MTODOS EMPLEADOS EN ECOLOGIA MICROBIANA

Objetivos:
Uno de los objetivos fundamentales de la Ecologa Microbiana es el estudio de
la actividad metablica de los microorganismos en su ambiente natural o bajo
condiciones de laboratorio que intentan simular el ambiente natural. En
trminos generales, la metodologa desarrollada hasta el presente para medir
actividad metablica de microorganismos incluye determinaciones de:
grado de actividad de enzimas especficas (ej. deshidrogenasas,
nitrogenasas, reductasas, celulasas, quitinasas y oxigenasas)
potencial heterotrfico (incorporacin de substratos orgnicos marcados con
radioistopos)
razn de crecimiento (estudios de la razn de incorporacin de nucletidos)
productividad primaria (sistema botellas claras - obscuras)
mineralizacin (descomposicin de materia orgnica a CO2),
carga energtica (ATP y adenilatos totales)
alargamiento de clulas bacterianas en respuesta a un substrato orgnico
que sostiene el crecimiento (Tcnica de Kogure)
procesos metablicos especiales (ej. metanognesis, declorinacin de PCB,
biotransformacin de xenobiticos); los procesos metablicos se pueden
monitorear midiendo la desaparicin de un substrato parental o la generacin
de productos intermediarios o del (los) producto(s) final(es)
actividad respiratoria asociada a cadenas de transporte de electrones
DEFINICION DE ECOLOGIA MICROBIANA:

Estudio de los microorganismos en su ambiente natural

Ambiente es todo aquello que rodea a un organismo vivo.
Por ejemplo los factores qumicos, fsicos y biolgicos.
Los microorganismos (MOs) son parte de comunidades organizadas
llamadas ecosistemas.
Los MOs interactan con el entorno y pueden cambiar en forma marcada
las caractersticas del mismo. Desempean papeles importantes en la
sntesis y degradacin de distintos compuestos.
MOs autotrficos: generan materia orgnica a partir de CO
MOs organotrficos: participan en la biodegradacin y reciclado de
materia orgnica.
Se puede definir un ciclo biogeoqumico para los elementos clave (C, N,
S, Fe) en el cual los mismos sufren distintos estados de xido reduccin
a medida que se mueven a travs de un ecosistema.
 Los MOs participan en las reacciones biogeoqumicas. Para muchos
elementos son los nicos capaces de generar los compuestos clave
capaces de ser utilizados por otros organismos.

LOS MICROORGANISMOS EN LA NATURALEZA

- Cualquier hbitat adecuado para el crecimiento de organismos superiores
puede tambin soportar el crecimiento de MOs. La inversa no es vlida.
-Los MOs pueden habitar la superficie de animales superiores y en algunos
casos pueden vivir dentro de plantas y animales. En tales hbitat alcanzan
grandes nmeros y pueden ser beneficiosos para las plantas o animales o ser
patgenos de sus respectivos hospedadores.
LOS MICROORGANISMOS Y EL MEDIO AMBIENTE
-El crecimiento de los MOs Los recursos nutricionales en la naturaleza depende
de Las condiciones de crecimiento
- El nicho de un organismo en particular est definido por los recursos
nutricionales, la cantidad de los mismos, el pH, la temperatura, la
disponibilidad de agua, luz y oxgeno de su hbitat.
-Cada organismo tiene un nicho primario o principal en el cual dicho organismo
es el mas exitoso.
- En la tierra existe un nmero innumerable de nichos microbianos siendo stos
en parte los responsables de la gran diversidad metablica y de la
biodiversidad de los MOs que tenemos en la actualidad.
- El hbitat de un MO es pequeo (est en relacin al tamao de los MOs), pero
pueden existir gradientes qumicos y fsicos en dicho hbitat que afecten a los
MOs.

