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201751 MicroscopiaconfocalWikipdia,aenciclopdialivre

Microscopiaconfocal
Origem:Wikipdia,aenciclopdialivre.

AMicroscopiaconfocalumatcnicaimagiolgicadesenvolvidaprimariamenteporMarvinMinsky,em
1955.ApesardofuncionamentodoMicroscpioConfocalsersemelhanteaodoMicroscpiodefluorescncia,
oprimeiroutilizadoparaaumentarocontrastedaimagemmicroscpicaeconstruirimagenstridimensionais
atravsdautilizaodeumorifciodeabertura,pinhole,quepermiteumagrandedefiniodeimagemem
amostrasmaisespessasqueoplanofocal.

Estatcnicatemvindoaadquirirumagrandepopularidadeepossuidiversasaplicabilidadesnacincia,
nomeadamentenaobtenodeimagensdeamostrasvivasedeinformaocomputadorizadatridimensionalna
pesquisabiolgica,naanlisequmicaedemateriais,principalmentenareadeneuroanatomiae
neurofisiologia.

ndice
1 Histria
1.1 Lentes
1.2 AparecimentodoMicroscpio
1.3 CinciaeoMicroscpio
1.4 GeraoSeguinte
1.5 MelhoriasdoSculoXVIII
1.6 MicroscpiosnoSculoXIX
1.7 MicroscpiodeFluorescncia
1.8 MicroscpioConfocal
2 PrincpiosFsicosdoFuncionamentodoMicroscpio Construo3DdeClulasda
Confocal MesodermedeEmbriesdeGalinha
2.1 ConstituiodoMicroscpioConfocal (Gallusgallus)
2.2 Luz
2.3 ptica
2.4 VisualizaodeumaImagem
3 Aplicaes
3.1 PreparaodeAmostrasBiolgicas
3.2 Riscos
3.3 VantagenseDesvantagens
4 Referncias
5 Ligaesexternas

Histria
Lentes

Nosesabeaocertoquandoaslentesforaminventadas,mas,em721a.C,hrelatosdeumcristalderocha
recortadocompropriedadesdeampliao.Conhecido,posteriormente,comolentedeLanyard,pensaseque
esteobjectopossatersidoaprimeiralentecriadapelohomem.Contudo,aslentespassaramaserrealmente
conhecidaseutilizadasporvoltadoanode1280,emItlia,comainvenodosculos.Comsuarpida
popularizao,logocomearamasprimeirasexperinciasdecombinaodelentesparaaplicaoem
instrumentosdeampliaodeimagens,resultandonacriaodoprimeiromicroscpiocomposto(comduasou
maislentes).[1]
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AparecimentodoMicroscpio

Adenominaode"microscpio"foidadapelomembrodaAcademiadeLinceiemdicoemRomaaservio
doPapaUrbanoVII,JohannGiovanniFaber(15701640)deBambergem1624.Osubstantivoprovmda
junodedoisvocbulosgregos:micros(pequeno)eskopein(ver,examinar).

OcrditopelainvenodomicroscpiodadoaoholandsZachariasJansen,porvoltade1595.Comoera
muitojovemnapoca,pensasequeoprimeiromicroscpio,comduaslentes,tenhasidodesenvolvidopeloseu
pai,HansJansen.Porm,eraZachariasquemontavaosmicroscpiosdistribudospelarealezaeuropeia,dado
que,naaltura,oinstrumentoeraconsideradoumbrinquedo,poispossibilitavaaobservaodepequenos
objectos.

Noobstante,apaternidadedomicroscpiotemsidomuitodiscutidaedisputada,umavezqueositalianos
atribuemestesingularinventoaoseucompatriota,fundadordomtodoexperimentaledacinciadinmicae
eminentefsicoematemtico,ofamosoGalileuGalilei(15641642),naturaldePisa.Segundotestemunhos,
Galileu,em1609,apenascombinoulentesoucristaisdeaumentonumtubodechumbooupapelo,aplicando
asaoestudodaastronomia,emborasetenhaapoiadonoconhecimentodoaparatopticoinventadopelos
Jansen.EsteinstrumentodeGalileupermitiaumaumentodetrintavezes,sendoaindaconsideradooprimeiro
telescpioproduzido.

Masdefactoparecenosereleoseuinventor,poisoseucontemporneoHansLippersheytinhaumtelescpio,
cujosfundamentosforamindagadosporGalileu,construindo,baseadoneles,oseuprpriotelescpio
aperfeioado.Ofactodeterconstrudoosseusprpriosinstrumentos,talcomoaconteceucomdiversos
cientistas,nolhecreditaobterapatentedeinventor,comoseusbigrafospretendem.Pelascomputaes
cronolgicas,ainvenodoinstrumentopertence,defacto,aosJansen.[1]

CinciaeoMicroscpio

OsculoXVIIfoiumperododegrandeinteressepelosmicroscpios.Aprpriapalavramicroscpiofoi
oficializadanapocapelosmembrosdaAcademiadeLincei,umaimportantesociedadecientfica.Contudo,
aindahaviadvidassobreaimportnciadoinstrumentoparaacincia.Aampliaodosobjectos,emtornode
novevezes,nopermitiaobservarcoisasrealmentenovas,detalformaqueaindanosesuspeitavaqueuma
estruturapresenteemtodosostecidosvivosestariaaoalcancedoolhohumanocomaajudadosmicroscpios:
aclula.[1]

