Biometria Hematica (Manual)

DETERMINACIN DE HEMOGLOBINA

Objetivo: Una prueba de hemoglobina es un examen que mide la cantidad total de

hemoglobina en la sangre y casi siempre hace parte de un conteo sanguneo
completo (CSC)

Introduccin: Es una protena conjugada de color rojo integrantes de los

eritrocitos entre un 31-34%. Existen varios mtodos para determinacin como
hematina cida, hematina alcalina, oxihemoglobina, carboxihemoglobina y
cianometahemoglobina; ste ltimo es el de eleccin por que es estable en
soluciones diluidas, porque existen en el mercado estndares de
cianometahemoglobina y porque las lecturas se pueden hacer en
espectrofotmetro de uso comn y corriente.

La sangre se hemoliza por agregado de un agente densoactivo, con el

ferrocianuro de potasio se oxidan el tomo de fierro de ferroso a frrico para
producir metahemoglobina. El cianuro de potasio estabiliza la
metahemoglobina pasando de cianometahemoglobina. La cloracin producida
es directamente proporcional a la concentracin de hemoglobina presente.

Material:
o Tubos de ensayo de 13 x 100 ml
o Pipetas de 1ml
o Pipetas de Sal
o Boquillas
o Gradillas
o Gasa
o Celdas para espectrofotmetro
o Sangre capilar o venosa con anticoagulante.
Reactivos:

o EDTA al 10 % (.07 ml por .5 ml de sangre)

o Reactivo DE Drabkin:
o Ferrocianuro de potasio
o Cianuro de potasio
o Bicarbonato de potasio
o Solucin estndar de cianometahemoglobina.
Procedimiento:

1.- En un tubo de ensayo, colocar 5 ml de reactivo de Drabkin

2.- Homogeneizar bien la sangre
3.- Llenar en sangre hasta la marca de la pipeta de Salhi
4.- Introducir la pipeta con sangre al tubo de ensayo y dejar caer la sangre,
despus mezclar bien la muestra.
5.- Se deja Reposar 10 min. Para la formacin de cianometahemoglobina
6.- Calibrar primero el manmetro y despus leer a 540 nanmetros en el
espectrofotmetro contra un blanco de reactivo.
7.- comparar con la curva calibrada de estndares.

Valores de referencia:

Mujeres: 12 -14 gr/dl

Mujeres embarazadas: 11-14 gr/dl
Hombres: 13-19gr/dl
Recin nacidos: 13.19gr/dl

DETERMINACIN DEL HEMATOCRITO

Objetivo: Es el porcentaje del volumen total de sangre compuesto de glbulos

rojos. Es una medicin compuesta por el tamao y nmero de GR y casi
siempre es parte de un conteo sanguneo completo (CSC). Dicho conteo
mide el nmero de glbulos rojos (GR), glbulos blancos (GB), la cantidad total
de hemoglobina en la sangre y la fraccin de la sangre compuesta de
glbulos rojos (hematocrito).

Introduccin: El hematocrito mide el porcentaje del volumen de sangre total

pero, ocupada solamente por los eritrocitos La sangre se extrae de una vena,
usualmente de la parte interior del codo o del dorso de la mano. El sitio de
puncin se limpia con un antisptico y luego se coloca una banda elstica
alrededor del antebrazo con el fin de ejercer presin y restringir el flujo
sanguneo a travs de la vena, lo cual hace que las venas bajo la banda se
llenen de sangre.Inmediatamente despus, se introduce una aguja en la vena
y se recoge la sangre en un frasco hermtico o en una jeringa. Durante el
procedimiento, se retira la banda para restablecer la circulacin y, una vez que
se ha recogido la sangre, se retira la aguja y se cubre el sitio de puncin para
detener cualquier sangrado.En los bebs o nios pequeos, el rea se limpia
con un antisptico y se punza con una aguja o lanceta para luego recoger la
sangre en una pipeta (tubo pequeo de vidrio), en una lmina de vidrio, sobre
una tira de examen o en un recipiente pequeo. Finalmente, se puede aplicar
un algodn o un vendaje en el sitio de la puncin si el sangrado persiste.En el
laboratorio, se toma un poco de la sangre y se introduce en una mquina
centrfuga, proceso que impulsa las clulas hacia el fondo del recipiente. La
porcin celular se compara con la cantidad total de la sangre y se expresa en
porcentaje. De hecho, dicha porcin celular representa casi la totalidad de los
glbulos rojos, mientras que el porcentaje de glbulos blancos es muy
pequeo.