NIVELES DE NUTRICIN Y VELOCIDAD DE CRECIMIENTO

- Los nutrientes entran al ecosistema en forma intermitente. A perodos de gran
abundancia le siguen perodos de escasez.
- Los MOs han diseado mecanismos de defensa que les permiten acumular y
almacenar materiales de reserva en forma de polmeros. Por ej. Poli-
betahidroxibutirato, alcanoatos, polisacridos (glucgeno), polifosfatos, azufre
elemental, etc.
- La velocidad de crecimiento de los MOs en la naturaleza no es la ptima o la
velocidad mxima que se da en el laboratorio. Las bacterias del suelo tienen
una velocidad de crecimiento de aproximadamente 1% de la velocidad mxima
de crecimiento obtenida en el laboratorio.
Hbitat
Tiempo de duplicacin Escherichia coli

en el intestino 12 horas
en el laboratorio 20 minutos

La disminucin de la velocidad de crecimiento en la naturaleza se debe a:

a) Baja disponibilidad de nutrientes
b) Distribucin no uniforme de los nutrientes en el hbitat
c) Efectos competitivos con otros MOs.

COMPETENCIA Y COOPERACIN MICROBIANA

La competencia por los recursos disponibles en la naturaleza es muy intensa y
el resultado depende de:
a) La tasa de incorporacin de los nutrientes
b) Las tasas metablicas inherentes a cada MO
c) La velocidad de crecimiento
- En algunos casos de competencia microbiana, un MO puede inhibir el
crecimiento de otros, por ej. con la produccin de antibiticos o de productos
txicos (Ej. el cido producido por la fermentacin de azcares).
- En algunos casos los MOs colaboran para llevar a cabo una transformacin
determinada que ninguno de ellos puede llevar a cabo por si solos. Esto se
llama sintrofa. Los organismos que participan deben convivir en un mismo
microambiente ya que el producto del metabolismo de uno de ellos debe ser de
fcil acceso para el otro.
Estas interacciones son cruciales para el xito competitivo de algunas bacterias
anaerbicas.
Otro ejemplo de relaciones cooperativas son por ej. el metabolismo
complementario entre las bacterias nitrosificantes y las nitrificantes para oxidar
el amonaco a nitrato. Otro ej. son las bacterias reductoras de sulfato y
oxidantes de sulfuro.

METODOS EN ECOLOGIA MICROBIANA

Interesan dos aspectos en la ecologa microbiana
1) La biodiversidad, es decir qu MOs y en qu nmero se encuentran en un
determinado hbitat.
2) La actividad microbiolgica, o sea como afecta la presencia de un
determinado MO al ecosistema.
Esto se puede llevar a cabo realizando las siguientes actividades:
Anlisis de las comunidades microbianas dependientes de cultivos.
Anlisis molecular de las comunidades microbianas.
Medicin de las actividades microbianas en la naturaleza.
Anlisis dependientes de cultivos: enriquecimiento y aislamiento.
- En la naturaleza los microbios existen en cultivos mezclados llamados
comunidades microbianas.
- Para aislar y estudiar un organismo particular los microbilogos utilizan
tcnicas de enriquecimiento.
- Se usan medios y condiciones de incubacin que seleccionan a un organismo
particular y contra-seleccionan a los organismos no deseados.
Ejemplo: el mtodo de Beijerinck Martinus (microbilogo holands) a quien se
deben las primeras tcnicas de cultivo de enriquecimiento para aislar la
bacteria fijadora de nitrgeno Azotobacter. Azotobacter puede crecer
rpidamente fijando N2 del aire, los medios de enriquecimiento carentes de
amonaco u otras formas de nitrgeno fijado son muy selectivos para este
organismo; las bacterias no fijadoras de nitrgeno o las bacterias fijadoras de
nitrgeno anaerbicas son contra-seleccionadas con este mtodo.

ENRIQUECIMIENTO Y AISLAMIENTO.
La columna de Winogradsky:
. Se usa para aislar y enriquecer en bacterias fototrficas prpuras y verdes,
bacterias reductoras de sulfato, y muchos otros anaerbios.
. Es un sistema anxico en miniatura.
. Se prepara llenando aproximadamente por la mitad un cilindro de vidrio
grande con un lodo rico en materia orgnica.
. El lodo es cubierto con agua de un lago, embalse o acequia y se tapa.
. Se coloca cerca de una ventana donde recibe luz solar atenuada y se deja
varias semanas.