GeraoSeguinte

NofinaldosculoXVII,osmicroscpiossofreramumamudananoseudesenhobsico.Devido
provavelmenteinstabilidadedosistemalateraldesustentao,passouseautilizarumtripdeapoio.O
primeiroesquemademicroscpiocomtripfoidivulgadonaAlemanhaem1631.Contudo,somenteem1683,
omicroscopistainglsJohnYarwellconstruiuoprimeiromodelodequesetemnotcia.[1]

MelhoriasdoSculoXVIII

OsculoXVIIIfoiumapocademelhoriasnaslentesenosmicroscpios,nomeadamenteanvelde
estabilidade,precisodefocagemefacilidadesdeuso.Osinstrumentospassaramaseranunciadosemdiversas
publicaespelomundointeiro,evriosmicroscopistaslanaramosseusmodelos.Porvoltadoanode1742,
osmicroscpiosqueprojectavamimagensfizeramgrandesucesso.Umadasdiversesdapocaeravisitaros
espectculosdeprojecomicroscpica.[1]

MicroscpiosnoSculoXIX

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NosculoXIX,osfabricantesdemicroscpiosdesenvolveramnovastcnicasparafabricaodelentese
passaram,tambm,autilizarespelhoscurvosparamelhoraracapacidadedefocagemdessesinstrumentos.Em
1840,osEstadosUnidoscomearamafabricarmicroscpios,umaactividadeatentorestritabasicamente
Inglaterra.Finalmente,porvoltade1880,oschamadosmicroscpiospticosatingiramaresoluode0,2
micrmetros,limitequepermaneceataosdiasdehoje.[1]

MicroscpiodeFluorescncia

AMicroscopiadefluorescnciafoiinventadahquaseumsculoatrs,quandoalgunsinvestigadores
experimentavamousodeluzultravioletaparaobterumamaiorresoluo.Noincio,asobservaes
microscpicaseramlimitadasaosespcimesquetinhamautofluorescncia,pormrapidamentesecomeoua
estudarcorantescomfluorescncia.Noentanto,sapartirdadcadade1940queaMicroscopiade
fluorescnciacomeouaganharpopularidade,quandoCoonseKaplanapresentaramumatcnicaquemarcava
anticorposcomumcorantefluorescenteparaestudarinteracesantignioanticorpo,oquepromoveuuma
profundaalteraonocampodaImunocitoqumica.

AdescobertaquerealmentetrouxeaMicroscopiadefluorescnciaparaavanguardaveioem1994,quando
ChalfieM.etalconseguiramexpressarnaturalmenteumaprotenafluorescente,aprotenafluorescenteverde
(GreenFluorescentProteinGFP),emorganismosvivos.Estefoiummarconaevoluodestarea,pois
permitiutodaumanovaclassedemtodosdemarcao.

NahistriadoMicroscpiodeFluorescncia,atecnologiafoiumtrampolimmultidisciplinardaEngenharia
ptica,QumicaeBiologia,emquetodasasdisciplinascontriburamparavisualizarassubstncias
fluorescentesunidassprotenas,aumentandoacompreensodaactividadecelular.Aimportnciada
MicroscopiadefluorescnciafoireconhecidarecentementecomoprmioNobeldeQumicadoanode2008,
quefoiconcedidopelodesenvolvimentodaGFP.[2]

MicroscpioConfocal

OdesenvolvimentodoMicroscpioConfocalfoiimpulsionado,emgrandeparte,pelodesejodeseobteruma
imagemdeeventosbiolgicosqueocorreminvivo.[3]

AinvenodesteobjectoatribudaaMarvinMinskyque,em1955,enquantoestudantedepsdoutoramento
naUniversidadedeHarvard,construiuummicroscpiocomoobjectivodeobterumaimagemderedesneurais,
utilizandopreparaesnocoradasdetecidocerebralvivo.[4]TodososMicroscpiosConfocaismodernos
empregamomesmoprincpiodaimagiologiaconfocalpatenteadaem1957.

AinvenodeMarvinMinskypermaneceudespercebidadurantealgumtempo,provavelmentedevidofalta
defontesdeluzintensasnecessriasparaseobterimagensedeumcomputadorcomumapotnciasuficiente
paralidarcomgrandesquantidadesdedados.

NasequnciadotrabalhodeMarvinMinsky,surgemM.DavidEggereMojmirPetran,nofinaldosanos1960,
quefabricamumMicroscpioConfocaldefeixesmltiplos,ondeutilizaramumdiscogiratrio(discode
Nipkow)paraexaminarsecesdetecidocerebralnocoradoeclulasganglionares.

Prosseguindonestarea,foiem1973queM.DavidEggerdesenvolveuoprimeiroMicroscpioConfocala
lasermecanicamentedigitalizadoepublicouasprimeirasimagensreconhecveisdeclulas.

Duranteofinaldosanos1970enadcadade1980,osavanosdainformticaedatecnologiadolaser,
juntamentecomosnovosalgoritmosparamanipulaodigitaldeimagens,levouaoaumentodointeressepela
MicroscopiaConfocal.

