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RELATRIO DE PS-DOUTORADO
PS-DOUTORADO JNIOR (PDJ)/CNPQ
PROJETO:
SUMRIO
2 DADOS DO ESTGIO................................................................................................... 3
3 RESUMO......................................................................................................................... 5
4 INTRODUO............................................................................................................... 6
5 OBJETIVOS.................................................................................................................... 10
6 ATIVIDADES REALIZADAS...................................................................................... 11
8 PUBLICAES.............................................................................................................. 21
9 REFERNCIAS............................................................................................................ 22
10 ANEXOS ....................................................................................................................... 25
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1 DADOS DO PROJETO
Processo: 155132/2010-5
Coordenadora do Projeto:
Prof. Dra. Zaida Ins Antoniolli Programa de Ps-Graduao em Cincia do Solo/UFSM
Vigncia inicial:
Outubro de 2010 a setembro de 2011.
Prorrogao concedida:
Outubro de 2010 a setembro de 2011.
2. DADOS DO ESTGIO
Perodo de realizao
De dezembro de 2010 a setembro de 2012.
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Dados do ps-doutorando
Nome
Ricardo Bemfica Steffen
Formao profissional
Engenheiro Agrnomo Solo (Universidade Federal de Santa Maria, 2004), Mestre em Cincia
do Solo (Universidade Federal de Santa Maria, 2007) e Doutor em Cincia do Solo
(Universidade Federal de Santa Maria, 2010).
E-mail: bemfica_steffen@yahoo.com.br
Dados da orientadora
Nome
Zaida Ins Antoniolli
Formao profissional
Biloga (Cincias Biolgicas, Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande do Sul, 1984),
Especialista em Biotecnologia (Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 1988), Mestre
em Fitotecnia (Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 1988), Doutora em Ecology of
Mycorrhizal Molecular Aspects (University of Adelaide, 1999).
Atuao profissional atual
Professora Associada do Departamento de Solos da Universidade Federal de Santa Maria.
Endereo profissional
Laboratrio de Microbiologia e Biologia do Solo e Ambiente, Sala 3310, Departamento de
Solos, Centro de Cincias Rurais, Prdio 42. Avenida Roraima, nmero 1000, Cep: 97.105-
900. Telefone: (55) 3220 8108.
E-mail: zantoniolli@gmail.com
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3 RESUMO
4 INTRODUO
com 90% das espcies arbreas de clima temperado, principalmente com as pertencentes s
famlias Pinaceae (95%), Fagaceae (94%), Betulaceae (70%) e Salicaceae (83%)
(OLIVEIRA; GIACHINI, 1999; MOLINA et al., 2005).
H indcios de que estes microrganismos contriburam para a extenso de florestas
para reas ambientalmente degradadas. Segundo Brunner (2001), o estabelecimento de mudas
florestais em solos deficientes em nutrientes ou contaminados pela deposio de certos
poluentes se torna possvel devido simbiose destas plantas com fECM.
Em solos que apresentam limitaes quanto a sua fertilidade, a inoculao de fECM
promove aumento na sobrevivncia das plantas aps o transplante (SILVA et al., 2003;
MELLO et al., 2006).
A maioria, os fungos ectomicorrzicos pertencem classe Basidiomycota, como os
gneros: Amanita, Hebeloma, Hysterangium, Laccaria, Lactarius, Rhizopogon, Russula,
Scleroderma, Suillus, Tricholoma entre outros (VELLINGA et al., 2009). Tm sido
considerada extremamente favorvel a associao destes fungos s espcies florestais
cultivadas como o Pinus spp., Eucalyptus spp. e a Acacia spp. Porm, no h relato no que se
refere s espcies ocorrentes no Bioma Pampa, o qual est inserido em um contexto de
produo silvcola, alm da escassez de conhecimento sobre associaes entre ectomicorrizas
e espcies florestais nativas, onde no so conhecidos, a priori, dados para o bioma em
questo. Conforme citam NARA e HOGETSU (2004), o papel das ectomicorrizas
fundamental na recuperao de reas impactadas ambientalmente, como o caso do Pampa,
que possui a predominncia de solos arenosos, de grande susceptibilidade ao humana.
