Pontificia Universidad Catlica de Chile

Facultad de Ciencias Biolgicas

Departamento de Gentica Molecular y Microbiologa
Biologa de Microorganismos
BIO151E-2

Informe N1:
Procedimientos bsicos y
morfologa de Microorganismos

Nombre: Constanza Rojas

Profesor:Dra. Beatriz Diez
Instructor:Mara Estrella Alcamn
Ayudante: Toms
Fecha de Entrega: 26 de Octubre 2016
Introduccin
La microbiologa es el estudio de organismos microscpicos, incluyendo a los virus,
denominados microorganismos. Este grupo abarca una amplia y diversa gama de organismos
que pueden encontrarse aislados o asociados, formando colonias y habitando toda clase de
ambientes.[1] Se encuentran tanto dentro, fuera y sobre los organismos macroscpicos,
incluyendo adems los diversos ambientes de toda la Tierra. Influyen en todos los seres
vivos, y por esto su estudio es trascendental.
Este prctico se centra en bacterias, organismos procariontes unicelulares que pueden formar
colonias. Para su estudio es necesario cultivar las cepas in vitro, ya sea en tubos de ensayo o
cpsulas de petri. Los medios de cultivo pueden ser lquidos, semislidos o slidos, cuya
composicin puede tener variados nutrientes y sustancias, segn la cepa a cultivar. [2]
Los medios lquidos favorecen el desarrollo bacteriano de clulas estresadas. Los medios
slidos son tiles para el estudio de morfologa de colonias en superficie. Los medios
semislidos sirven para estudiar la motilidad de las bacterias, no solidifican a temperatura
ambiente.[2]
Los medios de cultivo tambin pueden clasificarse segn su utilidad prctica, dividindose en
medios corrientes o especiales. Los medios corrientes son apropiados para el cultivo y
mantencin de la mayora de las bacterias, mientras los medios especiales sirven para el
cultivo de bacterias muy exigentes nutricionalmente, o bien, para aislar y diagnosticar
bacterias de inters.[3]
Los medios utilizados en esta ocasin fueron principalmente 3: Agar Corriente, Agar Sangre
y Agar McConkey. El agar Sangre es en base a agar corriente enriquecido con 5-10% de
sangre, siendo til para el cultivo de bacterias nutricionalmente exigentes y para deteccin de
hemlisis. El agar McConkey es un medio selectivo y diferencial, que contiene sales biliares
y cristal violeta para inhibir el crecimiento de GRAM +, y lactosa para distinguir bacterias
que la fermentan, formando colonias rojas.[4]
Fueron utilizadas distintas bacterias, tanto GRAM + como GRAM-, diferenciadas
fundamentalmente por la composicin de su pared celular. Las GRAM+ son aquellas que
retienen la primera tincin cristal violeta tras la decoloracin, debido a la gran cantidad de
peptidoglicanos en su pared, vindose violeta. Por otro lado, las GRAM- pierden esta tincin
tras la decoloracin de alcohol-acetona, y se tien con safranina en la segunda tincin,
vindose fucsia.[5]
Otra tincin para distinguir tipos de bacterias es la de Ziehl-Neelsen, para evidenciar la
presencia de bacilos cido-alcohol resistentes[6]. Para la observacin de estructuras como la
cpsula, se requiere el uso de tinta china, y para observar esporas, se usa el colorante verde de
malaquita[7]
Para este prctico se utilizaron cepas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Bacillus
cereus, adems de muestras de diversas partes del cuerpo humano y del ambiente.
E.coli es una de las bacterias mejor caracterizadas por la microbiologa, debido su fcil
cultivo en laboratorio. Se reproducen muy rpidamente y puede crecer en un medio mnimo
que solo tenga glucosa y sales inorgnicas. Son Gramnegativo y residen naturalmente en el
tracto intestinal de seres humanos y de otros animales de sangre caliente. [8]. S. aureus es una
bacteria gram positivo y patognica, causante de neumona en humanos. Es anaerobia
facultativa y se encuentra en el tracto nasal, a pesar de que rara vez produce una infeccin
grave. Es identificable por hemlisis en agar sangre. [9] B. cereus es una bacteria gram
positivo anaerobio facultativa, se encuentra frecuentemente en el suelo, polvo, vegetales,
harinas, cereales, entre otros. Puede ser patgena para el ser humano, aunque slo bajo ciertas
condiciones.[10]
Para el cultivo es necesario adems, mantener el ambiente y las herramientas esterilizadas,
eliminando los microorganismos encontrados en las superficies. Esto se hace para evitar que
el cultivo se contamine de esporas de hongos, o esporas de otras bacterias. Puede hacerse
flameando las herramientas hasta que tomen un color rojo vivo, y la superficie de trabajo
siendo limpiada con alcohol para desnaturalizar las protenas de los microorganismos.[ Para
aislar una cepa de bacterias se utilizan diferentes tcnicas de siembra, tales como zigzag,
cuadrantes u ocho sectores. Para la posterior identificacin de estas se realizaron pruebas de
catalasa y coagulasa.

