG, F2-isoprostano
antioxidante determinada a partir da leitura da inibio do ction radical
Aterosclerose MDA, HNE, acrolena, NO2-Tyr,
2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato, sal de diamnio) - ABTS+,
F2-isoprostano, NO2-Tyr
produzido nesta reao
Diabetes mellitus MDA, razo GSH/GSSG, protenas
S-glutationadas, NO2-Tyr, As substncias envolvidas no binmio antioxidante pr-oxidante
F2-isoprostano, AGE. caracterizam o ambiente redox biolgico (Tabela 5) e podem ser
Fonte: Adaptada da ref. 90 quantificadas associando as tcnicas bioqumicas tradicionais de
amostragem e determinao espectrofotomtrica, tcnicas cromato-
de estresse oxidativo, uma vez que nele so transportados e redistri- grficas, eletroanalticas, de ressonncia magntica e espectrometria
budos antioxidantes e endobiticos modificados por ao de ERO de massas18-20. Tal combinao possibilita relacionar o balano redox
e ERN. considerado uma amostra biolgica nica, potencialmente avaliado em indivduos com diferentes aspectos ambientais (poluio
mais informativa, j que, obtida de um indivduo, pode descrever urbana, por ex.), demogrficos, tnicos, culturais, clnicos e nutricionais,
seu estado de sade no momento da coleta16. Pode ser obtido em surgindo assim uma importante ferramenta no estudo de fenmenos
larga escala, com uma quantidade relativamente grande de prote- biolgicos vinculados ao estresse oxidativo.
nas (em mg), disponvel para estudo de numerosas condies e
estados de sade17. Tabela 5. Exemplos de biomarcadores de doenas
A anlise do balano redox pode ser feita em soro, e/ou plasma Doenas Exemplos de biomarcadores
e/ou eritrcitos.
O sistema antioxidante sanguneo classificado em enzimtico Diabetes Glicemia, frutosaminas, hemoglobina A1c,
e no enzimtico. O enzimtico representado, principalmente, mellitus avaliao da retina, neuropatia perifrica e
pelas enzimas antioxidantes: a superxido dismutase (SOD) que nefropatia
catalisa a dismutao do nion radical superxido (O2) a perxido Hipertenso Nveis pressricos, angiotensina I e II,
de hidrognio (H2O2) e O2 (Equao 1), a catalase (CAT) que atua arterial aldosterona, renina plasmtica, atividade da
na decomposio de H2O2 a O2 e H2O (Equao 2) e a glutationa sistmica ECA (Enzima Conversora da Angiotensina)
peroxidase (GPx), que atua sobre perxidos em geral, com utiliza- Artrite reumatide Citocinas, leucotrienos
o de glutationa como co-fator (Equao 3). Asma, DPOC Testes de funo pulmonar,
O sistema antioxidante no enzimtico formado por muitas (doena pulmonar citocinas, leucotrienos
substncias, com destaque para a glutationa (GSH), principal com- obstrutiva crnica)
posto antioxidante intracelular, tocoferis, ascorbato, cido rico e Injria cardiovascular cTroponina I e T
-caroteno, alm de protenas de transporte de metais de transio, Doena heptica ALT (alanina amino-transferase) e
como a transferrina (transporte do ferro) e ceruloplasmina (trans- GT (-glutamil-transpeptidase)
porte do cobre e oxidao do ferro para ser captado pela transferrina)18. Fonte: Adaptada da ref.12
Os metais de transio so potenciais formadores de espcies reativas
atravs da reao com outros compostos, uma vez que sofrem rea- No que se refere aos antioxidantes, alguns autores defendem o
es redox. Decorre, da, a necessidade de serem transportados as- estudo da capacidade antioxidante total (CAOT), ao invs de anlise
sociados a protenas, impedindo que essas reaes ocorram. de antioxidantes isolados, principalmente devido interao que
existe entre eles no plasma ou soro20. Na anlise da CAOT, leva-se
2 O2+ 2H+ H2O2 + O2 (1) em conta a ao acumulativa de todos os antioxidantes presentes;
2 H2O2 2 H2O + O2 (2) obtm-se um parmetro integrado, capaz de revelar nuanas acerca
2 GSH + H2O2 2 H2O + GSSG (3) do delicado equilbrio redox existente in vivo. A medida de CAOT
auxilia na avaliao dos fatores nutricionais, fisiolgicos e ambientais
O sistema antioxidante enzimtico e a glutationa esto presen- do balano redox em seres humanos20. Por outro lado, a anlise de
tes, predominantemente, no meio intracelular (Figura 2), da a uti- antioxidantes ou marcadores de dano isolados, adequadamente es-
lizao do eritrcito para sua anlise. Por outro lado, o sistema colhidos, pode facilitar a compreenso de situaes especficas como,
antioxidante no enzimtico localiza-se, principalmente, no meio por ex., a anlise de peroxinitrito (ONOO-) em doena vascular ou
extracelular, sendo por isso analisado em plasma e soro. No san- em inflamao associada leishmaniose. Outro aspecto a dualidade
gue circulam importantes antioxidantes, a exemplo das vitaminas das informaes obtidas: um aumento da CAOT no , necessaria-
C, E, -caroteno etc., bem como biomarcadores do dano causado mente, uma condio desejvel (p. ex., verificado em pacientes com
por ERO e ERN e outros, como malondialdedo (MDA), isopros- insuficincia renal crnica), nem indesejvel, uma vez que pode ocor-
Vol. 30, No. 5 Espcies reativas de oxignio e de nitrognio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo 1329

rer quando h uma diminuio na produo de ERO e ERN (p. ex., trolox captura duas molculas de RO2. O RO2 gerado para reagir
em ratos submetidos restrio calrica)21. O mesmo raciocnio apli- com os antioxidantes do fluido biolgico pode tambm ser detec-
ca-se a um marcador isolado. tado diretamente atravs de mtodos de quimioluminescncia. No
plasma humano, o valor normal de TRAP de 1 mM de RO2 cap-
CAPACIDADE ANTIOXIDANTE TOTAL (CAOT) turado por litro; as maiores contribuies so do urato (35-65%),
das protenas plasmticas (10-50%), do ascorbato (acima de 24%)
Os diversos testes propostos na literatura variam quanto ao tipo de e da vitamina E (5-10%).
radicais gerados, ao indicador de oxidao escolhido e ao mtodo usa-
do para sua deteco e quantificao. So chamados ensaios de capta- RN=NR N2 + 2R (4)
o (trap assays). Em todos esses ensaios, um radical gerado e R + O2 RO2 (5)
reage com molculas-alvo, para produzir cor, fluorescncia, quimiolu-
minescncia, perda ou ganho de sinais de ESR (Electron Spin ORAC (Oxygen-Radical Absorbancy Capacity)
Resonance ou Ressonncia do Spin Eletrnico) ou outra mudana
mensurvel. A presena de antioxidantes altera esses sinais, o que Este mtodo usa a protena Phycoerythrin (PE) (Ficoeritrina),
permite sua anlise quantitativa18. fotossinttica, marcadora de fluorescncia, como alvo dos radi-
Dentre os testes utilizados, citam-se aqueles conhecidos pelas cais. O ORAC mede a diminuio da emisso de fluorescncia de
siglas TRAP, ORAC, FRAP e TEAC18, 20-33 (Tabela 6). TRAP e PE adicionada ao plasma em presena de um composto azo, gera-
ORAC so mtodos cuja determinao analtica envolve reaes dor de radicais (Equao 4). A habilidade antioxidante do plasma
de transferncia de tomos de hidrognio e FRAP e TEAC, trans- calculada a partir da medida da rea sob a curva de decaimento da
ferncia de eltrons27. fluorescncia (Area Under the Fluorescence Decay Curve AUC,
til registrar que o decrscimo da CAOT no significa neces- com emisso a 565 nm) comparada ao padro que, na maioria das
sariamente que o dano oxidativo ocorreu; pode significar simples- vezes, o trolox. A PE pode ser oxidada por AAPH para gerar
mente que o mecanismo de defesa cumpriu sua funo habitual18. radical peroxila (Teste ORACRO2) ou por Cu2+-H2O2 para gerar ra-
dical hidroxila (Teste ORACHO) ou ainda, adicionando-se ons Cu+
TRAP (Total Radical - Trapping Antioxidant Parameter) como redutores (Teste ORACCu+).
O ORAC combina o tempo de inibio e a percentagem (%) de
O TRAP foi o primeiro ensaio desenvolvido para determinar a inibio da ao do radical pelo antioxidante e usa a rea sob a
CAOT do plasma sangneo. O mtodo foi desenvolvido por Wayner curva para a quantificao. O teste expressa os resultados como
et al.25. Consiste na gerao de radicais peroxila (RO2), por decompo- unidades de ORAC ou equivalentes do trolox, que corresponde
sio trmica, a uma velocidade controlada, de azoiniciadores (Equa- quantidade de trolox em mol que tem a mesma atividade
es 4 e 5). O dicloridrato do 2,2-azobis-(2-metilpropanoamidina) antioxidante para o radical peroxila em 1 L de plasma. Porm, se o
(AAPH ou ABAP, C8H18N6.2HCl, M.M 271,20 g/mol)18,28,29 exemplo gerador de radicais for o Cu2+, o trolox no pode ser usado como
de azoiniciador hidrossolvel. Existem outros azocompostos, que se padro, pois o mesmo pode atuar como pr-oxidante na presena
distinguem por serem lipossolveis, como, por exemplo, o AMVN de Cu2+. Neste caso, a ao antioxidante ser expressa em unidade
(2,2-azobis-2,4-pentanonitrila). Estes reagem rapidamente com o antioxidante: uma unidade equivale atividade antioxidante que
oxignio originando radicais peroxila (Equaes 4 e 5). causa o aumento da rea sob a curva de decaimento de fluorescncia
Aps adicionar AAPH ao plasma sangneo, a oxidao de PE em 100%22.
monitorada, a partir, por exemplo, de medidas de oxignio consu- Esse o nico mtodo que permite a medida total dos radicais
mido, durante a reao, em eletrodo de oxignio. O perodo no gerados e usa a tcnica de AUC ao invs da lag fase (fase de
qual a oxidao inibida pelos antioxidantes plasmticos com- retardo), utilizada pelos outros mtodos para quantificao dos ra-
parado ao do trolox (cido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2- dicais. A AUC combina o percentual de inibio ao tempo de inibi-
carboxlico, C14H18O4, M.M 250,3 g/mol), o anlogo hidrossolvel o da ao do radical (lag fase) pelo antioxidante22.
da vitamina E, usado como antioxidante de referncia e quantita- Mais recentemente, Prior e colaboradores31 sistematizaram e vali-
tivamente relacionado CAOT do plasma. daram o uso do ORACFL, prprio para a quantificao da CAOT em
Os valores de TRAP so expressos em mol de radical peroxila plasma ou soro. A separao das fraes antioxidantes lipoflicas e
capturado por molcula de trolox/L de plasma. Cada molcula de hidroflicas do plasma, foi obtida por extrao com hexano, aps adi-

