23/10/2012

Cronograma

Entrega do Relatrio 4

Entrega do Relatrio 5

Aula:
HOJE Eletroforese (SDS-PAGE) e Sequenciamento de Protenas
Prtica 6- Procedimento A (Dilise)
Execuo e Recolhimento do exercio 7

(Prova de Protocolo + Execuo e recolhimento Exerccio 10)

23/10

30/10 Laboratrio de informtica

06/11 Simulao computacional de purificao de protenas
Exerccio de Sequenciamento

1
 23/10/2012

Tratamento da
amostra (SDS + -
mercaptoetanol)
100 C/5 min

Determinao da
massa molecular
Colorao
Descolorao

Identificao e
Sequenciamento da
protena

Dilise

Eletroforese (SDS-PAGE)

Identificao e Sequenciamento de protenas

2
 23/10/2012

Dilise
Objetivo: Remover o excesso de sais (ons) que atrapalham nas etapas de caracterizao da
protena.
Antes da dilise Depois da dilise

Protenas

ons do tampo H2O

H2PO4-/HPO42-
Na+/Cl-

Tampo fosfato 50 mM Tampo fosfato 0.025 mM Tampo fosfato 0.0000125 mM

+ NaCl 1 M (1 ml) NaCl 0.5 mM NaCl 0.00025 mM

H2O 2L (diluio de 2000x) H2O 2L (diluio de 2000x)

HOJE

-Acrescentar 20 l de tampo de amostra

- Incubar em gua fervente por 5 min

+ 20 l de Tampo de Amostra:
23/10
Tampo (Tris, pH 6.8)
Glicerol
SDS
Azul de Bromofenol
-mercaptoetanol

3
 23/10/2012

Outros mtodos para separao da protena

Filtrao sob presso
Ideal para desalinizar e concentrar amostras

A amostra forada a passar

atravs de uma membrana
contendo poros de tamanho
definido colocando-se o tubo em
uma centrfuga

Dilise

Eletroforese (SDS-PAGE)

Identificao e Sequenciamento de protenas

4
 23/10/2012

Prtica 6- SDS-PAGE
1) Receber o gel preparado e aplicar as amostras preparadas previamente

Poo 1: Padro de peso molecular

Poo 2: Lisado centrifugado
Poo 3: Material DEAE
Poo 4: Padro isolado de -galactosidase

2) Ligar a fonte

3) Eletroforese at o corante azul de

bromo-fenol atingir a base do gel. Desligar
a fonte.
4) Retirar o gel e colocar na soluo de
colorao (Azul de Coomassie) e depois na
de descolorao.

5) Visualizar as bandas das protenas.

Identificar a -glicosidase.
5) Determinar o Peso Molecular.

Eletroforese
Eletroforese descreve a migrao de uma partcula carregada
sob influncia de um campo eltrico.

+ +

Mobilidade eletrofortica: = v/E = Z/f

v=ZE
Velocidade f
de migrao
Fora do campo eltrico
Carga Lquida (V. cm-1)
Coeficiente Friccional
(resistncia encontrada pelo on;
Voet afetado pelo tamanho/forma do on)

5
 23/10/2012

Eletroforese - Aplicaes
-Acompanhamento de purificao de protenas

-Acompanhar expresso de protenas

-Isolar protenas para anlise por MS

-Determinar o tamanho (Mr) da protena

Eletroforese em Gel
PAGE do ingls polyacrylamide gel electrophoresis o tipo de eletroforese mais
utilizado para anlise de protenas

Gel formado no
1. Uso de um campo eltrico espao formado entre
duas placas de vidro
2. Uso de um polmero grapeados contendo
(poliacrilamida ou agarose) espaadores ( 1mm)
3. Protenas carregadas
negativamente migram para o
polo positivo
4. Migrao depende da carga ,
massa, e formato das protenas

Lenhinger

6
 23/10/2012

Fundamentos sobre a polimerizao do gel de Poliacrilamida

- Persulfato de amnio + TEMED: Formao de Persulfato de Amnio TEMED

Radicais Livres iniciadores da polimerizao

TEMED
S2O82 + e- SO4

- Radicais derivados do persulfato induzem a reao de

polimerizao dos monmeros de acrilamida e de bis-
acrilamida

R + M RM
RM + M RMM
RMM + M RMMM , etc.

