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Quim. Nova, Vol. 40, No. 1, 85-96, 2017 http://dx.doi.org/10.21577/0100-4042.

20160163

POTENCIAL CATALTICO DE LIPASES LIGADAS AO MICLIO DE FUNGOS FILAMENTOSOS EM


PROCESSOS DE BIOTRANSFORMAO

Reviso
Daniela V. Corteza, Heizir F. de Castroa e Grazielle S. S. Andradeb,*
a
Departamento de Engenharia Qumica, Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de So Paulo, 12.602-810 Lorena SP, Brasil
b
Instituto de Cincia e Tecnologia, Universidade Federal de Alfenas, 37715-400 Poos de Caldas MG, Brasil

Recebido em 11/06/2016, aceito em 25/07/2016, web em 30/08/2016

POTENTIAL CATALYTIC OF MYCELIUM-BOUND LIPASE OF FILAMENTOUS FUNGI IN BIOTRANSFORMATION


PROCESSES. Over the past decades, mycelium-bound lipase of filamentous fungus has been extensively studied as an alternative
biocatalyst in biotransformation processes. Mycelium-bound lipase can be used directly as suspended free cells or immobilized
within biomass support particles as whole cells biocatalyst. In the latter, cells can be immobilized in situ or extra situ using different
support materials avoiding the purification step. This represents an attractive, cost-effective technology to enhance chemical reaction
efficiency. The present review covers the great versatility of mycelium-bound lipase to mediate biotransformation processes, given
particular emphasis in its use as biocatalyst for biodiesel production.

Keywords: mycelium-bound lipase; filamentous fungi; immobilization; biotransformation.

INTRODUO estado estacionrio (resting cells) ou mortas (no viveis), mas com
a maquinaria enzimtica de interesse mantida ativa.9 Na forma mais
Reaes de biotransformao ou biocatlise, uma das ferramentas simples, a clula ntegra usada como suporte, evitando as etapas de
da qumica verde, so amplamente usadas em sntese orgnica. Este extrao, isolamento e purificao das enzimas de interesse, as quais
tipo de processo emprega enzimas purificadas ou clulas ntegras, so normalmente trabalhosas e contribuem para tornar o processo
em especial, clulas microbianas livres ou imobilizadas e apresenta oneroso. Ademais, o ambiente natural das clulas ntegras garante
notvel destaque como uma tecnologia suplementar til para a in- a estabilidade da enzima porque sua localizao espacial otimizada
dstria qumica, fornecendo em alguns casos, reaes que no so permanece intacta.10-12 As clulas ntegras podem ser imobilizadas
facilmente conduzidas pela qumica orgnica clssica ou, em outros como um fenmeno natural ou por meio de procedimentos artificiais.
casos, promovendo reaes que podem substituir etapas qumicas As clulas imobilizadas so preferidas em relao s clulas livres,
severas.1-2 Adicionalmente, outros atributos benficos da biotrans- uma vez que so mais convenientes de manusear e de separar do meio
formao incluem versatilidade reacional, especificidade, reduo reacional, alm de serem mais estveis.3
no nmero de etapas no processo e alto rendimento.3 Diferente da Cerca de dois teros das pesquisas em sntese orgnica por
fermentao, na biotransformao o biocatalisador transforma mol- biotransformao envolvem a ao de enzimas hidrolticas como
culas precursoras pr-formadas (naturais ou sintticas) em limitado as lipases, as proteases e as esterases.4 Impulsionadas por sua ver-
nmero de etapas. Alm disto, o produto formado no limitado pelo satilidade, as lipases apresentam destaque no cenrio mundial de
metabolismo do biocatalisador.4-5 enzimas pois permitem a catlise de reaes de hidrlise e de sn-
As enzimas so catalisadores notavelmente eficazes, respons- tese, muitas vezes de forma quimio, regio e enantiosseletiva.13 Esta
veis por milhares de reaes qumicas coordenadas, envolvidas nos caracterstica faz com que as lipases apresentem aplicao em vrios
processos biolgicos dos sistemas vivos e podem agir in vitro.6-7 setores, como por exemplo, na indstria alimentcia, farmacutica,
Os processos enzimticos apresentam uma srie de vantagens de qumica fina, oleoqumica, energia (biodiesel) e na formulao
quando comparados com os processos qumicos convencionais de detergentes, dentre outros. Com base em indicadores, cientfico e
catalisados ou no. Segundo Faber,4 tipicamente, as velocidades das tecnolgico, Daiha et al.,14 relataram que a importncia das lipases
reaes mediadas por enzimas so superiores em relao aquelas como biocatalisadores, identificada em 1930, ainda mantem elevado
no catalisadas, por um fator de 108 - 1010. Entretanto, a literatura grau de interesse para aplicao em diversos segmentos industriais,
ainda aponta outras perspectivas sobre o vasto poder catalitico das com projeo de crescimento na demanda mundial estimada em 6,2%
enzimas, podendo alcanar, por exemplo, velocidades de reao anualmente, atingindo US$ 345 milhes em 2017.
aproximadamente 1010 a 1026 vezes superiores aos encontrados na A disponibilidade e os slidos conhecimentos de seleo, puri-
ausncia do catalisador.8 Diferente dos catalisadores metlicos nos ficao, preservao, manipulao bem como condies de cultivo
processos qumicos, as enzimas agem como um reagente ambien- de fungos filamentosos e a busca constante de novas e alternativas
talmente favorvel, uma vez que so completamente degradveis e fontes de lipases, criam oportunidades para o aprimoramento e/ou
os processos enzimticos so realizados sob condies operacionais descobertas de novas formas de obteno e aplicao da biomassa
mais brandas. Ainda, as reaes biocatalticas podem transformar como fonte da enzima. Dentro deste contexto, a presente reviso
uma grande variedade de substncias naturais ou no, em ambiente tem como objetivo apresentar dados de estudo e aplicao de lipase
aquoso ou orgnico.4 ligada ao miclio de fungos filamentosos, iniciando com os principais
A ao de clulas ntegras (whole cells), por sua vez, pode ser aspectos relacionados enzima, bem como a obteno e o preparo
comparada com aquela de enzimas em clulas que se encontram em do biocatalisador na forma de clulas ntegras.