Tabela 6. Grupo de biomarcadores em sangue e principais mtodos de anlise


Grupos de biomarcadores Sub-grupos Principais substncias e mtodos de anlise
Antioxidantes Capacidade antioxidante total TRAP, ORAC, FRAP, TEAC, por espectrofotometria.
Enzimas antioxidantes SOD, GPx e CAT so avaliadas espectrofotometricamente. Sua atividade
antioxidante e tcnica de anlise esto descritas no texto.
Antioxidantes no enzimticos Vitaminas E, C e -caroteno avaliadas por HPLC; glutationa avaliada por
espectrofotometria; ceruloplasmina e transferrina, por turbidimetria e cido
rico pelo mtodo enzimtico.
Marcadores de Protenas oxidadas Deteco de grupos carbonila por espectrofotometria.
dano oxidativo Lipdeos oxidados Deteco de malondialdedo por HPLC com deteco no ultravioleta.
Protenas nitradas 3-Nitrotirosina (3-NO2-Tyr) por HPLC, com deteco eletroqumica.
Oxidao das bases do DNA Deteco de 8-oxo-2-desoxiguanosina (8-oxodG) em linfcitos por HPLC
Quebra de DNA Teste do cometa (comet assay) em leuccitos
1330 Vasconcelos et al. Quim. Nova

o de gua e etanol ao plasma. As duas fraes sofrem partio efici- humanos, com o emprego dos ensaios supracitados.
ente entre o hexano e os solventes aquosos. Esse mtodo pode ser Cao e Prior22 compararam TEAC e FRAP com ORAC na deter-
empregado em outros fluidos biolgicos ou amostras de alimentos31. minao in vivo da CAOT em soro humano e concluram que o
ORAC apresenta maior especificidade. No ORAC, a razo molar
FRAP (Ferric-Reducing Ability of Plasma) de AAPH/antioxidante > 2000 e para a quantificao utiliza uma
combinao do percentual de inibio com o tempo de inibio da
Testa a fora antioxidante do plasma, via avaliao da reduo ao do radical pelo antioxidante. No FRAP, a maior limitao diz
do complexo Fe3+-TPTZ (ferritripiridiltriazina) [2,4,6-tri(2-piridil)- respeito menor sensibilidade e especificidade do mtodo. No
1,3,5-triazina, C18H12N6, M.M. 312,33 g/mol] a ferroso-tripiri- TEAC, a razo molar entre os reagentes H2O2/metamioglobina/
diltriazina (Fe2+-TPTZ) por redutores, no caso, os antioxidantes ABTS/trolox somente 10,2/0,25/25/1, o que pode reduzir ou equi-
plasmticos, em valor de pH baixo. Baseia-se no fato de que a librar o aumento na produo de espcies radicalares. Alm disso,
habilidade de um composto em produzir Fe2+ a partir de Fe3+ define a quantificao da atividade antioxidante feita atravs do
sua fora antioxidante. O complexo Fe2+-TPTZ tem uma cor azul percentual de inibio em um tempo fixo, sem considerar o tempo
intensa e pode ser monitorado, a 593 nm, em espectrofotmetro. A de durao da inibio22,23.
vitamina C e o cido rico, por ex., reduzem Fe3+ a Fe2+. Por outro preciso destacar que esses mtodos se baseiam estritamente
lado, um antioxidante que reduz efetivamente um pr-oxidante, em reaes qumicas in vitro e no tm qualquer similaridade com
no reduz, necessariamente, Fe3+ a Fe2+. sistemas biolgicos. A validade de seus dados limita-se a um con-
As limitaes do mtodo so, portanto: nem todo redutor que texto de interpretao estritamente qumico. Assim, Niki e Yoshida34
hbil para reduzir Fe3+ a Fe2+ antioxidante; nem todo antioxidante discriminam o que denominam potencial antioxidante qumico
tem a habilidade especfica para reduzir Fe3+ a Fe2+, como por ex., daquele biolgico (determinado in vivo ou em modelos biomi-
a glutationa. O resultado final pode ser convertido a mmol de equi- mticos), onde a compartimentalizao e a partio dos protago-
valentes de trolox por litro de plasma. A atividade relativa do trolox nistas redox (agente oxidante e alvo) entre fase aquosa e fase lipdica
em FRAP de 2,0 mmol/L, ou seja, a reao direta de Fe2+ propor- so consideradas35.
ciona uma mudana de absorbncia que a metade de 1 equivalen- O uso de tais testes para determinar a bioatividade de uma
te molar para o trolox31. amostra biolgica deve ser visto com cautela, uma vez que eles
no medem biodisponibilidade, estabilidade in vivo, reteno de
TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) ou Teste antioxidantes pelos tecidos, nem reatividade in situ25.
do ABTS Uma srie de novos mtodos, ainda no padronizados, foi e
continua a ser relatada, o que mostra o vigor da rea de pesquisa.
O TEAC baseia-se na inibio por antioxidantes do ction ra- Em vista da necessidade de mtodos cada vez mais sensveis, de
dical 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato, sal de pesquisa in situ, da mimetizao do ambiente biolgico, h forte
diamnio) (C18H24N6O6S4, M.M. 548,7 g/mol, ABTS+), que apre- interesse nesse desenvolvimento. Como exemplo, podem-se citar
senta absorbncia caracterstica primria em 415 nm e absores alguns mtodos eletroqumicos, no caso, a coulometria em corren-
secundrias em 660, 734 e 820 nm. te constante, para anlise de CAOT em plasma humano32. O mto-
O mtodo original baseia-se na ativao de metamioglobina como do utiliza bromo eletrogerado (eletrlise corrente constante a partir
peroxidase, em presena de ABTS. O complexo perferril da de brometo de tetraetilamnio, em HClO4 0,1 mol/L) e o ponto
hemeprotena produziria o ction radical ABTS + de cor azul final da titulao detectado amperometricamente32.
esverdeada. A adio desse radical a um meio contendo antioxidantes,
permite avaliar, atravs do grau de descolorao, a capacidade CAPACIDADE ANTIOXIDANTE ESPECFICA
antioxidante do mesmo. Alguns autores sugerem o uso de oxidao
qumica de ABTS, com utilizao de reagentes como dixido de Enzimas antioxidantes
mangans ou persulfato de potssio, uma vez que outros antioxidantes
podem contribuir para reduzir o radical ferrimioglobina formado Superxido dismutase (SOD)
durante a reao. O percentual de inibio de ABTS+ determinado As principais formas de superxido dismutases (EC 1.15.1.1),
em funo da concentrao e do tempo. Quando a medida relativa encontradas em humanos so a Cu/ZnSOD localizada no citosol
reatividade do trolox, como padro, sob as mesmas condies, o (dimrica), alm de lisossomas, ncleo e espao entre as membra-
teste denominado TEAC, expresso como unidades equivalentes de nas interna e externa da mitocndria (tetramrica) e a MnSOD lo-
trolox que correspondem a 1,0 mmol/L18,33. calizada na mitocndria (Figura 2).
Esse mtodo aplicvel para o estudo de antioxidantes lipos- A maioria das anlises de SOD realizada verificando-se a ativi-
solveis e hidrossolveis. dade de SOD indiretamente, geralmente por adio ao eritrcito do
A Tabela 7 ilustra valores de CAOT, obtidos em plasma e soro sistema xantina - xantina oxidase como fonte de O2 e um composto