PoucotempodepoisdapatentedeMarvinMinskyterexpirado,osdesenhosprticosdoMicroscpioConfocal
alaserforamtraduzidoseminstrumentosdetrabalhoporvriosinvestigadores.OfsicoholandsG.Fred
BrakenhoffdesenvolveuumMicroscpiodeVarrimentoConfocalem1979.Quaseemsimultneo,Colin
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SheppardcontribuiuparaatcnicacomaTeoriadaFormaodaImagem.TonyWilson,BradAmoseJohn
Whitealimentaramoconceitoe,maistarde(duranteofinaldosanos1980),demonstraramautilidadeda
ImagemConfocalLatentenoexamedeamostrasbiolgicasfluorescentes.[5]

EnquantoinvestigadoresemCambridge,BradAmoseJohnWhite
tentaramobservarasprimeirasdivisesmitticasdosembriesdeC.
elegans,atravsdeimunofluorescnciacomanticorposantitubulina,
numatentativadedeterminarosplanosdeclivagemdasclulas.No
entanto,noconseguiramatingiroseuobjectivo,vistoqueamaioriada
fluorescnciaobservadaestavaforadoplanodefocagem.Foientoque
estesinvestigadoresadoptaramatcnicadeMicroscopiaConfocal
propostaporMinsky.Em1987,foiconstrudooprimeiroMicroscpio
Confocalcomacapacidadedeproduzirimagenscombastanteutilidade,
combinandotecnologiasdelaser,decomputadoredemicroelectrnica.
AmoseWhiteconstruramoprimeiroprottipodoMicroscpio
Confocalqueincorporavaestastecnologiaseconseguiram,finalmente,
obterimagenscommelhorfocagemdosembriesdeC.elegans.Foi,
ento,em1987queosprimeirosinstrumentoscomercializados
apareceram.[6]

Duranteosanos1990,osavanosdapticaedaelectrnicaofereceram
lasersmaisestveisemaispoderososdealtaeficincia.Almdisso,
iniciavaseasintetizaodefluorocromosqueerammais PrimeiraPginadaPatentedeMarvin
cuidadosamentecombinadosslinhasdeexcitaodolaser.Aliadoao MinskySobreoMicroscpio
rpidoavanodavelocidadedeprocessamentodoscomputadoreseao Confocal
aumentodadisponibilidadetecnolgicadearmazenamentodegrande
volume,emergentenofinaldosanos1990,aetapafoidefinidacomo
umaexplosovirtual,noquedizrespeitoaonmerodeaplicaesquepoderoseralvodaMicroscopia
Confocal.

OsMicroscpiosConfocaismodernospodemserconsideradoscomosistemaselectrnicostotalmente
integrados,ondeomicroscpiodesempenhaumpapelcentralnumaconfigurao,constitudaporumoumais
detectoreselectrnicos,ocomputador(imagemparavisualizao,processamento,produoearmazenamento),
vriossistemasdelaserscombinadoscomdispositivosdeselecoeumfeixedevarrimentodemontagem.Na
maioriadoscasos,aintegraoentreasvriascomponentestoprofundaquetodaaMicroscopiaConfocal
frequentementereferidacomoumsistemacolectivodeimagemdigitaloudevdeo,capazdeproduzirimagens
electrnicas.

Estesmicroscpiosestoagoraaserintegradosnarotinadeinvestigaessobremolculas,clulasetecidos
vivos,oquenoerapossvelhapenasalgunsanosatrs.[5]

PrincpiosFsicosdoFuncionamentodoMicroscpioConfocal
ExistemtrstiposdeMicroscpiosConfocaiscomercialmentedisponveis:(1)oConfocalLaserScanning
Microscope(LSCM),omodelomaisutilizadodevidoelevadaqualidadedeimagemquepermiteaobteno
deimagensdealtaresoluoatravsdecortespticos,posteriormenteagrupadosparasefazerareconstruo
tridimensionaldatopografiadeobjectoscomplexos(2)oSpinningDiskConfocalMicroscope,comumdisco
deNipkow,cujorciodeconstruomaisrpidoeeficazqueoLSCM,sendo,porisso,tilemobservaes
dinmicase(3)oProgrammableArrayMicroscope(PAM).[7]

OsistemapticousadonestetipodeMicroscpiosomesmoqueaplicadonosMicroscpiosde
Fluorescncia.Noentanto,nestesltimos,ocampotodoiluminado,enquantoquenoMicroscpioConfocal
focalizasomenteumpontoemdeterminadaprofundidadenoespcimen.[8]

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ConstituiodoMicroscpioConfocal

UmMicroscpioConfocal,nogeral,constitudopor(1)umLaser,quecorrespondefontedeluzprojectada
naamostraequepodeterumcomprimentodeondaespecfico(2)umScannerqueumdigitalizadorpor
unidade,ouseja,moveolaserdemodoafocalizaraamostralinhaporlinha(3)oZcontrol,quepermitea
focagemdaamostraeaaquisiodaimagememsecesnoseixosXeZ(4)osFotomultiplicadores
(PhotomultipliersPMT),quevodetectarosfotesemitidose/oureflectidospelaamostra(5)oPinhole,
responsvelpeladiscriminaoprofundaepelaposionoseixosXeY(6)oBeamSplitterouViade
Fluorescncia,quedefinidapelacombinaodosespelhosdicricos(principalesecundrio)efiltrosde
emissoe(7)asObjectivas,responsveispelaformaopticadaimagem,quedeterminaaspropriedadesde
qualidadedaimagem,assimcomoasresoluesnoseixosX,YeZ,ecaracterizadapelaaberturanumrica,
quedeterminaotamanhodaimagemnolocal(conjuntamentecomoscomprimentosdeonda)einfluencia
substancialmenteaespessuramnimavivel.[7]

Luz

Aluzsurgesobaformadeftons,partculaselementaresdaforaelectromagntica.Sendoumaformade
energiaelctricaemagntica,estesviajamatravsdoespaocomportandosesimultaneamentecomopartculas
eondas.[9][10]