*e-mail: grazielle.andrade@unifal-mg.edu.br
86 Cortez et al. Quim. Nova

LIPASE A hidrlise de um substrato lipoltico catalisada por uma lipase


se inicia com a ligao do ster do lipdeo enzima e o ataque do
Aspectos gerais resduo serina da biomolcula carbonila do substrato, formando um
intermedirio tetradrico. A clivagem deste intermedirio tetradrico
As lipases (glicerol ster hidrolases, EC 3.1.1.3) fazem parte do libera o lcool, permanecendo um intermedirio correspondente
grupo das /-hidrolases, as quais possuem um padro de dobramento enzima acilada. Em uma reao de hidrlise a gua ataca esta enzima
caracterstico. A descrio original deste dobramento foi baseada no acilada para formar um segundo intermedirio tetradrico e a clivagem
estudo comparativo feito por Ollis et al.,15 das estruturas tridimensio- deste intermedirio libera o cido. Alternativamente, outro nuclefilo
nais de hidrolases de origem filogentica e funo cataltica diferentes. tal como um lcool pode atacar a enzima acilada, resultando, ento,
As /-hidrolases so compostas por um ncleo de oito folhas , um novo ster (uma reao de transesterificao). Na maioria dos
principalmente paralelas, rodeadas em ambos os lados por -hlices.16 casos, a formao da enzima acilada uma etapa rpida, portanto, a
Com poucas excees, as lipases apresentam ativao interfacial. remoo do grupo acila a etapa determinante.16
A presena de um grande volume de agregado lipdico prximo As lipases catalisam uma srie de diferentes reaes. Os pro-
superfcie da enzima altera o ambiente dieltrico nesta regio e os cessos bsicos de hidrlise e formao de steres (esterificao)
resduos carregados da protena interagem mais fortemente com um podem ser combinados em uma sequncia lgica para resultar em
substrato lipdico do que com a gua. Isto faz com que muitas lipases reaes denominadas interesterificaes.20 Dependendo dos materiais
apresentem uma alterao conformacional.17 Nestas enzimas, uma de partida, pode ocorrer uma reao de acidlise, na qual ocorre a
tampa na forma de lao ou de uma pequena -hlice, bloqueia o transferncia do grupamento acila entre um acilglicerol e um cido
acesso ao stio ativo. Quando em presena de um substrato lipdico carboxlico. Ainda pode ocorrer uma alcolise, na qual o grupamento
(ou inibidor), a tampa se adapta a uma nova conformao de forma a acila transferido entre um acilglicerol e um lcool. Outra reao
permitir o acesso ao stio ativo e ao mesmo tempo, uma grande rea tambm possvel a transesterificao, caracterizada pela troca de
hidrofbica tambm fica exposta, o que facilita a ligao da lipase grupamentos acila entre dois acilgliceris (Figura 1). As lipases
interface gua-leo.17-18 Entretanto, nem todas lipases apresentam tambm catalisam a reao de glicerlise. Neste caso, ocorre a inte-
a tampa que controla o acesso do substrato ao stio ativo, tornando, resterificao do triacilglicerol com glicerol.22
a presena desta estrutura e a ativao interfacial, critrios no A especificidade uma caracterstica importante das lipases.
adequados para sua classificao. Desta forma, lipases podem ser Estas enzimas podem ser especficas com relao molcula cida
melhor definidas como carboxilesterases que catalisam a hidrlise ou alcolica do substrato.13 As lipases no especficas clivam as
de acilgliceris de cadeia longa.19 molculas de acilglicerol na posio randmica, produzindo cidos

Figura 1. Alguns exemplos de reaes catalisadas por lipases (Adaptado de Vulfson,21)


