Ingeniera metablica de

bacterias
Alfredo Martnez Jimnez y Guillermo Gosset Lagarda
Entre los compuestos generados por la indus- tria qumica, los aromticos y los combusti- bles se
distinguen por tener un gran nmero de aplicaciones en los sectores farmacutico, de alimentos y
energtico. Actualmente, estas molculas se obtienen mediante procesos ba- sados en refinacin y
sntesis qumica a partir del petrleo y derivados. Esto permite producir compuestos aromticos y
combustibles ti- les con un costo de produccin relativamente bajo. Sin embargo, la mayora de estos
proce- sos generan subproductos que contaminan el medio ambiente. Por otro lado, depender del
petrleo como materia prima tiene la des- ventaja de que no es renovable, por lo tanto, en el futuro su
disponibilidad ser limitada. Por estos motivos, ha surgido el inters en la bsqueda de alternativas
tecnolgicas para producir compuestos tiles mediante proce- sos no contaminantes y que no dependan
del petrleo. Una de las alternativas ms promiso- rias es la biotecnologa. Esta rea tecnolgica puede
definirse como el uso de organismos o sus componentes, con el fin de generar bienes y servicios. Todos
los seres vivos tienen la ca- pacidad de realizar transformaciones qumicas debido a que poseen
protenas especializadas
llamadas enzimas que funcionan como catali- zadores. La biotecnologa estudia y aprovecha esta
capacidad cataltica natural de los orga- nismos para generar procesos biolgicos de produccin de
molculas tiles.
El conjunto de reacciones qumicas que ocurren en un organismo se conoce como me- tabolismo.
Esta serie de transformaciones qu- micas tiene el propsito de generar diversas molculas que sern
unidas en diferentes con- figuraciones y as se generarn nuevos com- ponentes celulares. Mediante
este proceso la clula crece hasta llegar a un punto en que se divide dando lugar a nuevas clulas.
Mediante reacciones especficas, la energa qumica para llevar a cabo estos procesos es extrada de las
molculas orgnicas, principalmente azcares. As, cualquier clula puede considerarse como una
fbrica microscpica, capaz de llevar a cabo un gran nmero de reacciones qumicas diferentes. Sin
embargo, en su estado natural, las clulas generalmente no producen cantida- des elevadas de los
compuestos tiles desde el punto de vista industrial. Por este motivo es necesario modificar su
metabolismo para que adquieran tal capacidad, para que se convier- tan en fbricas qumicas.
374 |
Ingeniera metablica de bacterias
La ingeniera de vas metablicas y la bacteria Escherichia coli El rea de la biotecnologa que se
relaciona al estudio y la modificacin del metabolismo es la ingeniera de vas metablicas (IVM). sta
puede definirse como la modificacin racional y direc- ta de las reacciones que constituyen el meta-
bolismo de un organismo, con el propsito de mejorar sus propiedades o su productividad (Bailey, 1991).
La IVM surge como una nueva rea dentro de la biotecnologa como resultado del cmulo de
conocimientos generados por varias disciplinas biolgicas que incluyen prin- cipalmente a la bioqumica,
la gentica, la bio- loga molecular y las ciencias genmicas. En la figura 1 se muestra un esquema que
represen- ta el flujo de informacin gentica en la clula, as como las reas de la biologa y la ingeniera
que son utilizadas como herramientas tericas y prcticas de la IVM. En la parte central de la figura se
muestra la relacin existente entre la informacin gentica contenida en el genoma de una clula, la
composicin de protenas y su efecto sobre el metabolismo. Este esquema re- presenta el dogma central
de la biologa mole- cular, el cual dicta que la informacin gentica fluye del cido desoxirribonucleico
(ADn), hacia el cido ribonucleico (ARn) y, finalmente, hacia las protenas. Las protenas son las
responsa- bles de llevar a cabo la mayora de las funciones celulares; por lo tanto, el tipo y la cantidad de
protenas especficas (proteoma) presentes en una clula determinan qu funciones celulares estarn
activas.