Oespectroelectromagnticocorrespondedistribuiodaintensidade
daradiaoelectromagnticasegundoasuafrequnciaoucomprimento
deonda.Variadesdeosraiosgama(demaiorenergia)sondasrdio
(demenorenergia),sendoquealuzvisvelcorrespondeapenasauma
pequenapartedesteespectroquepodesersubdivididodeacordocoma
corvermelhonoscomprimentosdeondalongosevioletaparaos
comprimentosdeondamaiscurtos.Aluzbrancaresulta,ento,da
misturadetodasascoresdoespectrovisvel.[11][12]
EspectroElectromagntico Aluzpossui,portanto,umanaturezaondulatria(conceitointroduzido
naFsicapelaprimeiravezporJamesClerckMaxwell).Noentanto,
quandointeragecommaterial,estascapazdedaroureceberenergiaempequenasquantidadesoqueremete
paraasuanaturezacorpuscular,ouseja,aluztambmconstitudaporpequenaspartculasdenominadas
fotes.[9][13]

Aenergiadeumfton(Ef)dadapelarelaoEf=hf,sendofa
frequnciadaondaelectromagnticaaqueoftonestassociadoeh
umaconstanteuniversaldeproporcionalidade,conhecidaporconstante
dePlanck(devidoaofsicoMaxKarlPlanck).Ainteracoentrealuze
amatriafazse,portanto,atravsdatrocadeumnmerodeterminado
deftons.[10][12]

Deacordocomoestadoatualdoconhecimentocientfico,aluz
geradapelomovimentodepartculascarregadas,nomeadamentede
eltrons,umdosconstituintesfundamentaisdotomoe,portanto,da
matria.Amaioriadasfontesluminosasemiteluzprovenientedo EnergiadoFoto
movimentodestaspartculas.Comosesabe,oseltronsencontramse
voltadoncleodotomo,ocupandoapenascertospadresenergticos
designadospororbitais.Acadaumadestasorbitaiscorrespondeumvalorespecficodeenergia.Quandoo
eltronseencontranaorbitalqualcorrespondeonveldeenergiamaisbaixonoirradiaenergia,noentanto,
quandootomoexcitado,oeltronpodeposteriormenteperderaenergiaadquirida,libertandoasobaforma
deumfton,ouseja,deluz.

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Asfontesdeluzusuaisdiferementresipelomodocomofornecemenergiaaoseltronsemmovimento.Sea
energiavemdocalor,afontedesignadaporincandescente.ocasodaluzprovenientedaslmpadas
incandescentes.Seprovmdeoutrafonte,talcomoaqumicaouelctrica,afontedesignaseporluminescente.
ocasodosmateriaisfosforescentes.[12][13]

Aluzdolaserdiferentedaluznormal,possuindoasseguintescaractersticas:

Monocromtica:possuiumcomprimentodeondaespecficodeluz,oquevairesultarnumacor
especfica
Coerenteou"organizada":cadaftonmovesejuntamentecomrestantes.Todososftonspossuem
frentesiniciadassimultaneamente
Direcionada:Possuiumfeixeestreitoeconcentrado,contrariamenteaoutrasfontesdeluzqueproduzem
disperso
Intensa.

Comojreferido,oftonemitidoporqualquertomotemumdeterminadocomprimentodeondaquedepende
dadiferenadeenergiaentreoestadoexcitadoeoestadofundamental.Seesseftonencontraroutrotomo
comumeltronemestadoexcitadoidntico,aemissoestimuladapodeocorrer.Oprimeiroftonpode
estimularouinduziremissoatmicadetalmaneiraqueoftonemitidocomoconsequnciavibrarnamesma
frequnciaedirecoqueoftonrecebido.

Assim,importantequeomeioapresentetomoscomeltronsemnveiscujoespaamentotenhajustamentea
energiadofeixedeluzquesedesejaobter.Setodosostomosdessemeioapresentaremeltronsnoestadode
maisbaixaenergia,aaodolasernopoderiniciarsedevidoaofactodequenoteremoseltronsexcitados
paraqueocorraoprocessodeemissoestimulada,oumesmoespontnea.

Assim,antesdeiniciarseaaodolaser,precisoqueamaioriadostomospossuaeltronsnosseusestados
excitados.

Outropontofundamentaldolaserumpardeespelhos,estandoestesposicionadosemcadapontadomeio
gerador.Osftonsrefletemsenosespelhosparaviajardeumladoaoutrodomaterialgeradordelaser.Durante
esteprocesso,estimulamoutroseltronsafazercomqueaenergiadecrescenteaumenteepodemcausara
emissodemaisftonsdeigualcomprimentodeonda.Umefeitodominocorreelogoseteropropagado
vriosftonsdemesmocomprimentodeonda.Apsainversodepopulaoterocorrido,produzindoa
excitaodoseltronscomajudadeumafonteexterna,odecaimentoespontneodeumdostomosparao
estadofundamentalcomeaaprovocaraemissoestimuladadosdemaistomose,consequentemente,produz
luz.Apenasaluzquesepropagaaolongodoeixoprincipaldolaservaisofrerasvriasreflexesnointeriorda
cavidaderessonante,fazendocomquehajaumfeixedeluz.

