Citometra de flujo Fundamentos

Introduccin: Fundamentos
Sistema de fluidos

Dra. Edith Corts Barberena

1 2
Departamento de Ciencias de la Salud

SISTEMAS INTEGRANTES
Dispersin de luz por la clula en clulas de sangre
completa lisada DE UN CITMETRO DE
FLUJO
Detectores
Punto de
interrogacin Rojo
Sistema Amarillo
ptico Verde
Fuente de luz
(Filtros
pticos) Complejidad
Tamao

Fluido
envolvente

Corriente de la
muestra Grficas para
Qu poblacin es la de mayor tamao? Cmo se sabe esto? 3 anlisis

Sistemas que componen un Sistemas que componen un

Citmetro de Flujo: Citmetro de Flujo:
Fluidos: Fluidos: Para introducir y alinear a las
clulas para ser medidas.
pticos: Aire: Actualmente no se usa.
Electrnicos:
Lquidos

Los avances en cada uno de estos sistemas ha

permitido el desarrollo de citmetros con
mayores capacidades en la medicin de clulas.

5 6

1
 Sistema de fluidos Hay dos tipos de cmaras

Filtro de aire

Bomba Punto de
de aire interrogacin
Direccin del flujo
Regulador Celda de flujo
de fluido

Punto de
Punto de interrogacin
Depsito Desperdicio interrogacin
de fluido Regulador de
Filtro la muestra

Tubo de muestra
7 8
Cerradas Abiertas

Sistema de equipos BD SISTEMA DE INYECCIN DE MUESTRA

Tubo externo

Aire

Tubo interno

Flujo de la muestra

Los citmetros BD usan Direccin del

este tipo de cmara 9
flujo de la 10
muestra

Cmara tipo BD Flujo de la muestra

Lser
Este tipo de
La diferencia de
sistema de fluidos presin entre los
Punto de
interrogacin
permite el paso fluidos ayuda a
suave, continuo y alinear a las
no pulstil de la clulas frente al
muestra. lser.

Fluido
Fluido de la muestra
envolvente

Cerradas Velocidad baja (12L/min)

11 Velocidad alta (60L/min) 12

2
 Otros sistemas de fluidos Otros sistemas de fluidos

Otros cambios en el SIP

Otros controles de fluidos Cambios en SIP
El inyector de aire est separado
Otros equipos usan bombas Tubo externo de acero inoxidable del tubo inyector.
Inyector de
peristlticas en combinacin con (como los otros). Tubo interno de Electrodo Hay dos electrodos con
aire
frenos de fluidos y polmero que baja al fondo del tubo.
microprocesador para controlar diferentes alturas que detectan el
Sistema de retro-alimentacin dual volumen de la muestra leda.
directamente el fluido de la en el diseo fludico que controla la
muestra. velocidad del flujo envolvente. Electro Tubo Ventaja: Se puede hacer conteo
do inyector celular (cls/ml).
Ventajas: El cambio en el SIP asegura Tubo de de la Desventajas: ?
Ventaja: Disminucin de costos. que se tome toda la muestra. la muestra
Compacto. Mantenimiento de Se asegura la estabilidad del flujo de muestra
bajo costo. En parte lo hace el la muestra con el control del flujo
usuario. envolvente.
Desventajas ?
Desventaja: Se obstruye 13 14
frecuentemente.

Otros sistemas de fluidos: Demostracin de alineacin

Celda de flujo microcapilar
Se modifica para evitar el uso del
flujo envolvente.
Ventaja: Sistema compacto. Se
usan menos clulas. Se producen
menos desechos. El usuario
puede remover la celda para la
limpieza (menor costo de
mantenimiento)
Posible desventaja: Que se tape
muy seguido la celda.
acstica (enfoque)
Enfoque acstico.
Las clulas son enfocadas en una
sola lnea por ondas sonoras al
pasar por una pieza que produce
ultrasonido.
Enfoque acstico apagado (OFF). Enfoque acstico encendido (ON).
Muestra alineada
Muestra desalineada.
Ventajas: Permite una mayor
amplitud de concentracin
celular. Aumento o disminucin
de velocidad del fluido sin afectar
alineacin. Compacto.
Desventaja: ?
15 16

Caractersticas de Anlisis: Luz

Fundamentos
Dispersin de la luz Fluorescencias:
Sistema ptico (Tamao y FL1,, FL2,
FL1 FL2, FL3,
FL3, FL4,
FL4,
Complejidad) FL5.
FL5 .

