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PESQUISA Revista Brasileira de Cincias da Sade

Research DOI:10.4034/RBCS.2013.17.01.08 Volume 17 Nmero 1 Pginas 65-70 2013


ISSN 1415-2177

Rendimento de Clulas Mesenquimais


do Tecido Adiposo Submetidas a Diferentes
Protocolos de Extrao
Adipose-Derived Mesenchymal Cells Yield Under Different
Cell Extraction Protocols
FERNANDA GINANI
DIEGO MOURA SOARES
CARLOS AUGUSTO GALVO BARBOZA

RESUMO ABSTRACT
Objetivo: Estabelecer um protocolo de extrao de clulas Objective: To establish a protocol for extraction of adipose-
mesenquimais do tecido adiposo, a partir da avaliao do derived mesenchymal cells, evaluating the cell yield in two
rendimento celular em dois mtodos de digesto enzimtica methods of tissue enzymatic digestion. Material and Methods:
do tecido. Material e Mtodos: Fragmentos de tecido adiposo Fragments of adipose tissue were removed from the inguinal
foram extrados da regio inguinal de camundongos e region of mice and processed by two different protocols:
processados por dois protocolos distintos: Grupo 1 digesto Group 1 - enzymatic digestion with collagenase I; Group 2 -
enzimtica com colagenase I; Grupo 2 digesto enzimtica enzymatic digestion with collagenase I and trypsin/EDTA,
com colagenase I e tripsina/EDTA, ambos por 1 hora a 37C. both for 1 hour at 37C. In the third passage (P3), cells from
No terceiro subcultivo (P3) as clulas dos dois grupos foram both groups were counted in a Neubauer chamber for
submetidas a contagem em Cmara de Neubauer para evaluation of cell proliferation, and growth curves were plotted
avaliao da proliferao celular e obteno da curva de at intervals of 24, 48 and 72 hours. The DAPI nuclear staining
crescimento nos intervalos de 24, 48 e 72 horas. Foi realizada was performed in both groups in a 72-hour interval to evaluate
a marcao pelo DAPI no intervalo de 72 horas, nos grupos the presence of nuclear morphological damage. Data were
estudados, para avaliar a existncia de danos morfolgicos analyzed statistically with a significance level of 5%. Results:
nucleares. Os dados foram analisados estatisticamente, com The two groups showed an upward pattern of cell growth.
nvel de significncia de 5%. Resultados: Os dois grupos The mean cell counts showed a higher cell proliferation in
exibiram um padro de crescimento celular ascendente. As group I, with a statistically significant difference between
mdias das contagens celulares demonstraram uma maior groups in intervals of 48 and 72 hours (p<0.05). Nuclear
proliferao celular no grupo I, com diferena estatisti- morphological changes were not observed in the groups.
camente significante entre os grupos nos intervalos de 48 e Conclusion: The enzymatic digestion of adipose tissue by
72 horas (p<0,05). Alteraes morfolgicas nucleares no collagenase I, without association with trypsin, improves the
foram observadas nos grupos. Concluso: A digesto yield of mesenchymal cells, what suggests the choice of
enzimtica do tecido adiposo por colagenase I, sem that protocol in experiments with this cell type.
associao com a tripsina, proporcionou melhor rendimento
das clulas mesenquimais, o que favorece a escolha desse
protocolo em experimentos com este tipo celular.

DESCRITORES DESCRIPTORS
Tecido Adiposo. Tcnicas de Cultura de Clulas. Proliferao Adipose Tissue. Cell Culture Techniques. Cell Proliferation.
Celular.

1 Biomdica. Mestranda do Programa de Ps-graduao em Odontologia do Departamento de Morfologia da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte (UFRN), Natal/RN, Brasil.
2 Cirurgio-Dentista. Mestrando do Programa de Ps-graduao em Odontologia. Departamento de Morfologia da Universidade Federal do Rio Grande
do Norte (UFRN), Natal/RN, Brasil.
3 Doutor em Patologia Bucal. Professor Associado do Departamento de Morfologia e do Programa de Ps-graduao em Odontologia da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal/RN, Brasil.

http://periodicos.ufpb.br/ojs2/index.php/rbcs
GINANI et al.