Oespelhoqueseencontranumadaspontasdolasersemiprateado,oquesignificaquereflecteumaparteda
luzepermiteapassagemdeoutraparte.Essapartedaluzqueconseguepassaraluzlaser.[14][15]

ptica

Omecanismodefuncionamentopticodestemicroscpiomelhorentendidocomoumpardelentes,como
espcimensituadonopontofocaldeumadaslentesecomaformaodeimagemnopontofocaldaoutra.O
princpiobsicodoMicroscpioConfocalcaptarapenasaporodoespcimensituadanopontofocalde
lentemaisprximadeste.Estametaconseguidaatravsdaassociaodeumorifciodeaberturaoupinhole,
quenomaisdoqueumasuperfciecomumorifcio.Destaforma,oorifcioestrategicamentecolocadono
pontofocaldalenteoposta(isto,noextremocontrriodosistemadelentesrelativamenteaoespcimen)
sendo,portanto,atravessadoapenaspelaluzreferenteaopontofocalcaptadopelosistema.[3][16]

Deacordocomomecanismodefuncionamentodopinhole,podemosserlevadosapensarquequandomais
pequenoforoorifcio,melhor.Quandomaioracapacidadedeeliminaraluzdefundomaisdefinidasera
imagemobtida.Defacto,emtermostericos,esseoraciocniocorrecto.Naprtica,noentanto,umpinhole

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muitopequenopodereliminartambmaluznecessriaparaaformaodaimagem,isto,acapacidadede
seccionamentopticoouopticalseccioningseriatoelevadaqueassecesdeluzemitidaseriamdemasiado
finasparaseremcaptadaspelofotomultiplicador.

Umaformadeevitaresteeventopoderiaresidirnoaumentoda
intensidadedaluzemitidapelolaserounoaumentodaconcentraode
fluorforos.Noprimeirocaso,sabesequedemasiadaintensidade
luminosalevasaturaooumesmodegradaodosfluorforos.No
segundo,aexcessivaconcentraodestasmolculaspodelevar
interacoentreelaslevandoafenmenosdequenching(fenmenoque
FocagemdoMicroscpioConfocal designaaperdadeluminosidadedeumadeterminadasubstncia).
Comoosfluorforossoexcitadosporumcomprimentodeonda
diferentedaquelequeemitem,apresenademuitosfluorforosjuntosnopermitequeelescaptem
eficazmentealuzexcitatria,isto,captamumdeterminadocomprimentodeondaecomeamaemitirnoutro,
emissoestaqueinterferecomacaptaodefluorforosdemasiadoprximos.Decertaforma,parauma
concentraomuitograndedefluorforos,oaumentodaintensidadedeluzemitidainibeseasiprpria,uma
vezquediminuiataxadeexcitaomolecular.[16]

Experimentalmente,observousequepinholescomdimenses
inferioressdodiscodeAirynooferecembenefcios.Opinhole
desejvelterumtamanhoigualaodiscodeAiry(pontodefocagem
mximoqueseconsegueobtercomumalenteperfeita.Otamanhodeste
discovarivelconsoanteocomprimentodeondaaqueest
subjacente),[16]umavezquepoderserultrapassadopelatotalidadeda
Variaonaqualidadedaimagem luznopontofocaletercapacidadeparaeliminarluzindesejvel.A
obtidaconsoanteotamanhodo focagemdeumpontonicopermiteobteraquiloaquesedesignapor
pinhole opticalseccioning,isto,permiteformarumaimagemplanadeuma
finasecofocadadoespcimen.[3]Comoaluzemitidapeloespcimen
foradopontofocaleliminadapelopinhole,aimagemobtidacomMicroscpioConfocalbastantemais
definidaemrelaoaoutrostiposdemicroscopia.[3][16][17]UmadasgrandesvantagensdoMicroscpio
Confocaladvmprecisamentedacapacidadeparaopticalseccionning.Comaobtenodestasimagens
bidimensionaismuitodefinidas,possvelobtersecesatodaaespessuradotecidoecriarimagens
tridimensionaisatravsdajunodasprimeiras.

Pelotamanhoecaractersticasdopinhole,verificaseque,acadamomento,aquantidadedefotesquechegam
aosensorbastantepequena.Assim,necessriaautilizaodeumafonteluminosamuitointensa,que,nos
temposdacriaodoaparelho,eraumalmpadadezircnio.Actualmente,optasepeloslasers,queaindatm
avantagemdeemitirnumcomprimentodeondaespecfico,existindovriosdisponveisnomercadocom
comprimentosdeondadiferentes.[3]

TendoemcontaquenocasodoMicroscpioConfocal,aobjectivaumaestruturaquealuzatravessanosdois
sentidos,aindaquecomprimentosdeondadiferentes,necessrioumfiltrocapazdesepararesses
comprimentosdeondasemquenenhumdosdoisseperda.Assim,colocadoumespelhodicrico(didois
cricocor)oudicromticoparareflectirolasereseratravessadopelaluzemitidaouviceversa.[17]