Porosidade do gel dado pela % da acrilamida

[monmeros]
determina o
tamanho dos
poros Tamanho do poro

Ligaes cruzadas
(bis-acrilamida) Porcentagem de acrilamida:
5 %; 10 %, 15 %; 20 %; 30 %

Protenas
(SDS-PAGE)
Polmero de acrilamida
e bis-acrilamida

Gel serve como uma peneira

7
 23/10/2012

Tipos de Eletroforese

No-Desnaturante (Nativa)
Separao por carga,
Eletroforese peso molecular e forma

Desnaturante (SDS-PAGE)
Separao por
peso molecular

Agente Denaturante

Torna a protena carregada negativamente

Protenas reduzidas e desnaturadas com SDS apresentam a mesma velocidade de

migrao quando em eletroforese livre (sem o gel, somente tampo).

v=ZE
f SDS desnatura a protena
1 SDS liga a 2 resduos de aminocidos

No entanto, quando em gel as protenas so separadas segundo o seu peso molecular

Resumindo: Em SDS-PAGE as protenas so separadas basicamente pelo tamanho!

8
 23/10/2012

SDS-PAGE no redutor e redutor

No-Desnaturante (Nativa)
Separao por carga, peso molecular e
forma
Eletroforese
No-Redutora
SDS
Protena
Desnaturante (SDS-PAGE)
SDS
Separao por peso
molecular
-mercaptoetanol
Redutora Ou DTT

Experimentos em SDS-PAGE no-redutor e redutor permitem observar a presena de

dmeros e outras protenas contendo pontes de disulfeto.

9
 23/10/2012

Gel de aplicao ou empilhamento

Visualizao de Protenas aps Eletroforese

1. Colorao com o corante

(Coomassie blue, Prata)
2. Descolorao com cido actico

Lenhinger

10
 23/10/2012

Estimativa do Peso Molecular de Protenas

( SDS Gel Electrophoresis)

Mr

d
D

Rm =d/D
Mr = massa molecular
(ou peso molecular) D= Migrao total
d = Migrao individual de cada banda
Lenhinger

Mtodos para determinar peso molecular

SDS-PAGE Mr Preciso
5-10 %
d
D
Migrao relativa

Rm =d/D
Mr = massa molecular
(ou peso molecular)

Cromatografia de Excluso
Preciso
10 %
Eluio relativa

Espectrometria de Massas

Mtodo bastante sensvel

Fornece valores de PM com
alta presiso
Preciso
0.001 %

11
 23/10/2012

Eletroforese em
Gel-Bidimensional
Objetivo: Maximizar a separao de protenas

(c) Eletroforese em gel bidimensional

Primeira Dimenso Segunda Dimenso
Focalizao isoeltrica SDS gel electrophoresis
Separa de acordo com o pI Separa de acordo com o tamanho

Lenhinger

12
 23/10/2012

Focalizao Isoeltrica
1. Eletroforese em gradiente de pH
2. Protenas so distribudas ao longo
do gradiente de pH de acordo com o
valor do seu pI.
3. Cada protena focalizada em uma
faixa estreita de pH prxima ao seu
pI

Lenhinger

Eletroforese em gel bidimensional das protenas de E. coli

- mais de 2,000 protenas podem ser visualizadas

Utilizada para comparar nveis de expresso de protenas

Protenas de interesse podem ser identificadas utilizando-se anticorpos
Protenas so identificadas por espectrometria de massas
Lenhinger

13
 23/10/2012

Dilise

Eletroforese (SDS-PAGE)

Identificao e Sequenciamento de protenas

O sequenciamento da protena fornece informaes

acerca da estrutura primria

Espectrometria de massas

14
 23/10/2012

A sequncia de aminocidos pode ser determinada pela

sequncia do DNA do gene que o codifica

Proteoma

Genoma

No entanto, sequenciamento do gene NO:

- Localiza pontes de disulfeto (S-S)
- Identifica modificaes ps-traducionais

Sequenciamento de Protenas

15
 23/10/2012

(a) Determinao da composio/proporo de aminocidos: Hidrlise cida (HCl 6 M)

1) hidrlise tambm pode ser realizada em meio bsico, utilizando 2-4 M de NaOH
2) A hidrlise tambm pode ser realizada por digesto enzimtica: Ex. Pronase
(mistura de proteases)
3) A separao e anlise dos aminocidos pode ser feita por diversas tcnicas
como HPLC ou cromatografia em camada delgada (TLC).

Na TLC (thin layer chromatografy) os aminocidos

so revelados (p. ex. com nihidrina) e identificados
Fig 7-6 Separao e Anlise de utilizando-se padres.
aminocidos por HPLC. (Voet 3ed).