Material:

o Tubo de Wintrobe que tiene 11.5 cm de largo x 3 mm de luz (hueco).

Para el micro se usa el tubo capilar)
o Pipeta Pasteur larga o Cnula
o Centrfuga
o Sangre capilar (micro) o venosa (macro) con anticoagulante
Procedimiento:

o Despus de extraer la muestra de sangre se coloca en el tubo de ensayo

con el anticoagulante.
o Homogenizar perfectamente la sangre haciendo girar el tubo.
o Utilizando la pipeta Pasteur o canula para llenar de sangre el tubo de
Wintrobe exactamente hasta 10, no deben quedar burbujas de aire en
el tubo
o Centrfuga a 3600 rpm. Durante 30 min.
o Ver resultado.
Valores de referencia:

H= 47 +- 2.5
M= 42+- 2.5

CUENTA ERITROCITARIA

Objetivo: Es un examen de sangre que mide el nmero de glbulos rojos (GR)

en la sangre y casi siempre se realiza como parte de un conteo sanguneo
completo (CSC) Consiste en diluir la sangre con el lquido de Hayem en una
proporcin exacta y luego examinar al microscopio una pequea cantidad de la
muestra colocada en la cmara de Neubauer, contando el nmero de
elementos que se encuentran en el retculo de la cmara y mediante una
operacin matemtica se obtiene la cifra total.

Introduccin: Los glbulos rojos sanguneos transportan la hemoglobina

que, a su vez, transporta el oxgeno. La cantidad de oxgeno recibida por el
tejido depende de la cantidad y funcin de los glbulos rojos y la hemoglobina.
Normalmente, los glbulos rojos sobreviven aproximadamente 120 das en la
sangre, luego son removidos por clulas especializadas en el bazo y en el
hgado. Cuando la eritropoysis tiene lugar normalmente, su resultado final es
la produccin de una clula-eritrocito perfectamente diferenciada y apta para
su funcin principal que es la de transportar oxgeno y CO2 . La falta de ncleo
le confiere la virtud de acarrear el oxgeno sin consumir prcticamente nada de
el; su forma bicncava es la que mejor se presta para afrontar la hemlisis; su
membrana no admite la salida de hemoglobina.

Material:

o Tubos de ensayo de 13x100mm

o Pipetas de Thomas para glbulos rojos
o Cmara de Neubauer
o Boquillas
o Microscopio
o Gasa
o Gradilla
o Sangre capilar o venosa con anticoagulante
Reactivos:

o EDTA (sal di sdica) al 10%

o Lquido de Hayem:
o Cloruro de mercurio 0.5 g
o Cloruro de sodio 1.0g
o Sulfato de sodio 5.0g
o Agua destilada 100ml
Procedimiento:

o llenar con sangre bien mezclada la pipeta de Thoma, hasta la marca 0.5.
(Las pipetas estn constituidas por dos porciones capilares y un bulbo
central. El tubo capilar inferior est dividido en 10 partes iguales con
 marcos de0.5 y 1.0.En el interior del bulbo existe una perlita de plstico
(roja), para favorecer la mezcla de la sangre con el lquido y en el
capilar superior hay una marca 101)
o Se limpia cuidadosamente con gasa la parte externa de la pipeta para no
contaminar el liquido de harem al introducir la pipeta.
o Llenar la pipeta con lquido de Hayem hasta la marca 101.
o Agitar durante 3 minutos para mezclar perfectamente.
o Limpiar y Colocar el cubre hematmetro sobre la cmara.
o Desechar las primeras 3-5 gotas de la pipeta y llenar la cmara por uno
de los bordes del cubrehematmetro.
o Se deja que el lquidos penetre lentamente entre la cuadrcula y el
cubrehematmetro hasta que la plataforma de recuento este
completamente cubierta de muestra.
o Dejar reposar de 3-5 minutos sobre la platina del microscopio.
o Con objetivo de 40x se encuentra los eritrocitos contenidos en 80
cuadros pequeos; uno central y cuatro de los extremos.
Clculos:
Si se considera que el retculo central tiene 400 cuadritos se realizar el
siguiente clculo.
N x 200 x 10 x 400 = N x 10,000
80
N= nmero de eritrocitos contados
200= factor de dilucin
10= correccin x altura de la cmara
Valores de referencia:
Hombres 4.5 x 106 5.5 x 106 mm3
Mujeres 4.3 x 106 5.0 x 106 mm3

CUENTA LEUCOCITARIA

Objetivo: La sangre se diluye 1:2 con una solucin hipotnica de cido actico
que destruye a los eritrocitos.