Vol. 40, No. 1 Potencial cataltico de lipases ligadas ao miclio de fungos filamentosos em processos de biotransformao 87

graxos livres, glicerol, monoacilgliceris e diacilgliceris como Neste estudo, os autores concluram que a aplicao destes bioca-
intermedirios. As lipases 1,3 especficas liberam cidos graxos das talisadores para o setor industrial ainda significativo, entretanto,
posies 1 e 3 e formam, por esta razo, produtos com composies ressaltam a necessidade do desenvolvimento de lipases que alcancem
diferentes daquelas obtidas pelas lipases no regiosseletivas, ou seu potencial cataltico total.
mesmo pelo catalisador qumico. As lipases cido graxo especficas,
por sua vez, apresentam ao especfica na hidrlise de steres cujos Fontes produtoras
cidos graxos so de cadeia longa insaturada com duplas ligaes,
em cis no carbono 9.13,23 As lipases so encontradas na natureza em tecidos animais e vege-
Outra caracterstica importante a estereoespecificidade, ou tais e em microrganismos (fungos, leveduras e bactrias). Dependendo
seja, a capacidade que algumas lipases possuem de discriminar os da sua origem, podem apresentar massa molecular variando de 19 a
enantiomros de uma mistura racmica. A especificidade estrutural 75 kDa e atuar numa ampla faixa de pH (4,0-9,0) e de temperatura,
ou regiosseletividade decorrente da orientao imposta pelas di- a qual varia do ambiente at 70 oC.23 Dentre as fontes produtoras de
menses e pela estrutura do centro ativo ligao do substrato. Estas lipase, as microbianas so as mais utilizadas industrialmente, porque
restries levam distino e transformao seletiva de funes as enzimas apresentam uma grande diversidade em suas propriedades
quimicamente similares na mesma molcula. A seletividade e a este- catalticas e especificidades por substratos.25 Os microrganismos com
reoqumica advm da prpria quiralidade da enzima, ou seja, de sua potencial para produzir lipases podem ser encontrados em vrios
simetria estrutural, que limita a ao em substratos que no satisfaam habitats, incluindo, por exemplo, ambiente marinho,26 ambiente
determinadas relaes espaciais. Desse modo, a catlise enzimtica antrtico,27-28 resduos de leos vegetais e de petrleo29 e indstrias
permite transferir ou criar centros quirais nas molculas, assim como de produtos lcteos,30 solos contaminados,31 plantas,32 e alimentos
distinguir formas enantiomricas. Lipases tm sido empregadas para deteriorados33. Desta forma, a natureza e os ambientes oferecem um
resoluo de racematos, resultando em rendimentos elevados, para extraordinrio e potencial acervo de fontes de lipase, as quais podem
obteno de steres, lcoois e cidos opticamente puros.12-13,24 Essa apresentar novas propriedades e aplicaes.
versatilidade faz destas enzimas, biocatalisadores potenciais devido a Os fungos filamentosos possuem a habilidade de crescer em
sua grande aplicabilidade em vrios setores, conforme exemplificado substratos bastante simples e de baixo custo, alm da excepcional
na Figura 2. capacidade de expressar e excretar protenas.34 Estas caractersticas
e graas ao avano do conhecimento da fisiologia, bioqumica e
gentica dos fungos filamentosos tornou possvel a explorao de
seu imenso potencial para a produo de lipase, assim como outras
enzimas de aplicao industrial.35 Alguns dos fungos produtores de
lipase com destacada aplicao comercial so aqueles pertencentes
dos gneros Rhizopus sp., Aspergillus sp., Penicillium sp., Geotrichum
sp., Mucor sp. e Rhizomucor sp. Entretanto, a Figura 3 representa
uma listagem de diferentes espcies desses gneros, bem como de

Figura 2. Alguns exemplos de aplicao de lipases nos diversos setores

Em um estudo muito interessante visando avaliar se o uso das


lipases como biocatalisadores ainda relevante no contexto tecnol-
gico, Daiha et al.,14 analisaram o nmero de publicaes e patentes
relacionados, em um perodo de trinta anos (1983 a 2012), com base
em quatro setores industriais de diferentes estgios de desenvolvimen-
to e com diferentes nveis tecnolgicos. Durante a busca de patentes,
foram obtidos 671 documentos relacionados resoluo cintica,
456 na formulao de detergente, 165 para a produo de biodiesel
e 544 para produtos do setor alimentcio e veterinrio. Com relao
a publicaes cientficas, o nmero de documentos encontrados para
cada setor correspondeu a 1352, 117, 439, e 315, respectivamente. Figura 3. Exemplos de fungos filamentosos avaliados para obteno de lipases
88 Cortez et al. Quim. Nova