17

3
 Dispersin de luz por la clula
Dispersin lateral Cmo se identifican otras caractersticas?
(SSC)
Uso de anticuerpos u otras
protenas conjugadas con
fluorocromos.
Intercalantes de ADN
fluorescentes.
Luz
Fluorocromos sensibles a pH,
del
lser especies reactivas de O, etc.
SE REQUIERE GENERAR UNA
SEAL FLUORESCENTE.
Dispersin frontal
(FSC)
19 20

Colorantes Fluorescentes Sistemas que componen un

Citmetro de Flujo: ptico.
FITC
ptica de excitacin: Una fuente de
excitacin para generar las seales.
PE

PerCP ptica de coleccin: Filtros de luz que

permiten el paso luz en longitudes de onda
Para detectar a los especfica y refleja aquella que sea
anticuerpos unidos a las APC
clulas, se requiere el uso
diferente.
de fluorocromos.

21 22

Sistemas que componen un

Citmetro de Flujo:
ptica de excitacin: Comprende una
fuente de excitacin para generar las
seales de luz y lentes para enfocar la luz
en el punto de interrogacin.
Fuentes de luz:
Lseres: Argn, kriptn ion, HeNe, etc.
Lmparas de arco (como los microscopios de
fluorescencia): Mercurio y mercurio-xenn.
23
Fuentes de luz
Se requiere que emita un nmero
relativamente grande de fotones.
Por qu?
Un tercio de la luz colectada se pierde en los
filtros pticos.
Los detectores de diodo solo convierten la
mitad de la seal luminosa a electrnica,
mientras que los fotomultiplicadores solo un
cuarto.
24

4
Caractersticas de las fuentes de Lmparas de arco y filamento,
luz. LEDs
Requieren filtros para seleccionar la
longitud de onda deseada.
Luz dispersa en todas direcciones.
Son insuficientes para la fluorescencia
dbil.
Son una alternativa barata.
Principal aplicacin: cuantificacin de ADN.
25 26

Lser
Lser
Una sola longitud de onda.
Alineamiento del lser solo por personal
Rayo de un punto pequeo. Iluminacin del proveedor.
uniforme.
Si se daan, el costo del cambio es alto.
La mayora producen entre 10 a 25 mW.
Enfriamiento depende del poder del lser:
10 a 25 mW, enfriamiento por aire.
200 mW, enfriamiento por agua.

27 28

ptica de excitacin Esquema general del sistema ptico

FL1 verde Lente de enfoque
Laser Longitud de Fluorocromos
onda Fotodetector

Azul 488 nm FITC, PE, PerCP, SSC azul Filtro de barrera

Argon-in PerCP-Cy5
Filtro dicroico
FL2 naranja
Celda
Rojo 635 nm APC
Diodo FL3 rojo

Violeta 407 nm Pacific Blue,

Alexa Fluor 407 y Lser
430, otros. FSC azul
30
29

5
 Esquema general del sistema ptico Filtros de luz y semi-espejos
FL1 verde Lente de enfoque
(lentes dicroicos) Bandpass
Longpass (LP) Shortpass (SP) De intervalo
De longitud amplia De longitud corta Ancho de banda
Fotodetector 500 520 480 500 520
PMT

500 520
SSC
PMT Filtro de barrera
FL2
Filtro dicroico

480
PMT
Celda
FL4
PMT
LP500 SP500 500/50
FL3

Lser azul
FSC azul 400 500 600 400 500 600 400 500 600
32
Lser rojo
*Crean que era paso de banda? A bailar!