Tabela 7. Capacidade antioxidante total em plasma/soro humanos por vrios ensaios


Mtodo Resultados tpicos (M) e referncias Comentrios
TRAP ~1000 Uso de azoiniciadores na gerao de radicais,
Free Radical Biol. Med. 1994, 21, 211. que reagem com O2, dando radical peroxila.
Ensaio da Ficoeritrina 1162 265 Mede a diminuio da emisso de fluorescncia de PE,
(PE) ou ORAC Free Radical. Biol. Med. 1995, 18, 29. adicionada ao plasma, em presena de um composto azo,
gerador de radicais.
Ensaio ABTS 1320-1580 Redox Rep. 1996, 2, 161 Ver Figura 3.
FRAP 612-1634 Anal. Biochem. 1996, 239, 70. A reduo de Fe3+ a Fe2+ define a capacidade antioxidante.
Fonte: Adaptada da ref. 18
Vol. 30, No. 5 Espcies reativas de oxignio e de nitrognio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo 1331

que seja reduzido pelo O2 18,26 como, por ex., o 2-(4-iodofenil)-3-(4- pode ser feita adicionando-se GSH, GR, NADPH e um perxido
nitrofenol)-5-cloreto de feniltetrazol (INT, C19H13ClIN5O2.x H2O, M.M. para dar incio reao (t-BOOH, por ex.), sendo monitorada a
505,7 g/mol). O O2 transfere um eltron ao INT e produz formazana, 340 nm quando o NADPH convertido a NADP47.
detectada em espectrofotmetro a 505 nm. A atividade da enzima
medida a partir do grau de inibio da reao a que o eritrcito foi Glutationa redutase (GR)
submetido e os valores so expressos em unidades por grama de A glutationa redutase (EC 1.6.4.2) uma flavoprotena depen-
hemoglobina (Hb) (U/g Hb). A inibio da formao do cromgeno dente de NADPH e da integridade da via das pentoses. a enzima
proporcional atividade de SOD presente na amostra. Nessa tcnica, necessria para manuter a glutationa em sua forma reduzida e, pos-
uma inibio de 50% definida como uma unidade de SOD36-39. sivelmente, para controlar o estado redox de NADP em tecidos
onde GSSG est disponvel48. A recuperao de GSH por GR
Catalase (CAT) uma etapa essencial para manter ntegro o sistema de proteo ce-
A catalase (EC 1.11.1.6), cujo stio ativo contm o grupo heme, lular, pois, baixas concentraes de GSH esto associadas ao
est enclausurada no peroxissoma, a principal organela respons- estresse oxidativo1.
vel pela desintoxicao celular e pela oxidao de cidos graxos A anlise de GR em eritrcitos feita utilizando-se tcnicas
de cadeia longa, fonte inesgotvel de perxidos orgnicos, produ- espectrofotomtricas, em valores de absorbncia de 340 nm, quando
tos carbonlicos e oxignio singlete. A catalase , tambm, encon- o NADPH convertido a NADP+. Uma unidade de GR definida
trada nas mitocndrias das clulas do tecido cardaco. como 1 mol de GSSG reduzida por min a 30 C, em pH 7,4 48,49.
Os dois caminhos mais utilizados para estudo de sua atividade Conforme citado acima, a anlise de enzimas antioxidantes
referem-se medida do decaimento na concentrao de H2O2 e da comumente realizada em eritrcitos49, o que requer o hemograma ou
gerao do oxignio18,26. A leitura do decaimento de H2O2 feita eritrograma dos indivduos estudados e aponta para a adoo da unidade
por espectrofotometria no ultravioleta a 240 nm. Os valores de CAT de enzima expressa em unidade de enzima por grama de hemoglobina,
tambm so expressos em unidades por g de hemoglobina (U/g cujos valores de referncia esto dispostos na Tabela 7.
Hb). Uma unidade de CAT corresponde atividade da enzima ne-
cessria para o consumo de 1 mol de H2O2 em 1 min40. Sistema antioxidante no enzimtico

Glutationa Peroxidase (GPx) Relaciona-se a um grupo de antioxidantes que podem ser agrupa-
A famlia de GPx (EC 1.11.1.9) reduz H2O2 e outros perxidos dos em compostos produzidos in vivo, como o caso da glutationa,
a gua ou lcool. Apresenta-se sob 4 formas: GPx 1 ou clssica, da ubiquinona e do cido rico, e em compostos obtidos direta-
encontrada no citosol de todas as clulas do corpo; GPx 2 ou gas- mente da dieta tais como vitaminas E, C, -caroteno e outros.
trointestinal, especfica do trato gastrointestinal; GPx 3 ou plas-
mtica ou extracelular, encontrada no fluido do revestimento inter- Glutationa
no do pulmo e no leite materno, alm do plasma em mamferos, e A glutationa (GSH) (C10H17N3O6S, M.M 307 g mol-1) um
a GPx 4, que atua sobre perxidos de resduos de cidos graxos nas tripeptdeo (L--glutamil-L-cisteinilglicina) que exerce funes
membranas e lipoprotenas, reduzindo, tambm, o hidroperxido essenciais na clula, destacando-se sua funo como cofator da
da timina, formado como conseqncia do ataque dos radicais famlia de enzimas glutationa peroxidases (GPx), em que desem-
base timina do DNA41,42. A famlia de GPx integra o grupo de penha papel protetor contra o estresse oxidativo, com sua oxidao
selenoprotenas, que tm, em seu stio ativo, o selnio (Se), obtido a dissulfeto da glutationa (GSSG) (C20H32N6O12S2, Mr 612,6 g/mol).
da dieta ligado metionina, em alimentos de origem vegetal (seleno- um tampo redox sulfidrlico que mantm os resduos cisteinila
metionina) e, ligado cistena, em alimentos de origem animal da hemoglobina e de outras protenas do eritrcito, no estado redu-
(selenocistena). O Se reconhecidamente um nutriente antioxi- zido. A GSH o nico tiol no protico presente em espcies
dante, com recomendaes de obteno na dieta considerando sua aerbias e seu papel intracelular antioxidante inclui a desintoxicao
atividade antioxidante e nutricional43,44. de xenobiticos e de ERO. A falha nesta funo resulta na forma-
No organismo humano, a selenometionina ocupa o lugar da o de meta-hemoglobina e conseqente incapacidade do eritrcito
metionina nas protenas e a selenocistena constituinte das em transportar oxignio, alm de causar uma variao na forma do
selenoprotenas (selenocistena a forma na estrutura primria de eritrcito, impedindo sua passagem para rgos vitais50-52.
todas as selenoprotenas, inclusive GPx)41,44. Uma unidade de GPx O preparo das amostras muito importante para minimizar a
corresponde atividade de enzima necessria para converter 1 mol atividade de -glutamil-transpeptidase, que quebra ligaes -
de NADPH a NADP+ em 1 min. Como as demais enzimas antioxi- glutamilpeptdeo de GSH; a reduo de GSSG por GR ou a oxida-
dantes, os valores de GPx so expressos em unidades por g de o de GSH. Muitos procedimentos so desenvolvidos para inibir
hemoglobina (U/g Hb). estas reaes enzimticas e no enzimticas: acidificao, utili-
Um mtodo muito utilizado para avaliar a atividade de GPx em zando, por ex., cido perclrico, capaz de inibir tanto a -glutamil-
eritrcitos consiste em adicionar ao lisado de hemcias uma mis- transpeptidase quanto a GR, e o uso de quelantes como o cido
tura contendo NADPH, GSH, GR, EDTA (agente quelante que tem etilenediaminotetractico (EDTA), que limita a oxidao de GSH53.
tambm a funo de impedir a oxidao de GSH a GSSG) e tam- A concentrao de glutationa total (GSH + GSSG) pode ser
po fosfato. Uma alquota da mistura adicionada ao hemolisado, medida usando-se 5,5-ditiobis-(2-cido nitrobenzico) (DTNB,
mantido em banho-maria a 37 C durante 1 min, adicionando-se, C14H8N2O8S2, M.M 396,3 g/mol) e GR. A velocidade de reduo de
em seguida, H2O2 ou hidroperxido orgnico, para iniciar a reao, DTNB verificada espectrofotometricamente a 412 nm, compri-
que acompanhada em espectrofotmetro. mento de onda relativo absoro do produto reduzido, o cido 5-
O mtodo similar quele tradicional de Mills45,46, que mede a mercapto-2-nitrobenzico (TNB), ou sais correspondentes (Figura
velocidade de oxidao de GSH por H2O2 catalisada por GPx pre- 4). O mesmo procedimento pode ser utilizado para a determinao
sente no hemolisado. O consumo de GSH medido, mantendo em de GSSG, com acompanhamento da mudana de absorbncia em
concentraes constantes a GR e o NADPH que converte imediata- NADPH a 340 nm. Entretanto, para evitar a interferncia de GSH,
mente a GSSG produzida em GSH. Portanto, a anlise de GPx essa deve ser derivatizada com vinilpiridina26 (no interfere com
1332 Vasconcelos et al. Quim. Nova

