Instituto Politcnico Nacional

Escuela nacional de Ciencias Biolgicas

Laboratorio de Mtodos de Anlisis

Determinacin de la actividad de enzimas proteolticas.

Mtodo de kunitz

Profesora: Rosa Martha Cabrera Martnez

Alumna:
Mariana velazquez

Grupo: 4IM1 Semestre: 15/2 Seccin: 3

OBJETIVOS:

a) Elaborar una curva estndar de actividad enzimtica.

 b) Determinar la actividad proteoltica de la bromelana, la papana y otras
proteasas.

FUNDAMENTO:

El mtodo de kunitz se emplea para la determinacin de la actividad de las enzimas

proteolticas, el cual se basa en medir la cantidad de pptidos y aminocidos solubles
liberados durante la hidrlisis de la casena por protenas proteolticas (bromelana y
papana) aprovechando la capacidad, de ciertos de ellos y puedan absorber
selectivamente a 280 nm.

Diagrama de flujo:

Determinaci
n de la
actividad de
enzimas
proteolticas.
Mtodo de
Preparar una
serie de kunitz
tubos de la Preincubar
T1 y 1 0.04mg/ml siguente los tubos
de sol. de tripsina. manera: por 5
T2 y 2 0.08mg/ml minutos a
de sol. de tripsina. 35C
T3 y 3 0.12mg/ml
de sol. de tripsina.
T4 y 4 0.16mg/ml
de sol. de tripsina. Agreagar 1ml
T5 y 5 0.20mg/ml de solucin de
de sol. de tripsina. casena al 1%
en intervalos de
TI y I sol. de 1 minuto y
bromelaina 1:10 seguir
TII y II sol. de incubando por
bromelaina 1:20 20 minutos.
TIII y III sol. de Despues de los
papaina 20 minutos
concentrada Sacar del bao
agragar a los
TIV y IV sol. de tubos problema maria secar y
papaina 1:2 3 ml de TCA al dejar reposar
10% y agitar 30 minutos.
vigorosamente. Centrifugar a
2000 rpm por
minuto
durante 20
Agregar minutos.
tambien 3ml de
TCA y 1 ml de
caseina a los Detrminar en
tubos testigo. el
sobrenadant
e d elso
tubos los
valores de A
a 280 nm.
RESULTADOS:

Tabla 1. Actividad enzimtica de la tripsina.

Tubo Concentracin A 280 A280

de Tripsina Problema Testigo corregida
(mg/ml)
T1 y 1 0.04 0.232 0.098 0.134
T2 y 2 0.08 0.297 0.068 0.23
T3 y 3 0.12 0.368 0.115 0.253
T4 y 4 0.16 0.431 0.086 0.345
T5 y 5 0.20 0.492 0.071 0.421
PROBLEMAS
TI y I Bromelana 0.771 0.348 0.423
1:10
TII y II Bromelana 0.744 0.202 0.542
1:20
TIII y III Papana con. 0.712 0.632 0.08
TIV y IV Papana 1:2 0.386 0.336 0.05

Actividad enzimtica de la tripsina

0.45
0.4
f(x) = 1.72x + 0.07
0.35 R = 0.98
0.3
A(280nm) 0.25
0.2
0.15
0.1
0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2

[mg/ml]

Clculos para unidades trpticas:

Con la curva de actividad enzimtica se tiene la pendiente y se calcula

m 1.722
[UT]= 20
= =0.0861[UT ]/mg
20
1 mg----- 0.0861 UT

0.04 mg------ x= 3.444x10-3 UT

0.08 mg------ x= 6.888x10-3 UT

0.12 mg------ x= 0.010332 UT

0.16 mg------ x= 0.013776 UT

0.20 mg------ x= 0.01722 UT

Tabla 2. Curva de actividad enzimtica especifica para la digestin de casena

por tripsina.