El metabolismo es un proceso celular en que participan un gran nmero de protenas di- ferentes. La
clula posee mecanismos para co- ordinar cules protenas y en qu cantidad son necesarias
dependiendo de las condiciones ex- ternas. Cualquier clula microbiana tpica tiene el potencial gentico
en su genoma para sinte- tizar un nmero considerable de protenas. En el caso de la bacteria
Escherichia coli, se estima que este nmero es cercano a 4400 protenas diferentes. El control sobre
cules protenas se sintetizan ocurre principalmente a nivel de la sntesis del ARn. Existen protenas,
llamadas
reguladores, que tienen la funcin de facilitar o impedir que un gene sea transcrito en ARn. De esta
manera, mediante la regulacin gentica, la clula tiene mecanismos para controlar que slo se
sinteticen las protenas necesarias para una condicin ambiental determinada.
La posibilidad de modificar de manera di- recta el metabolismo es el resultado del cono- cimiento
actual sobre las reacciones qumicas que lo constituyen, las enzimas que catalizan dichas reacciones y
los genes que las codifi- can. Debido a que el metabolismo es una red muy extensa y compleja de
reacciones, se ne- cesitan metodologas que permitan analizarlo cuantitativamente. Asimismo, se
requieren herramientas especializadas para modificar de manera directa los componentes celulares. El
conjunto de instrumentos se presenta en la figura 1.
La ingeniera gentica y sus tcnicas de ADn recombinante surge en los aos setenta como resultado
del conocimiento acumulado en el campo de la biologa molecular. Con ello se abre la posibilidad de
aislar, editar y modifi- car el material gentico, logrndose incluso el transplante de genes entre especies
diferentes. Una importante aplicacin de la ingeniera ge- ntica ha sido el desarrollo de cepas bacteria-
nas con la capacidad de producir cantidades elevadas de protenas teraputicas, como es el caso de la
insulina y la hormona de crecimiento humanas (Olmos et al., 1994).
El desarrollo en aos recientes de las tc- nicas de la biologa molecular ha permitido la
determinacin de las secuencias nucleotdicas de genomas completos. Surge as la ciencia ge- nmica,
la cual tiene como objetivo el estudio de la funcin, interrelacin y evolucin de to- dos los genes de un
organismo. La ciencia ge- nmica se ha desarrollado con el apoyo de la bioinformtica, interfase
indispensable para el anlisis terico de las secuencias de ADn depo- sitadas en bases de datos.
La biologa estructural y las tcnicas de ADn recombinante han sido aplicadas al estu- dio y
modificacin de protenas, desarrollndo- se as la ingeniera de protenas. Esta disciplina
ciencia genmica bioinformtica
anlisis de flujos metablicos anlisis de control metablico
ARN
protenas (enzimas)
metabolismo
ingeniera gentica ingeniera de protenas
Figura 1. Herramientas tericas y experimentales de la ingeniera de vas metablicas.
| Ingeniera metablica de bacterias

375
nutrientes
genoma
transcriptoma proteoma metaboloma
376 |
Ingeniera metablica de bacterias
tiene como objetivo la modificacin racional de las propiedades de una protena, tomando como base la
informacin funcional y estruc- tural. La ingeniera de protenas generalmente se aplica al mejoramiento
de enzimas. Entre las mejoras que se realizan a este tipo de prote- nas, se pueden citar: incrementar la
actividad especfica, cambiar la especificidad hacia nue- vos substratos, eliminar la inhibicin alostrica,
entre otros.