outros gneros descritos na literatura como fontes promissoras da O crescimento e as distintas atividades metablicas dos organis-
enzima. Essas espcies foram isoladas de amostras de solo, fezes de mos so respostas s condies do ambiente fsico-qumico que os
animais, partes de plantas e em frutos (endofticos). rodeia.97 A produo de enzimas em escala industrial se faz majo-
Os fungos endofticos habitam o interior das plantas, sendo ritariamente por fermentao submersa, embora haja uma tradio
encontrados nos rgos e tecidos vegetais como sementes, folhas estabelecida na utilizao de fermentao slida ou semisslida.98-99
e ramos, sem causar danos aos seus hospedeiros, mas agindo como Os processos submersos so aqueles em que a clula produtora se
controladores de patgenos e predadores por meio da produo de desenvolve no seio do meio de cultivo, sob agitao.
substncias antagnicas e enzimas.82-83 A Figura 4 destaca alguns Os mecanismos que regulam a biossntese de lipases variam de
exemplos de estudos de deteco e seleo de fungos endofticos forma significativa entre os diferentes microrganismos produtores.
isolados a partir de amostragens originadas do Brasil, da Espanha Em alguns casos, a produo de lipase parece ser constitutiva e
e da ndia. independente da adio de substratos lipdicos no meio de cultivo.
Entretanto, sua presena pode aumentar o nvel de atividade lipoltica.
Por outro lado, h microrganismos que preferem, por exemplo, leo,
triacilgliceris ou qualquer outro indutor como cidos graxos, do que
fontes de carbono simples como acares, para a produo da enzima.
Deste modo, as fontes de carbono lipdicas podem ser consideradas
essenciais para a obteno de um alto rendimento em lipase. Fontes
de nitrognio e micronutrientes tambm devem ser considerados para
o crescimento microbiano e a otimizao da produo da enzima.100
A literatura relata diversos estudos de otimizao do meio e das
condies de cultivo de microrganismos visando obter biomassa com
elevada atividade lipoltica (ligada ao miclio). Por exemplo, Essamri
et al.,101 verificaram que as variveis pH, temperatura, concentrao de
leo e perodo de incubao foram significativas sobre o crescimento
celular de Rhizopus oryzae e a atividade lipoltica no interior das
clulas. Os resultados mostraram que os rendimentos mais elevados
foram obtidos quando utilizados pH 5,0, temperatura de 25 C, 3%
de concentrao de leo de colza e 120 h de incubao.
Yang et al.,102 Zeng et al.,103 Wang et al.,104 observaram que os
diferentes efeitos dos leos na produo de lipase por R. oryzae e
Rhizopus arrhizus so causados pelos cidos graxos presentes em sua
composio, e a produo da enzima est relacionada aparentemente
com a quantidade de cido oleico presente em cada leo. A utilizao
de leos refinados como substrato no meio de cultivo aumentou a
atividade cataltica das clulas ntegras, e dentre diversos leos tes-
tados, o leo de oliva foi o que promoveu atividades lipolticas mais
Figura 4. Exemplos de estudos de deteco e seleo de fungos endofticos, elevadas. Em outro estudo, as clulas de R. oryzae provenientes de
citando as potenciais fontes de lipase meio de cultivo enriquecido com os cidos oleico e linoleico mostra-
ram atividade de metanlise superior observada com as clulas cujo
Condies para a produo de lipases ligadas ao miclio de meio foi enriquecido com cidos graxos saturados. Alm disto, clulas
fungos filamentosos provenientes de meio enriquecido com cido palmtico mostraram
maior estabilidade do que clulas enriquecidas com cidos graxos
A otimizao das condies de cultivo de grande importncia insaturados.105 Utilizando tambm R. oryzae, Sun et al.,106 observaram
uma vez que influenciam nas propriedades do microrganismo pro- que diferentes leos indutores resultaram em composies variadas
dutor da enzima, bem como na razo das lipases retidas no miclio e de membrana celular, o que influenciou diretamente na atividade
excretadas para meio de cultivo.25 Em geral, as lipases so excretadas cataltica e na estabilidade operacional do biocatalisador. A adio
para o meio de cultivo com o objetivo de captar os nutrientes para de leos vegetais ricos em cidos graxos insaturados promoveu um
a clula microbiana, clivando o substrato lipdico em componentes aumento na produo de lipase ligada ao miclio. Os autores tambm
mais polares e, portanto, mais fceis de absoro.93 Entretanto, a observaram que as clulas cultivadas em meio enriquecido com cidos
excreo da lipase para meio de cultivo depende do gnero do fungo graxos saturados exibiram maior estabilidade operacional do que as
filamentoso, como por exemplo para Geotrichum candidum no qual clulas enriquecidas com cidos graxos insaturados.
a lipase formada na regio do envelope celular e retida por um Durante estudo com Rhizopus chinensis para verificar a produo
perodo, antes de ser liberada.94 Esse comportamento foi tambm e atividade da lipase ligada ao miclio, Wang et al.,104 constataram que
confirmado no trabalho desenvolvido por Loo et al.,95 que consta- o leo de oliva foi melhor indutor de enzima dentre uma variedade
taram em 54 h de incubao elevada atividade lipoltica nas clulas de substratos lipdicos. Com a suplementao do meio cultivo com
ntegras de G. candidum, seguida de reduo da atividade aps este peptona (56 g L-1), maltose (13 g L-1), K2HPO4 (3 g L-1), MgSO4.7H2O
perodo, provavelmente devido liberao da enzima para o meio de (5 g L-1) e pH inicial 6,0, a atividade da biomassa celular proporcionou
cultivo. Em estudo com Rhizopus oryzae, Hama et al.,96 constataram a um incremento da ordem 90%. Ainda com relao ao R. chinensis,
presena de dois tipos da enzima, sendo uma lipase de 34 kDa (ROL Teng e Xu,107 verificaram dentre uma srie de variveis experimen-
34) encontrada ligada parede celular e uma lipase de 31 kDa (ROL tais que as mais significativas foram volume de inculo, agitao,
31), ligada membrana e parede celular. Neste mesmo estudo, os concentrao de leo de oliva e volume do meio de fermentao.
autores tambm observaram um decrscimo acentuado na quantidade Os autores tambm constataram a importncia do leo de oliva na
de lipase ligada membrana com o tempo de cultivo. produo da lipase ligada ao miclio.
Vol. 40, No. 1 Potencial cataltico de lipases ligadas ao miclio de fungos filamentosos em processos de biotransformao 89