Objetivos:
- Conocer materiales, medios de cultivo, mtodos de siembra y aislamiento en
bacteriologa. Adquirir prctica con estos procedimientos y conocer sus utilidades.
- Conocer y aplicar diferentes tipos de tincin, para reconocer estructuras y tipos de
bacterias.
- Reconocer caractersticas macroscpicas y microscpicas que poseen las colonias de
bacterias.
- Familiarizarse con la diversidad de bacterias presentes en el ambiente, a travs de la
toma de muestras del entorno.
- Reconocer distintas especies de bacterias a travs de pruebas bioqumicas.

Materiales y Mtodos:
Los procedimientos para el prctico 1 fueron los indicados en la gua de trabajos
prcticos[12], salvo por la siembra de E. coli de medios lquido-lquido que no estaba
especificada en la gua.
Materiales:
Agar Corriente, en placa y tubo
- Agar Sangre, en placa y tubo
- Agar McConkey, en placa y tubo
- Asa microbiolgica
- Porta y cubreobjetos
- Microscopio ptico
- Coleccin en caja de 7 muestras
- Mechero Bunsen
- Cultivos de E. coli, B. cereus y S. aureus
Los procedimientos para el prctico N2 fueron aquellos descritos en la gua de trabajos
prcticos[13].

Materiales utilizados:
-Muestras sembradas en el laboratorio n1. - Azl de metileno
- Porta y cubreobjetos - Aceite de inmersin
- Cristal violeta - Microscopio ptico
- Lugol - Asa microbiolgica
- Alcohol acetona - Mechero Bunsen
- Safranina - Agua destilada
- Tinta china - Trulas estriles
- Fucsina -Agar Sangre, Corriente y McConkey
- Verde de malaquita
- Alcohol cido
Los procedimientos para el prctico N3 fueron aquellos descritos en la gua de trabajos
prcticos [14]. No se incluyen materiales utilizados para la preparacin del prctico N4.

Materiales utilizados:
- Cultivos del prctico N3
- Microscopio ptico
- Agua oxigenada
- Pipeta
- Reactivo ltex.
- Puntas de plstico
- Cristal violeta
- Lugol
- Alcohol-acetona
- Safranina
- Porta y cubreobjetos
Resultados
I. Prctico N1
Se analizaron las muestras microscpicas entregadas por los ayudantes de laboratorio, cuyas
observaciones estn indicadas a continuacin en la Tabla I.

Tabla I. Observaciones de muestras teidas.

Muestra Afinidad de Tincin Morfologa Agrupacin

N101 Gram positivos Bacilos Cadena

N102 Gram negativos Bacilos Cadena

N103 Gram positivos Coccos Cadena

N104 Gram positivos Coccos Racimo

N105 Gram negativos Cocobacilos sin agrupacin.

N106 - Redondas Sin agrupacin.

N107 Verde de malaquita - Tincin de Bacilos. Espora Sin agrupacin

Esporas circular.

N108 Tinta China - Cpsula no teida Bacilos Racimo

La muestra N106 corresponde a levadura, por lo que no tiene caractersticas atribuibles de bacteria.

Se realizaron adems, siembras de E. coli, S. aureus y B. cereus, tanto desde medio lquido a
slido como de slido a slido y de slido a lquido. Se usaron tanto tubos de ensayo como
cpsulas de petri con agar sangre, corriente y McConkey. Los medios y observaciones de los
tubos y cpsula se realizaron en el siguiente prctico y presentan a continuacin en las tablas
II y III respectivamente.

II. Prctico N2.

Tabla II.Observaciones macroscpicas y medios de cultivo de bacterias en tubos de ensayo.