El anlisis de flujos metablicos tiene como objetivo determinar la distribucin y la mag- nitud de los
flujos de materia y energa en la clula (Stephanopoulos et al., 1999). Este tipo de estudios es posible
debido a que se cono- ce prcticamente la totalidad de las reacciones qumicas que constituyen el
metabolismo de E. coli. Se sabe que en el metabolismo de esta bacteria participan aproximadamente
994 en- zimas y 794 metabolitos. En esta red metab- lica algunas reacciones siempre estn activas y
otras se inducen o reprimen dependiendo de las condiciones donde se encuentre la bacteria. La
complejidad del metabolismo ha generado la necesidad del desarrollo de mtodos de es- tudio
especiales, basados en enfoques tericos y experimentales. Uno de estos mtodos es el diseo de
modelos del metabolismo celular in silico, es decir, simulados en una computado- ra. En esta rea se
fusionan la informtica y la bioqumica. Ahora es posible simular, median- te algoritmos implementados
en programas de computadora, los flujos en las reacciones me- tablicas de una bacteria. As se pueden
calcu- lar los efectos sobre esta distribucin de flujos por cambios en la composicin de nutrientes, o la
ausencia de una o varias enzimas. Este tipo de estudios ha sido muy valioso para ayudar a entender
cules son los lmites tericos en la capacidad de produccin de algunos metaboli- tos y cules son las
distribuciones de flujos que permiten llegar a dicho resultado.
La determinacin de flujos metablicos en una clula viva es otra aproximacin al estudio del
metabolismo celular. Esta metodologa se basa en la utilizacin de molculas marcadas con istopos.
Esta metodologa es muy pode-
rosa pues permite determinar la mayora de los flujos metablicos intracelulares. Sin embargo requiere
de equipos costosos y clculos muy complejos. La determinacin de flujos meta- blicos se basa en el
uso de molculas de az- cares en las cuales uno o varios de sus tomos de carbono son el istopo
13C. Los istopos son tomos de un elemento que difieren en el n- mero de neutrones en su ncleo. En
el caso del carbono, el istopo ms abundante es el 12C. Utilizando tcnicas analticas es posible de-
terminar si una molcula contiene tomos del istopo 12C o 13C. En este tipo de experimentos,
generalmente se utiliza glucosa marcada. La glucosa es alimentada en un cultivo bacteriano y, como
resultado del metabolismo, sus tomos de carbono terminan formando parte de la ma- yora de los
componentes celulares. Utilizando mtodos analticos, es posible determinar la posicin de los tomos
de 13C en un gran n- mero de molculas en la clula. Con esta infor- macin y el conocimiento de la
estequiometra en la red metablica del organismo, es posible calcular los flujos internos en la clula
(Flores et al., 2002).
El objetivo del anlisis de control metablico (ACM) es definir la relacin cuantitativa de una reaccin
enzimtica sobre el flujo en una va metablica completa. Cuando se desea modifi- car el metabolismo
de un microorganismo, una de las principales preguntas es: cul o cules de las actividades
enzimticas debern ser mo- dificadas para lograr un efecto especfico? no es sencillo encontrar la
respuesta a esta pregunta, principalmente debido a la gran complejidad del metabolismo celular. El ACM
es la principal he- rramienta que permite identificar las enzimas clave dentro de vas metablicas
especficas. La relacin entre una actividad enzimtica y el flujo metablico se expresa como un
coeficiente de control de flujo (CCF). El CCF se define como el cambio en el flujo en una va metablica
que re- sulta al incrementar la actividad de una enzima en particular. La determinacin de los CCF para
las enzimas dentro de una va metablica espe- cfica, permite establecer cules de ellas son las que
limitan el flujo. Una vez que se identifican
| 377
las enzimas limitantes, mediante la aplicacin de la ingeniera gentica se puede incrementar el nivel de
expresin de sus genes y por conse- cuencia la actividad especfica.