FL1
ptica de adquisicin *Modificado del manual
488/10
530/30

del FACSCalibur SSC

Detector Filtro Color Fluorocromos

Divisor de haz 90/10

FL1 530/30 Verde FITC FL2
585/42

nm
FL4 Espejo dicroico Espejo dicroico 560SP
FL2 585/42 Amarillo- PE 640LP
661/16
nm naranja

FL3 670nm LP Rojo PerCP, PerCP- Semi-espejo

Cy5.5 670LP

FL3
FL4 661/16 Rojo-naranja APC
nm Lser de 488nm
Lser de diodo rojo Diodo de FSC
33 Lente de enfoque Celda de flujo 488/10 34

Fibra
Cambios en la ptica Seal del ptica Filtro de
lser azul intervalo

B
Diseo de pastel Diseo octagonal D
Arreglo de fotomultiplicadores en Lseres Filtro
forma de pastel. Lentes para moldear y dicroico
Se reemplazan los lentes de enfocar los lseres F
enfoque y se disminuye el Uso de fibra ptica.
nmero de semi-espejos. Se simplifica el cambio de G
Incrementa la captacin de la luz filtros y espejos.
al evitar la prdida. H
Se reducen los problemas de la
alineacin de los lseres. E
Sistema muy compacto. A
C

Arreglo octagonal
35 36

6
 Sistema electrnico

Citometra de flujo Convierte las seales pticas a seales electrnicas

usando detectores de luz y amplificadores de seal.

Sistema electrnico: Deteccin de

seales Cada medida tomada de cada detector
es referida como un parmetro.

Los datos son adquiridos como una

lista de valores de cada parmetro
(variable) por cada evento (clula)
37 38

FL1
530/30
Seales generadas al incidir el lser en Detectores: PMT SSC
488/10

la clula
Dispersin lateral (SSC) Filtro
Divisor de haz 90/10
585/42
FL2

FL4 Filtro 560SP

Filtro 640LP
Lser 661/16
Fotodiodo

Semi-espejo

670LP
Detector: Diodo
FL3

Dispersin frontal (FSC)

Lser de 488nm
39 Lser de diodo rojo Diodo40
de FSC
Lente de enfoque Celda de flujo 488/10

Deteccin de seales Fotodiodo

Es un semiconductor.
Sensible a la luz.
No requiere de fuente de poder externa
para funcionar.
Tiempo Tiempo Tiempo

Lser Lser Lser

41 42

7
 Conversin de las seales pticas en
seales proporcionales electrnicas.
Deteccin de la dispersin de luz frontal
Pulsos en voltaje

LIN

FSC
SSC Filtro Fotn Pre-
amplificador LIN
FITC
Tiempo
Fotodiodo LOG

Fotodiodo Niveles
Lser PE
Parmetro Levels
FSC El detector de FSC convierte luz
E00
E01 dispersada hacia delante en un pulso
FACSCalibur E02
E03
de voltaje proporcional al tamao de la
E-1 clula o partcula.
FSC
El detector de FSC convierte luz dispersada hacia delante en un
43 44
pulso de voltaje proporcional al tamao de la clula o partcula.

Fotomultiplicador (PMT)
Dispersin lateral y fluorescencia
Fotoctodo Tubo al vaco Electrones
Dispersin lateral (SSC) Filtro

-- - -- -- - Salida de la

-- -- ---- corriente de la
- seal

Lser Fotodiodo

Componentes electrnicos para generar el Dinodo

gradiente de voltaje
Suministro
de alto
voltaje
El detector de SSC convierte la luz dispersada Dispersin frontal (FSC)
lateralmente en un pulso de voltaje proporcional
al contenido en orgnulos membranosos 45 Modificado de Bogh y Duling, 1993. 46
(granularidad).

Conversin de la seales pticas en seales

Partes de un tubo fotomultiplicador proporcionales electrnicas.
Pulsos en voltaje