Em 2014, Andrade et al.,62 avaliaram o efeito dos leos vegetais silanizao a um suporte de slica e quelao de xidos de metal.110
de soja, de girassol, de linhaa, castanha-do-par e de oliva sobre o Em relao ao aprisionamento em matriz porosa, h dois mtodos
crescimento celular e a atividade lipoltica de Mucor circinelloides. possveis para este tipo de imobilizao: no primeiro caso, as clulas
Todos os leos favoreceram as variveis respostas, sendo os valores se difundem em uma matriz porosa pr-formada e a reteno ocorre
mximos obtidos quando foi utilizado o leo de oliva numa con- no momento em que a mobilidade fica dificultada pelo aumento do
centrao de 30 g L-1. Segundo os autores, estes resultados podem nmero de clulas. Os suportes pr-formados so mais vantajosos
estar relacionados alta proporo de cido oleico (70%) no leo de porque so mais resistentes compresso e desintegrao que
oliva. Ainda neste estudo, a adio de fontes de nitrognio ao meio, podem ocorrer em leitos empacotados ou em tanques agitados.110
bem como o nvel de inculo e a aerao do meio tambm foram Normalmente, utilizam-se este tipo para a imobilizao de fungos
parmetros importantes. filamentosos, visto que ocorre adeso das clulas microbianas
O cultivo na presena e ausncia de leo de oliva tambm superfcie do suporte. Quando os poros so maiores, as clulas em
apresentou efeito sobre a atividade lipoltica das clulas ntegras crescimento (hifas) penetram no suporte, preenchendo seu espao
de Aspergillus niger, conforme verificado por Romero et al.,70. As interno.112 No segundo caso de imobilizao por aprisionamento, a
especificidades dos biocatalisadores variaram com o tipo de reao matriz porosa sintetizada em torno das clulas a serem imobiliza-
e o substrato utilizado (cido graxo, ster de cido graxo ou lcool). das. Neste procedimento so utilizados compostos (polmeros) que
O cultivo do fungo filamentoso na presena do indutor resultou em gelificam em forma matrizes porosas hidroflicas.113
uma lipase ligada ao miclio mais reativa em reaes de transeste- Entre as vrias tcnicas disponveis para imobilizao clulas
rificao e esterificao com steres de cido graxo de cadeia longa de fungos filamentosos para aplicao em biocatlise, a que utiliza
na presena de etanol. partculas porosas para suporte de biomassa constitudas por cubos de
espuma de poliuretano (do ingls, Biomass Support Particles BSPs)
Imobilizao de clulas ntegras a mais amplamente utilizada porque possui muitas vantagens sobre
outras tcnicas, em termos de aplicao industrial. Estes suportes so
O processo de biotransformao pode ser conduzido por clulas constitudos de material inerte com boas propriedades mecnicas e
ntegras no estado livre, entretanto a imobilizao facilita o manuseio baixo custo comercial, alm de possurem elevada porosidade e ampla
e separao do biocatalisador do meio reacional, alm de promover superfcie de adsoro.108 Entretanto, a literatura aponta outros tipos
maior estabilidade do sistema.3 de suportes, como por exemplo, esferas de criogel obtidas a partir
Imobilizao um termo geral que descreve as muitas formas de do lcool polivinlico (PVA) e esferas de quitosana adicionados de
fixao, encapsulamento ou aprisionamento de clulas ou enzimas polivinilpirrolidona e polisfosfatos,114-116 esferas de polihidroxibutirato
em um suporte slido. Especificamente, a imobilizao de clulas - PHB e terra diatomcea - Celite,55 partculas de bucha vegetal,117-118
ntegras representa uma forma particular de adeso celular baseada esferas de alginato de clcio,119 membranas de politetrafluoretileno
na habilidade de certos microrganismos de se fixarem em suportes PTFE,120 conforme apresentado na Tabela 1.
slidos por meio de ligaes naturais ou fsico-qumicas.108 O conceito