Estrategias generales de ingeniera de vas metablicas para incrementar la produccin de un metabolito
de inters La aplicacin ms frecuente de la IVM es la modificacin del metabolismo con el fin de ge-
nerar cepas microbianas que puedan producir una cantidad elevada de un metabolito parti- cular. Existen
estrategias generales de IVM que se pueden aplicar con este fin, independiente- mente del metabolito
que se desee producir: 1) Con base en el conocimiento bioqumico de la va metablica que sintetiza al
compues- to de inters, identificar a las enzimas que son sujetas a control por inhibicin alostri- ca, es
decir, enzimas cuya actividad es inhi- bida por sus productos u otros metabolitos celulares. Estas son las
enzimas clave que regulan el flujo de carbono hacia una va es- pecfica. 2) Para incrementar el flujo de
carbono hacia la va biosinttica de inters, identificar y eli- minar los controles alostricos y transcrip-
cionales en las enzimas clave de esa va y en los genes que las codifican. 3) Lograr un alto nivel de
expresin de los ge- nes que codifican para las enzimas clave a las que ya se les elimin el control
alost- rico. Esto se logra insertando los genes de inters en molculas de ADn llamadas pls- midos, los
cuales se replican en forma inde- pendiente del cromosoma y se encuentran en varias copias dentro de
la clula. 4) Identificar y eliminar posibles pasos limi-
tantes dentro de la va de inters. 5) Incrementar la disponibilidad metablica de los intermediarios del
metabolismo cen- tral que sean los precursores del metabolito que se desea producir. Estos puntos
representan la serie de anlisis y modificaciones mnimas a realizar con el propsi-
Ingeniera metablica de bacterias
to de generar una cepa de produccin mediante la aplicacin de la IVM. A continuacin se presen- tarn
ejemplos de cmo se aplican estas estrate- gias para el desarrollo de cepas de E. coli produc- toras de
compuestos aromticos y etanol.
Sntesis en E. coli de compuestos aromticos con aplicacin industrial mediante la introduccin de genes
heterlogos (caso melanina) La va de sntesis de compuestos aromticos es una fuente de metabolitos
esenciales, as como de un gran nmero de los llamados me- tabolitos secundarios en bacterias y
plantas. Actualmente, la mayora de los compuestos aromticos utilizados en la industria qumica y de
alimentos se obtienen por procesos de sntesis qumica, empleando derivados de pe- trleo como
materia prima. Frecuentemente, este tipo de procesos genera subproductos que contaminan el medio
ambiente. Utilizando la ingeniera gentica de vas metablicas y de protenas, es posible desarrollar
cepas bacteria- nas con el potencial para sintetizar molculas tiles, hasta ahora slo obtenidas
mediante sntesis qumica. Estas cepas bacterianas utili- zarn a la glucosa u otras fuentes renovables
de carbono como materia prima en procesos biotecnolgicos no contaminantes.
Las tcnicas de ingeniera gentica permiten el aislamiento de genes de cualquier organismo y su
modificacin para que sean funcionales en otra especie. Siguiendo este esquema, ha sido po- sible
generar cepas de E. coli con la capacidad de sintetizar protenas humanas de uso teraputico. De la
misma manera, se ha logrado la transferen- cia a E. coli de genes que codifican para enzimas y con esto
modificar su metabolismo. Es as como se abre la posibilidad de dotar a esta bacteria con la capacidad
de sintetizar metabolitos que se en- contraran normalmente fuera de su repertorio natural. En el caso de
los compuestos aromticos, existen ya varios ejemplos de cmo se pueden extender las vas
biosintticas naturales para que este microorganismo pueda sintetizar nuevos compuestos (figura 2).
378 |
Ingeniera metablica de bacterias
Siguiendo esta estrategia, se han construi- do cepas de E. coli con la capacidad de producir
directamente a partir de glucosa: cido qunico, catecol, melanina e ndigo. Algunas cepas mo- dificadas
pueden producir precursores, los cua- les, mediante transformaciones qumicas, dan lugar a los
compuestos: hidroquinona, benzo- quinona, cido adpico, aspartamo, benzocana, cido glico y
pirogalol (LaDuca et al., 1999). Varios de estos productos son sintetizados ac- tualmente usando al
petrleo como materia prima. Al contar ahora con cepas bacterianas capaces de producirlos a partir de
glucosa, se abre la posibilidad de desarrollar tecnologas biolgicas sustentables no contaminantes.