GR) ou com N-etilmaleimidina (NEM)49,53,54. Quando NEM utili- A CoQ transportada na circulao ligada a lipoprotenas, sendo
zada, o derivado formado deve ser eliminado antes da anlise, pois 60% associada com LDL, 25% com HDL e 15% com outras
o mesmo inibe a GR. lipoprotenas. A atividade antioxidante de CoQH2 depende, no
Outra forma de determinar a concentrao de glutationa nas somente da sua concentrao total, mas tambm do seu estado redox,
hemcias descrita no trabalho de Calvo-Marzal e colaborado- ou seja, da proporo de CoQH2 em relao CoQ total.
res55, onde se utilizam eletrodos de pasta de carbono modificados A ubiquinona, tanto na forma reduzida (CoQH2), como na forma
com Tetratiofulvaleno Tetracianoquinodimetano (TTF-TCNQ). oxidada (CoQ), pode ser quantificada em plasma humano obtido de
sangue coletado em heparina, centrifugado e armazenado a -70 C,
30 min aps a coleta. A anlise feita em HPLC, com o plasma
tratado com 1-propanol para dissociao de CoQ, e -tocoferol da
lipoprotena e com a adio do anlogo dietoxlico da CoQ, como
padro interno. O sobrenadante injetado diretamente na cmara de
injeo do HPLC e CoQH2 e CoQ so determinadas26,49.

cido rico
O cido rico (URH3) deriva do metabolismo das purinas e pro-
duzido pela oxidao de hipoxantina e xantina pela xantina oxidase
(XO) e xantina desidrogenase (XD). Na maioria das espcies, a enzima
peroxissomal urato-oxidase converte urato a alantona, que, por sua
vez, convertida a alantoato e depois a glioxilato e uria, todos produ-
tos mais solveis em gua que o urato. Seres humanos e outros primatas
no contm a urato-oxidase, da, o urato acumula-se no plasma e
Figura 4. Reaes usadas para deteco de glutationa. (A) Reao enzimtica excretado na urina. Em pH fisiolgico, o cido rico dissociado a
DTNB e do produto da sua reduo, TNB (cido 5-tio-2-nitrobenzico), sob urato (UrH2-) (pKa 5,4)5. O urato tem solubilidade menor em gua e
ao de GSH, observado em 412 nm. (B) Reao no enzimtica para sua concentrao encontra-se muito prxima de seu limite de solubi-
deteco de NADP a 340 nm lidade (300 M) 5; por isso, o excesso de produo de urato leva
formao de cristais, o que ocorre na gota, tratada com alopurinol,
Coenzima Q (CoQ) inibidor de XO/XD. Oxidantes fortes, tais como OH, podem oxidar o
A coenzima Q10 (Figura 5) ou ubiquinona o nico lipdio nion urato (UrH2-) ao radical urato, que dissociado (pKa 3,1), ao
endogenamente sintetizado atravs da via do mevalonato, que apre- nion radical urato (UrH). Esse estvel graas ressonncia que
senta funo redox56. um AO que desempenha papel central na permite a disperso da carga negativa. O urato tambm reage com
cadeia respiratria mitocondrial, na cadeia de transporte de eltrons radicais ROO antes de este penetrar a membrana celular e iniciar o
extra-mitocondrial, participa da regulao da permeabilidade, dimi- dano e, com o dixido de nitrognio (NO2), para formar o nion
nui a oxidao de protenas de membrana, previne a oxidao do nitroxila NO2- e por fim, atua como antioxidante, por sua capacidade
DNA e impede a disfuno endotelial, provavelmente por aumentar de quelar metais de transio. O nion radical urato (UrH) pode reagir
a disponibilidade de NO. Sua forma antioxidante, o ubiquinol com ascorbato (AscH-), regenerando o urato5 (Equao 6)18.
(CoQH2), produto da reduo de CoQ, inibe a iniciao e propaga-
o da peroxidao lipdica, com conseqente impedimento da for- UrH + AscH- UrH2- + Asc (6)
mao de ROO (radical peroxila). Alm disso, a coenzima Q rege-
nera a vitamina E do radical tocoferila57,58. O cido rico apresenta atividade antioxidante significativa e
sua concentrao no plasma maior que a de outros antioxidantes,
como vitaminas C e E20.
A anlise de urato pode ser feita em soro ou em plasma (obtido
em heparina ou EDTA), de preferncia frescos, pelo mtodo
enzimtico automatizado, utilizando kits para dosagem, atravs da
diminuio da absorbncia, aps tratamento com uricase. O cido
rico, que absorve em 293 nm, ao ser convertido a alantona pela
uricase, apresenta diminuio na sua absorbncia15.

Vitamina E ou tocoferol
O termo vitamina E a designao comum de duas diferentes
famlias de compostos que ocorrem na natureza: os tocoferis e os
tocotrienis, que exibem, qualitativamente, a atividade biolgica do
-tocoferol, que o composto mais potente e, geralmente, a forma
predominante. Estruturalmente, tocoferis e tocotrienis diferem
apenas na cadeia lateral e ambos se subdividem em , , e ,
dependendo do nmero e posio do grupo metila no anel cromanol59.
Figura 5. Stios de ao de coenzima Q, vitamina E e ascorbato na peroxidao O tocoferol o antioxidante lipossolvel que atua bloqueando a
lipdica. LH: cido graxo polinsaturado; OH; radical hidroxila; Fe3+- etapa de propagao da peroxidao lipdica dos cidos graxos poli-
O2:radical perferrila; CoQH2: coenzima Q reduzida; CoQH-: semiubiquinona; insaturados das membranas e lipoprotenas. Intercepta o radical
L: carbono central radicalar do cido graxo; LOO: radical lipdico peroxila; peroxila (RO2), resultante com formao do radical tocoferila, que
vitE-OH: vitamina E (-tocoferol); vitE-O: vitamina E (radical -tocoferila); ser regenerado por ascorbato, glutationa ou ubiquinol a tocoferol5,60.
Asc: Ascorbato; Asc: radical ascorbila. Adaptado da ref. 57 O tocoferol pode ser medido em plasma, soro, plaquetas e eritrcitos
Vol. 30, No. 5 Espcies reativas de oxignio e de nitrognio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo 1333