(b) Identificao da extremidade amino-terminal utilizando:

Reagente de Sanger (1-fluor-2,4-dinitrobenzeno, FNDB)

16
 23/10/2012

(c) Sequenciamento de toda a cadeia polipetdica: Degradao de Edman

Fenilisotiocianato (PITC)

cido trifluoractico

(c) Sequenciamento de toda a cadeia polipetdica: Degradao de Edman

Limitaes:
Tempo de anlise longo
Grande quantidade de amostra

Atualmente o mtodo de
escolha para o
sequenciamento tem sido
a espectrometria de
massas

17
 23/10/2012

Sequenciamento de protenas
grandes requer a clivagem parcial da
cadeia polipeptdica (enzimas)

18
 23/10/2012

O sequenciamento dos peptdeos derivados da

clivagem parcial da protena pode ser feita por:

-Degradao de Edman
(tcnica pouco usada atualmente)

-Espectrometria de Massas
(tcnica mais utilizada atualmente devido a maior sensibilidade e
especificidade do mtodo)

Identificao e Sequenciamento de Protenas

por Espectrometria de massas (MS)

Aspectos histricos

Apesar da espectrometria de massa ser utilizada a muito anos para o estudo

de molculas orgnicas, sua aplicao para o estudo de macromolculas foi,
por muito tempo, limitado por problemas tcnicos.

Macromolculas como protenas, DNA e carboidratos so fragmentados

pelos processos necessrios para ionizar as molculas no vcuo do aparelho.

Porm, com o advento de duas novas tcnicas de ionizao, isto mudou, e

hoje a espectrometria de massas uma ferramenta importante em biologia.

19
 23/10/2012

Requisito fundamental para anlise

no espectrmetro de massas
Gerao de ons em fase gasosa
Mas como volatilizar uma macromolcula???

http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2002/fenn-lecture.html

Nobel Prizes - Chemistry

2002

John B. Fenn is the chemist who invented
the ELECTROSPRAY method
(1988).
Professor of Chemistry at Yale University,
USA, and at Virginia Commonwealth
University, USA
Koichi Tanaka research engineer who
developed the MALDI technique
(1987).
Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan.

20
 23/10/2012

Mtodos de Ionizaes Brandas

Protenas so ionizadas pela aquisio de prtons (ons c/ carga positiva)
A carga adquirida pela protonao de resduos bsicos da protena (Lys, Arg)
Massa da protena

[M + nH]n+

A ionizao por electrospray

produz protenas carregadas
com mltiplas cargas

A ionizao por MALDI produz

protenas monocarregadas

Vantagens da utilizao de espectrometria de massas

A espectrometria de massas permite determinar a massa da protena/peptdeo com alta

preciso (<0.001%). A preciso de massa na eletroforese (SDS-PAGE) de 5-10 %.

possvel identificar protenas atravs da anlise das massas do peptdeos

gerados (Peptide Mass Fingerprinting) e utilizao de softwares que fazem a
busca dos peptdeos detectados em banco de dados (p. ex. MASCOT)

Ainda mais, possvel realizar o sequenciamento completo de cada peptdeo.

Isso importante para identificao de novas protenas e de modificaes ps-
traducionais.

21
 23/10/2012

Estratgias para a identificao de protenas por espectrometria de massas

Protena Desconhecida Digesto enzimtica

Em geral a protena isolada de gel 2D...

Mistura de Peptdeos

Determinao da massa da Determinao das massas de cada peptdeo

protena intacta por espetrometria de massas
por espectrometria de massas

Busca das massas

dos peptdeos
em Banco de Dados
(PMF*)
Match No Match
(protena conhecida) (protena desconhecida)

Identificao e Sequenciamento de cada

Caracterizao da Protena peptdeo por MS/MS

Match Busca das sequncias

(protena conhecida) em banco de dados de
sequncias
(PFF**) No Match
(protena desconhecida)

Caracterizao de uma
nova protena
*PMF = Peptide Mass Fingerprinting; **PFF = Peptide Fragmentation Fingerprinting

Peptide Mass Fingerprinting

(PMF)

22
 23/10/2012

Protenas podem ser identificadas atravs das massas de peptdeos gerados na

sua hidrlise por enzimas conhecidas. Os dados das massas dos peptdeos so
colocados em um tipo de google para protenas (ex. Mascot)

Espetro de massa dos peptdeos gerados

pela clivagem da protena com uma protease

Identificao de protenas por

peptide mass fingerprint (PMF)
a) Busca em banco de dados de
protenas
b) Comparao dos peptdeos
detectados com os peptdeos tericos
obtidos na digesto de protenas com
a protease utilizada no experimento
c) Match! Identificao. ex.: MASCOT