Se desarrolla una mezcla de organismos

- Cianobacterias y algas en el tope (zona oxignica).
- Proceso de descomposicin en el lodo o sedimento produce productos
adecuados como cidos orgnicos, alcoholes y H 2, sustratos adecuados para
las bacterias
reductoras de sulfato.
- El sulfuro producido a partir del sulfato gatilla el desarrollo de las bacterias
verdes o prpuras del azufre. Se toman muestras de la columna a profundidad
para obtener muestras de cultivos anaerbicos.
- La columna de Winogradsky se ha usado para enriquecer diversos
procariotas, tanto aerobios como anaerobios. Una vez que se ha establecido un
enriquecimiento, se puede intentar obtener cultivos axnicos.
SESGO EN EL ENRIQUECIMIENTO
En el laboratorio, el organismo que est mejor adaptado a las condiciones in
vivo podra crecer mas rpido y convertirse en el organismo dominante.
Tpicamente, el organismo ms apto in vivo es solo un componente minoritario
del ecosistema.
La solucin es la dilucin del inculo. Se cree que la dilucin elimina aquellas
poblaciones minoritarias, pero de crecimiento rpido dando de este modo la
oportunidad de desarrollarse a otros miembros de la comunidad que tienen
tiempos de duplicacin mayores.
La dilucin del inculo es una prctica comn en el cultivo de enriquecimiento
en la microbiologa actual.
AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS O AXNICOS.
Los cultivos axnicos se pueden obtener a partir de cultivos de enriquecimiento
de varias maneras; los mtodos ms frecuentes son:
a) la siembra por estra en superficie (caja de Petri),
b) la siembra en profundidad (agar shake) y
c) la dilucin en lquido.
-Siembra por estra en superficie.
Para aquellos MOs que crecen bien en medio slido, este es el mtodo de
eleccin. A partir de una poblacin mixta se obtienen al estriarla en superficie
de agar colonias aisladas. Repitiendo con cada una de las colonias aisladas
este procedimiento se consigue un cultivo axnico que puede ser transferido a
un medio lquido.
-Siembra en profundidad o agar-shake La dilucin de un cultivo mixto en agar
fundido da lugar a colonias embebidas en el agar. Este mtodo es til para
purificar anaerbios. Se hacen diluciones sucesivas seriadas para obtener
cultivos puros
AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS.
El nmero ms probable. - Dilucin serial de un inculo en medio lquido hasta
que el tubo final en la serie no muestre crecimiento.
- Conocida como la tcnica del nmero ms probable (NMP).
-Se usa para estimar el nmero de microorganismos en alimentos, aguas
residuales y otro tipo de muestras donde el nmero necesita ser asignado en
forma rutinaria. Utilizando diluciones seriadas de 10 en 10, el ltimo tubo que
muestre crecimiento tiene que haberse originado a partir de 10 clulas o
menos. Si se repite este proceso varias veces se obtiene cultivos puros. Se
pueden usan medios altamente selectivos y condiciones de incubacin
dirigidos a uno o a un pequeo grupo de organismos, como por ej. un
determinado patgeno, o medios complejos para obtener una estimacin del
nmero total de clulas.
- El ltimo tubo que muestra crecimiento (en el ej. Es la dilucin 10-5) debe
haberse desarrollado a partir de 10 clulas o menos.
- Para obtener cultivos axnicos se utiliza como inculo la mayor dilucin que
muestra crecimiento y se repite el procedimiento.
- Para una estimacin del nmero de un tipo determinado de bacteria en una
muestra, el NMP se define como la dilucin ms elevada que muestra
crecimiento. Si el medio utilizado fuera muy selectivo, por ejemplo para
bacterias reductoras de sulfato, se podra concluir que para el caso mostrado
en la figura hay entre 10 5 y 10 6 clulas recuperables de ese organismo por
gramo de muestra. Se hacen rplicas para mayor exactitud y un blanco de
dilucin.

