CUESTIONARIO PARA ESTUDIAR BIOQUMICA

2 Parcial:
Protenas Parte II y Enzimas

1. Qu mtodo espectrofotomtrico usaras para determinar protenas

totales en suero sanguneo?

A travs del mtodo colorimtrico de Biuret, entre ms oscura la coloracin de

la muestra, mayor ser la concentracin de protenas, leyendo las
absorbancias en un espectrofotmetro.

Este mtodo se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu 2+ y

los grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu 2+ se acompleja
con 4 NH. La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la
cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica,
de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy
baja y slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados
muy concentrados (por ejemplo en suero).

2. Qu mtodo colorimtrico usaras t para medir la cantidad de

protena cuya concentracin es menor a 20 g/ml

El mtodo de Lowry, ya que es sensible a cantidades bajas.

El mtodo de Lowry (1951) es un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa

de las protenas. A la muestra se aade un reactivo que forma un complejo
coloreado con las protenas, siendo la intensidad de color proporcional a la
concentracin de protenas, segn la ley de Lambert-Beer A= .l.c
Este mtodo consta de dos etapas:
1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas formando complejos
con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos complejos Cu2+-
protena tienen un color azul claro. Adems, provocan el desdoblamiento de la
estructura tridimensional de la protena, exponindose los residuos fenlicos de
tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reaccin. El Cu2+ se
mantiene en solucin alcalina en forma de su complejo con tartrato.
2) La reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los
grupos fenlicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayora de las
protenas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del
reactivo de Folin-Ciocalteau es el cido fosfomolibdotngstico, de color amarillo,
que al ser reducido por los grupos fenolicos da lugar a un complejo de color azul
intenso.
3. Dibuja la curva de saturacin que se obtiene con una enzima
A) Michaeliana.

La ecuacin que relaciona la concentracin del sustrato, la velocidad inicial, la

Km y la Vmx, es conocida como ecuacin de Michaelis-Menten. Las enzimas
cuya cintica obedece dicha ecuacin se denominan enzimas Michaelianas.

Figura 1.0 ejemplo de una curva Michaelis-Menten.

B) Alostrica.

Las enzimas alostricas normalmente tienen mltiples sitios activos y a

menudo muestran cooperatividad, esto es, que la unin de un sustrato a un
sitio activo aumenta la capacidad de otros sitios activos para unir y procesar
sustratos.

Ilustracin 1 CURVA ALOSTERICA

 Figura ejemplo de una curva Alostrica.

*Hiperblica (comportamiento cintico Michaeliano)

*Sigmoidea (comportamiento cintico Alostrico)

Figura cinticas Michaeliana (Mioglobina) y alostrica (hemoglobina).

4. Dibuja las grficas de Lineweaver-Burk de una enzima en presencia y
ausencia de inhibidores:

A) competitivo

B) no competitivo
C) acompetitivo

5. Si la Hexokinasa (HK) tiene una Km de 0.05 M por glucosa y la

Glucokinasa de 1 mM, cul de las dos tiene mayor afinidad por ese
sustrato?

La Hexokinasa (HK) tiene una Km de 0.05 M, ya que los valores pequeos de

Km tienden a tener mayor afinidad por su sustrato.

La Km nos da una idea la afinidad que tiene el enzima por su sustrato, cuanto
mayor es Km menor es la afinidad (predominan las formas E y S libres), cuanto
menor es Km mayor es la afinidad (predomina la forma ES).

6. Porqu en presencia de un inhibidor competitivo no puede

encontrarse el complejo ESI (Enzima-Sustrato-Inhibidor).

En la Inhibicin competitiva, el sustrato y el inhibidor compiten por la enzima

libre, pudiendo unirse uno o el otro, pero no ambos simultneamente, hay una
interaccin mutuamente excluyente del sustrato y de Inhibidor con la enzima.
La unin de Enzima a Inhibidor conduce a la formacin de un complejo no
productivo.
7. Identifica el tipo de enzima (hidrolasa, liasa, etc.) segn la reaccin
que cataliza cada una:

Enzima Reaccin
1 Hexokinasa glucosa + ATP glucosa 6-P + ADP
2 Fosfogluco glucosa 6-P fructosa 6-P
Isomerasa
3 Aldolasa fructosa 1,6 bis-P gliceraldehido 3-P +
dihidroxiacetona-P
4 Piruvato piruvato + NADH lactato + NAD+
Deshidrogenasa
5 Piruvato Kinasa fosfoenol piruvato + ADP piruvato + ATP
6 Ureasa urea + H2O CO2 + NH3
7 Piruvato piruvato + CO2 + ATP oxaloacetato +
Carboxilasa ADP + Pi
(nota: -P = fosfato; Pi = fsforo inorgnico)

ENZIMA TIPO DE EZIMA

1 Hexokinasa Ligasa
Formacin de enlaces C-C, C-S, C-O y C-N
mediante reacciones de condensacin acopladas a
la rotura de ATP o a un cofactor similar.
2 Fosfogluco Isomerasa
Isomerasa Transferencia de grupos dentro de molculas
dando formas isomtricas.

3 Aldolasa Liasa
Adicin de grupos a dobles enlaces, o formacin
de dobles enlaces por eliminacin de grupos.

4 Piruvato Oxido reductasa.

Deshidrogenas Transferencia de electrones (iones hidruro o
a tomos de hidrgeno).
5 Piruvato Kinasa Ligasas
Formacin de enlaces C-C, C-S, C-O y C-N
mediante reacciones de condensacin acopladas a
la rotura de ATP o a un cofactor similar.
6 Ureasa Hidrolasa.
Reacciones de hidrolisis (transferencia de grupos
funcionales al agua).

7 Piruvato Ligasas
Carboxilasa Formacin de enlaces C-C, C-S, C-O y C-N
 mediante reacciones de condensacin acopladas a
la rotura de ATP o a un cofactor similar.

8. El sefadex G 75 tiene un lmite de exclusin molecular de 50 000 y un

lmite de separacin entre 1000 y 50,000; en cambio la resina
Sephadex G 100 presenta lmite de exclusin 100,000 y de separacin
de 5,000 a 150,000. Cul es ms conveniente para aislar una protena
cuyo peso molecular es de 30,000. Porqu?.

El gel G 75 por que sus rangos abarcan pesos moleculares de 3 000 - 80 000 y
en este caso la protena a utilizar tiene un peso molecular de 30 000, por lo que
entra en los rangos establecidos.

Sephadex es una marca registrada de gel dextrano que se usa en laboratorio para
la tcnica de filtracin en gel y cromatografa. Las molculas de dextrano estn
unidas entre s con enlaces cruzados. Variando estos enlaces, se ven alteradas
las propiedades del gel.

9. En una cromatografa de exclusin molecular cul es el orden de

elucin de las molculas segn su tamao (chicas, medianas,
grandes). Porqu?.

Las molculas se separan en funcin de su tamao, eluyendo en orden

decreciente del peso molecular.

Las molculas ms pequeas an, entrarn en los intersticios de las esferas y

todava estarn ms retardadas que las anteriores que slo tenan que
rodearlas. Al final, saldrn primero con el volumen inicial (o el volumen que
ocupan los intersticios entre las esferas) las molculas de mayor tamao,
posteriormente saldrn las de tamao intermedio, y con el volumen total del
lquido contenido en el lecho cromatogrfico saldr la molcula ms pequea .

10. La ley de Lambert-Beer establece que la concentracin de una

sustancia es directamente proporcional a la absorcin de luz por una
solucin de dicha molcula. Cundo esto no se cumple?

La ley de Beer es una ley lmite, no se cumple para todas las concentraciones,
se cumple slo en un rango determinado de concentraciones, dentro de ese
rango es donde hay que trabajar.
Se trabaja en el rango de concentracin donde hay una linealidad cuando
trabajamos con concentraciones elevadas se procede a la dilucin de la
muestra hasta que queda dentro del rango donde se cumple la ley de Beer.
 BIBLIOGRAFA

Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal
Biochem. 72: 248-254.

Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, Klenk DC (1985): Measurement of protein
using bicinchoninic acid. Anal Biochem 150: 76-85.

Suelter CH (1985): A Practical guide to enzymology, Editorial, John Wiley & Sons,
New York.

O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr y R.J. Randall. J. Biol. Chem. 193: 265-
275 (1951)