Ademais, sabendo-se da alta especificidade apresentada por ectomicorrizas, pode-se obter
isolados de interesse para a produo florestal brasileira por meio de testes neste sentido.
Nos campos sulinos, estudos morfolgicos de ectomicorrizas caracterizam resultados
muito importantes no conhecimento da biodiversidade de espcies. Porm, nos dias atuais, o
uso da biologia molecular indispensvel, como pode ser observado nos trabalhos de Gomes
et al. (2002); Tedersoo et al. (2007); Morris et al. (2009), entre outros. Dentre as diversas
ferramentas moleculares disponveis, tem sido consenso o uso daquelas baseadas no
sequenciamento do espao interno transcrito (internal transcribed spacer ITS) do rDNA de
fungos, auxiliando na caracterizao da espcie e na construo de estudos filogenticos.
A regio ITS composta por regies no codificantes localizadas entre regies
altamente conservadas do rDNA responsveis pela codificao da subunidade menor e maior
dos ribossomos (BRIDGE; ARORA, 1998). So de fcil amplificao, possuem natureza
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5 OBJETIVOS
6 ATIVIDADES REALIZADAS
1- Santa Maria
2- Alegrete
3- Barra do Quara
4- Boror
5- Rosrio do Sul
6- Dilermando de Aguiar
7- So Pedro do Sul
8- So Borja
9- Cacequi
10- So Gabriel
11- Santiago
12- So Sep
13- Caapava do Sul
14- Lavras do Sul
15- So Vicente do Sul
16- Itaqui
17- Maambar
18- Unistalda
19- Santa Margarida do Sul
20- Bag
21- Pelotas
22- Santana da Boa Vista
23- Candiota
24- Hulha Negra
25- Uruguaiana
26- Cerrito
27- Jaguar
28- Nova Esperana do Sul
29- Santana do Livramento
30- Dom Pedrito
Figura 1. Municpios amostrados no Bioma Pampa do Rio Grande do Sul.
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Figura 2. Viagens prospectivas realizadas pelo grupo de pesquisas onde foram realizadas
coletas nas reas do Bioma Pampa (A), em diferentes ecossistemas (B), coletando-se diversos
gneros de fungos ectomicorrzicos (C e D).
Figura 3. Fungos ectomicorrzicos Lactarius deliciosus (A), Russula sp. (B), Suillus luteus (C),
Russula sp. (D), Suillus sp. (E), Scleroderma sp. (F) e gneros de fungos no identificados (G e H)
coletados em fragmentos de Pinus elliotti em municpios do Rio Grande do Sul localizados no Bioma
Pampa.
Tabela 1. Continuao...
Tabela 1. Continuao..
amplificao foram efetuadas por meio de uma desnaturao inicial a 94 C por 2 minutos,
seguida por 35 ciclos que consistiram de: desnaturao a 94 C por 1 minuto, anelamento a
55 C por 1 minuto, e extenso a 72 C por 1 minuto e 30 segundos. Por fim, realizou-se uma
extenso final a 72 C por 10 minutos.
Posteriormente amplificao, realizou-se a eletroforese dos produtos de PCR em gel
de agarose a 1,5%. A eletroforese foi conduzida em cuba horizontal contendo o gel submerso
em tampo TBE 1X (90 mM Tris-borato, 2 mM EDTA, pH 8,0). Para corar as bandas de
DNA e visualiz-las em transluminador, foi realizada a adio de 10 mg mL-1 de brometo de
etdeo, sendo o registro fotogrfico efetuado com o uso do aparato Cnon Snot S2IS.