Medios S. aureus E. coli B. cereus

Lquido a slido colonias puntiformes Colonias -
Slido a slido - Colonias indefinidas Formacin de colonias
Slido a Lquido precipitado - precipitado
Lquido a Lquido - precipitado -
Los medios slidos corresponden a agar corriente. Los guiones indican que no se realiz siembra.
 Tabla III. Observaciones macroscpicas de siembras en cpsulas de petri.

Tipo de y cepas Forma Borde Elevacin Superficie Caract. fsicas

medio

E. coli puntiforme lobulado convexa rugosa cerea, sin color, opaca

Agar corriente S. aureus puntiforme ondulado plana rugosa cerea, sin color, opaca.

B. cereus puntiforme ondulado plana rugosa cerea, sin color, opaca

E. coli puntiforme lobulado convexa rugosa cerea, sin color, opaca.

Hemlisis gama

Agar sangre S. aureus puntiforme ondulado plana rugosa cerea, sin color, opaca.
Hemlisis alfa

B. cereus puntiforme ondulado plana rugosa cerea, sin color, opaca.

Hemlisis beta.

Agar E. coli puntiforme ondulado convexa rugosa cerea, fucsia, opaca.

McConkey S. aureus - - - - -

B. cereus - - - - -
Simbologa: Los guiones indican que no hubo crecimiento.

Se realizaron tinciones gram a muestras de las colonias de cada cepa y se observaron al

microscopio. Las observaciones se presentan a continuacin en la tabla 4.

Tabla IV. Observaciones microscpicas de las tres cepas sembradas.

Cepa Tincin Gram Forma Agrupacin

E. coli gram negativo cocobacilos sin agrupacin

S. aureus gram positivo coccos racimos

B. cereus gram positivo bacilos cadena

Se realizaron siembras de frotis de faringe, zona nasal y otras partes del cuerpo y el entorno.
Las observaciones de las colonias se realizaron en el prctico 3 y se sealan a continuacin en
las tablas V y VI.
 III. Prctico N3

Tabla V. Observaciones macroscpicas de colonias de frotis corporales y ambientales.

Muestra Tipo de Agar Caract. fsicas colonias Observaciones

Inodoro de Agar Sangre Colonias blancas circulares Crecimiento de

hombres y puntiformes. Colonias hongo. Hemlisis
amarillas y beige, gama.

Pantalla de Colonia caf-verdosa, Crecimiento de hongo

iPad colonias rojas y blancas. peludo.

Nasal 1 Agar Sangre Colonias puntiformes Las colonias de color

blancas transparente y blanco intenso eran
blancas intensas circulares. ms abundantes.

Nasal 2 Agar Corriente Colonia blanca-crema. -

Dedo de pie Agar McConkey Colonia rojo brillante. Hongos blancos

peludos.

Lentes Agar McConkey nada. -

Nasal 3 Agar Sangre Colonia amarilla plida, -

colonia blanca, colonia
naranja.

Nasal 4 Agar Corriente Colonia amarilla plida, -

colonia amarilla convexa.

Microondas Agar Sangre Colonias blanco-crema Crecimiento hongo

irregular, colonia amarilla blanco
plida, colonia amarilla
umbilical.

Ombligo Agar McConkey - -

Oreja Agar McConkey - Hongo amarillo con

relieve.

Saliva 1 Agar Sangre colonia amarilla plida, La colonia amarilla

colonia amarilla intensa intensa es ms grande.

Saliva 2 Agar corriente. Colonia semitransparente, -

colonia amarilla-blanca,
colonia amarilla-naranja
Los guiones indican que no hubo crecimiento de colonias u observaciones.

Se realizaron tinciones gram a las muestras de faringe y una ambiental. Adems se le

realizaron pruebas bioqumicas a las colonias de faringe.
Tabla VI. Observaciones macroscpicas y microscpicas pruebas bioqumicas de frotis de faringe y
ambientales.

Muestra Caract. fsicas colonias Hemlisis Tincin Pruebas bioqumicas y

observaciones

Faringe 1 Colonia puntiforme Beta Gram + Catalasa negativo.

transparente.

Faringe 2 Colonia circular blanca, Alfa Gram + *Colonia pequea:

colonias puntiformes Catalasa - .
transparentes pequeas y *Colonia grande:
medianas. catalasa +, coagulasa -.