Tubo Unidades A 280

trpticas corregida
1 0.00344 0.134
4
2 0.00688 0.23
8
3 0.01033 0.253
2
4 0.01377 0.345
6
5 0.01722 0.421

Curva de actividad enzimtica especifica para la digestin de casena por tripsina

0.45
0.4 f(x) = 20.01x + 0.07
0.35 R = 0.98

0.3
A(280nm) 0.25

0.2
0.15
0.1
0 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.02 0.02

[UT]

Clculos para determinar las unidades trpticas por gramo de enzima

Para bromelana con la ecuacin de la curva

Y= 20x + 0.069

0.423= 20x + 0.069

0.043 - 0.069/20= 0.0177 UT de bromelana

Para la dilucin:

0.0177 X 20= 0.354 UT/1ml

Por los ml originales:

0.354 X 36= 12.744 UT/ml

Por los 25g utilizados:

12.744/25= 0.5047 UT/g

Para la papana

0.08 0.069/20= 5.5x10-4

Por los ml utilizados:

5.5X10-4 X 34= 0.0187 UT/ml

Por los 25g utilizados:

0.0187/25= 7.48X10-4 UT/g

Preguntas adicionales

a) Defina actividad enzimtica y actividad especfica.

R:

Actividad Enzimtica: Es la cantidad de enzima que cataliza la conversin de

1 mol de sustrato por-minuto.
Actividad Enzimtica Especfica: Es el nmero de unidades de enzima por
mg de protena.

b) Escriba la clasificacin de las proteasas, en funcin de su

mecanismo de accin y diga en que grupo se ubican las
determinadas en la prctica.

R:
Endopeptidasas: son aquellas enzimas que hidrolizan los enlaces
peptdicos internos de una protena (tripsina y quimotripsina) dando
como resultado cadenas de pptidos.
 Exopeptidasas: actan sobre enlaces terminales de una protena
(aminopeptidasa y carboxipeptidasas). Basndose en su sitio de accin
sobre el N o el C terminal.

Aminopeptidasas: actan sobre el N libre terminal de la cadena

polipeptdica liberando un aminocido o un dipptido o tripptido.

Carboxipeptidasas actan sobre el C terminal de la cadena polipeptdica.

Se subdividen en cuatro subgrupos dependiendo de su mecanismo
cataltico y al grupo funcional presente en su sitio activo.

c) Para qu se agrego cistena en las muestras de pia, y papaya?

R: Para poder determinar la absorbancia especifica de nuestras
muestras problema ya que estn pueden llevar a cabo la reaccin con
algunas interferencias y asi no podemos determinar la actividad
especfica correcta.
d) Cul es la especificidad de enlace de la tripsina?
R: Enlaces adyacentes a lisina y arginina.
e) Cmo es que la tripsina no hidroliza las protenas del pncreas?
R: La tripsina es producida por el pncreas en forma de tripsinogeno
(enzima inactiva), y luego es activado en el duodeno por la
enteroquinasa intestinal a tripsina (enzima activa) mediante corte
proteoltico.

DISCUSIN:

Lo primero que podemos notar en nuestros resultados es que en nuestra tabla

1 nuestra absorbancia corregida para los tubos de bromelaina nos da
resultados errneos ya que en los tubos de dilucin de 1:20 nos da una
absorbancia mas grande que en la dilucin de 1:10 cuando debi de ser lo
contrario esto se puede deber a la forma de trabajo que se realizo por equipo
ya que todas las muestras fueron realizadas por grupo y esta problemtico no
se obtuvo con otro equipo.

Para nuestro calculo de unidades trpticas por gramo de muestra nuestra

papana no entro en los lmites de nuestras absorbancias, esto tal vez se puede
deber a que la papana presenta una buena actividad cuando el fruto se
encuentra no tan maduro y la que se trabajo estaba muy madura.

CONCLUSION:

Se elabor la curva de actividad enzimtica de la tripsina.

Determinamos la actividad proteoltica que son las unidades trpticas por
gramo de muestra de la papana y la bromelaina.

BIBLIOGRAFIA:
 Lehninger, L. Albert. (1991). Bioqumica. 2 Edicin. Editorial
Omega. Barcelona
Espaa. Pp. 195 206.

Badui Dergal, S. (2000). Qumica de los alimentos. Editorial

Pearson Educacin.
D.F. Mxico. Pp. 589 - 593.