En bacterias como E. coli, el repertorio meta- blico de compuestos derivados de la va arom- tica es
limitado. Sin embargo, si se considera la totalidad de los organismos que poseen esta va, es posible
observar la gran diversidad en com- puestos que se derivan de la misma. Adems del papel que estos
compuestos juegan dentro del metabolismo primario del organismo, se han identificado funciones de
proteccin contra competidores, patgenos o depredadores, as como una funcin estructural en plantas
(ligni- na). Entre los compuestos aromticos con un pa- pel protector se encuentran las melaninas. Estos
son pigmentos que se han identificado en orga- nismos desde bacterias hasta el hombre. Exis- ten varios
tipos de melaninas, uno de ellos, las eumelaninas, provienen de la transformacin de la tirosina por
medio de la accin de la enzima tirosinasa (Cabrera-Valladares et al., 2006). La eu- melanina es un
polmero aromtico; una de sus principales caractersticas es el amplio rango de absorcin dentro del
espectro electromagntico. Durante los ltimos aos ha crecido el inters en este tipo de polmeros,
debido a que se han identificado algunas propiedades fisicoqumicas importantes. Se sabe que la
melanina puede ac- tuar como fotoprotector, intercambiador cati- nico, agente quelante, semiconductor
amorfo, y posee actividades antioxidantes y antivirales.
Las melaninas se pueden obtener mediante extraccin a partir de tejidos animales o a par- tir de
cultivos de bacterias u hongos. Tambin
se pueden obtener mediante sntesis qumica a partir de L-dihidroxifenilalanina (L-dopa) u otras
molculas qumicamente similares. La extrac- cin de melanina a partir de tejidos animales presenta el
problema de un bajo rendimiento y, sobretodo, de variabilidad en la composicin qumica del producto.
En el caso de la extraccin a partir de cultivos de cepas naturales produc- toras de melaninas, el
problema principal es el bajo rendimiento. Finalmente, la produccin de melaninas por medio de sntesis
qumica es un proceso costoso debido al bajo rendimiento du- rante la sntesis de los precursores
empleados.
Debido a las limitaciones de los mtodos descritos anteriormente, existe el inters en el desarrollo de
cepas microbianas modificadas que permitan la sntesis de melanina qumica- mente homognea y con
un nivel de produc- cin elevado. Los procesos desarrollados a par- tir de estas nuevas cepas han tenido
un xito limitado debido a que estas cepas no han sido modificadas para sobreproducir compuestos
aromticos. Adems, se han utilizado genes que codifican para tirosinasa provenientes de hongos, los
cuales no se expresan adecuada- mente en E. coli.
Tomando en cuenta estos antecedentes, se decidi trabajar en el desarrollo de cepas de E. coli con
una alta capacidad de produccin de melanina. Esta bacteria carece de la capacidad natural para
sintetizar este polmero; sin em- bargo, existen otras bacterias que s pueden hacerlo. Considerando lo
anterior, se decidi utilizar las tcnicas de ingeniera gentica para transferir de alguna de estas bacterias
a E. coli el gene que codifica para una tirosinasa. De las bacterias que se sabe pueden producir melani-
na, se eligi a Rhizobium etli como organismo donador del gene de la tirosinasa. R. etli es una bacteria
del suelo que se asocia con las plantas de frijol para ayudarles a fijar nitrgeno y con esto mejorar su
capacidad de crecimiento. Con base en la informacin sobre el genoma de esta bacteria, se dise una
estrategia para aislar el gene melA que contiene la informacin para la sntesis de la enzima tirosinasa.
El gene melA fue aislado e introducido a la bacteria E. coli. La
| 379
\ei\e[debf_hklWje[h_jheiW#*#F
)#Z[en_#:#WhWX_de#^[fjkbeiedWje#-#F
)#Z[^_Zhegk_dWje
)#Z[^_Zhei_gk_cWje
Ingeniera metablica de bacterias
CdE
(
hidroquinona
idj[i_i
9k
!( pirogalol
cido glico gWZ
cido qunico Klebsiella pneumoniae
CdE>
(
!
benzoquinona
WhePWheO
catecol catA >
( cido adpico gkc_YW
\[^b_d] Klebsiella pneumoniae Acinetobacter calcoaceticus
idj[i_i
idj[i_i benzocana |
Y_Zef#Wc_deX[dpe_Ye Yeh_icWje L-fenilalanina
aspartamo gkc_YW
gkc_YW
|Y_Ze\b_Ye
WdjhWd_bWje L-tirosina
melA
Rhizobium etil ndigo
_dZeb melanina
L-triptofano
Figura 2. Compuestos aromticos sintetizados por Escherichia coli mediante la introduccin de genes de otras
especies mi- crobianas. El nombre de los genes introducidos y el orga- nismo del que provienen estn indicados en
las flechas que dan lugar a cada compuesto.