Introduccin: La leucopoysis es un proceso que se lleva a cabo con gran

actividad, ya que si el nmero de granulositos circulantes de ninguna manera
es comparable al de los eritrocitos, en cambio se estima que la sobre vida de
los neutrfilos no excede de 5 das, de las cuales solo pasan 10 hrs. en la
sangre circulante.
El azul de metileno permite reconocer fcilmente el lquido y observar mejor
los glbulos blancos, a los que tie ligeramente

Los normoblastos no se destruyen, por lo que se deben tomar en cuenta para

corregir los resultados Sirven para clasificar a los eritrocitos de acuerdo a su
tamao y contenido de hemoglobina Se utiliza el hematocrito y la cuenta de
eritrocitos para calcular los ndices:

o VCM (Volumen Corpuscular Medio)

o CMHC (Concentracin Media de la Hemoglobina Corpuscular)
o HCM (Hemoglobina Corpuscular Media)
Es posible medir de manera directa los ndices eritrocitarios en contadores
celulares automticos. Por ejemplo: el coulter; al pasar los eritrocitos a travs
de un orificio en el cual fluye una corriente elctrica.

Material:

o Tubos de ensayo de 13 x 100mm

o Pipeta de Thoma para glbulos blancos
o Cmara de Neubauer
o Microscopio
o Boquillas
o Gasa
o Sangre capilar o venosa con anticoagulante

Reactivos:

o EDTA (sal disdica) al 10 %

o Liquido de Turk:
o cido actico glacial 3.0 ml
o Agua destilada c.b.p. 100 ml
o Adicionar 1 o 2 gotas de azul de metileno

Procedimiento

o 1.- Llenar la pipeta con sangre bien mezclados hasta la marca de .5

o 2.- Limpiar cuidadosamente la pipeta por fuera
o 3.- Aforar con solucin de Turk hasta la marca de II
o 4.- Agitar la pipeta durante 3 min.
o 5.- Se desechan las primeras 4 o 5 gotas de la pipeta y se carga la
cmara de Neubauer
o 6.-Dejar reposar la cmara durante 3 min.
 o 7.- En el microscopio con el objetivo de 10x, se cuentan los leucocitos
presentes en los cuatro cuadros grandes de los extremos
o 8.- Multiplicar por 50 el promedio de los leucocitos con la siguiente
frmula Clulas contadas x 20 (dilucin) x 10 (correccin de altura) /4
(nm. De cuadro de 1mm contados)
Este factor vara si se cambia la dilucin y o el nmero de cuadros contados

-En caso de existir normoblastos (eritrocitos nucleados) deber hacer la cuenta

diferencial leucocitaria

Valores de referencia:

Leucocitos:

o Adultos: 5000 10 000 / mm3

o Recin nacidos: 10 000 25 000 / mm3
o Nios: 8000 15 000

CUENTA DIFERENCIAL LEUCOCITARIA

Introduccin:

Se realizar este proceso en caso de existir normoblastos (eritrocitos

nucleados) en la cuenta leucocitaria

Por este proceso se podr decir cuantos normoblastos hay por cada 100
leucocitos. Ejemplo:

Si hay 28 normoblastos por cada 100 leucocitos se aplica la siguiente relacin:

128 100
12000 x
x = 9375 leucocitos

La cuenta leucocitaria diferencial es el conteo del nmero de los distintos tipos

de leucocitos. Identifica a los individuos con una mayor susceptibilidad a la
infeccin

Tcnica:

La cuenta leucocitaria total circulante se divide en 5 tipos de leucocitos:

 o neutrfilos (en banda y segmentados). Su citoplasma es incoloro y tiene
mltiples granos color gris; o puede ser multilobulado, que posee cuatro
lbulos nucleares.
o eosinfilos: es redondo u ovalado, el ncleo posee no ms de tres
lbulos y en el citoplasma se observa no mas de 20 granos color
naranja.
o basfilos: se caracterizan por sus grandes granulaciones azul oscuro.
Estos grnulos son hidrosolubles.
o linfocitos: Su citoplasma es azul plido y la cromatina nuclear color
prpura azulado oscuro; casi no posee citoplasma.
o monocitos: su ncleo suele ser arrionado. Contiene una red de
cromatina. El citoplasma se tie de un color azul grisceo y contiene
finas granulaciones color rosa.
Valores de referencia:

Neutrfilos:

*En banda 0-11%

*Segmentados 25-62%
Eosinfilos: 0-2%
Basfilos: 0-1%
Linfocitos: 25-40%
Monocitos: 3-12%

TINCIN DE WRIGHT

Fundamento: La tincin de Wright es una tincin de tipo Romanowsky. Es

extremadamente importante en el laboratorio de hematologa este tipo de
tincin, ya que puede obtenerse una cantidad abundante de informacin a
partir del examen de un frotis de sangre perifrica bien teido Una tincin de
Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidacin, as
como eosina Y o eosina B.