de clulas ntegras imobilizadas em biocatlise diferente do con- APLICAO DE LIPASES LIGADAS AO MICLIO DE
ceito de clulas imobilizadas utilizadas em processos fermentativos. FUNGOS FILAMENTOSOS EM PROCESSOS DE BIO-
As clulas so normalmente tratadas antes ou aps imobilizao, de TRANSFORMAO
forma a perder a capacidade de multiplicao (viabilidade), mas com
as enzimas desejadas mantidas estveis e em estado ativo. No caso Sntese de steres
de processos fermentativos convencionais, as clulas imobilizadas
so mantidas em estado de crescimento dentro da matriz por um steres de sacardeos e cidos graxos so surfactantes no-inicos
suprimento contnuo dos nutrientes, favorecendo a manuteno de naturais, com propriedades prebiticas e aplicaes na produo de
suas funes biolgicas necessrias para o processo.9 alimentos (gordura diettica), como emulsificante, agente antimicro-
Para a imobilizao de clulas so utilizados os mtodos am- biano e revestimento de proteo para frutas, dentre outros exemplos.
plamente utilizados na tecnologia de imobilizao de enzimas, tais Em 2004, Antczak et al.,114 produziram os steres de acar caprilato
como adsoro, ligao covalente, ligao cruzada e aprisionamento de glicose, caprilato de sacarose, oleato de sacarose e linoleato de
(encapsulamento). Entretanto, devido a morfologia das clulas, alguns sacarose por clulas ntegras de Mucor circinelloides imobilizadas
critrios devem ser impostos para seleo adequada do suporte e do em criogel-PVA e meio reacional composto pelos acares e cidos
mtodo de imobilizao. A literatura disponvel referente a imobi- graxos solubilizados em mistura de teres de di-n-pentila e de pe-
lizao de clulas ntegras escassa, podendo ser destacado apenas trleo, adicionado de antioxidantes naturais. Os autores avaliaram a
revises abrangentes publicadas por Fukui e Tanaka,9 Jack e Zajic,109 atividade de gua do meio reacional e a otimizao da composio
e Karel et al.,110 abordando aspectos importantes que serviram de base do meio reacional e os rendimentos em steres produzidos variaram
para elaborao dos conceitos descritos neste tpico. As principais de 0 a 66%, aproximadamente.
tcnicas normalmente utilizadas para imobilizao de clulas integras Lipase ligada ao miclio de Rhizopus chinensis mostrou atividade
so baseadas na adsoro em suportes inertes, na encapsulao e apri- sinttica superior a outras dez lipases comerciais, na esterificao dire-
sionamento em matrizes polimricas ou ligao covalente, cruzada e ta do etanol com diferentes cidos carboxlicos (C2 a C8). O tamanho
inica, em suportes previamente ativados.110 da cadeia do cido carboxlico influenciou o grau de esterificao,
Os sistemas em que as clulas so imobilizadas por ligao na sendo obtido o valor mais elevado (98,5%) para o cido hexanico a
superfcie so populares devido facilidade de execuo. Neste caso, 40 oC adotando relao molar cido:etanol de 1:1,3.132
a fora com a qual as clulas esto ligadas ao suporte varia de acordo Em 2003, Torres et al.,84 isolaram um total de 94 fungos endofti-
com o tipo de clulas e o tipo de suporte.110 Neste tipo de imobilizao cos a partir 27 amostras de plantas provenientes do Mediterrneo. Os
podem ocorrer interaes inicas ou adsortivas naturais, ou ligaes autores verificaram que 80% das cepas isoladas se mostraram como
covalentes entre grupos reativos do suporte e do biocatalisador.111 As potenciais fontes de lipase. Os miclios liofilizados destas cepas foram
clulas podem ser quimicamente ligadas a uma superfcie por uma va- submetidos esterificao para produo de oleato de isopropila e
riedade de mtodos que incluem a ligao cruzada com glutaraldedo, a cepa codificada como 10A foi a que apresentou melhor resultado,
90 Cortez et al. Quim. Nova