Inodoro -Colonia oscura: Gram - cocobacilo

hombres. -Blanca: Gama Gram + staphylococco
- Amarilla: Gram + staphylococco

Discusin
En el prctico N1 se analizaron caractersticas microscpicas de diversas muestras (Tabla I),
las cuales presentaron diversas afinidades a la tincin Gram. Esto se debe a las propiedades
de sus paredes celulares, las cuales, dependiendo del grosor y cantidad de peptidoglicanos,
podrn retener o no la tincin Gram. La tincin Gram consiste primeramente en fijar las
bacterias con alcohol, para luego baar la muestra con la tincin Cristal Violeta, cuyos
trifenilmetanos se unen a las paredes celulares con peptidoglicanos.[15] Posteriormente, se
aplica el mordiente Lugol, cuya presencia de yodo forma un complejo insoluble en agua.
Luego, se realiza una decoloracin con un solvente orgnico, en este caso alcohol-acetona,
que solubiliza el complejo formado anteriormente. Finalmente, se utiliza una tincin de
contraste como Safranina. Las gram+ aparecern con color violeta, debido a que su pared
gruesa de peptidoglicanos dificulta el paso del alcohol, y no pierde su tincin, mientras las
gram- pierden por completo la tincin y se tien posteriormente con safranina. [16] Las
agrupaciones formadas contribuyen a una mejor supervivencia de la colonia.

Se observaron adems muestras de tincin de esporas y de cpsula, las cuales posteriormente

fueron realizadas en laboratorio. Para la tincin de esporas se realiz la tincin
Schaeffer-Fulton, la cual utiliza el colorante verde de malaquita que tie las esporas de color
verde, mientras el resto de la clula se tie de color fucsia con el colorante de contraste
safranina.[17] Por otro lado, para la observacin de cpsula se realiz una tincin negativa,
en la cual los grnulos finos de la tinta china favorecen un fondo opaco, resaltando las
cpsulas, que no permiten el paso de la tinta al interior de la bacteria. [18]

Para la siembra de las tres principales cepas utilizadas en el prctico, se mantuvo la llama del
mechero prendida y cercana a la siembra, para evitar contaminacin.
La cepa E. coli se desarroll con xito en todos los medios, tanto en lquidos como en slidos
y en todos los tipos de agar.(Tablas II y III). Esto se debe a que, como fue mencionado en la
introduccin, es de fcil cultivo y no tiene mayores exigencias. Las caractersticas fsicas
coinciden con las halladas en la bibliografa consultada. [19] (Tabla III). En agar McConkey,
present un color fucsia caracterstico de una fermentacin de lactosa [20].

La cepa S. aureus fue capaz de desarrollarse tanto en agar corriente como el agar sangre, sin
embargo, la composicin del agar McConkey mencionada en la introduccin, impidi el
desarrollo de esta cepa por ser Gram +. Sus caractersticas fsicas coinciden con la
bibliografa consultada, salvo por la coloracin amarilla[21], y produjo alfa-hemlisis, (Tabla
III) indicando que es capaz de romper los glbulos y ocupar los nutrientes con mayor xito de
lo que se indica en bibliografa, ya que generalmente se encuentra beta-hemlisis.

La cepa B. cereus, al igual que S. aureus, no logr crecer en agar McConkey por ser gram
positiva. Su agrupacin en forma de cadena (Tabla IV) es propio de su gnero Bacillus. [22]
Produjo hemlisis beta, denotando su capacidad de romper globulosas.

En el prctico N3 se evidenci la amplia diversidad de bacterias presentes en zonas

cotidianas de nuestro entorno, siendo la muestra de microondas una de las ms diversas y
abundantes en bacterias (Tabla V). Esto puede deberse a la gran cantidad de restos de
alimento presente. Por otro lado, zonas de la piel expuesta como ombligo y oreja no parecen
tener presencia de bacterias Gram -, ya que en agar McConkey no hubo crecimiento. Por otro
lado, la presencia de crecimiento de hongos puede deberse a la comn presencia de esporas
en el ambiente.