][d[i nah
Pseudomonas putida
380 |
Ingeniera metablica de bacterias
expresin de este gene en la bacteria permiti la generacin de una cepa recombinante de E. coli que
adquiri la capacidad de sintetizar me- lanina a partir de tirosina (Cabrera-Valladares et al., 2006) (figura
3). Con esta cepa recombinan- te de E. coli se desarroll un proceso fermen- tativo con el cual se logr
producir hasta 6 g/l de melanina en la escalas de 1, 10 y 100 litros (Lagunas-Muoz et al., 2006).
A la fecha, nuestro grupo de investigacin contina mejorando la produccin de melani- na a partir de
clulas completas de E. coli. Sin duda uno de los principales retos es producir el pigmento a partir de
fuentes de carbono de menor precio que la tirosina. Esto se puede lo- grar manipulando el metabolismo
central del carbono, es decir, canalizando la glucosa hacia la formacin de los precursores de los
amino- cidos aromticos (fosfoenol piruvato y eritrosa- 4-fostato) y eliminando la regulacin de la va de
produccin de tirosina. En trabajos previos hemos utilizado estrategias similares para maximizar la
produccin de fenilalanina (Bez et al., 2004). Sin embargo, acoplar la produccin de melanina a la
generacin de tirosina requeri- r de la aplicacin de estrategias novedosas de la ingeniera de vas
metablicas para lograr un proceso de alto rendimiento. Aunado a esto, el desarrollo de estos
catalizadores nos proveer del conocimiento necesario para producir me- laninas de diversos colores,
que tienen diferen- tes propiedades y aplicaciones en campos tan diversos como el de salud,
cosmetologa, biol- gicos, de barnices y pinturas, de sntesis qumi- ca y fabricacin de polmeros
conductores de electricidad, entre otros.
Sntesis en E. coli de compuestos de fermentacin con aplicacin industrial mediante la introduccin de
genes heterlogos (caso etanol carburante a partir de residuos agroindustriales) El etanol anhidro o
etanol carburante es un ex- celente combustible que, adems, puede usar- se como oxigenante de
combustibles fsiles, o bien como sustituto de gasolina. Los combus-
tibles fsiles tienen una disponibilidad finita y, dado el extensivo uso que actualmente se hace de ellos,
se agotarn en el presente siglo. El etanol carburante se produce mediante tec- nologas biolgicas a
partir de material reno- vable, no es contaminante como el petrleo, su uso no incrementa la
concentracin neta de bixido de carbono en la atmsfera. Por tanto, el uso del etanol carburante no
propi- cia el incremento de temperatura ni el cambio climtico en el planeta. Actualmente existen
tecnologas consolidadas y bien desarrolladas para producir etanol carburante. Dichas tec- nologas
utilizan como fuente de carbono a la sacarosa proveniente de la caa de azcar, en Brasil, y a la glucosa
proveniente del almidn de maz. en EE.UU. Mxico no es autosuficien- te en la produccin de maz, es
ms, se impor- tan ms de ocho millones de toneladas al ao de este grano para satisfacer las
necesidades directas de alimentacin de la poblacin, o in- directas a travs de la engorda de ganado
para consumo humano. Entonces esta materia pri- ma no es viable para la produccin de etanol
carburante. Por otro lado, an cuando Mxico produce excedentes de sacarosa y los exporta, este
azcar proveniente de la caa de azcar tampoco es una materia prima viable para pro- ducir etanol. Las
razones no son tecnolgicas sino econmicas: tales excedentes no satisfa- cen los altos volmenes
requeridos para que el etanol sea empleado como energtico, el costo del etanol de sacarosa nacional
(la ms costo- sa del mundo) es mayor comparado con el de la gasolina (Martnez et al., 2006).