CULTIVOS AXNICOS DE ALTA TECNOLOGA:

Las pinzas lser
- Las pinzas de lser consisten de un microscopio ptico invertido equipado con
un lser infrarrojo enfocado con precisin y un instrumento de
micromanipulacin.
- Una clula individual del campo de visin es atrapada por el haz de rayos
lser y separada del resto de los microorganismos contaminantes.
- Es un mtodo til para aislar bacterias de crecimiento lento que pueden ser
superadas por el crecimiento rpido de otras poblaciones en los cultivos de
enriquecimiento tpicos o para organismos presentes en bajo nmero.
Pinzas de lser para el aislam

ANLISIS MOLECULAR DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS.

Viabilidad y cuantificacin mediante tcnicas de tincin.
- El colorante fluorescente DAPI (4,6-diamido-2- fenilindol) se usa con
frecuencia para teir microorganismos en hbitat opacos.
- Clulas teidas con DAPI presentan fluorescencia azul brillante y son muy
fciles de ver y contar.
- Tincin con DAPI es ampliamente usada para la enumeracin de
microorganismos en el ambiente, en alimentos y en muestras clnicas.
- Para muestras acuticas las clulas pueden ser teidas sobre la superficie de
un filtro, despus que la muestra lquida ha sido pasada a travs del mismo. 39
Clulas de Escherichia coli despus de haber sido teidas con DAPI (4,6-
diamido-2-fenilindol) DAPI es un colorante fluorescente inespecfico que tie
cidos nucleicos y no suele reaccionar con la materia inerte. DAPI es una forma
razonable de estimar el nmero de clulas presentes en una muestra. Ventaja:
es una tcnica sencilla, no es especfica (tie todos los MOs de una muestra.
Desventaja: No diferencia entre clulas vivas y muertas, ni permite el rastreo
de organismos especficos en el ambiente.
TINCIN DE VIABLES
- Hay mtodos de tincin fluorescentes que permiten distinguir entre clulas
vivas y muertas.
- Basadas sobre la integridad de la membrana citoplasmtica (MC). A la
muestra se aaden dos colorantes (verde y rojo).
- El colorante verde penetra todas las clulas. - El colorante rojo penetra en las
clulas donde la MC no est intacta (por ejemplo clulas muertas).
- Mtodo no adecuado para examinar microscpicamente muestras naturales
debido al teido inespecfico de los materiales inertes. Se utiliza con cultivos
bacterianos de laboratorio (muestras clnicas, del ambiente y de alimentos).
Tincin de clulas viables Clulas vivas (verdes) y clulas muertas (rojas) de
Micrococcus luteus (cocos) y Bacillus cereus (bacilos) teidas por el mtodo de
tincin Live/Dead (vivas/muertas) Bac Light TM de viabilidad bacteriana. El
colorante verde penetra en todas las clulas, viables o no, mientras que el rojo,
penetra solo en aquellas clulas cuya membrana est daada (clulas
muertas). Este mtodo da una evaluacin instantnea de la viabilidad. Se
utiliza en cultivos bacterianos de laboratorio, pero no es adecuado para el
examen de muestras naturales debido a problemas de tincin inespecfica con
los materiales inertes
ANTICUERPOS FLUORESCENTES
- Explota la especificidad de anticuerpos contra los constituyentes de superficie
de un organismo particular.
- Se usa para la identificacin o seguimiento de organismos en hbitat
complejos con muchos microorganismos, tales como suelos o muestras clnicas
que contengan una mezcla de muchos organismos.
- Requiere de la preparacin de anticuerpos especficos contra el
microorganismo de inters lo cual es largo y laborioso.
- Anticuerpos relevantes clnicamente son disponibles comercialmente.
Protena fluorescente verde para el etiquetado celular Las clulas bacterianas
pueden ser alteradas mediante tcnicas de ingeniera gentica para volverlas
fluorescentes. Se puede insertar en su genoma el gen que codifica por la
protena verde fluorescente (GFP, green fluorescent protein). Al expresarse, las