por tcnicas cromatogrficas, sendo a HPLC em fase reversa, a tc- O mtodo mais comumente adotado para analisar carotenides
nica de escolha, com deteco por espectrofotometria no UV (cujo em soro humano HPLC em fase reversa. A amostra de sangue
comprimento de onda depender do solvente), por espectrofluori- deve ser coletada sem anticoagulante, uma vez que o EDTA (cido
metria ou ainda por mtodos eletroqumicos26. Por ser lipoflico, o etilenodiaminotetraactico), o oxalato e o citrato reduzem a con-
tocoferol requer uma etapa pr-analtica de extrao com hexano, centrao de -caroteno, porque catalisam as reaes de
que realizada ao abrigo da luz e sob refrigerao. isomerizao ou de oxidao do mesmo. Alm disso, todas as eta-
pas requerem proteo contra a luz26. As protenas devem ser pre-
Vitamina C ou ascorbato viamente desnaturadas por exposio ao cido perclrico; o -
O cido ascrbico essencial ao homem, pois no pode ser sin- caroteno subseqentemente extrado com mistura de acetato de
tetizado a partir da glicose que seu precursor, como ocorre em etila tetraidrofurano (1:1) e nenhuma etapa de evaporao
plantas e na maioria dos animais. Em sistemas biolgicos, em pH requerida. A separao obtida usando-se eluio isocrtica em
fisiolgico (7,4), 99,95% da vitamina C (AsCH2) encontra-se na for- coluna C18 com deteco em ultravioleta a 436 nm65. A anlise pode
ma de ascorbato (Asc-), que a forma que atua como antioxidante, ser realizada com cada um dos tipos de carotenides ou em termos
ao doar um H ou [H+ + e-] para um radical. O ascorbato (AscH-) atua da concentrao de carotenides total, que podem ser extrados
como antioxidante sobre ERO e ERN, em ambiente biolgico aquo- tambm com solvente orgnico, geralmente hexano, e detectados
so, resultando na formao do nion radical semidesidroascorbato medindo-se a absorbncia a 453 nm26.
(Asc), ou ascorbila, pouco reativo. Atua eficientemente sobre o nion-
radical superxido (O 2), o perxido de hidrognio (H 2O2), o Protenas de transporte de metais de transio
hipoclorito (ClO-) e os radicais hidroxila (OH) e peroxila (OOH). O Os metais de transio Fe e Cu so essenciais ao organismo
ascorbato pode atuar diretamente nas membranas celulares, por im- humano para a sntese de muitas enzimas e protenas envolvidas na
pedir a iniciao da peroxidao lipdica ou indiretamente por rege- respirao, transporte de O2, formao de xido ntrico e outras
nerar a vitamina E, que atua como antioxidante na face lipoflica da reaes redox (por ex., oxidao de adrenalina, noradrenalina e
membrana5. Alm disso, pode regenerar o nion radical urato a par- ascorbato). Sua habilidade na transferncia de eltrons os caracte-
tir de urato, fechando o ciclo de atuao antioxidante do mesmo, riza como potentes pr-oxidantes, uma vez que tm o poder de
como discutido anteriormente (Equao 6)18. converter H 2O2 em OH (Tabela 1). Alm disso, so potentes
A deteco de vitamina C em plasma ou em soro requer pre- catalisadores de reaes de auto-oxidao e decompem perxidos
cauo, uma vez que um composto facilmente oxidvel. Devido lipdicos a radicais peroxila e alcoxila, muito reativos.
a sua facilidade de oxidao, em pH neutro (fisiolgico) ou alcali- Estes ctions podem ser dosados sob a forma livre, ou ligados a
no, recomendvel a acidificao do plasma, preferencialmente sua protena de transporte. Essa ltima forma a mais adequada, uma
aps sua separao por centrifugao, adicionando-se cido vez que os mesmos circulam no plasma, em sua quase totalidade,
tricloroactico, cido metafosfrico, ou cido oxlico, isolado ou ligados s protenas transferrina e ceruloplasmina, respectivamente.
em associao com cido tricloroactico. HPLC a tcnica mais
comumente usada na sua separao e anlise. Recentemente, Transferrina
Katepe61 desenvolveu uma tcnica para deteco simultnea de A transferrina uma betaglobulina sintetizada pelo fgado, res-
ascorbato e malondialdedo em soro humano, utilizando HPLC com ponsvel pelo transporte de ferro no plasma. O Fe obtido da dieta
deteco no UV. pode ser o Fe3+ (frrico) ou Fe2+ (ferroso). Para entrar na clula
duodenal necessrio que o Fe esteja na forma reduzida. No inte-
-caroteno rior do eritrcito oxidado a Fe3+ e, em seguida, reduzido a Fe2+,
Os carotenides so pigmentos intensamente coloridos, para circular no plasma inicialmente ligado ceruloplasmina, que
lipossolveis, sintetizados por plantas e microrganismos, presen- novamente o oxida, para que seja captado pela transferrina e da
tes em muitos alimentos, particularmente frutas, vegetais e peixes. transportado para o fgado, onde armazenado e distribudo para
Existem mais de 600 tipos de carotenides e apenas 10% tm ati- as clulas66.
vidade pr-vitamina A, que a capacidade de converso dos A transferrina pode ser medida diretamente em soro ou plasma
carotenides em retinol62. (coletado em heparina ou EDTA), fresco ou refrigerado (de 2 a 8
As propriedades antioxidantes dos carotenides esto associa- C) por at 7 dias ou congelado a -20 C, por at 3 meses. A anlise
das com sua capacidade de capturar radicais e outras espcies, como feita por turbidimetria, utilizando-se kits comerciais, em
oxignio singlete, em baixas concentraes e em baixa presso espectrofotmetro cuja leitura feita a 37 C em comprimento de
parcial de oxignio, tais como aquelas da maioria dos tecidos sob onda de 340 nm. A transferrina pode tambm ser medida indireta-
condies fisiolgicas62. No entanto, as funes de carotenides na mente pelo clculo que utiliza a Capacidade Total de Ligao do
dieta, na preveno de doenas no esto definitivamente estabe- Ferro CTLF (ou TIBC Total Iron Binding Capacity), que
lecidas, havendo muita controvrsia na literatura. Neste aspecto, se refere quantidade total de ferro que a transferrina capaz de
importante citar dois estudos de associao da suplementao de ligar. A CTLF determinada medindo-se o excesso de ferro no
-caroteno e preveno de cncer de pulmo e doena arterial sobrenadante de uma quantidade conhecida de ferro adicionado ao
coronariana (DAC) em fumantes, onde se verificou, inclusive, um soro para saturar a transferrina, o qual separado aps precipita-
aumento da mortalidade: o CARET (Carotene and Retinol Efficacy o da protena. De posse de tal valor, calcula-se a transferrina
Trial)63, com 18.314 fumantes acompanhados durante 4 anos re- srica (TS) a partir da frmula67
velou aumento de 46% na mortalidade por CA de pulmo, de 26%
na mortalidade por DAC e de 17% na mortalidade geral e, o ATBC TS (mg/100 mL) = (0,8 x CTLF) 43
(Alpha-Tocopherol and Beta-Carotene Lung Cancer Prevention
Study)64, de preveno secundria, com 29.133 fumantes acom- Ceruloplasmina
panhados durante 6 anos revelou aumento de 18% na mortalidade A ceruloplasmina ou ferroxidase I uma 2-glicoprotena que
por CA de pulmo, de 12% na mortalidade por DAC e de 8% na transporta cerca de 90 a 95% do cobre total no plasma66. O Cu2+,
mortalidade total. obtido da dieta, quelado pelo aminocido histidina e absorvido no
1334 Vasconcelos et al. Quim. Nova