Tabela 1. Exemplos de imobilizao de fungos filamentosos

Mtodo de imobilizao Suporte Fungo filamentoso Referncia


Thermomucor indicae seudaticae
Bucha vegetal (Luffa cyllindrica) 117-118,121
Rhizopus oryzae
Aspergillus oryzae
Espuma de poliuretano 122-125
R. oryzae
Adsoro fsica
(Imobilizao in situ) Espuma de poliuretano revestida
R. oryzae 126
com carvo ativado
Esponja de ao inoxidvel Rhizopus nigricans 127
Tecido no tecido (PET/PE) R. oryzae 128
Mucor circinelloides
Polihidroxibutirato (PHB)
Adsoro fsica Penicillium citrinum 55
Celite
R. oryzae
M. circinelloides
Espuma de poliuretano - glutaraldedo 62,129
Ligao cruzada R. oryzae
Bucha vegetal (Luffa cyllindrica) - glutaraldedo R. oryzae 130
Alginato de clcio R. oryzae 131
Politetrafluoretileno (PTFE) Aspergillus terreus 120
Encapsulamento in situ
Quitosana-polivinilpirrolidona M. circinelloides
114-116
Criogel-PVA Mucor racemosus

sendo posteriormente identificada como Rhizopus oryzae. Visando Alta preferncia enantiomrica da lipase ligada ao miclio de
avaliar o potencial deste biocatalisador em reao de esterificao Aspergillus flavus permitiu o preparo de (R)-1-fenilacetato de etila
de cidos graxos, os autores verificaram que a atividade cataltica a partir da esterificao de rac-1-feniletanol (Figura 8). O produto
foi inversamente proporcional ao contedo de gua adicionada ao foi formado com um excesso enantiomrico (ee) de 94,6% em 24 h
meio reacional. Ainda foi verificado que a enzima se manteve ativa de reao a 40 oC e (S)-1-feniletanol permaneceu no meio reacional
em uma faixa de pH de 3,0 a 8,0, com atividade mxima entre 4,0 e com um valor de ee superior a 99%.133
7,0, alm de mostrar termoestabilidade, com mxima atuao 60 oC.
Recentemente, Zanotto et al.,85 isolaram fungos de plantas da Biodiesel
Regio Amaznica, Brasil, os quais foram avaliados como fontes de
lipase ligada ao miclio, visando aplicao em reaes de biotrans- O uso de lipase ligada ao miclio como biocatalisador na produo
formao. Neste estudo, foram isolados um total de 212 fungos, de biodiesel tem atrado considervel ateno, principalmente porque
sendo 77 fungos endofticos, 45 fungos fitopatognicos e 90 fungos evita o custo elevado de preparao da enzima purificada. O biodiesel
degradadores de madeira, extrados de fontes como sementes, frutas, produzido por meio da reao de transesterificao de triacilgliceris
hastes, folhas e razes. Aps seleo prvia, 64 fungos potencialmente (leos e gorduras) com lcool de cadeia curta (metanol ou etanol).
produtores de lipase foram submetidos reaes de sntese do olea- A transesterificao dos triacilgliceris (TGA) catalisada por lipase
to de pentila e linoleato de dodecila (Figura 5 A-C). Os resultados realizada em trs reaes sucessivas: TGA a diacilglicerol (DAG),
das reaes de esterificao e transesterificao em meio orgnico DAG a monoacilglicerol (MAG) e MAG em ster alqulico gerando
mostraram que as lipases ligadas ao miclio dos isolados UEA_001, glicerol como coproduto, sendo que cada etapa de reao libera uma
UEA_007 e UEA_115 foram capazes de sintetizar oleato de pentila, molcula de interesse (ster alqulicos). A clivagem enzimtica inicial
linoleato de dodecila e palmitato de etila, com rendimentos que do TAG para DAG pela lipase parece ser a etapa limitante das trs
variaram de 87 a 98%. reaes reversveis, porque a clivagem do DAG mais rpida que
Em seu estudo, Solarte et al.,133 reportaram que clulas ntegras a reao anterior. A migrao do grupo acila de 1,2-DAG para 1,3-
de uma cepa selvagem de Aspergillus flavus, permitiu o preparo de DAG e 2-MAG para 1-MAG, que precedem a reao, promovem um
laurato de etila, com rendimento de 96% (Figura 6A) e uma mistura rendimento elevado de biodiesel (Figura 9).134
de acrilato de 2-cloro-1-(cloro metil)etila e acrilato de 2,3-dicloro-1- As lipases sn-1,3-especficas, tais como Rhizopus oryzae,135 e
-propila, com rendimento similar ao encontrado quando utilizadas Mucor circinelloides,64 catalisam eficientemente a transesterificao
lipases comerciais (Figura 6B). do leo vegetal para steres de etila com rendimentos superiores a
90%. Este elevado rendimento de transesterificao enzimtica resulta
Resoluo cintica da migrao de resduos acila para posies especficas na molcula
de glicerol, pois mesmo sendo enzimas sn-1,3-especfica, estas li-
Os mesmos fungos isolados por Zanotto et al.,85 testados para pases so eficientes para clivar cidos graxos de TAG, nas posies
sntese de steres, foram avaliados na resoluo cintica do racemato sn-1,3 promovendo a migrao de resduos acila da posio sn-2
(R,S)-2-octanol, sendo verificado que as cepas UEA_053 e UEA_115 para posies terminais (sn-1 e sn-3) no glicerol.136 Por outro lado,
mostraram capacidades enantiosseletivas promissoras. Com o fungo a migrao de grupo acila pode ser influenciada pela polaridade do
UEA_053, foram obtidos valores de excessos enantiomricos eesubstrato solvente usado na reao de transesterificao. De acordo com Li et
de 22%, eeproduto de 99%, porcentagem de converso (c) de 18% e al.,134 a reduo da polaridade do solvente aumenta as constantes de
razo enantiomrica (E) superior a 200, enquanto utilizando clulas velocidade de migrao do grupo acila devido influncia favorvel
ntegras de UEA_115 os resultados obtidos foram 29%, 99%, 22% da disperso da carga sobre o estado de transio, conduzindo a
e superior a 200, respectivamente (Figura 7). rendimentos variados de biodiesel.
Vol. 40, No. 1 Potencial cataltico de lipases ligadas ao miclio de fungos filamentosos em processos de biotransformao 91