clulas que contienen la GFP aparecen color verde cuando se observan con un
microscopio de luz ultravioleta. Las clulas etiquetadas con GFP se pueden
introducir en un medio, como las races de las plantas, y seguir con el
microscopio la clula etiquetada. Aunque ste mtodo no resulta til para
medir poblaciones naturales, las clulas etiquetadas con GFP se pueden
introducir en un medio, como las races de las plantas. Con ste mtodo, los
eclogos microbianos pueden estudiar in situ la competencia microbiana entre
la microbiota nativa y la cepa con GFP introducida, o evaluar el efecto de la
perturbacin en el ambiente.
La GFP tambin se puede utilizar como un gen indicador reporter fusionado a
un opern para estudiar la regulacin de la transcripcin de distintos
promotores por medicin de la fluorescencia. 46 Clulas modificadas por
ingeniera gentica que expresan la GFP (green fluorescent protein). Clulas de
Pseudomonas fluorescens modificadas por ingeniera gentica con la GFP
observadas por microscopa lser confocal. Las clulas estn adheridas a races
de cebada y presentan fluorescencia de color verde. Las clulas teidas de azul
son parte de la biota normal de las races de cebada y se han teido con el
colorante inespecfico DAPI. El uso de GFP permite rastrear las clulas
introducidas en el ambiente. Este mtodo no es un mtodo de tincin sino que
es un mtodo de etiquetado molecular.
ACTIVIDAD RESPIRATORIA ASOCIADA A LA CADENA DE TRANSPORTE
DE ELECTRONES:
Las variaciones por unidad de tiempo en la actividad respiratoria pueden ser
interpretadas como un reflejo de la actividad metablica de los
microorganismos que residen en determinado hbitat. An cuando se han
desarrollado varios instrumentos y tcnicas para medir actividad respiratoria
(ej. respirmetro-Warburg, respirmetro-YSI, microcalorimetra y pruebas
bioqumicas para medir actividad de deshidrogenasas) su utilizacin in situ ha
sido limitada. De un lado, el consumo de oxgeno en muchos ecosistemas
acuticos resulta ser muy bajo para poder ser detectado, particularmente en
ambientes marinos y por otro lado, la utilizacin del instrumento o tcnica
requiere de condiciones que difieren de las condiciones ambientales que
prevalecen in situ. Ms importante an, los resultados obtenidos por los
mtodos antes mencionados son el reflejo de medidas macroscpicas (1 cm - 1
mm). Dicha escala de medidas no puede ser relacionada con procesos
ejecutados por microorganismos que medimos en una escala mucho ms
pequea (micrmetros). El desarrollo reciente de microelectrodos selectivos
para oxgeno, xido nitroso, sulfuro y pH ha permitido estudiar la actividad
metablica de comunidades microbianas in situ. No obstante, esta tecnologa
an enfrenta algunos inconvenientes relacionados a su costo inicial, costos de
operacin para estudios in situ y a la fragilidad de los microelectrodos.
El uso de sales de tetrazolium provee de mtodos alternos indirectos para
medir actividad respiratoria asociada a una cadena de transporte de
electrones. Dichas sales se conocen desde el 1894, siendo reconocidas
inicialmente por su efecto de teir bacterias.
La reduccin de una sal de tetrazolium causa la formacin de un precipitado
insoluble de coloracin intensa, conocido con el nombre de formazn (Figura
1). Hoy da su utilizacin se extiende a: pruebas de viabilidad de semillas,
presencia y enumeracin de bacterias, pruebas de motilidad bacteriana en
agar semislido y deteccin de sistemas enzimticos de deshidrogenasas. Las
sales de tetrazolium presentan diferencias en grado de solubilidad en grasas,
tamao de los cristales de formazn que generan al reducirse y la rapidez con
que se produce la reaccin de reduccin. En trminos generales, el potencial
