Adicion Cepas Lacticas Probioticas en Leche en Polvo 26mg% Uach

Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias Agrarias

Escuela de Graduados
ADICIN DE CEPAS LCTICAS PROBITICAS EN

LECHE EN POLVO 26% MG
TESIS DE MAGSTER
PATRICIA CABEZN PALOMINOS
VALDIVIA CHILE
2010
ADICIN DE CEPAS LCTICAS PROBITICAS EN
LECHE EN POLVO 26% MG
Tesis presentada a la Facultad de Ciencias Agrarias de la

Universidad Austral de Chile en cumplimiento parcial de los
requisitos para optar al Grado de Magster en Ciencia y
Tecnologa de la Leche
por
VALDIVIA - CHILE
2010
Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias Agrarias
INFORME DE APROBACIN TESIS DE MAGISTER
La Comisin Evaluadora de Tesis comunica al Director de la Escuela de

Graduados de la Facultad de Ciencias Agrarias que la Tesis de Magster
presentada por el candidato
Ha sido aprobada en el examen de defensa de Tesis rendido el da 10 de Enero

de 2011, como requisito para optar al grado de Magster en Ciencia y
Tecnologa de la Leche y, para que as conste para todos los efectos firman:
Profesor Patrocinante:
..
Renate Schbitz T.
Tec. Mdico, M.Sc. Food Microbiology
Instituto de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos
Profesores informantes:

Carmen Brito C.
Ingeniero en Alimentos, M.Sc. Food Science
.
Fernando Espina U.
Ingeniero Agrnomo, M.Sc. Food Science
A mis maravillosos padres Lily y Patricio
hermanas, cuaito y sobrino Vicente
el regalo ms bello
que Dios me ha
dado como
familia
AGRADECIMIENTOS
Deseo expresar mis agradecimientos sinceros a todas aquellas personas que

participaron en la realizacin de mi memoria de titulo, muy especialmente a la:
Profesora Renate Schbitz por su orientacin y valiosas sugerencias a travs del

curso del estudio y preparacin del manuscrito. Cario y confianza depositada en m
durante el transcurso de tesis y con quien pude compartir momentos muy
enriquecedores y gratos en lo acadmico y personal.
Profesora Carmen Brito, por su constante apoyo con su vasto conocimiento en el

sector lcteo, motivacin, cario y con quien tuve el placer de compartir mi pasin
por la msica clsica.
A los profesores Alejandro Romero (mi tutor del magster), Fernando Espina,
Marcia Costa, Emilio Teixido, Fernando Asenjo quienes en el transcurso de la
memoria, me brindaron su apoyo destacando a las profesoras Marcia Rojas y
Mariela Horzella junto con Vivi Riquelme por su incondicionalidad y afecto.
A mis panelistas sensoriales, miembros del Icytal y Yanina por buena disposicin.
A la Cooperativa Agrcola y Lechera de la Unin (Coln), Prolesur S.A. (Soprole), y

al Sr. E. Marin del laboratorio Valtek S.A. por su donaciones para este proyecto.
Dr Heriberto Fernndez, Ricardo Fuentes, Luigi Ciampi, Lus Cristi, Miguel

Aguilar, Neve Vendt y Emilio Vigliengo de Chr Hansen y Vagn Westergaard de
GEA, por entregarme sus opiniones, cada vez que fueron consultados.
A Cristian Pinargote y Mnica Obando por su compaerismo. A mis amigos

