0141 BIOQUMICA EXPERIMENTAL Seccin 3. ACTIVIDAD ENZIMTICA
ACTIVIDAD ENZIMTICA
3. ACTIVIDAD ENZIMTICA
PARTE I: CURVAS TEMPORALES DE ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA LACTATO
DESHIDROGENASA DE MSCULO ESQUELTICO DE BOVINO.
Objetivos
- Conocer las caractersticas generales de las enzimas como catalizadores biolgicos.
- Adquirir la habilidad para medir la actividad de una enzima utilizando un mtodo
espectrofotomtrico.
- Relacionar los distintos parmetros asociados a la medicin de la actividad enzimtica que
permiten seguir y evaluar la purificacin de una enzima (actividad especfica, rendimiento y
enriquecimiento).
Introduccin
Las enzimas son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de una reaccin y no se
consumen o modifican durante sta. Sin su presencia, muchas de las reacciones bioqumicas celulares
no podran proceder a la velocidad requerida. El incremento en la velocidad de la reaccin se encuentra
entre 106 a 1012 veces con respecto a la reaccin en ausencia del catalizador. Otra propiedad de las
enzimas es su alto grado de especificidad; solamente catalizan la reaccin en la que participa un
sustrato (especificidad absoluta) o un grupo de sustratos con ciertas caractersticas qumicas y
geomtricas comunes (especificidad de grupo).
La enzima, al ser una protena, tiene una estructura geomtrica caracterstica y la porcin de la enzima
que especficamente une o reacciona con el sustrato se denomina centro cataltico o sitio activo.
Para muchas enzimas sus residuos de aminocidos son suficientes para efectuar la catlisis, para otras
es necesario que exista un cofactor, ya que en ausencia de ste no se cataliza la reaccin. El cofactor
es un in metlico como el Fe2+, Zn2+, Mo2+. Para otras reacciones se necesita una coenzima, es decir
una molcula orgnica con caractersticas no proteicas, que generalmente se sintetiza a partir de
vitaminas. La coenzima funciona como un cosustrato cuando se une transitoriamente al sitio activo de la
enzima, de tal forma que se libera al medio durante cada ciclo cataltico. ste es el caso de las
deshidrogenasas que trabajan con el NAD+, como la enzima que nos ocupar en sta seccin
experimental. Cuando la coenzima se une fuertemente a la enzima, ya sea por medio de enlaces
covalentes o interacciones no covalentes, se le da el nombre de grupo prosttico.
Diseo de un ensayo enzimtico
Durante el aislamiento y purificacin de una enzima, es necesario realizar un ensayo para determinar la
cantidad y pureza de la enzima, as como evaluar las caractersticas cinticas de la enzima. Para el
diseo de un ensayo enzimtico se requiere conocer la reaccin que se analiza, es decir: A) cuales son
las especies que se requieren (sustrato, la o las coenzimas, el o los cofactores, entre otros); B) la
estequiometra completa, y C) los efectos del pH, temperatura y fuerza inica sobre la actividad de la
enzima.
Adicionalmente a lo anterior, debe de estar disponible un mtodo para identificar y monitorear cualquier
cambio fsico, qumico o biolgico que ocurre durante la conversin del sustrato a producto. Se pueden
utilizar distintas tcnicas para determinar los cambios en las concentraciones de sustrato o producto
como la espectrofotometra, la fluorometra, la titulacin cido-base y el conteo radiactivo. La eleccin El ensayo de actividad est basado en la deteccin del cambio de absorcin del NADH y el NAD+. El
de alguna de ellas depende esencialmente de las caractersticas estructurales del sustrato y/o producto,
as como de la qumica de la reaccin.
1 2
0141 BIOQUMICA EXPERIMENTAL Seccin 3.
Si un ensayo enzimtico involucra el seguimiento de la concentracin del sustrato o producto durante
un intervalo de tiempo, el ensayo se denomina cintico. Por otro lado, cuando se realiza la
determinacin de la concentracin del sustrato o producto a un solo tiempo, se denomina ensayo a
tiempo fijo. En lo posible se recomienda realizar ensayos temporales de reaccin, ya que cualquier
desviacin de la linealidad puede detectarse inmediatamente. Los cambios en la linealidad de la
reaccin pueden deberse a una o varias causas, el decremento en la concentracin de sustrato, la
desnaturalizacin de la enzima y a la inhibicin causada por el producto de la reaccin. Pero, hay que
aclarar que la velocidad inicial de una reaccin ocurre en los primeros minutos de la reaccin, una
relacin lineal que se mantiene cuando el consumo de sustrato no va ms all del 5% de la
concentracin inicial. Por tanto, cuando se realiza un estudio sobre la actividad enzimtica, es
fundamental que las velocidades que se obtengan sean las iniciales.
Lactato deshidrogenasa de mamfero.
El nombre cientfico de la lactato deshidrogenasa o LDH es L-lactato: NAD+ oxidoreductasa (EC
1.1.1.27). Es una enzima importante en el metabolismo anaerobio de la glucosa para la regeneracin
del ATP. La actividad de la LDH es alta durante la actividad fsica intensa, cuando la tensin de oxgeno
disminuye y la demanda de ATP es alta. Bajo condiciones aerobias, la enzima cataliza de manera