La accin combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky y da

una coloracin prpura a los ncleos de los leucocitos y a los grnulos
neutroflicos y de color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto
son el azul B y la eosina Y.

Las propiedades de tincin de Romanowsky dependen del enlace de los

colorantes a las estructuras qumicas y de las interacciones del azul B y la
eosina Y. Los agrupamientos de cidos nucleicos, las protenas de los ncleos
celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante bsico.

La eosina Y, colorante cido, se fija a los agrupamientos bsicos de las

molculas de hemoglobina y a las protenas bsicas.

Material:

o Frotis sanguneo
o Agua destilada
o Eosina B
o Eosina Y
o Azul de metileno
o Alcohol metlico
Procedimiento:

1.- Hacer un frotis sanguneo, ni demasiado delgado, ni que llegue al extremo

del portaobjetos
2.- Fijar el frotis con alcohol metlico y dejar secar
3.- Sumergir el portaobjetos en el hemoclorante 1, durante 5 o 6 segundos
4.- Lavar con Buffer 7.2 y sacudir para eliminar exceso
5.- Sumergir por 6-8 segundos en el hemoclorante 2
6.- Lavar con buffer 7.2 y dejar secar
7.- Observar al microscopio

CUENTA PLAQUETARIA

Introduccin: Las plaquetas son fragmentos de una clula llamada

megacariocito, se encuentran unas 250 mil x mm3 , su vida media es de 9.5
das, sus funciones principales son: coagulacin y mantener la integridad de las
paredes de los vasos.

Miden de 3-4 micras de dimetro, son redondeadas, se pueden observar con

una tincin azul de crisil brillante, no tienen ncleo; el nmero de plaquetas es
el resultado el equilibrio entre el numero de plaquetas producidas en la mdula
sea y las utilizadas, tambin de la prdida o destruccin de la sangre
perifrica.

Material:
 o sangre venosa con EDTA al 10%
o tubo de ensayo de 13 x 100ml
o pipeta de Thoma para glbulos rojos
o cmara de Neubauer
o caja de petri
o gradilla
Reactivos:

o Colorante de azul de cresil brillante

o EDTA al 10 %
Procedimiento:

1.- Asepsia y obtencin de la muestra Adultos o nios:

La sangre se extrae de una vena (puncin venosa), usualmente de la parte
interior del codo o del dorso de la mano. El sitio de puncin se limpia con un
antisptico y luego se coloca un torniquete.

Bebs o nios pequeos:

En los bebs o nios pequeos, el rea se limpia con un antisptico y se punza
con una aguja o lanceta para luego recoger la sangre en una pipeta.

2.-Descargar la pipeta en el lquido diluyente

3.-Enjuagar y llenar hasta la marca 1 y con la , muestra de sangre hasta 1.1

4.-Mezclar de 3-5 minutos

5.-Tirar las primeras 3-5 gotas

6.-cargar la cmara cuenta glbulos

7.- dejar reposar 5 minutos, en una caja petri con un papel filtro hmedo

8.- Dejar reposar la cmara

9.- observar por le objetivo 10x

10.- las plaquetas aparecen como cuerpos coloreados en todo el cuadro

central.

Clculo:
Numero de plaquetas contadas x 1000

Valores de referencia:

150 mil- 450 mil /mm3

Cuidados durante el examen:

Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un

dolor moderado, mientras que otras slo sienten un pinchazo o sensacin de
picadura. Despus, puede haber una sensacin pulstil.

El conteo plaquetario se puede ver afectado por muchos estados patolgicos.

Igualmente, se puede medir para evaluar la causa de un sangrado excesivo.

Entre los medicamentos que pueden disminuir el conteo de plaquetas estn:

agentes quimioteraputicos, cloranfenicol, colchicina, agentes bloqueadores
H2, heparina, hidralacina, indometacina, isoniacida, quinidina, estreptomicina,
sulfonamida, diurticos tiazdicos y tolbutamina.