O
isolamento de uma populao de clulas antifngico (Gibco, USA), objetivando eliminar possvel
progenitoras do tecido adiposo de roedores foi contaminao.
descrito pela primeira vez por RODBELL (1964). Posteriormente, os fragmentos de tecido adiposo
VAN, RONCARI (1977) relataram que o tecido adiposo foram submetidos a dois protocolos para extrao de
de ratos adultos contm clulas com potencial para clulas mesenquimais:
proliferar e adquirir caractersticas morfolgicas
semelhantes s de adipcitos. - Grupo I: digesto enzimtica com soluo
Aps a introduo da lipoaspirao, a obteno contendo 3 mg/mL de colagenase I (Gibco).
de tecido adiposo se tornou mais fcil (ILLOUZ, 1983).
Em 2001, uma modificao nos mtodos de isolamento - Grupo II: digesto enzimtica com soluo
existentes utilizando resduos de lipoaspirao como contendo 3 mg/mL de colagenase I (Gibco) e
matria-prima demonstrou o potencial desta fonte de 1mL de tripsina/EDTA (Cultilab).
tecido abundante para futuras terapias clnicas. O tecido
adiposo humano, obtido por lipoaspirao, foi pro- Ambos os grupos foram incubados em placa de
cessado para a obteno de uma populao de clulas Petri, por 1 hora a 37C. Em seguida, o material resultante
semelhantes a fibroblastos, que foram mantidas in vitro da digesto enzimtica foi transferido para um tubo
por perodos prolongados com um crescimento celular cnico tipo Falcon, adicionado 5 mL de PBS e centri-
estvel e baixos nveis de senescncia. A citometria de fugado a 1200 rpm por 5 minutos. Os adipcitos pre-
fluxo e a imunofluorescncia mostraram que a maioria sentes no sobrenadante foram aspirados e as clulas
dessas clulas era de origem mesodrmica ou mesen- precipitadas foram submetidas a uma nova centri-
quimal (ZUK et al., 2001). fugao com PBS. O pellet celular foi processado em
Embora haja alguns debates envolvendo a origem uma peneira de 70 m e as clulas foram cultivadas em
de clulas-tronco no tecido adiposo - se realmente se meio -MEM contendo antibitico (Cultilab) e suple-
originam no tecido adiposo, ou so, talvez, clulas- mentado com 10% de soro fetal bovino (Cultilab) e
tronco mesenquimais do sangue perifrico que passam mantidas a 37 C em 5% de CO2 at atingirem 70 90%
pelo tecido adiposo esse tecido representa uma fonte de confluncia, com troca de meio a cada trs dias.
fcil e disponvel para o isolamento de clulas-tronco Com a finalidade de identificar a natureza
potencialmente teis que podem ser obtidas em grandes multipotencial das clulas, as mesmas foram cultivadas
quantidades com morbidade mnima (LEVI, LONGAKER, em meios de diferenciao osteognico e adipognico
2011, STERODIMAS et al., 2010). No entanto, a (StemPro Differentiation Kits, Invitrogen Corp.,
padronizao dos mtodos para preparao do tecido, Carlsbad, CA, USA) por at 21 dias. Aps este perodo,
isolamento das clulas e cultivo das mesmas ainda se as clulas exibiram, na microscopia de luz, morfologia
faz necessrio. caracterstica de clulas osteoblsticas e adiposas.
Neste sentido, o objetivo do trabalho foi esta- No terceiro subcultivo (P3), as clulas foram
belecer um protocolo de extrao de clulas mesen- cultivadas em placas de 24 poos, na densidade de 3x104
quimais do tecido adiposo, a partir da avaliao do clulas/poo, durante os intervalos de 24, 48 e 72 horas
rendimento celular aps o processamento tecidual por aps o plaqueamento, com o objetivo de avaliar o
dois mtodos de digesto enzimtica. rendimento celular e obter a curva de crescimento nos
diferentes grupos. Decorridos os tempos experimentais,
as clulas foram submetidas anlise da adeso e
MATERIAL E MTODOS proliferao celular utilizando-se o mtodo de excluso
por azul de Tripan em cmara de Neubauer. A existncia
O presente trabalho foi aprovado pela CEUA/ de alteraes morfolgicas no ncleo das clulas
UFRN (protocolo 008/2009). Clulas mesenquimais do estudadas foi avaliada atravs da marcao pelo DAPI
tecido adiposo foram obtidas de dois camundongos (4-6-Diamidino-2-phenylindole), em microscpio de
albinos Swiss machos, com dois meses de idade e 30g fluorescncia, no intervalo de 72h.
de peso. Aps a eutansia, fragmentos do tecido Os dados obtidos foram submetidos anlise
adiposo foram coletados da regio inguinal e mantidos no paramtrica. Cada valor das contagens celulares
em tampo fosfato (PBS) at seu processamento. Em correspondeu mdia desvio padro da mdia de 4
cmara de fluxo laminar, o fragmento tecidual foi cortado amostras por intervalo em cada grupo. As diferenas
em fragmentos menores e submetidos a trs lavagens, entre os grupos foram comparadas pelo teste de Mann-
de 10 minutos cada, com uma soluo contendo meio - Whitney, considerando-se um nvel de significncia de
MEM (Cultilab, Brasil) enriquecido com antibitico e 5%.