Por su abundancia y capacidad de reno- vacin sustentable, las materias primas ms viables para la
produccin de biocombusti- bles resultan ser los azcares presentes en los residuos agroindustriales (la
lignocelulosa o biomasa), siendo su bajo o nulo costo otro fac- tor que favorece su uso. Los residuos de
la in- dustria azucarera, y potencialmente cualquier residuo agroindustrial, son sustratos ms eco-
nmicos, pero ms complejos que la glucosa y la sacarosa, y pueden ser convertidos en pro- ductos
tiles mediante procesos de fermenta-
Figura 3. Lado izquierdo de la caja: cepa de E. coli silvestre (no pro- ductora de melanina). Lado derecho: cepa de E.
coli modi- ficada por tcnicas de ingeniera metablica para producir melanina.
Ingeniera metablica de bacterias

| 381
382 |
Ingeniera metablica de bacterias
cin. En promedio el bagazo de caa de azcar mexicano contiene 42% de celulosa y 28% de
hemicelulosa. sta ltima est compuesta de polmeros de xilosa, cido urnico, radicales acetilo,
arabinosa y manosa. Tcnica y econ- micamente es recomendable llevar a cabo una hidrlisis qumica
de la fraccin hemicelulsica, generando jarabes que contienen xilosa, arabi- nosa y glucosa, en una
relacin 80, 5 y 15% y una hidrlisis enzimtica de la fraccin celul- sica (Ingram et al., 1999 y Martnez
et al., 2000), para generar glucosa y celobiosa. La mayora de los microorganismos en la naturaleza
utilizan glucosa para llevar acabo sus actividades me- tablicas. no obstante, la variedad de micro-
organismos que metabolizan pentosas y otras hexosas, diferentes a la glucosa, es restringida; ms an,
no existen microorganismos silves- tres capaces de metabolizar eficientemente xilosa o arabinosa o
mezclas de glucosa-xilosa o glucosa-celobiosa en productos de fermenta- cin. Los microorganismos
ms eficientes en la produccin de etanol, la levadura Saccharomy- ces cerevisiae y la bacteria
Zymomonas mobilis, nicamente pueden usar glucosa, sacarosa y fructosa para producir etanol, pero no
tienen la capacidad de metabolizar xilosa, arabinosa y celobiosa, o mezclas de ellas. Mediante el uso de
la IVM se pueden disear y desarrollar cepas de bacterias y levaduras con el propsito de metabolizar y
canalizar el flujo de esqueletos de carbono hacia la formacin de etanol a par- tir de pentosas como
xilosa y arabinosa. Desde el punto de vista tcnico e industrial, las cepas ms exitosas han sido las
construidas por IVM a partir de E. coli mediante la introduccin de vas forneas para producir etanol
(Ingram et al., 1999). Entre las estrategias utilizadas estn: la integracin a cromosoma de los genes que
codifican para la piruvato descarboxilasa (pdc) y alcohol deshidrogenasa (adh) de Zymomonas mobilis, la
interrupcin de vas que compiten con el piruvato por la produccin de etanol (Ingram et al., 1999) y la
construccin de cepas que eliminen el fenmeno de represin cata- blica y puedan metabolizar
pentosas y hexo-
sas simultneamente. La figura 4 muestra el esquema metablico ideal para la produccin de etanol a
partir de glucosa y xilosa en cepas etanolognicas de E. coli.
Una de los microorganismos ms exitosos que pretende ser utilizado a escala industrial para producir
etanol a partir de hidrolizados de residuos agroindustriales es la cepa E. coli KO11. Esta cepa es capaz
de convertir todos los azcares presentes en los hidrolizados del bagazo de caa de azcar en etanol
con rendi- mientos mayores a 90% del terico, con con- centraciones de etanol de 45 g/L. Sorprenden-
temente, esta cepa en cultivos anaerobios con glucosa o xilosa incrementa sustancialmente su velocidad
especfica de crecimiento, el flu- jo glicoltico y de consumo de azcares (Huer- ta-Beristin et al., 2005).