duodeno. transportado ao fgado ligado albumina e l incorpo- derivam da peroxidao lipdica. Eles so classificados em prim-
rado na protena ceruloplasmina. O Cu2+ ligado ceruloplasmina , rios (os hidroperxidos lipdicos) e secundrios, que derivam da -
ento, distribudo para as clulas. Alm do transporte de Cu2+, a ruptura dos hidroperxidos lipdicos.
ceruloplasmina oxida Fe2+ a Fe3+ para sua subseqente transferncia
para a transferrina, da a sinonmia de ferroxidase, e catalisa a S- Malondialdedo (MDA)
nitrosao de biomolculas tilicas66,68,69. O malondialdedo um produto secundrio da peroxidao
A determinao de ceruloplasmina humana baseia-se na rea- lipdica, derivado da -ruptura de endociclizao de cidos graxos
o entre essa enzima como antgeno e o anti-soro especfico obti- polinsaturados com mais de duas duplas ligaes, tais como cido
do em kits disponveis no mercado. O princpio do mtodo a linolico, araquidnico e docosaexanico18,70-72. Atualmente, o MDA
reao antgeno (a enzima presente no soro) com o anticorpo con- considerado um candidato potencial para ser escolhido como um
tido no kit. A reao d lugar a um complexo insolvel, produzin- biomarcador geral de dano oxidativo em plasma14.
do uma turbidez que pode ser lida espectrofotometricamente. Por- O MDA foi o foco de ateno da peroxidao lipdica durante
tanto, sua anlise feita por imunoturbidimetria, a 37 C, utilizan- muitos anos, pelo fato de poder ser medido livre, utilizando-se o
do-se espectrofotmetro, em 340 nm. A ceruloplasmina pode ser cido tiobarbitrico (TBA). O MDA reage com TBA e forma um
medida diretamente em soro fresco ou refrigerado entre 2 a 8 C cromgeno de cor rosa fluorescente, cuja absoro ocorre em de
por at 2 dias ou congelado a -20 C por at 3 meses. 532 nm e fluorescncia em 553 nm26 (Figura 6). Considerando-se
Os valores de referncia para os antioxidantes no enzimticos que o teste no especfico para MDA, pois outros aldedos parti-
citados esto ilustrados na Tabela 8. cipam da mesma reao, a tcnica utilizando HPLC com deteco
no UV, recentemente desenvolvida por Katepe61, em soro humano,
Tabela 8. Valores de referncia para enzimas antioxidantes em revela-se mais especfica. Na tcnica de Katepe, o soro acidificado
eritrcito humano para liberar o MDA ligado ao grupo amino de protenas.

Enzimas antioxidantes Valores de Referncia (U/g Hb)


Superxido Dismutase (SOD) 6.500 14.500
Catalase (CAT) 16.500 26.500
Glutationa Peroxidase (GPx) 30 44
Glutationa Redutase (GR) 5,4 8,8
Obs: Se for adotado protocolo de kit, considerar o valor referncia
do kit. p.ex., kit RANSOD, RANDOX para SOD, VR = 1102 -=
1601 U/g Hb. Fonte: Adaptado da ref. 49

Avaliao de dano oxidativo em componentes celulares

As macromolculas reagem com ERO e ERN com a produo Figura 6. Reao utilizada para deteco de malondialdedo (MDA) em
de diversos marcadores de dano oxidativo (Tabela 2), que podem plasma humano. Ao plasma adicionado cido tiobarbitrico (TBA), que
ser identificados em sangue humano, entre outros fluidos biolgi- reage com MDA e forma um cromgeno que absorve a 532 nm
cos. A presente reviso dar nfase anlise de marcadores da
peroxidao lipdica com ateno particular MDA, marcadores Hidroxinonenal (HNE)
de oxidao de protenas, especificamente os derivados contendo O HNE o produto majoritrio da oxidao de cidos graxos
grupos carbonila e se far um breve comentrio de marcadores de polinsaturados. Vrias tcnicas foram desenvolvidas para sua de-
espcies reativas de nitrognio. terminao em amostras biolgicas, em sua forma livre, pois a re-
Conforme mencionado13,14, h um esforo mundial para valida- cuperao de HNE do plasma muito baixa e, como acontece com
o de biomarcadores de estresse oxidativo. No momento, no en- todos os aldedos, h necessidade de sua derivatizao para anlise
tanto, no h consenso sobre qual o mtodo mais til, mais confivel, em HPLC 18,26,70-72. A derivatizao com 2,4-dinitrofenilidrazina
mais acurado, ou especfico para os diferentes tipos de dano (DNFH), seguida de cromatografia em camada delgada e HPLC,
oxidativo. No h possibilidade de se fazer a comparao direta com deteco por espectrofotometria no UV, consome um tempo
entre os mtodos, usando amostras idnticas, da, a extrema difi- considervel. Neste sentido, foi proposto um mtodo utilizando-se
culdade de obteno de valores de referncia absolutos para 1,3-cicloexanodiona, que forma um derivado que pode ser detecta-
marcadores especficos em sistemas vivos13,14. mister anotar que do por fluorescncia73. A seletividade do mtodo pode ser aumen-
o balano redox de uma dada populao normal sofre influnci- tada por utilizao de tetraidrofurano ao invs de cinco outros
as genticas (caractersticas tnicas), ambientais (ex., poluio at- solventes, porm a recuperao de HNE muito baixa (cerca de
mosfrica), nutricionais (consumo de carnes e vegetais) e culturais 8%)74. Mais recentemente, a quantificao de HNE em plasma pas-
(ex., hbitos de exerccio fsico intenso, alcoolismo, ou tabagis- sou a ser realizada com pentafluorobenzil-hidroxilamina para for-
mo), o que um complicador adicional. Enquanto os trabalhos de mar o derivado pentafluorobenziloxima (Figura 7), que analisa-
sistematizao prosseguem, til conhecer os principais marcadores do por cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas
e os mtodos mais utilizados para sua quantificao. com ionizao qumica negativa (GC/NICI-MS) usando HNE
deuterado como padro interno26. Nesse mtodo, apesar de haver
Marcadores de peroxidao lipdica um aumento significativo na recuperao de HNE do plasma (60 a
80% versus 8%), sua concentrao permanece, ainda, mais baixa
A importncia do dano oxidativo causado por ERO e ERN em do que a de outros aldedos marcadores de peroxidao lipdica,
lipdios motivo de discusses na busca do melhor marcador em devido, provavelmente, ligao aos grupos sulfidrila ou amina de
fluidos biolgicos, uma vez que produtos numerosos e complexos protenas26.
Vol. 30, No. 5 Espcies reativas de oxignio e de nitrognio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo 1335

de reao que forma os AGEs (Advanced Glycation End products),


denominada reao de Maillard 72,78.

Figura 7. Esquema reacional para a determinao de hidroxinonenal (HNE)

Isoprostano (8-epi-prostaglandina 2,8epi-PGF2)