Figura 5. Reaes de (A) esterificao de cido oleico com n-pentanol e de (B) cido linoleico com dedocanol e (C) transesterificao de palmitato de p-ni-
trofenila com etanol, catalisadas por lipases ligadas ao miclio de fungos isolados da Regio Amaznica (Adaptado de Zanotto et al.,85)

crescente o nmero de trabalhos publicados na literatura a CONCLUSES


respeito da utilizao de clulas ntegras de fungos filamentosos imo-
bilizados na produo de biodiesel. Apesar da utilizao das clulas O uso de clulas ntegras de fungos filamentosos com atividade
ntegras reduzir as etapas de obteno do biocatalisador purificado, lipoltica ligada ao miclio vem despertando grande interesse de
acarretando reduo do custo final do produto, alguns inconvenientes investigao pelo seu potencial de uso na biotecnologia, pois sua
devem ser levados em considerao. As clulas ntegras possuem aplicao pode reduzir consideravelmente os custos de um processo
baixa estabilidade operacional em sistemas livres de solvente.137 enzimtico. Em especial, a utilizao de clulas ntegras imobilizadas
Alm disto, a imobilizao celular torna a sntese do biodiesel mais em suportes porosos de baixo custo como biocatalisadores em reaes
lenta do que no processo em que se emprega lipase purificada.138 de biotransformao tem revelado resultados promissores de rendi-
Neste aspecto, diversos estudos esto sendo realizados com o obje- mento em produto. A simplicidade da tcnica de imobilizao, que
tivo de promover a estabilidade operacional das clulas ntegras de se baseia na habilidade natural de adeso celular ao suporte durante
forma a reduzir a desativao da lipase ligada ao miclio, causada o crescimento, e a possibilidade de utilizao do biocatalisador em
pelo excesso de metanol no meio reacional, alm de propor novas processos contnuos, confere as clulas ntegras imobilizadas vanta-
estratgias de processo visando o aumento da eficincia de converso gens do ponto de vista comercial e industrial.
e ganhos em produtividade. A Tabela 2 apresenta alguns exemplos.
A grande maioria dos trabalhos publicados reporta o emprego de AGRADECIMENTOS
clulas ntegras de R. oryzae imobilizadas em partculas de espuma
de poliuretano. Este fato se deve a comprovada eficincia cataltica CAPES (Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de
da lipase deste fungo filamentoso juntamente com a simplicidade Ensino Superior) e ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento
operacional da tcnica de imobilizao. Entretanto, existem relatos de Cientfico e Tecnolgico), pelo apoio financeiro.
outros tipos de fungos filamentosos e de suportes tambm avaliados
para a produo de biodiesel.
92 Cortez et al. Quim. Nova

Figura 6. (A) Sntese de laurato de etila e (B) obteno de uma mistura de rgio-ismeros por clulas ntegras de Aspergillus flavus (Adaptado de Solarte et al.,133)

Figura 7. Resoluo de (R,S)-2-octanol com acetato de vinila, catalisadas por lipases ligadas ao miclio de fungos isolados da Regio Amaznica (Adaptado
de Zanotto et al.,85)

Figura 8. Resoluo cintica do rac-1-feniletanol por lipase ligada ao miclio de Aspergillus flavus (Adaptado de Solarte et al.,133)
Vol. 40, No. 1 Potencial cataltico de lipases ligadas ao miclio de fungos filamentosos em processos de biotransformao 93

Figura 9. Esquema da transesterificao de TGA catalisada por lipase 1,3-especfica com a migrao do grupo acila (Adaptado de Li et al.,134)

Tabela 2. Exemplos de produo de biodiesel por lipases ligada ao miclio de fungos filamentosos imobilizados

Fungo filamentoso Estratgia avaliada Resultado observado Referncia


Esterificao de cido graxo, com adio de solvente
Rendimento de 80%, aps 12 h de reao, mantendo
(n-hexano) e peneira molecular no meio reacional; 118
constante por dez ciclos
Reuso do biocatalisador
Previa degumao do leo e adio de solvente (n-
Rendimento de 78%, aps 73 h de reao 131
hexano) no meio reacional
Rendimentos superiores a 90%, com de decrscimo
Adio de lquido inico no meio reacional;
para aproximadamente 60% a partir do segundo 139
Reuso do biocatalisador
reciclo
Rhizopus oryzae
Uso de reator de leito empacotado, operado em modo
Converses mantidas em aproximadamente 80% por
batelada; 126
quatro ciclos consecutivos de aproximadamente 200 h
Alimentao peridica do agente acilante
Uso de reator de leito empacotado, operando em
modo contnuo; Converso de 92%, aps 72 h de reao 121
Alimentao gradual do agente acilante
Reao em duas etapas: hidrlise prvia do leo Rendimento em steres metlicos de 88,6%, aps 42
129
seguida da esterificao dos cidos graxos formados h, com reteno de 79% mesmo aps seis bateladas
Reator de leito fixo empacotado, operando em modo Estabilidade operacional por 25 dias, com ren-
contnuo; dimentos de reao de 93% e produtividade de 63
Adio de solvente (terc-butanol) ao meio reacional 3,5 mgsteres gbiocat-1 h-1
Mucor circinelloides
Os rendimentos mais elevados com leo de coco
Avaliao de diferentes leos vegetais no comestveis;
(97%) e de macaba (95%) cujos perfis de cidos 64
Reao em modo batelada e contnuo
graxos mostraram predominncia de cido lurico
Adio de solvente (terc-butanol) no meio de reao; Decrscimo na inativao da enzima, com obteno de
Aspergillus nominus 140
Reuso do biocatalisador 95,3% de rendimento em steres, aps 40 h de reao
Aspergillus niger Adio gradual do agente acilante Rendimento de 87% aps 72 h de reao 141

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