Almdoespelhodicrico,oMicroscpioConfocaltambmequipadocomespelhosmveis.[16]Aquandoda
suacriao,Minskyconstituiuassuasimagensatravsdamobilidadedoespcimen.Contudo,aindaqueeste
mtodopermitaevitardefeitosnaslentes,levavamuitasvezesaperdasderesoluodaimagem.Almdisso,a
nvelbiolgicotornaseimpossvelefectuaralgumasmanipulaes(talcomomicroinjecodesondas
fluorescentes)quandooespcimenmvel.[3]Destaforma,optaseactualmentepormanteroespcimen
estticoenquantoolaser"varre"todaasuasuperfcie.Estemtodoconseguidocomespelhos,associadosa
pequenosmotores,querodamdeformaaconseguirabrangerumarealimitadadoespcimen.[16]Dereferir
queosespelhossoresponsveispelavarrimentodolaserapenasaduasdimenses.[8]
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Nestetipodemicroscopianuncahumaimagemcompletadoespcimen,umavezqueacadainstanteapenas
observadoumponto.Assim,omicroscpioacopladoaumsistemainformticoqueconstriumaimagem,
pixelapixel,medidaqueospontosdoespcimensofocados.Geralmente,umaimagemdemoracercade0,1
a1segundosasergerada.Contudo,esteperodopodersermaiorparaobtenodeumaimagem
bidimensionaldealtadefiniooutridimensional.fundamentalqueosfluorforosnoseencontrem
demasiadoexpostosaocomprimentodeondaqueosexcita,sobpenadesofreremdanosouphotobleaching
(destruiofotoqumicadeumfluorforo).Assim,soactualmenteusadosmtodosdecapturaaalta
velocidade,como,porexemploaMicroscopiaConfocalcomdiscodeNipkow.Estediscodetmmilharesde
pinholesemtodaasuasuperfcie,oquepermiteaactuaodealgumascentenasdelesacadamomento.[16][17]

VisualizaodeumaImagem

Olaseremiteumfeixedeluzqueirincidir,emprimeirolugar,naobjectivae,deseguida,noespelhodicrico,
quereflectealuzparaumasegundaobjectiva.Estaconvergealuzparaumnicopontonaamostra.Aluz
fluorescenteemitidapelaamostra,ento,captadapelasegundaobjectivaepassaatravsdoespelhodicrico,
enquantoquealuzdofeixereflectida.Posteriormente,aluzfluorescentedaamostraconvergidaporuma
terceiraobjectivademodoasercaptadapelofotomultiplicador.Antesdestaserdetectadapelomesmo,
parcialmenteobstrudadeformaqueapenasaluzprovenientedopontofocalsejacaptada.Ofotomultiplicador
transforma,ento,osinalluminosoemsinalelctrico,quesergravadoporumcomputador.[7]Omicroscpio
digitalizaaamostrasequencialmente,pontoporpontoelinhaporlinha,econvergeospixisnumaimagem.
Destemodo,secespticasdaamostrasoimagenscomgrandecontrasteeresoluonoseixosX,Y,Z,ou
seja,sotridimensionais.[8]

AstrcitosImagemconstrudapor
MicroscopiaConfocal

Aplicaes
Apesardasualongahistria,srecentementeoMicroscpioConfocalsetornounuminstrumentoprticocom
aplicaesdefinidas.Entreestasaplicaesdestacaseaobtenodeimagensvaliosasdeamostrasvivasede
informaocomputorizadatridimensionalnapesquisabiolgica,naanlisequmicaedemateriais,permitindo
alocalizaotridimensionaldeestruturasemolculasmarcadascomfluorocromos.[18][19]Oespectrode
aplicaesespecficasdestetipodemicroscopiavastoerestringidoapenaspeloslimitesdoavanocientfico.

Estetipodemicroscpioapresentaespecialrelevnciaemestudosdeneuroanatomiaeneurofisiologia,bem
comoestudosdemorfologiadeumagrandevariedadedeclulasetecidos.Damesmaforma,acrescente
utilizaodeprotenasfluorescentesproporcionaumaexpansodonmerodeestudoscientficos

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experimentais,associadosaousodetcnicasdeMicroscopiaConfocal,possibilitandooaumentodonmerode
aplicaes.

Actualmenterealizamsevriastcnicascomrecursoaesteequipamento,nomeadamentemarcaode
eptopos,TransfernciadeEnergiadeRessonnciaporFluorescncia(FluorescenceResonanceEnergy
TransferFRET),pesquisadasclulasestaminais,estudosde''Photobleaching'',informaesobtidaspor
tempodevidafluorescente,microscopiamultifoto(multifoton),reflexointernatotal,hibridizaodeDNA,
sondasmembranaresedeieseprotenasbioluminescentes.[3][20]

MarcaodeEptopos

AtcnicadeMarcaodeEptoposparaaMicroscopiaConfocalmuitosemelhantedeImunocitoqumica,
utilizandofluorocromoscomomolculaspropiciadorasdevisualizao.[3][20]

TransfernciadeEnergiadeRessonnciaporFluorescnciaouFluorescenceResonanceEnergyTransfer
(FRET)

Alocalizaoprecisaeanaturezadeinteracesentremolculas,emclulasvivas,apresentamgrande
relevnciaemmuitasreasdeinvestigaobiolgica.Paracompreenderestasinteracesfsicasnosprocessos
biomolecularestpicos,aproximidaderelativadaspartculasnecessitadeserdeterminadacomalguma
preciso.

AtcnicadeTransfernciadeEnergiadeRessonnciapor
FluorescnciaouFRET(TheodoreFrster,1949),quandoconjugada
comamicroscopia,permiteadeterminaodadistnciaentremolculas
numraiodenanmetros(proximidadesuficienteparaqueocorra
interacomolecular).[3][20][21]

Atravsdamarcaodevrias
EsquemailustrativodeFRET
estruturascelularescom
fluorforosindividuaisque
possuamdiferentesespectrosdeexcitaoeemissoecomorecursoa
diferentescombinaesdefiltrosfluorescentes,serpossvelexaminar
aproximidadedasmolculasmarcadasdentrodeumanicaclulaou
numcortedetecido.