Os isoprostanos pertencem famlia dos eicosanides, de ori-
gem no enzimtica e so produzidos pela oxidao do cido
araquidnico. Inicialmente, so formados nos fosfolipdios da Figura 8. Exemplos de processos de formao de grupos carbonila por
membrana celular e depois liberados para os fluidos biolgicos oxidao de aminocidos. Adaptado da ref. 18
pela fosfolipase26,72. Ao contrrio do que ocorre com os hidrope-
rxidos lipdicos (produtos primrios da peroxidao lipdica - PL), O contedo carbonlico de protenas amplamente utilizado
que se decompem rapidamente nos fluidos e tecidos humanos, como marcador de dano oxidativo em protenas, sob condies de
F2-isoprostanos so produtos secundrios da peroxidao lipdica estresse oxidativo. necessrio, porm, identificar a natureza do
quimicamente estveis podendo, inclusive, ser dosados na urina. grupo carbonila, i.e, qual dos resduos de aminocido sofreu o dano.
Essa estabilidade a razo pela qual a sua quantificao desperta A ligao de certos aldedos a protenas (ex. MDA e HNE) pode
interesse, com o aparecimento de muitos protocolos para sua an- gerar carbonilas por glicoxidao, de modo que a presena de gru-
lise. Alm disso, so produtos especficos da PL, esto presentes po carbonila no , necessariamente, indicativa de oxidao de
em quantidades detectveis em todos os fluidos biolgicos e teci- aminocidos.
dos, sua formao aumenta drasticamente em modelos animais de H diversas tcnicas para se medir a presena de grupo carbonila
dano oxidativo e modulada pelo estado antioxidante e seus nveis em protenas, sendo imprescindvel uma preparao adequada da
no so afetados pelo contedo de lipdios da dieta75. Como MDA, amostra79. Por isso, tal anlise em plasma humano requer uma exaus-
ele , tambm, considerado um candidato potencial para ser esco- tiva seqncia de procedimentos para separar as protenas. O m-
lhido como um biomarcador geral de dano oxidativo em plasma14. todo mais conveniente o espectrofotomtrico, baseado na reao
O mtodo mais adequado para anlise de isoprostanos a de DTNB com o grupo carbonila, que forma a hidrazona da pro-
cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas com tena, cuja leitura de absorbncia feita a 370 nm72,76,79,80. A unida-
ionizao qumica negativa (GC/NICI-MS), contudo, devido aos de mais utilizada para carbonila nmol/g de protena, por isso
altos custos financeiro e operacional, os mtodos radiomtricos e preciso quantificar a protena total da amostra utilizando-se o m-
imunolgicos so mais utilizados26,71,72. todo de Bradford81 ou outros.
A Tabela 9 mostra valores de referncia de alguns marcadores
Marcadores de oxidao de protenas de dano oxidativo em macromolculas analisados em sangue hu-
mano, embora haja muita controvrsia na literatura13,14.
Grupos carbonila em protenas
A modificao de protenas pode ser induzida por ERO, por Tabela 9. Valores de referncia para antioxidantes no enzimticos
ctions metlicos (Fe2+, Cu+), por endobiticos (GSH), por HOCl e em sangue humano
HOBr, no processo da fagocitose, por irradiao, por perxidos
lipdicos, por oxidorredutases, por frmacos etc. (Tabela 2). Todos Antioxidantes Valores de referncia
os aminocidos so susceptveis oxidao, principalmente os aro- Glutationa GSH (plasma) 1 3 M
mticos, que so os alvos preferidos de ataque. Existem, portanto, Glutationa GSH (eritrcito) 1 3 M
muitos mecanismos para oxidao de protenas e, ao mesmo tem- Coenzima Q CoQ (plasma) 0,4 1,0 M
po, muitas substncias passveis de tal modificao26,76. A oxida- cido rico ou Urato (soro) 0,2 0,4 mM
o direta de lisina, arginina, prolina e treonina fornece derivados Vit. E ou Tocoferol (plasma) 20 M
carbonlicos (Figura 8). Alm disso, grupos carbonila podem ser Vit. C ou Ascorbato (plasma) 30 100 M
introduzidos em protenas via reao com aldedos derivados da -Caroteno (plasma) 0,3 0,6 M
peroxidao lipdica (MDA, HNE) ou gerados a partir da reao de Transferrina (soro) 200 360 mg/dL
reduo de acar (p.ex., glicose) ou produtos de sua oxidao com Ceruloplasmina (soro) 15 60 mg/dL
resduos de lisina (reaes de glicao e de glicoxidao formando
carboximetil-lisina) 69,76,77. Vale salientar que, segundo o Joint Fonte: Adaptada das refs. 18 e 98 e kit analtico Spinreact.
Commission on Biochemical Nomenclature, o termo glicao di-
fere de glicosilao. Esta ltima constitui o processo ps-traducional Marcadores de espcies reativas de nitrognio (ERN)
catalisado enzimaticamente. A glicao um processo no
enzimtico a que esto sujeitas todas as protenas e consiste de 2 O xido ntrico (NO) rapidamente metabolizado a produtos
etapas: a glicose e o grupo amino de lisina reagem e formam frutose- estveis, ou seja, nitrito e nitrato, na maioria dos fluidos do corpo,
lisina (FL); FL sofre desidratao, rearranjo e ciclizao, seguida inclusive no plasma. Quando em presena de O2 forma ONOO,
1336 Vasconcelos et al. Quim. Nova

que promove diferentes efeitos biolgicos a partir de trs reaes: dos de GPx, CAT e SOD e positivamente correlacionados com o
reao redox direta 82, reao com CO 2 formando CO 382, 83,84 e aumento de TBARS no tecido cerebral92. Diabticos no depen-
homlise de cido peroxinitroso82 (Tabela 1). dentes de insulina (tipo II) apresentaram queda significativa nos
O mtodo de determinao mais comumente utilizado baseia- nveis de SOD, CAT, GSH, ascorbato e -tocoferol no plasma e
se na reao de diazotao (mtodo de Griess), especfico para eritrcitos, nos 2 primeiros anos de diagnstico, o que foi positiva-
nitrito e que no detecta nitrato. O tratamento da amostra com agen- mente correlacionado com a durao da doena e com o desen-
tes redutores ou enzimas gera o total de produtos em termos de volvimento de complicaes93. Estudos recentes com hipertensos
nitrito e nitrato, com deteco espectrofotomtrica26. Outros mto- revelaram nveis mais baixos de SOD, CAT e GPx em eritrcitos94-97
dos foram desenvolvidos, incluindo-se HPLC, eletroforese capilar e nveis elevados de MDA92. Esses so alguns dos muitos exemplos
e cromatografia de troca inica com deteco no ultravioleta, des- de estudos de estresse oxidativo em doenas j instaladas, utilizan-
de que em soro ou plasma frescos. do marcadores obtidos em fluidos biolgicos, principalmente em
Existem diversas limitaes para a determinao de nitrato e sangue humano.
nitrito em sangue, destacando-se: sua meia vida no plasma de
cerca de 1 h e 30 min sendo, a seguir, excretados pela urina; seus CONSIDERAES FINAIS
valores plasmticos so dependentes da integridade renal. Assim,
o real valor de sua determinao precisa ainda ser estabelecido26. A Como visto, muitos processos celulares so governados pelo
combinao de NO com outras ERO gera reagentes (Tabela 1) que balano redox. As substncias envolvidas no binmio antioxidante
promovem a nitrao das biomolculas, incluindo resduos de pr-oxidante e que configuram o ambiente redox biolgico po-
tirosina e tocoferol localizados nas membranas. A 3-nitrotirosina dem ser quantificadas associando s tcnicas bioqumicas tradici-
(3-NO2-Tyr) e o 5--nitrotocoferol constituem os biomarcadores onais, tcnicas cromatogrficas, espectrofotomtricas e eletroana-
de oxidao NO-dependentes de tecidos biolgicos. Para ambos, lticas, selecionadas pela observao de critrios de sensibilidade,
HPLC com deteco eletroqumica a tcnica de escolha, pela especificidade, acuracidade, facilidade de manipulao, rapidez,
sensibilidade e seletividade, pois necessrio separ-los de outros robustez, objetivo, tipo de amostra, preo, repetibilidade, eficin-
produtos de oxidao: 3,4-DOPA, 3-clorotirosina, 3,3-ditirosina, cia, entre outros. A determinao dessas substncias revela-se de
m-tirosina e o-tirosina, no caso de 3-NO2-Tyr e de outras formas de grande importncia, com perspectivas de aplicao clnica para
tocoferol (, , ) no caso de 5--nitrotocoferol26,85. diagnstico de doenas e do estado geral de sade do indivduo.
Alm disso, o entendimento dos mecanismos utilizados pelas c-
Outros marcadores de dano em macromolculas lulas para a manuteno do balano redox do meio fundamental
na identificao de biomarcadores representativos para a avaliao
Em sangue, o dano ao DNA detectado atravs do teste do do nvel de estresse oxidativo de diferentes indivduos. H interes-
cometa em leuccitos, (comet assay)86-89. Idealmente, a avalia- se dos especialistas em cincias da sade, em cincias qumica e
o do dano em DNA deve reunir os marcadores excretados na bioqumica, em nutrio, e, principalmente, do pblico em geral.
urina, 8-hidroxi-desoxinucleotdeos (8-OH-dG) e suas bases livres H muita complexidade nas diversas reas envolvidas, muita
(8-hidroxiguanina) e os marcadores medidos em sangue26,71,72. informao e discusso. O nmero de artigos publicados quadru-
plicou na ltima dcada26. O presente trabalho procurou citar os
Associao de marcadores de balano redox a doenas mtodos de determinao analtica mais conhecidos e utilizados,
aplicados em sangue/ou plasma/ou soro humano. A natureza nica
A Tabela 3 ilustra exemplos de doenas cujo mecanismo do plasma humano, enquanto fonte no s de protenas clssicas j
fisiopatolgico tem a participao do estresse oxidativo, a Tabela 4 utilizadas no diagnstico de doenas (em concentraes de mg/
lista os marcadores de dano oxidativo associado com algumas doen- mL), mas em nvel de protemica (pg/mL at ng/mL), torna esse
as humanas e a Tabela 5 apresenta exemplos de biomarcadores uti- biofluido um desafiante meio de investigao e aponta para o de-
lizados para o diagnstico e/ou monitoramento de doenas7-10,12,90. A senvolvimento de tcnicas capazes de identificar biomarcadores
determinao de antioxidantes e marcadores de dano oxidativo com mais especficos16, inclusive do ambiente redox. Apesar de reco-
aplicao clnica para diagnstico, com excees, como o caso da nhecido que os testes de diagnstico in vitro contribuem em 94%
ceruloplasmina na doena de Wilson, permanece em nvel de pes- com os registros de dados clnicos e influenciam em 60 a 70% das
quisa, uma vez no foi possvel ainda sequer determinar se o fen- decises clnicas97, o seu uso em nvel de protemica no est esta-
meno oxidativo observado causa ou conseqncia da doena. belecido e encontra-se em franco desenvolvimento.
Muitos estudos permitiram verificar o fenmeno do estresse H enormes desafios que impedem ou pelo menos dificultam a
oxidativo em doenas. Em pacientes com hemocromatose, dimi- sua aplicao para descobrir biomarcadores de maior sensibilida-
nuio dos nveis de -tocoferol, ascorbato e retinol foram encon- de e especificidade, entre outras caractersticas importantes11 para
trados e positivamente correlacionados com o aumento de TBARS o fenmeno que est sendo investigado e, conseqentemente, a uti-
(substncias reativas do cido tiobarbitrico) no plasma91. Em pa- lizao destes dados para inferir estado redox de indivduos e para
cientes com doena de Alzheimer, foram encontrados nveis eleva- auxiliar em terapia antioxidante. No h consenso. No momento, a