Exemplo: Identificao da
beta-glicosidase

23
 23/10/2012

Procedimento: Remoo da banda da -glicosidase, digesto com

tripsina e anlise por espectrometria de massas

Tripsinizao

MALDI-TOF
Obs. O protocolo de digesto utilizado inclui uma alquilao prvia dos tiois livres com iodoacetamida,

Espetro de massa dos peptdeos derivados da digesto da

beta-glicosidase com tripsina Lista de
peptdeos
detectados
Intens. [a.u.]

x10 4 1179.511
m/z
698.315
742.326
2.5
780.283
866.400
936.431
2.0 963.414
963.414 1034.066
898.397
1082.483
1121.502
1.5
1154.519
1170.517
1179.511
1.0 1361.555
1333.524 1383.528
1515.656
742.326 1515.656 1728.736
0.5 1783.703
1783.703
1940.766
2065.844 2383.836
3313.082
2089.867
2938.198 4074.899
0.0
2272.853
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 2288.853
m/z
2310.801
2938.198

24
 23/10/2012

Busca no Mascot utilizando as massas dos peptdeos detectados

Lista de
peptdeos
detectados
m/z
698.315
742.326
780.283
866.400
936.431
963.414
1034.066
1082.483
1121.502
1154.519
1170.517
1179.511
1361.555
1383.528
1515.656
1728.736
1783.703
1940.766
2089.867
2272.853
2288.853
2310.801
2938.198

Modificaes variveis mais comuns

Alquilao de tiis livres

Durante o preparo da amostra para anlise no espectrmetro de massa comum realizar a

reduo de pontes de disulfeto (beta-mercaptoetanol ou DTT) e a alquilao do tiolato (SH
livre) (p. ex. alquilao com iodoacetamide)

25
 23/10/2012

As massas detectadas so comparados com as massas tericas da protena atravs

de softwares especficos (neste exemplo utilizou-se o Biotools da Bruker)

Massas detectadas Massas tericas

RESULTADO OBTIDO NO MASCOT

Scores acima de 86 so significantes (p<0.05)

O score obtido na busca foi de 121.

Portanto o resultado signifiante.

Parmatros utilizados na
busca pelo Mascot

26
 23/10/2012

Resultado do Mascot mostrando as sequncias que tiveram match (em vermelho)

O match ocorre quando a massa experimental bate com a terica

Massas que
tiveram
match

Massas que no tiveram match. Essas massas podem ser de

uma outra protena ou de peptdeos que sofreram alguma
modificao.

Concluses da busca no Mascot

Os dados de anlises dos peptdeos derivados da digesto trptica da banda

retirada do gel de eletroforese mostram que a protena purificada corresponde
beta-glicosidase de Spodoptera Frugiperda.

A cobertura da sequncia foi de 23 % com um erro de 0.5 Da. possvel atingir

uma cobertura maior usando erros maiores (47 % com um erro de 2 Da), porm
isso pode levar interpretaes errneas sobre a identificao da protena.

Apesar da cobertura ser aparentemente baixa, as sequncias que foram cobertas

(sequncias que tiveram o match) possibilitam realizar a identificao da protena
com um score de 121. Esse score indica o grau de significncia do resultado e
para a busca realizada, scores acima de 86 so significantes (p<0.05).

27
 23/10/2012

Sequenciamento de peptdeos
por espectrometria de massas
Antigamente o sequenciamento era
feito pela degradao de Edman.
Atualmente o mtodo de escolha a
espectrometria de massas.

Peptdeos podem ser fragmentados no espectrmetro de massa

A clivagem mais comum ocorre na ligao peptdica, gerando ons da srie y e b.

28
 23/10/2012

Espectro MS/MS de um peptdeo

b2-b1
= 147.02
Phe (F)

y2-y1
= 128.06
Gln (Q)

= 128.06 = 163.07 = 71.03

Lys (K)

Glu(E)

Fonte: Wilson & Walker. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology, 7ed. Captulo 9, pgina 382-383

Espectro de massa da mistura de peptdeos

Intens. [a.u.]

x10 4 1179.511

2.5

Seleo e fragmentao de peptdeo

2.0

963.414
(MS/MS)
898.397

1.5

1.0
1333.524

742.326 1515.656
0.5
1783.703
2065.844 2383.836
2938.198 3313.082 4074.899
0.0
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
m/z

Espectro de massa dos fragmentos de do on de m/z 1179.511

29
 23/10/2012

30/10/2012 (Turma A)
06/11/2012 (Turma B)

LABORATRIO DE INFORMTICA

30