Assim,oFRETassumesecomoumprocessoatravsdoquala
transfernciadeenergiaocorreentreumfluorforonumestadode
excitaoeumsegundocromforoqueseencontrenasproximidades.
OmecanismodeFRETenvolveassimumfluorforodadornumestado
ProcessodeFRET
electrnicodeexcitaoquetemacapacidadedetransferiressaenergia
deexcitaoparaumcromforo(receptor)nasproximidadesnuma
reacononradiativeaolongodeinteracesdipolodipolodelongoalcance.Atravsdestatcnica,possvel
verificarasmolculasqueseencontrammaisprximas(permitindoconcluiracercadaassociaomolecular)
contrariamenteaoquepossvelobservarcomoMicroscpioptico(limitederesoluomaisbaixo).

PesquisadeClulasEstaminais

Asclulasestaminaissoclulasindiferenciadasquesepodemautorenovar,expandirediferenciarem
diversostiposcelulareseduranteodesenvolvimentoembrionrioqueestasclulasseespecializam.Mais
tarde,noindivduoadulto,asclulasestaminaisreparamtecidosdanificadosesubstituemasclulasque,
devidoaofenmenodesenescnciaouleso,morrem.Estasclulassoestudadasessencialmentepeloseu
potencialnautilizaoemtransplanteseparacurardoenasemqueostecidosforamdanificados.[3][22]

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Comoaspropriedadesdestetipocelularprecisamdesercompreendidas
utilizase,entreoutras,tcnicasdeMicroscopiaConfocal.Estatcnica
permiteestudarascaractersticasmorfolgicasdasclulasestaminais
comotamanhoeforma,obterimagenstridimensionaisquepossibilitam
aanlisedasestruturasinternasqueasconstituem,bemcomorecolher
informaosobreaactividadecelular.[3][20][23]

EstudosdePhotobleaching

OprocessodePhotobleaching
envolveadiminuioda
absoroedaintensidadede
fluorescnciadedeterminado
ClulasEstaminais:Construode
fluorforo.[24]Tcnicascomo umaImagememMicroscopia
PerdadeFluorescnciana Confocal
Photobleaching(Fluorescence
LossinPhotobleachingFLIP)
eRecuperaodeFluorescnciaapsPhotobleaching(Fluorescence
RecoveryafterPhotobleachingFRAP)soutilizadasparaobservaro
movimentodesubstnciasintracelulares.

OPhotobleachingofenmenocaracterizadopelaperdade
PrincpiodoPhotobleaching fluorescnciaque,emdeterminadascircunstncias,permiteacedera
informaesquedeoutraformanoseriampossveisdeobter,comoa
verificaodaintegridade/continuidadedamembranaeaexaminao
dafluideznadirecolateral.[3][20][25]

NatcnicadeFLIP,umaregiodaclulaemestudobleachedcontinuamente,ouseja,sujeitaaumqumico
queremovetodaacorinatadotecidoouotornabranco,porprocessosdeoxidao.Esteprocessotemcomo
objectivopermitirvisualizaradirecodomovimentodotransporteintracelular,atravsdaobservaoda
perdaprogressivadefluorescncianessadireco.

Assimestatcnicarequerapreparaode"clulas"marcadascomfluorforos,sendomaisutilizado
actualmenteoGFPouprotenasrelacionadas,especficasparaosalvosdeinteresse.Obleachingcontnuoda
readeinteressenaclularequerumailuminaoporlaserprecisaesuficienteparainactivartodosos
fluorforosdentrodareaemestudo.

Asimagensobtidasaolongodotempo(timelapse)soutilizadaspara
capturaraperdadefluorescncianadirecodotransporte.Permite,
tambm,descreveromovimentoparadentro(FLIP)ouparafora
(FLOP)deumaregiodeinteresse.[20]
ExemplodeumaRecuperaoaps PoroutroladonaFRAP,apsamarcaocomsondacomfluorforos,
Photobleaching retiradaprimeiramenteumaimagem/fotografiaantesderealizar
photobleaching.Deseguidadireccionadaumafontedeluzparauma
pequenareadeinteresse,comumcomprimentodeondaapropriado.Osfluorforosdestaregioso,assim,
excitadoscomumailuminaodegrandeintensidade,perdendorapidamenteoseutempodevida.Nesteponto
,ento,possvelvisualizarareadeinteressecomoumpontoescuro.Assondasmarcadasqueaindatma
capacidadedeemitirfluorescnciavosedifundirnaamostraepreencheroespaodassondasquejnotm
estacapacidadenareaseleccionada.[19]

InformaesobtidasporTempodeVidaFluorescente

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Asimagensobtidasportempodevida(deFluorescncia)atravsdeMicroscopiaouFLIM(Fluorescence
LifetimeImagingMicroscopy)tmcomobaseaaplicaodemltiplascorescommarcadoresfluorescentes
paraaobservaodadistribuiocelulardemolculasbiolgicascomoasprotenas,lpidos,cidosnucleicose
ies,entreoutros.Cadamarcadorfluorescenteapresentaumtempoespecficodeduraoparaaemissode
fluorescncianoseuestadoexcitado.Detectandoasdiferenasnessetempopossveldistinguirfluorocromos
queemitemfluorescncianomesmocomprimentodeonda,assimcomocasosnosquaisexista
autofluorescncia.Estetipodeanlisepermiteaindaobterinformaosobremolculasnumaclulavivatendo
emconsideraotodososfactoresconhecidosqueafectamasobrevidadafluorescncia,comoporexemplo,
intensidadeinica,propriedadeshidrofbicas,concentraodeoxignio,Photobleachingeintensidadedaluz.
Estabelecendoarelaoentreestesfactoreseaduraodaemissodefluorescnciapossvelcalculara
concentraoinicaeanalisaraFRET.[3][20][21]