reversible la conversin de lactato a piruvato (Figura 3.1). Pero lo contrario ocurre cuando disminuye el
O2 celular o bien el pH es cercano a 7.0, entonces el piruvato es convertido a lactato con la
concomitante conversin de NADH a NAD+. La regeneracin del NAD+ permite que el flujo de la va
glucoltica contine. La actividad de la enzima decrece en el sentido de Piruvato Lactato cuando la
demanda de energa cesa o hasta que los niveles de lactato llegan a ser altos e intolerables.
Figura 3.1. Reaccin que cataliza la lactato deshidrogenasa. La reduccin del piruvato para formar lactato es reversible y
dependiente de la presencia de una coenzima.
La LDH es un tetrmero de subunidades con un peso molecular de 35 kDa cada una. Hay dos tipos de
subunidades, la H que predomina en el corazn y la M que predomina en el msculo y el hgado. Las
subunidades se pueden asociar formando 5 tipos de tetrmeros con estequiometras distintas: H4,
H3M1, H2M2, H1M3 y M4. Todos estos tienen actividad de LDH, pero tienen diferentes afinidades por
el lactato o el piruvato. Las enzimas que catalizan la misma reaccin pero difieren en su estructura son
llamadas isoenzimas.
En la prctica se determinar la actividad de la LDH de msculo esqueltico de bovino, enzima que
contiene casi exclusivamente subunidades M, esto es la isoenzima M4. En est parte del protocolo se
medir a diferentes tiempos la reaccin en el sentido de Piruvato Lactato, utilizando como fuente de
enzima las fracciones que fueron obtenidas durante el protocolo de purificacin de la LDH de la seccin
II del manual.
NADH es una molcula que absorbe a 340 nm, mientras que el NAD+ no. Entonces, la actividad de la
enzima en las muestras se detectar como una disminucin en la absorbancia a 340 nm, debido a que
en la reaccin el NADH es convertido a su forma oxidada, el NAD+.
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4. Todas las celdas se mantienen en el hielo. Despus adicionar a una de la celdas 50 L de 4 mM
Material biolgico. NADH e inmediatamente agregar 10 L de la muestra de enzima diluida.
Fraccin 1 5. Se tapa la celda con parafilm y se agita por inversin dos veces y se lee inmediatamente la
Fraccin 2 absorbancia a una longitud de onda de 340 nm. Consideraciones: si la absorbancia inicial es
Fraccin 3 menor de 0.4 es posible que la actividad de la enzima sea muy alta, por lo que se recomienda
Fraccin PA repetir el ensayo en una de las celdas ya preparadas y hacer una dilucin mayor de la enzima, si
Fraccin PB no hay cambio en la absorbancia entonces diluir menos la muestra.
6. Los valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.1). El
Material y equipo ensayo de actividad se realizar a temperatura ambiente, por lo que una vez adicionada la
Celdas de plstico enzima hay que mantener la celda dentro del espectrofotmetro.
Tubos de microfuga
Parafilm Tabla 3.1. Lecturas de absorbancia de las fracciones obtenidas de la purificacin de protenas
1 Recipiente para hielo Tiempo (min) F3 F__ F___ F____ F____
1 Micropipeta de 200-1000 L Dilucin Dilucin Dilucin Dilucin Dilucin
1 Micropipeta de 20-200 L
1 Micropipeta de 2-10 L
1 caja de puntas de 1000 L para micropipeta 0.5
1 caja de puntas de 200 L para micropipeta
1.0
1 Vrtex
Espectrofotmetro (por grupo) 1.5
2.0
Reactivos
1 M Amortiguador de fosfatos pH 7.0 2.5
10 mM Piruvato de sodio 3.0
4 mM NADH. Reactivo que debe de disolverse justo antes de usarlo, puede usarse el
3.5
amortiguador de fosfatos para su disolucin. Verificar que la absorbancia a 340 nm sea mayor de
1.0, si no es as volver a pesar y medir. 4.0
4.5
Desarrollo experimental.
5.0
Curvas temporales de actividad de lactato deshidrogenasa.
Se sugiere que todos los equipos midan primero la curva temporal de actividad a la fraccin 3, que es la
fraccin que usarn para obtener los parmetros cinticos de la enzima. Para obtener las curvas de
actividad determinarn la dilucin ptima de enzima para realizar los ensayos. Una vez que concluyan pendiente
con esa fraccin y dependiendo del tiempo que hayan consumido de la sesin, realizar posteriormente Actividad
las curvas temporales de actividad a la fraccin 1 y/o la fraccin purificada A o B.
(mmolmin-1mg-1)
Las mezclas de reaccin se realizarn directamente en las celdas de plstico. Se usar agua para
ajustar a 0 el espectrofotmetro. 7. Realizar una grfica de Absorbancia vs Tiempo (minutos) para cada una de las diluciones de
cada una de las fracciones y obtener la pendiente de la recta.
1. Descongelar la protena y mantenerla a 4C en un recipiente con hielo. Hacer una primera 8. Para calcular la actividad de la enzima se utiliza la siguiente ecuacin:
dilucin de la fraccin 3, se recomienda 1:10.
2. Se etiquetan 5 celdas. Abs
3. A cada una de las celdas se les aadirn los siguientes componentes: m * Vol. ensayo (mL ) * F
Actividad = min = mmol min 1 mg 1
515 L 100 mM Amortiguador de fosfatos
29.3 L 10 mM Piruvato
( )
M cm 1 * b (cm ) * mg protena
1