Las muestras de Faringe fueron sometidas a pruebas bioqumicas y tincin gram, para
distinguir las especies presentes. (Tabla VI). La prueba de catalasa consiste en determinar si
la bacteria produce o no esta enzima, cuya funcin es catalizar la reduccin de perxido de
hidrgeno, resultando como producto Agua y O2. De esta forma, se aplica agua oxigenada a
un inculo de cultivo, y se observa y hay presencia de burbujas correspondientes a O2 en
caso de ser catalasa positiva. [23] Otra prueba bioqumica utilizada fue la de coagulasa,
enzima cuya funcin es convertir fibringeno en fibrina. La prueba consiste en aplicar un
factor de agrupamiento, partculas con anticuerpo especfico para aglutinar bacterias con el
antgeno de coagulasa fija. [24]
Los resultados de estas pruebas indicaron que en faringe 1 nos encontrbamos en presencia
de una bacteria gram + y catalasa -. Esto indica la probable presencia de Streptococcus, la
cual est presente en la zona faringea y se descarta presencia de Staphylococcus, que son
catalasa +. . En faringe 2, la colonia color blanco result gram +, catalasa + y coagulasa -,
estando probablemente en presencia de alguna especie de Staphylococcus coagulasa -,
descartando la presencia de Staphylococcus aureus. [25]
Conclusiones
La gran cantidad de siembras realizadas permiti el conocimiento, familiarizacin y prctica
de cultivo de bacterias, pudiendo reconocer la amplia diversidad de estas frente a la
diferencia de su crecimiento en los medios de cultivo, tanto segn su metabolismo, como sus
variadas caractersticas fsicas en colonia.
Los distintos medios de cultivo permitieron diferenciar y reconocer bacterias, entendiendo su
utilidad y manejo, sobretodo el agar McConkey, sumamente diferencial y selectivo.
La aplicacin de tinciones fue fundamental para la distincin de bacterias, divindolas en dos
grandes grupos segn gram, y adems favoreciendo la observacin en detalle de estructuras
con tinciones como la tinta china y verde de malaquita.
La observacin microscpica de colonias permiti el reconocimiento de gneros de bacterias
y su abundancia. Por otro lado, la descripcin macroscpica de colonias permite un mejor
estudio de la cepa, sirviendo adems para distinguir su metabolismo dependiendo del medio.
Las muestras recogidas del entorno cotidiano permitieron abrir la percepcin de la vida
diaria, comprobando la abundancia y diversidad de microorganismos en nuestro propio
cuerpo humano y entorno, comprendiendo an ms la influencia sobre todos los seres vivos.
Finalmente, las pruebas bioqumicas realizadas fueron un mtodo eficiente para detectar
presencia de una especie sobre otra.
Referencias
[1] Brock: Biologa de Microorganismos, Madigan, Michael T. ;Martinko, John M.; Parker,
Jack., 10. ed., 2004, Espaa. Captulo 1.1
[2] Referencia 1. Captulo 5.
[3] Microbiologa Clnica Aplicada, P. Garca Martos; M.T. Fernandez del Barrio; F-
Paredes Salido, 3 Edicin, 1997. Cap.4, pg. 28.
[4] Introduccin a la microbiologa , Vera Garca, 2edicin. Pag 61.
[5] Microbiologa . Roger Y. Stanier; Julio R. Villanueva, 2Edicin, 1992. Cap 6, pg
155.
[6]Microbiologa Clnica Prctica, Fernando Paredes Salido, 2edicion, pag 43.
[7] Bacteriologa General: Principios Y Prcticas de Laboratorio, Evellyn Rodriguez
Cavallini. pag 75.
[8]Gentica: Un enfoque conceptual, Benjamin A. Pierce, 3 Edicin, Editorial Mdica
Panamericana, 2009. Captulo 8, pg 216.
[9] Microbiologa Clnica, Guillem Prats, 1Edicin, 2005. Pg. 35-36.
[10] Microbiologa Alimentaria: Metodologa Analtica para Alimentos y Bebidas, Mara
del Rosario; Pascual Anderson, 2Edicin, 2000, Espaa. Captulo 11, pg. 93.
[11] Gua de trabajos prcticos. Bio 151E. Pontificia Universidad Catlica de Chile, 2016.
pg 19
[12]Ref 11. pag 34.
[13]Ref 11 pag 48
[14]Ref 11 pag 57.
[15] Diagnstico Microbiolgico , Elmer W. Koneman,Stephen Allen , 6 Edicin, 2006.
Cap 1 pg 20.
[16] Bioqumica Humana: Curso bsico , Jos M. Macarulla,Flix M. Goi , 2Edicin,
1994. Cap 8, pg 161
[17] Ref. 15, pg 755.
[18] Ref 15. pg 18.
[19] Ref. 15 pg. 36
[20] Ref 15. pg 269-270.
[21] Ref 15. pag 257.
[22] Ref 15 pag 744.
[23] Ref 7. . Pag 217
[24] Ref 23. pg 227.
[25] Ref 9 pag 36.