Para purificao dos produtos de PCR utilizou-se protocolo baseado no uso de PEG
8000 a 13% descrito por DUNN e BLATTNER (1987). Adicionou-se um volume de soluo
de PEG 8000 (PEG a 13%, NaCl a 1,6M) homogeneizando-se cuidadosamente com o auxlio
de micropipeta. Este material permaneceu nesta condio overnight. Posteriormente, o
material foi centrifugado por 15 minutos a 13.000 rpm. Descartou-se a soluo de PEG e o
material passou por uma etapa de limpeza com a adio de 200 L de etanol a 70%, seguido
de uma centrifugao por 10 minutos a 13.000 rpm. O procedimento de limpeza foi repetido
por trs vezes. Por fim, os pellets foram secos temperatura ambiente com posterior eluio
em 8 L de gua ultrapura, conforme prope SAMBROOK et al. (1989).
O material foi enviado para sequenciamento onde foram utlizados os
oligonucleotdeos iniciadores ITS 1 e ITS 4. O sequenciamento foi realizado no sequenciador
Mega BACE 5000 (Amersham Bioscience), seguindo-se o protocolo fornecido pelo
fabricante. Com as sequncias analisadas obteve-se a sequncia concenso, com auxlio do
programa STADEN (STADEN et al. 1992-2000), assim como o alinhamento de sequncias
por meio do algoritmo ClustalW. As sequncias do GenBank foram escolhidas utilizando-se o
Algoritmo Megablast, disponvel na plataforma BLAST do NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e as anlises filogenticas foram realizadas com auxlio do
programa MEGA (TAMURA et al., 2006). O andamento das anlises moleculares dos
isolados est apresentado no quadro 1.
Na figura 6 apresentado o gel obtido aps a eletrofores do produto da PCR realizada
com os primers da regio ITS. Durante a realizao das anlises foi decidido incluir tambm
um par de primers para amplificar a regio 18S e posteriormente sequenci-la, uma vez que
esse dado auxilia na identificao dos fungos.
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Figura 6. Eletrofores dos produtos de PCR obtidos a partir do uso de primers que flanqueiam a
regio ITS do rDNA. A primeira coluna evidencia o padro 100 pb, onde foram destacados os
fragmentos de 850 e 650 pb. Observam-se as bandas formadas a partir da amplificao dos fungos
onde as letras PM, seguida de diferentes nmeros, representa o registro de coleta e C- o controle
negativo.
De maneira geral foi possvel amplificar a regio ITS da maioria dos fungos coletados.
Parte das sequencias j foi analisada e os resultados esto apresentados na tabela 2.
importante salientar que apenas uma frao dos resultados esto apresentados neste
relalatrio, j que muitas sequencias ainda esto sendo analisadas.
Quadro 1. Andamento das anlises moleculares realizadas nos isolados ectomicorrzicos coletados.
Extrao Extrao PCR Purificao Sequenciamento
CI1
DNA MF2 DNA MC2 18S ITS 18S ITS 18S ITS
PM 01
PM 02
PM 03
PM 04
PM 05
PM 06
PM 07
PM 08
PM 09
PM 10
PM 11
PM 12
PM 13
PM 14
PM 15
PM 16
PM 17
PM 18
PM 19
PM 20
PM 21
PM 22
PM 23
PM 24
PM 25
PM 26
PM 27
PM 28
PM 29
PM 30
PM 31
PM 32
PM 33
PM 34
PM 35
PM 36
PM 37
Lacunas sombreadas indicam tarefas j realizadas;
1
Cdigo de identificao;
2
Miclio fresco;
3
Meio de cultura.
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solidificao do meio, o frasco foi fechado com papel alumnio e plstico de PVC
transparente, para esterilizao em autoclave a 1 atm., durante 20 minutos. Aps a
autoclavagem, os erlenmeyers estavam prontos para a inoculao das plntulas com os fungos
ectomicorrzicos.
Trs discos de 10 mm de dimetro foram transferidos para os erlenmeyer de 250mL
contendo o meio MNM slido. Esses erlenmeyer foram incubados em estufa a 28 C, durante
30 dias para o crescimento do miclio fngico. Aps a preparao das sementes, duas
sementes pr-germinadas foram adicionadas em cada erlenmeyer. Os erlenmeyers foram
mantidos em incubadora com fotoperodo de 12 horas a 241 C, por perodo de 35 dias.