redox de las sales de tetrazolium al reducirse al estado formazn es de
alrededor de -0.08 voltios, relativo al electrodo de hidrgeno. De esta forma,
los tetrazoles actun como aceptadores de electrones de muchos nucletidos
de pirimidinas asociados a sistemas enzimticos (ej. deshidrogenasas).
Las sales de tetrazolium: cloruro de trifenil tetrazolium (TTC) y cloruro de iodo-
nitrotrifenil tetrazolium (INT), (Figura 2), son utilizadas frecuentemente para
medir actividad respiratoria asociada a cadenas de transporte de electrones,
dada la rapidez con que son reducidas por la mayora de los sistemas de
deshidrogenasas. Estas sales, al reducirse, se precipitan formando un complejo
insoluble en agua de color rojo intenso.
Podemos extraer el precipitado usando alcoholes (metanol, etanol o propanol)
o mezclas de solventes orgnicos (tetracloroetileno-acetona, 2:3) (Burton et al.,
1986). La eficiencia de extraccin del formazn por estos solventes es la
siguiente: tetracloroetileno-acetona > propanol > etanol > metanol. La
concentracin de formazan extrada puede ser determinada por
espectrofotometra. El uso de estas sales nos permite estimar la actividad
respiratoria ligada a cadenas de tansporte de electrones que operan bajo
condiciones aerbicas (respiracin aerbica) y anaerbicas (respiracin
anaerbica). Finalmente, es importante sealar que la reduccin de sales
tetrazolium es afectada por el pH. A pH bajos (pH < 5) se inhibe la reduccin
del TTC o del INT a la correspondiente sal formazn. Por consiguiente, es
importante considerar el pH de las muestra, cuando utilizamos la reducin de
sales tetrazolium como un indicador de la actividad respiratoria de una
comunidad de un cultivo microbiano.
Equipo y materiales:
Espectrofotmetro (VIS)
Celdas de espectrofotmetro (1 cm)
Botellas de suero de 60 ml con tapn de ter-butyl
Solucin de cloruro de 2 - iodofenil - 3 - fenil - 5 - nitrofenil
tetrazolium (2%)
Pipetas (2.0 ml y 10.0 ml)
HgCl2 (30%) Cuidado, es un material txico, utilize guantes
desechables al trabajar con esta solucin!
Etanol 100%
Centrfuga clnica o centrfuga refrigerada de alta velocidad
Tubos de cristal de 40 ml, con tapa de rosca (para centrfuga clnica)
Tubos de centrfuga plsticos de 50 ml (para centrfuga refrigerada)
METODOLOGIA
METODO PARA DETERMINAR ACTIVIDAD RESPIRATORIA ASOCIADA A
CADENAS DE TRANSPORTE DE ELECTRONES
TIPO DE MUESTRA
28.5 ml muestra de agua o
28.5 ml muestra de sedimento acuoso o
28.5 ml dilucin de sedimento o
28.5 ml de un cultivo o suspensin bacteriana
1. Transfiera muestra a botella de suero de 60 ml (con tapn de ter-butyl).
2. Aadir 1.5 ml INT (2%).
3. Incubar 1 hr, en obscuridad (incubacin in situ para muestras de campo).
4. Fijar muestra con 1.0 ml de HgCl2 (30%) (guardar a 4C o en hielo en
obscuridad).
5. Centrifugar muestra a 500 g por 20 min en centrfuga clnica (o 10,000 rpm
en centrfuga refrigerada de alta velocidad, 2C).
6. Decantar sobrenadante.
7. Aadir 5 ml etanol (100%) al pellet y agitar vigorosamente en Vortex por 2
minutos.
8. Centrifugar extracto a 400 g/20 min (centrfuga clnica) o a 10,000 rpm/10
min a 2C en centrfuga refrigerada de alta velocidad.
9. Transferir sobrenadante (a tubo de 15 ml de cristal, limpio y con tapa de
rosca).
10. Repetir extraccin INT-Formazn del pellet con 5 ml adicionales de etanol
(repetir pasos 7 - 8).
11. Mezcle el sobrenadante de la segunda extraccin con sobrenadante de
primera extraccin.
12. Leer absorbancia del extracto a 485 nm (utilice etanol 100% como blanco) .
13. Calcule concentracin de INT-Formazn en mg/L utilizando la curva
estndar .

BIBLIOGRAFIA
http://www.uprm.edu/biology/profs/massol/manual/p4-actividadmicro.pdf
http://www.iib.unsam.edu.ar/php/docencia/licenciatura/biotecnologia/2009/Micr
oBiol/Ecologia.pdf