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Rendimento de Clulas Mesenquimais do Tecido Adiposo Submetidas a Diferentes Protocolos de Extrao

RESULTADOS colagenase associada tripisina/EDTA. Verificou-se


significncia estatstica entre os grupos nos intervalos
Os dois protocolos estudados permitiram um de 48 e 72h (Tabela 1).
padro de crescimento ascendente das clulas mesen- Na anlise em microscopia de fluorescncia no
quimais derivadas do tecido adiposo, como mostra a foram observadas alteraes morfolgicas, como
Figura 1. fragmentaes nucleares e ncleos picnticos, nas
A extrao realizada apenas com colagenase clulas mesenquimais extradas por meio dos protocolos
exibiu um ndice proliferativo estatisticamente mais estudados (Figura 2).
acentuado quando comparada com a que utilizou

Figura 1. Curva de crescimento das clulas mesenquimais derivadas do tecido adiposo nos
intervalos de tempo estudados.

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GINANI et al.

Figura 2 - Fotomicrografia das clulas do Grupo I (A) e Grupo II (B), aps 72 horas de cultivo celular.
(Colorao DAPI, 40x)

DISCUSSO Quando se busca extrair clulas-tronco de tecidos


dentais (polpa e ligamento periodontal), por exemplo, a
O tecido adiposo representa uma fonte abun- associao da colagenase I com a dispase bastante
dante de clulas-tronco com grande plasticidade, de fcil realizada (VASCONCELOS et al., 2011, PAPACCIO et
acessibilidade e extremamente disponvel em proce- al., 2006); todavia, esta ltima enzima no utilizada na
dimentos de lipoaspirao (LEVI, LONGAKER, 2011). digesto do tecido adiposo.
Mesmo aps algumas dcadas do isolamento de clulas- Neste estudo, optamos por testar a capacidade
tronco do tecido adiposo, os protocolos para a extrao proliferativa das clulas obtidas aps o processamento
desse tipo celular ainda no esto bem estabelecidos. tecidual com colagenase tipo I isoladamente ou
Diversos protocolos para digesto tecidual tm sido associada tripsina/EDTA. Com isso, observamos um
descritos, sendo a colagenase tipo I com ou sem melhor rendimento celular quando a extrao realizada
associao a outra soluo a enzima mais utilizada sem a associao da colagenase com a tripisina/EDTA.
(DE GIROLAMO et al., 2011, FAUSTINI et al., 2010). A Os resultados menos favorveis do rendimento celular
literatura revela que uma digesto efetiva tambm pode para o grupo extrado com colagenase e tripsina/EDTA
ser obtida com colagenase tipo II (GASTALDI et al., pode ser explicado pelo fato de que a tripsina, quando
2010), enzima RTase (KO et al., 2011), colagenase tipo II utilizada por um longo perodo de tempo, pode clivar
com soluo salina balanceada de Hanks (TALNS- receptores de fatores de crescimento na superfcie celular
VISCONTI et al., 2006) e colagenase tipo I associada ou protenas de membrana, comprometendo a atividade
tripsina (ZHU et al., 2008), albumina de soro bovino celular (HUANG et al., 2010).
(LEE, KIM, KIM, 2010), ao tampo fosfato salino Em relao aos possveis danos morfolgicos
(GONDA et al., 2008, LIU et al., 2008) ou ao tampo nucleares, estes no foram verificados em nenhum dos
fosfato salino com soro bovino (MARINO et al., 2010, protocolos utilizados no presente estudo, demonstrando
MITCHELL et al., 2006). que a ao das duas enzimas restringe-se membrana
Normalmente a extrao celular de um tipo de celular.
tecido especfico realizada com base em protocolos Os resultados deste estudo mostram uma maior
que foram estabelecidos, esperando que rendimentos capacidade proliferativa das clulas quando a digesto
semelhantes sejam conseguidos posteriormente. enzimtica do tecido adiposo realizada com colagenase,

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Rendimento de Clulas Mesenquimais do Tecido Adiposo Submetidas a Diferentes Protocolos de Extrao

corroborando com os resultados encontrados por DE CONCLUSO


GIROLAMO et al., (2011) e FAUSTINI et al., (2010).
Este fato contribui para a utilizao deste protocolo para A digesto enzimtica do tecido adiposo por
isolamento de clulas mesenquimais derivadas do tecido colagenase, sem associao com a tripsina, propor-
adiposo para utilizao em futuras terapias regene- cionou melhor rendimento das clulas mesenquimais, o
rativas, visto que se faz necessrio uma quantidade que favorece a escolha desse protocolo em estudos
adequada de clulas viveis para aplicao clnica. posteriores com este tipo celular.

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