Tabela 10. Valores de referncia para alguns marcadores de dano oxidativo em macromolculas analisados em soro e plasma humanos
Marcador de dano oxidativo Valores de referncia Mtodo analtico
Malondialdedo MDA (plasma) 1 3 M Separao por HPLC de MDA de adutos TBA ou deteco
fluorimtrica de TBARS
Isoprostano 35 6 pg/mL Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas
Carbonila em protenas 0,4 1,0 nmol/g ptna Espectrofotometria (Figura 8)
Fonte: Adaptada das refs. 18, 76 e 99
Vol. 30, No. 5 Espcies reativas de oxignio e de nitrognio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo 1337

despeito do forte interesse, desenvolvimento e plausibilidade bio- DTNB: 5,5-Ditiobis (2-nitro-5-cido tiobenzico)
lgica, a hiptese de ligao direta entre estresse oxidativo e doen- EDTA: cido etilenediaminotetra-actico
as ainda de difcil comprovao, uma vez que h inmeros fato- ER: Espcies Reativas
res limitantes, tais como procedimentos de coleta e armazenamento; ERO: Espcies Reativas de Oxignio
a tcnica analtica em si, em muitos casos, de elevado custo e de ERN: Espcies Reativas de Nitrognio
difcil operacionalizao, a falta de uniformidade nas unidades em ESR: Electron Spin Resonance. Ressonncia de spin
que se exprimem os resultados, bem como os valores de refern- de eltron
cia; a quantidade de fatores interferentes e, principalmente, ques- Fe3+-TPTZ: Ferritripiridiltriazina
tes ligadas variabilidade gentica. Apesar da existncia de vri- Fe2+-TPTZ: Ferrosotripiridiltriazina
os biomarcadores de balano redox em sangue (Tabela 6) e da FL: Frutose-lisina
listagem dos valores considerados normais ou de referncia18,49,76,98,99 FRAP: Ferric-Reducing Ability of Plasma Habilidade
(Tabelas 7 a 10), til salientar que no existem ainda valores de plasmtica de reduzir o sal frrico
referncia universalmente aceitos/adotados, uma vez que os pr- GC/NICI-MS: Gas chomatography/negative ion chemical
prios mtodos de anlise e quantificao, alm de envolverem di- ionization mass spectrometry: cromatografia
ferentes tcnicas, esto em processo de desenvolvimento e aperfei- gasosa acoplada espectrometria de massas com
oamento. A validao dos mtodos encontra-se em curso13,14, com ionizao qumica negativa
utilizao do modelo murino, tratado com injeo intra-peritoneal GPx: Glutationa Peroxidase
de CCl413,14. O desenvolvimento de outros modelos faz-se ainda GR: Glutationa Redutase
necessrio para comparao. GSH: Glutationa reduzida
Nessa perspectiva, pesquisas aliando esses marcadores e novos GSSG: Glutationa oxidada
desenvolvimentos de ferramentas e mtodos analticos que possi- GT: Glutationa Transferase
bilitem uma avaliao de forma menos invasiva, sensvel, rpida e Hb: Hemoglobina
simples, com janelas de deteco cada vez menores, vm assumin- HIV+: Pacientes soropositivos em relao ao HIV (Human
do um papel relevante no avano da investigao. Estaremos, pro- Immunodeficiency Virus)
vavelmente, em condies de relacionar o ambiente redox avalia- HNE: Hidroxinonenal
do em indivduos com diferentes aspectos demogrficos, clnicos e H 2O 2 : Perxido de hidrognio
nutricionais, de entender os mecanismos do estresse oxidativo, bem HPLC: High Performance Liquid Chromatography -
como de prevenir ou minimizar os efeitos das doenas oriundas Cromatografia lquida de alta eficincia
dos mesmos, realizando diagnsticos antecipados. INT: 2-(4-Iodofenil)-3-(4-nitrofenol)-5-cloreto de fenil-
tetrazol
AGRADECIMENTOS LH: cido graxo poli-insaturado
MDA: Malondialdedo
Aos rgos financiadores PADCT/CNPq/CTINFRA, MCT, MS, NEM: N-Etilmaleimidina
Fundao de Amparo Pesquisa de Alagoas (FAPEAL), Banco do ORAC: Oxygen Radical Absorbancy Capacity Capacidade
Nordeste do Brasil (BNB), PPSUS/CNPq/SESAU/FAPEAL, CA- de absorbncia do radical oxignio
PES/COFECUB, Instituto do Milnio-INOFAR e RENORBIO/ PE: Phycoerythrin- Ficoeritrina
CNPq. Ao Prof. N. A. Soares, pela reviso da linguagem, ao Prof. PhGPx: Fosfoidrolipdio glutationa peroxidase
E. J. H. Bechara pela cuidadosa reviso e constantes discusses na Ptna: Protena
rea e aos revisores do presente artigo pelos valiosos comentrios. R: Radical
RONS: Reactive oxygen and nitrogen species- Espcies
LISTA DE ABREVIAES reativas de oxignio e nitrognio
SOD: Superxido dismutase
AAPH: 2,2-Azobis(2-metilpropanoamidina) TBA: cido tiobarbitrico
ABAP: Dicloridrato do 2,2-azobis-(2-metilpropanoamidina) TBARS: Thiobarbituric Reactive Substances - Substncias
ABTS: 2,2-Azinobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato, sal Reativas do cido Tiobarbitrico.
de diamnio t- BOOH: terc-Butil-hidroperxido
AGEs: Advanced Glycation End products. Produtos finais TCNQ: Tetracianoquinodimetano
de glicao avanada. TEAC: Trolox Equivalent Antioxidant Capacity Capa-
AIDS: Sndrome de deficincia imunolgica adquirida cidade antioxidante equivalente ao trolox
AMVN: 2,2-Azobis-2,4-pentanonitrila TS: Transferrina srica
AO: Antioxidante TRAP: Total Radical - Trapping Antioxidant Parameter.
ATBC: Alpha-Tocopherol and Beta- Carotene Lung Cancer Parmetro antioxidante relacionado captura total
Prevention Study de radicais
AUC: Area-under-curve. rea sob a curva TROLOX: cido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-
CAT: Catalase carboxlico
CAOT: Capacidade Antioxidante Total TTF: Tetratiofulvaleno
CARET: Carotene and Retinol Efficacy Trial XD: Xantina desidrogenase
CCl4: Tetracloreto de carbono XO: Xantina oxidase
(CHOH)n: Hidrocarboneto
DAC: Doena Arterial Coronariana REFERNCIAS
8-OH-dG: 8-hidroxi-desoxiguanosina
DNFH: Dinitrofenilidrazina 1. Schafer, F. Q.; Buettner, G. R.; Free Radical Biol. Med. 2001, 30, 1191.
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