(PMT)
SSC

LIN
Fotoctodo. Salida de la seal

Fotn
LOG
Sistema de entrada
FL1

Fuente de
electro-ptica. LOG
poder del PMT
Voltaje
150-999 v
Multiplicador de
FL2

electrones. Parmetro
nodo. Parameter
FL3

SSC
FL1
FL2
FL3
FL4

FL4
47 48

Tiempo

8
 Cuantificacin de un pulso de voltaje. Anlisis de la altura y conversin digital.

FSC

SSC

FL1

FL2

FL3
Lser Clula Lser

Tiempo Tiempo Tiempo Tiempo Tiempo

Anlisis de la altura del pulso
rea del pulso rea del pulso
Altura del pulso

Convertidor anlogo-
Volts

digital 0.01v/canal

Interfase GP10

Ancho del pulso Ancho del pulso

Tiempo 49 50
0 1000

Amplificacin de seales Sistema electrnico

Lineal La conversin de la seal de voltaje analgico a
(intervalos regulares) digital da como resultado valores que son mostrados
apropiada para: en un eje dividido en canales.
Seales que oscilan en
un intervalo limitado Cada canal corresponde a un valor de voltaje de la
(0-1,000) seal.
Con distribuciones con
picos estrechos como
el contenido en DNA.
Logartmica
(intervalos crecientes)
Cubre un intervalo ms
amplio de variacin de 0 64 128 192 256 0 64 128 192 256
52
la seal (0-10,000). 51

Sistema electrnico: Datos Sistema electrnico: visualizacin

Datos de adquisicin en modo de lista
Los datos se muestran en forma de una grfica a
travs de un programa (software).
Event Param1 Param2 Param3 Param4
FS SS FITC PE
1 50 100 80 90
Parmetro 2

2 55 110 150 95

3 110 60 80 30

53
Parmetro 1 54

9
 Vocabulario
Parmetro: Caracterstica fsica o qumica
Anlisis de datos de una clula.
Intrnseca: Se obtiene sin necesidad de
reactivos. Ej. Desviacin de luz,
O como se pueden visualizar los autofluorescencia.
datos. Extrnseca: Se usan reactivos para revelarlos.

Por cierto, se le dicen pruebas al uso de reactivos

en citometra.
55 56

Histograma Grficos de punto (Dot plots)

Se obtienen grficos
por combinacin de
dos parmetros. Granulocitos

Mejor visualizacin de
poblaciones.
En este ejemplo se Monocitos

Histograma de side scatter (90) de una muestra de grafican linealmente Linfocitos

sangre lisada y marcada con anticuerpos la desviacin frontal y
fluorescentes. Shapiro, 2004. la lateral de luz.
57 58

Picos y valles Grficas de punto tridimensionales

Una manera que era Shapiro les llama

muy utilizada es el grficos de nube.
histograma de dos Es difcil interpretar
parmetros. estas grficas.
En este ejemplo se Una poblacin puede
grafica SSC y la quedar cubierta por
fluorescencia en otra.
escala logartmica.

59 60

10
 Grfica de densidad Grficos de contorno
Los colores o la
intensidad de un color
indican abundancia de
eventos.

61 62

Gate Gate
Se puede definir como la seleccin de una
Qu es un gate?
regin de anlisis para visualizar una
Qu significa hacer un gating? poblacin en otra grfica y parmetros.
Con
Singating
gating
Complejidad relativa

Complejidad relativa

Granulocitos B
Granulocitos

Monocitos
Monocitos
Linfocitos Linfocitos T

Tamao relativo 63 64
Tamao relativo

Vocabulario Vocabulario
Citometra multiparamtrica: Se realizan FSC: Desviacin de luz frontal o de ngulo
mediciones simultneas de un nmero de pequeo. Las siglas se derivan de las
diferentes substancias en las clulas. palabras en ingls forward scattering.

65 66

11
 Qu es la fluorescencia?
Vocabulario
Las molculas fluorescentes tienen la capacidad de
SSC: Desviacin de luz lateral, ortogonal, absorber energa de la luz.luz. Se les conoce como
90 o de ngulo amplio. Las siglas se fluorescencia o fluorforo
fluorforo..

derivan de las palabras en ingls side El fluorocromo libera la energa en forma por:
por:
scattering. Vibracin y disipacin de calor
calor..

> 530 nm
488 nm

Energa de
Energa de
luz incidente
Estructura luz incidente
67 en comn 68

Vocabulario
Fotoblanqueamiento: El fotn blanquea
una molcula fluorescente por
rompimiento de un doble enlace.

488 nm Se rompe el doble enlace.

No hay fluorescencia.
Energa de
luz incidente
Estructura
en comn 69

12