MicroscopiaMultifoto(Multifoton)

Estatcnicaumapoderosaferramentadeinvestigao,quecombinaMicroscopiaConfocalcomfluorescncia
multifotnicadelongocomprimentodeonda,permitindoaobtenodeimagenstridimensionaisdealta
resoluo,dealvosmarcadoscomfluorocromosmuitoespecficos.[3][20]

Destemodo,atcnicaconsistenamarcaodaamostrabiolgicaemestudo,comumaoumaissondas
fluorescentesantesdeserexaminadanomicroscpio.Noentanto,apesardestepassodemarcaocomsondas
afectarinevitavelmenteoespcimenbiolgicodealgumaforma,extremamenteimportanteenecessriopois
ostecidos/estruturastecidularesnopossuemcontrastesuficienteparaseremvisualizadas.Umanicafontede
luz(laser)possuienergiasuficienteparaexcitarumelectronassondasfluorescentes,casotenhaum
comprimentodeondaadequado.Assimsendo,possvelconjugarvrioslasersqueemitememcomprimentos
deondainferiores,mascujosomatriopermiteaexcitaodeumelectro.Destemodo,apenassoexcitados
oselectresqueseencontramnopontodeintersecodoslasersequesoespecficosparaessecomprimento
deonda(somatriodoscomprimentosdeondadecadalaser).[26]

ProtenasFluorescenteseBioluminiscentes

Noestudodabiologiacelularedamedicina,aGFP,assuasvariantesgenticasedeespectrodecor(YFP
YellowCFPCyanBFPBluedsRFPRed),aluciferaseeaaequarina,tmsemostradobastanterelevantes
noestudodaposiooumovimentodecomponentescelulares(protenas,geneseestruturascelulares),[27]
variaesdasconcentraesinicasintracelulares,bemcomonadetecodaadenosinatrifostato(ATP).A
importnciadaGFPencontraserelacionadacomofactodeogenenoqualtemorigem,quandoisolado,poder
expressaraprotenanoutrosorganismosvivos.[3][17]

PreparaodeAmostrasBiolgicas

Comoemqualquertcnicalaboratorialqueenvolvaaanlisedeamostrasbiolgicasimprescindvelterem
consideraoquaisosmtodosdepreparaoideais.NocasodaMicroscopiaConfocalasamostraspodemser
organismosvivos,culturascelulares,amostrasfixadas,corteshistolgicosderotina,sendoastcnicas
adequadasaotipodeamostraeprocedimento.[3][17]

Afixao,tambmnestatcnica,deveestabelecerumequilbriocomamanutenodaantigenicidade,sendo
queofixadormaiscomumoParaformaldedoa4%tamponado,utilizadoaumatemperaturade4C.O
Formolcomercialpossui,nasuaconstituio,Metanol(615%)eoutrasimpurezasquepodemafectarafixao
e,consequentementeatcnica.

Aamostradevesersubmersaemfixadorcomligeiraagitao,sendoqueostecidosqueseencontram
osmoticamenteactivospodemapresentaralgumasalteraesmorfolgicas(retracoouexpansotecidual).[28]

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Aespessuradoscorteshistolgicosdependedadistnciadetrabalhodecadaalvo,dapenetrabilidadedo
anticorpooudofluorocromoutilizadoparacoloraoedaspropriedadesdetransparnciadotecidoqueforma
aamostra.Otempodeobservaodeveserlimitado,umavezqueosradicaislivresquesoproduzidosdurante
otempodeexcitaodosfluorocromosdanificamasclulasetecidosnofixados.

Asamostrasdevemserprotegidasdaluz,analisadasrapidamenteearmazenadasnofrio.[29]

Riscos

TendoemcontaosreagentesutilizadosnastcnicasdeMicroscopiaConfocal(fluorocromos,DAPI,meiosde
cultura,fixadores,entreoutros)consideramsemltiplosriscos,taiscomo,inflamveis,nocivos,irritantes,
txicosecancergenos.

VantagenseDesvantagens

Comotodasastecnologias,aMicroscopiaConfocalapresentadiversasvantagense
desvantagens.[30][31][32][33][34]

Vantagens Desvantagens
Imagensmultidimensionais Elevadocusto
Nmerolimitadodeondasdeexcitaodisponveis
Seccionamentoptico
comlaserscomuns
Carcternocivodaradiaolaserdealta
Melhorcontrastequeamicroscopiadeluzconvencional
intensidade
Melhorresoluoqueamicroscopiadeluzconvencional Carcternocivodasclulasetecidosvivos
Observaodaclulavivasemdestruio
Estudodevariaesinicasemclulasvivas
Observaodetecidosemtemporeal
Observaodeclulasvivassemfixaoouartefactos
deseccionamentofsico
Altaresoluo

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MicroscpioConfocal(emingls)
CentrosomeMovementintheEarlyDivisionsofCaenorhabditiselegans:ACorticalSiteDetermining
CentrosomePosition(http://www.jcb.org/cgi/reprint/109/3/1185.pdf)ArtigoCientficosobreembries
deC.elegans(emingls)
Photobleaching(http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/fluorescence/photobleaching/)Ficheiroem
JAVAqueexplicaofenmenodePhotobleaching(emingls)

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