210.7 L H2O
donde:
m: es la pendiente de la recta (Abs/t) en unidades de abs / min
: es el coeficiente de extincin molecular para el NADH, 6.22 x 103 M-1 cm-1.
3 4
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b: es la distancia de la celda, que corresponde a 1 cm Devlin TM. 1992. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Ed. Wiley- Liss, pp. 135-190.
Vensayo: es el volumen total del ensayo. Localizacin QP514.2
F: es el factor de dilucin para la enzima Kopperschlger G, Kirchberger J. 1996. Methods for separation of lactate dehydrogenases and
clinical significance of the enzyme. Journal of chromatography B, 684, 25-49.
9. Con los datos de actividad y los obtenidos en la prctica de purificacin de protenas llena la Mathews C. 1992. Bioqumica, 2da edicin, Ed. McGraw-Hill pp. 398-433. Localizacin QP514.2
Tabla 3.2. Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 202-233.
10. Recuerda que para obtener el dato de la actividad especfica hay que multiplicar la actividad QH345 L43
enzimtica por los mg totales de protena en la fraccin. Pardo-Vzquez JP. Cap 10. Cintica enzimtica. En Bioqumica de Laguna. El Manual Moderno,
SA de CV., 2002, pP185
Tabla 3.2. Tabla de purificacin de la LDH de msculo esqueltico de bovino. Voet D, Voet JG. 1992. Bioqumica. Ed. Omega S. A. pp. 342-378. Localizacin QP514.2
Procedimiento Volumen Protena Actividad Actividad Veces de Rendimiento
de la total en la enzimtica especfica purificacin
fraccin fraccin (mmol min-1mg-1) mmolmin-1mg-1total
(mL) (mg) de la fraccin
Homogeneizado 1 100
(F1 o F0)
Sobrenadante de la
precipitacin con
sulfato de amonio
45% (F2)
Botn obtenido de
la pp con sulfato de
amonio 70% (F3)
Primera Fraccin
que sali de la
cromatografa*
(FPA)
Segunda Fraccin
que sali de la
cromatografa*
(FPB)
Anotar cual cromatografa se realiz, de intercambio inico o de afinidad?.