Actualmente varios grupos en el mundo, incluyendo el nuestro de ingeniera metablica en el Instituto de
Bio- tecnologa de la UnAM, estamos tratando de mejorar cepas como la descrita anteriormente. Los
principales objetivos son obtener mayores concentraciones de etanol en menor tiempo, realizar la
hidrlisis de la fraccin celulsica del bagazo de caa en el mismo reactor para que fermenten al mismo
tiempo tanto las pentosas y hexosas, provenientes de la fraccin hemice- lulsica, como la glucosa,
obtenida de la hidr- lisis de la celulosa. Para lograr estos objetivos se requiere de una coordinacin y
colaboracin estrecha entre actores del mbito tecnolgico y cientfico, que definan los requerimientos de
un proceso industrial de ingeniera de vas me- tablicas que permita mejorar los biocatlizado- res
productores de etanol a partir de residuos agroindustriales.
Agradecimientos Se reconoce el apoyo del Programa de Apo- yo a Proyectos de Investigacin e
Innovacin Tecnolgica, UnAM, proyectos: In220403 e In205005; y del Conacyt, proyectos: Conacyt-
Sagarpa 2004-C01-224 y Conacyt-Estado de Morelos MOR-2004-C02-048.
| Ingeniera metablica de bacterias

383
glucosa xilosa transporte de glucosa
gluclisis
NADH!H!
PTS
XyIFHG XyIE
Figura 4. Esquema metablico ideal para la produccin de etanol a partir de glucosa y xilosa en cepas
etanolognicas de E. coli.
transporte de xilosa ATP
xilosa
ADP
ATP ADP
va de Zymononas mobilis integrada en Escherichia coli para la produccin eficiente de etanol
va homloga de produccin de etanol ADP
va de las pentosas fosfato
piruvato decarboxilasa
CO
2 piruvato
acetaldehdo
piruvato
NADH!H!
NAD! !CoA
formato liasa
acetil#CoA
acetaldehdo
NADH!H!
alcohol
lactato
NAD!
acetaldehdo deshidrogenasa
NADH!H! fosfotransacetilasa
Pi
alcohol CoA
deshidrogenasa
deshidrogenasa deshidrogenasa
NAD! NAD! acetyl#P
acetato#cinasa
ATP
lactato
formato acetato
etanol
la formacin de lactato, formato y acetato fue inactivada para favorecer la sntesis de etanol
384 |
Bibliografa Bez, J. L. et al., Metabolic engineering and protein direc- ted evolution increase the yield of L-
phenylalanine synthesized from glucose in Escherichia coli, en Biote- chnol. and Bioeng., 87, 2004. Cabrera-
Valladares, n. et al., Expression of the melA gene from Rhizobium etli CFn42 in Escherichia coli and cha-
racterization of the encoded tyrosinase, en Enzyme Microb. Technol., 38, 2006. Flores, S. et al., Analysis of carbon
metabolism in Escheri- chia coli strains with an inactive phosphotransferase system by 13C labeling and nMR
spectroscopy, en Me- tab. Eng., 4, 2002. Huerta-Beristin, G. et al., Ingeniera metablica para in- crementar el flux
y rendimiento de etanol en Escheri- chia coli etanolognica, en Revista Mexicana de Inge- niera Qumica, vol. 4,
2005.
Ingeniera metablica de bacterias
Ingram, L. O. et al., Enteric bacterial catalyst for fuel etha-
nol production, en Biotechnology Progress, 15, 1999. LaDuca, R. J. et al., Metabolic pathway engineering of
aro- matic compounds, en Davies y Demain (eds.), Manual of industrial microbiology and biotechnology, Was-
hington, American Society for Microbiology, 1999. Lagunas-Muoz, V. H. et al., Optimum melanin produc- tion using
recombinant Escherichia coli, en J. Appl. Microbiol., 101, 2006. Martnez, A. et al., Etanol carburante a partir de
bagazo
de caa?, en Claridades Agropecuarias, 2006. Olmos, J. et al., Production in Escherichia coli of a rat chi- meric
proinsulin polypeptide carrying human A and B chains and its preparative chromatography, en J. Bio- technol., 38,
1994. Stephanopoulos, G., Metabolic fluxes and metabolic en-
gineering, en Metabolic Engineering, 1, 1999.