Durante a conduo do experimento, realizou-se rodzio dos erlenmeyers, duas vezes
por semana, atendendo s exigncias do delineamento experimental, cujo objetivo foi eliminar
possveis diferenas quanto incidncia de luz, temperatura e sombreamento. O delineamento
experimental utilizado foi o inteiramente casualizado.
Ao trmino do experimento, as plntulas das cinco espcies foram avaliadas quanto
formao de associao micorrzica com os isolados avaliados.
Nesta fase do trabalho, houve contratempos devido constante adaptao de
metodologias para conduo dos ensaios, em funo de contaminaes oriundas da incubao
das sementes florestais. De todas as espcies florestais avaliadas neste trabalho, observou-se
apenas associao ectomicorrzica in vitro da grpia (Apuleia Ieiocarpa) e da canafstula
(Peltophorum dubium) com o fungo Suillus luteus, e da espcie sibipiruna (Caesalpinia
peltophoroides) com o fungo Pisolithus sp. Nestas espcies, aps o perodo de incubao,
observou-se a presena de rede de Hartig, o que evidencia a associao ectomicorrzica
(Figura 7).
Artigos publicados
STEFFEN, R. B.; STEFFEN, G. P. K.; ANTONIOLLI, Z. I.; SILVA, R. F. da. leo essencial
de Eucalyptus grandis Hill em Maiden no estmulo micorrizao de mudas de sibipiruna
(Caesalpinia peltophoroides Benth.). Cincia Florestal, v. 22, n. 1, p. 69-78, 2012.
9 REFERNCIAS
BRIDGE, P.D.; ARORA, D.K. Interpretation of PCR methods for species definition. In:
BRIDGE, P.D.; ARORA, D.K.; REDDY, C.A.; ELANDER, R.P. Applications of PCR in
mycology. CAB International: New York, 1998. p.63-84.
BRUNNER, I. Ectomycorrhizas: their role in forest ecosystems under the impact of acidifying
pollutants. Perspectives in Plant Ecology, Evolution and Systematics, Zrich, v. 4, n. 1, p.
13-27, 2001.
GOMES, E.A. et al. Polymorphism in the internal transcribed spacer (ITS) of the ribosomal
DNA of 26 isolates of ectomycorrhizal fungi. Genetics and molecular biology, v.25, n.4,
2002. p. 477-483.
IBGE - Instituto brasileiro de geografia e estatstica. Mapa dos biomas brasileiros. Acesso
on line em 22 de maro de 2010. Disponvel em:
<http://www.ibge.gov.br/home/presidencia/noticias/21052004biomas.shtm>.
MARX, D. H. The influence of ectotrophic mycorrhizal fungi on the resistance of pine roots
to pathogenic fungi and soil bacteria. I. Antagonism of mycorrhizal fungi to root pathogenic
fungi and soil bacteria. Phytopathology, St. Paul, 59: 153-163, 1969.
RILLIG, M.C.; MUMMEY, D.L. Tansley review: mycorrhizas and soil structure. New
Phytol, v.171, 2006. p. 41-53
SMITH, S. E.; READ, D.J. Mycorrhizal symbiosis. London: Academic press, 1997. 605p.
TAMURA, K.; KUMAR, S.; NEI, M. Mega: integrated software for molecular evolutionary
genetics analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics, Baltimore, v.5,
p.150-163, 2006.
TEDERSOO, L. et al. Ectomycorrhizal fungi of the Seychelles: diversity patterns and host
shifts from the native Vateriopsis seychellarum (Dipterocarpaceae) and Intsia bijuca
(Caesalpiniaceae) to the introduced Eucalyptus robusta (Myrtaceae), but not Pinus caribea
(Pinaceae). New Phytol, v. 175, 2007. p. 321-333.
WHITE, T. J. et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for
phylogenetics. In: Innis, M.A. et al. (Eds.) PCR protocols. A guide to methods and
applications. Academic press, San Diego, 1990. p. 315-322.