11. Analizar los resultados.

Cuestionario
1. Por qu se us H2O como blanco para calibrar el espectrofotmetro en la prctica?
2. Menciona los pasos que deben seguirse para obtener la frmula que se propone para calcular la
actividad de la enzima.
3. Cules son las diferentes unidades en que se puede reportar la actividad de una enzima?
4. Proponga un protocolo para determinar la actividad de la enzima que no sea el de realizar una
curva temporal de aparicin de productos.
5. Analizando los resultados que se encuentran en la tabla 3.1 menciona cual fue el paso en el que
la protena se enriqueci ms. Por qu?
6. Al analizar en conjunto los datos obtenidos en la electroforesis y los de actividad en qu pasos
de la purificacin se eliminan ms contaminantes?.
7. Cul es la utilidad de realizar una tabla de purificacin en la que se toma en cuenta la actividad
de la enzima?

Referencias
5 6
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PARTE II. FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS:
EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO Y DE UN INHIBIDOR.
Objetivos:
- Determinar la concentracin de sustrato en la cual la enzima alcanza su velocidad mxima.
- Entender el significado de los parmetros cinticos Vmax y Km.
- Calcular los parmetros cinticos de la reaccin catalizada por la lactato deshidrogenasa utilizando
diferentes grficos de la ecuacin linealizada de Michaelis-Menten.
- Determinar el efecto de una inhibidor en la actividad de la lactato deshidrogenasa
- Analizar el efecto de un inhibidor sobre los parmetros cinticos de la enzima.
0141 BIOQUMICA EXPERIMENTAL Seccin 3. ACTIVIDAD ENZIMTICA
caractersticos de una enzima, aunque dependen de las condiciones en las que se llev a cabo la
reaccin, ya que hay que recordar que la enzima es una protena que responde modificando su
estructura y carga elctrica cuando los componentes de la solucin cambian.
Una manera para obtener los valores de Km y Vmax de una enzima tambin llamados parmetros
cinticos de una enzima, es graficando los valores de velocidad contra la concentracin de sustrato.
Este mtodo tiene la desventaja de que se grafica una curva y no una lnea recta por lo que la
interpolacin es difcil. Otra manera, es la de utilizar alguna de las expresiones matemticas que
producen una lnea recta como son la de Eadie-Hosftie, la de Hanes o la ms popular la de
Lineaweaver-Burk y que es la ecuacin que a continuacin se muestra:

Introduccin
El trmino cintica enzimtica implica el estudio de la velocidad de una reaccin catalizada por una
enzima y los efectos que pueden tener varios factores como los inhibidores. Uno de los principales
estudios que se realizan en una enzima es medir el efecto en la velocidad de la reaccin cuando se
modifican las concentraciones del sustrato de la enzima y se mantienen constantes la concentracin de
Como se observa en el ejemplo anterior, las formas lineales de la ecuacin de Michaelis-Menten son
enzima, el pH, la fuerza inica del medio, la temperatura, entre otros.
expresiones matemticas simples y aunque cada una tiene sus problemas de interpretacin son tiles
para obtener los valores de Km y Vmax.
Curva de velocidad en funcin de la concentracin de sustrato. Tanto en una reaccin catalizada
por una enzima como en una reaccin qumica, se espera que la velocidad de la reaccin de conversin
Una de las formas de regulacin de la actividad de una enzima es a travs de molculas que
de sustratos a productos, sea directamente proporcional a la concentracin de los reactantes que
disminuyen su velocidad de reaccin, inhibidores. Los inhibidores pueden encontrarse de manera
participan en la reaccin, es decir si se duplica la concentracin de cualquiera de los sustratos la
natural en las clulas para controlar la velocidad de una reaccin metablica, o bien pueden ser
velocidad de la reaccin tambin se duplica. A una reaccin as se denomina reaccin de segundo
compuestos sintticos que se utilizan como herramientas experimentales para el estudio de las
orden y se representa como una lnea recta con pendiente positiva y diferente de cero.
reacciones enzimticas. Muchos compuestos txicos como antibiticos, pesticidas o herbicidas son
inhibidores de enzimas que son responsables de reacciones vitales para la clula. La interaccin de un
Pero en una reaccin que es catalizada por una enzima, slo a concentraciones bajas del o los
inhibidor y la enzima no es siempre la misma, ya que depende de la naturaleza qumica del inhibidor
sustratos se obtiene una reaccin de segundo orden. A concentraciones altas de sustrato la velocidad
as como de la reaccin qumica que cataliza la enzima. Para dilucidar el tipo de interaccin entre
es independiente de la concentracin de sustrato, debido a que no hay ms enzima que lleve a cabo la
ambas molculas se recurre a determinar el efecto del inhibidor en las constantes cinticas de la
reaccin. La reaccin a concentraciones altas de sustrato se llama reaccin de orden cero y tambin
enzima.
se representa como una lnea recta pero con pendiente casi igual a cero.
Inhibidores competitivos. Son molculas que tienen una similitud estructural y qumica al sustrato de
En resumen, en una reaccin catalizada por una enzima la variacin en la concentracin del o los
la enzima. Debido a lo anterior el inhibidor se puede unir al sitio activo de la enzima. Pero como el
sustratos presenta diferentes rdenes de reaccin. Para un gran nmero de enzimas la grfica que se
inhibidor no es idntico al sustrato, la enzima no es capaz de convertir el inhibidor a producto. El
produce se puede describir mediante la expresin matemtica de una hiprbola rectangular. Como en
inhibidor simplemente bloquea el sitio activo, por regla no es posible que tanto el inhibidor como el
cualquier expresin matemtica se expresan en ella la relacin entre las variables junto a 1 o ms
sustrato se encuentren al mismo tiempo en el sitio activo. Si se adiciona ms sustrato y el inhibidor es
constantes.
reversible, el aumento en la concentracin de sustrato reduce la inhibicin. El inhibidor afecta
El trabajo pionero de Michaelis y Menten y Bringgs y Haldane llev a describir la ecuacin de la
exclusivamente el valor de la Km de la reaccin catalizada por la enzima (Figura 3.2).
hiprbola rectangular, ahora conocida como ecuacin de Michaelis-Menten, con ella es posible
predecir el comportamiento de la enzima en condiciones experimentales diferentes. Entonces, la
ecuacin se describe as:

V max [s ]
v=
Km + [s ]
Donde las dos variables de la ecuacin son la velocidad (v) y la concentracin de sustrato (s). Mientras
que las dos constantes son la Km y la Vmax. La Km es llamada la constante de Michaelis-Menten. El
valor de Km de una enzima para un sustrato especfico es la concentracin del sustrato a la cual la
velocidad de la reaccin es la mitad de la velocidad mxima. La Vmax es la velocidad terica mxima
de una reaccin. A concentraciones muy altas de sustrato el valor de la velocidad se aproxima al de la
velocidad mxima de la reaccin, pero nunca se llega a sta. Los valores de Km y Vmax son Figura 3.2. Efecto de los inhibidores sobre los parmetros cinticos de una enzima.
7 8
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Reactivos
Inhibidor no competitivo. El inhibidor no se une al sitio activo de la enzima sino a un sitio alejado del
sitio activo y ocasiona un cambio conformacional en el sitio activo de la enzima. Un inhibidor no 1 M Amortiguador de fosfatos pH 7.0
competitivo puro es aquel en el que slo se altera la capacidad de unir al sustrato. La mayor parte de 10 mM Piruvato de sodio
los inhibidor son inhibidores mixtos es decir no slo se afecta la unin del sustrato sino tambin la 10 mM Oxamato de sodio
conversin del sustrato a producto. Debido a lo anterior, los inhibidores mixtos alteran tanto el valor de 4 mM NADH. Reactivo que debe de disolverse justo antes de usarlo.
la Vmax como el de la Km de la enzima (Figura 3.2).
Desarrollo experimental.
Inhibidor acompetitivo. Es un inhibidor que no es capaz de unirse a la enzima libre, es decir slo se
une al complejo Enzima-Sustrato. Lo anterior puede deberse a que la unin del sustrato expone o crea Efecto de la concentracin de sustrato.
sitios de acceso o unin para el inhibidor, en el o fuera del sitio activo. Una vez que el inhibidor se une 1. Numerar las celdas.
la enzima se previene la formacin de producto. El inhibidor acompetitivo altera tanto la Km como la 2. En una celda de plstico se adicionan el amortiguador de fosfatos, el agua y el piruvato de
Vmax de la enzima. Sin embargo, a diferencia de la grfica que se produce con un inhibidor de tipo no acuerdo a lo que se indica en la tabla 3.3. Justo antes de medir se aaden 50 L de NADH 4 mM
competitivo mixto, las curvas a diferentes concentraciones de inhibidor son paralelas en este ltimo. y 10 L de la muestra de enzima diluida, fraccin 3 obtenida en la prctica de purificacin.
En la prctica se determinarn las constantes cinticas, Km y Vmax, de la lactato deshidrogenasa de Tabla 3.3. Efecto de la concentracin de sustrato.
msculo de bovino, para la reaccin en el sentido de piruvato a lactato, manteniendo constante la Solucin 1 2 3 4 5 6
concentracin de enzima, el pH y la temperatura de reaccin. Tambin se determinar el tipo de
inhibicin que un cido carboxilico produce en la actividad de la enzima, el oxamato (Figura 3.3) a *Concentracin final de 0.06* 0.09* 0.15* 0.25* 0.36* 0.5*
travs de medir la actividad de la enzima a diferentes concentraciones de sustrato y a una sola piruvato (mM)
concentracin de inhibidor su efecto en las constantes cinticas de la reaccin catalizada por la 100 mM Amortiguador de 515 515 515 515 515 515
enzima. fosfatos pH 7.0
H2O c.b.p. 815L (L) 235.1 232.7 227.8 219.6 210.7 200
10 Mm Piruvato (L) 4.9 7.3 12.2 20.4 29.3 40
4 mM NADH (L) 50 50 50 50 50 50
ENZIMA (1:200) (L) 10 10 10 10 10 10
3. Tapar la celda con parafilm y agitar 2 veces por inversin.
Figura 3.3 Estructuras del piruvato y el inhibidor que se usar en la prctica, el oxamato. 4. Ajustar el espectrofotmetro con agua y leer la absorbancia de la muestra a una longitud de onda
de 340 nm.
Material biolgico 5. Los valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.4).
Fraccin 3 obtenida en la prctica de purificacin.

Materiales y equipo
10 celdas de plstico
Tubos para microfuga
1 Recipiente para hielo
1 Vaso de precipitados de 25 mL
3 Tubos de ensayo 13x100mm
1 Micropipeta de 1000 L
1 Micropipeta de 200 L
1 Micropipeta de 10 L
1 Micropipeta de 50L
Puntas para micropipeta de diferentes capacidades
1 Vortex
Parafilm
Espectrmetro (por grupo)

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Tabla 3.4. Lecturas de absorbancia de la actividad de la LDH a diferentes concentraciones de sustrato.
Tiempo Piruvato (mM) 1. Se adiciona en una celda de plstico los reactivos de acuerdo a los volmenes y el orden que se
encuentra en la Tabla 3.5.
(seg) 0.06 0.09 0.15 0.25 0.36 0.5 2. Los valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.6).
30
Tabla 3.5. Registro de absorbancias de la actividad de la LDH en presencia de un inhibidor.
60 Tiempo Piruvato (mM) + Oxamato 0.35 mM
90 (seg) 0.06 0.09 0.15 0.25 0.36 0.5
120 30
150 60
180 90
210 120
240 150
270 180
300 210
240
6. Obtener la pendiente y calcular la actividad de manera similar al punto 6 de la prctica anterior.
7. Posteriormente se grafican: 270
A) Actividad vs concentracin de sustrato (grfica de Michaelis-Menten); 300
B) La actividad de acuerdo a la ecuacin de Lineweaver-Burk y
C) La curva de acuerdo al mtodo de Hanes-Wolff.
8. Calcular las constantes cinticas Km y Vmax, con los datos obtenidos de los tres grficos 3. Obtener la pendiente y calcular la actividad enzimtica.
anteriores. 4. Realizar los siguientes grficos: A) Actividad vs concentracin de sustrato; B) La grfica de
actividad de acuerdo a Lineweaver-Burk y C) La curva de acuerdo al mtodo de Hanes-Wolff.
Efecto de un inhibidor en la actividad de la LDH. 5. Calcular las constantes cinticas Km y Vmax, con los datos obtenidos de los tres grficos
Al igual que en la seccin anterior se mide la actividad de la lactato deshidrogenasa a diferentes anteriores.
concentraciones de piruvato, pero ahora se adiciona el oxamato de sodio, compuesto que inhibe la 6. Determinar el tipo de inhibicin que oxamato ejerce sobre la LDH.
actividad de la LDH (Tabla 3.5).
Cuestionario
Tabla 3.5. Composicin de medio de reaccin para medir el efecto del oxamato en la actividad de la lactato deshidrogenasa.
Solucin 1 2 3 4 5 6 1. Por qu es importante determinar los valores de Km y Vmax de una enzima?
2. Disea un protocolo diferente al presentado en est seccin para determinar la actividad de la
*Concentracin final de piruvato 0.06* 0.09* 0.15* 0.25* 0.36* 0.5* lactato deshidrogenasa.
(mM) 3. Cul fue el blanco de la reaccin?
100 mM Amortiguador de fosfatos pH 515 515 515 515 515 515 4. En que intervalo de concentracin la reaccin de la LDH muestra un comportamiento de primer
7.0 orden?
5. En que intervalo de concentracin la reaccin de la LDH muestra un comportamiento de orden
H2O c.b.p. 815L 235.1 232.7 227.8 219.6 210.7 200 cero?
6. Qu orden de reaccin es cuando no es de cero o primer orden?
10 mM Oxamato (L) 27.2 27.2 27.2 27.2 27.2 27.2
7. Qu significado tiene?
10 mM Piruvato (L) 4.9 7.3 12.2 20.4 29.3 40 8. Define Km e indica qu unidades tiene.
9. Define Vmax e indica qu unidades tiene.
4 mM NADH (L) 50 50 50 50 50 50 10. Qu tipo de inhibidor es el oxamato? Fundamenta tu respuesta.
ENZIMA (1:200) (L) 10 10 10 10 10 10 11. Cules son los inhibidores naturales de la LDH de msculo?
12. Por qu la clula reduce la actividad de la LDH?

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Referencias
Mathews C. 1992. Bioqumica, 2da edicin, Ed. McGraw-Hill pp. 398-433. Localizacin QP514.2
Nelson D. 2004. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 202-
233. QH345 L43
Voet D, Voet JG. 1992. Bioqumica. Ed. Omega S.A. pp. 342-378. Localizacin QP514.2

Sitios recomendados para

1. aprender utilizar los conceptos de Km, Vmax
http://csm.jmu.edu/biology/courses/bio220/aotw3.html en la pgina pulsar la tecla
kinetics_model.xls, despus regresa a la pgina inicial y contesta las preguntas que se
te hacen.
http://www.mhhe.com/biosci/genbio/biolink/j_explorations/ch07expl.htm

NOTAS Y CLCULOS

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