Alexandra, Javier, Natalia, lvaro, Jos Antonio y muy especialmente a la familia
que me acogi en su hogar ta Antonieta, to Arturo, Cristi, Nana, Tere, Martn y
Marisol. Sin olvidar a la Sra. Eliana, Mara Jos y ta Bernardita.
I
NDICE DE CONTENIDOS
Captulos Pgina
RESUMEN 1
SUMMARY 3
1 INTRODUCCIN 5
1.1 Hiptesis 6
1.2 Objetivo general 7
1.3 Objetivos especficos 7
2 REVISIN BIBLIOGRFICA 8
2.1 Alimentos funcionales 8
2.2 Microorganismos probiticos 10
2.3 Efecto de los probiticos en las alergias atpicas y 19
diarreas por rotavirus
2.3.1 Alergias atpicas 19
2.3.2 Diarreas por rotavirus 20
2.3.3 B. lactis Bb12 y L. rhamnosus E800 21
2.4 Leche en polvo 25
2.4.1 Incorporacin de cepas probiticas a la leche en 26
polvo
2.5 Caractersticas de los probiticos del estudio 34
2.5.1 B. lactis Bb12 34
2.5.2 L. rhamnosus E800 35
3 MATERIALES Y MTODO 37
3.1 Lugar y duracin de la investigacin 37
3.2 Materiales 37
3.2.1 Materias primas 37
3.2.1.1 Cepas utilizadas 37
3.2.1.2 Sustrato para la inoculacin de las cepas 38
3.2.1.3 Bolsas utilizadas para envasar la leche en polvo 38
II
NDICE DE CONTENIDOS
Captulos Pgina
3.2.2 Equipos 38
3.2.2.1 Unidad de liofilizado 38
3.2.2.2 Mquina envasadora con sistema barrido 38
3.2.2.3 Cmara de almacenamiento termoreguladas 38
3.2.2.4 Cmara de congelacin 38
3.3 Metodologa de trabajo 38
3.3.1 Obtencin de cultivo celular en fermentador 38
3.3.2 Control del cultivo celular 39
3.3.2.1 Determinacin de absorbancia 39
3.3.2.2 Neutralizante 39
3.3.2.3 Control microscpico de los cultivos 39
3.3.2.4 Recuento de microorganismos probiticos 39
3.3.3 Liofilizacin de los cultivos celulares 41
3.3.3.1 Concentracin celular 41
3.3.3.2 Congelacin 41
3.3.3.3 Liofilizacin 41
3.3.3.4 Refrigeracin 41
3.3.4 Control posterior al proceso de liofilizacin 42
3.3.4.1 Recuento microbiolgico de cada cultivo 42
3.3.4.2 Anlisis de la humedad 42
3.3.5 Inoculacin y homogeneizacin de las cepas en la 42
leche en polvo y almacenamiento a temperatura
ambiente
3.3.6 Evaluacin del efecto de la temperatura de 43
almacenamiento y tiempo de almacenamiento de
la leche en polvo sobre la supervivencia de L.
rhamnosus E800 y B. lactis Bb12
3.3.7 Evaluacin del efecto de la temperatura de 44
reconstitucin de la leche sobre la viabilidad de las
cepas L. rhamnosus E800 y B. lactis Bb12
3.3.8 Evaluacin del efecto de las cepas probiticas 44
sobre las caractersticas organolptica de la leche
reconstituida, sometida a dos tiempos de
reconstitucin
III
NDICE DE CONTENIDOS
Captulos Pgina
3.3.9 Evaluacin fsico qumica 48
3.3.9.1 Viscosidad 48
3.3.9.2 Acidez 48
3.4 Diseo experimental y anlisis estadstico 48
4 PRESENTACIN Y DISCUSIN DE 50
RESULTADOS
4.1 Cultivo celular de cepas probiticas 50
4.1.1 Crecimiento de L. rhamnosus E800 en caldo GEM 50
4.1.2 Crecimiento de B. lactis Bb12 en caldo GEM 51
4.2 Efecto del liofilizado sobre la viabilidad de las 56
cepas probiticas
4.3 Efecto de la temperatura de almacenamiento en la 59
viabilidad de las cepas probiticas inoculadas en la
leche en polvo entera
4.4 Efecto de la temperatura de reconstitucin de la 75
leche en polvo sobre la viabilidad de las cepas
probiticas
4.5 Evaluacin de las caractersticas sensorial y fsico 82
qumica de los tratamientos sobre la leche en
polvo
4.5.1 Evaluacin sensorial 82
4.5.2 Acidez titulable 89
4.5.3 Viscosidad 91
4.5.4 Textura 94
5 CONCLUSIONES 96
6 BIBLIOGRAFA 98
7 ANEXOS 112
IV
NDICE DE TABLAS
Tabla Pgina
1 Alimentos con probiticos comercializados en Chile 15
2 Principales beneficios sobre la salud de las cepas 18
probiticas disponibles en Chile
3 Diseo experimental 49
4 Parmetros cinticos obtenidos en las cepas probiticas 54
en los distintos cultivos celulares en caldo GEM a pH
5,8
5 Efecto del liofilizado en la viabilidad de las cepas 56
probiticas en los distintos cultivos celulares
6 Evolucin de los probiticos viables hasta la adicin a la 60
leche en polvo
7 Evolucin de probiticos viables en leche en polvo (log 65
ufc/g + DE) y cultivo inicial almacenados a 25C + 2C
8 Efecto de tiempo de almacenamiento a 25 + 2C en la 67
viabilidad de las cepas probiticas
10 Efecto global del almacenamiento en la viabilidad de las 74
cepas probiticas adicionadas a la leche en polvo,
despus de 60 das
ufc/g + DE) a los 60 das de almacenamiento de la leche
en polvo a 25C y reconstituidas a 40C+ 2C
ufc/g + DE) a los 60 das de almacenamiento de la leche
en polvo a 25C y reconstituidas a 60C+ 2C
13 Promedio de acidez titulable de los tratamientos al 90
inicio, mitad y fines del almacenamiento a 25C + 2C
al cabo de 60 y 180 min
V
NDICE DE FIGURAS
Figura Pgina
1 Curva de crecimiento de L rhamnosus E800, (VTT 51
Technical Research Centre of Finland) en caldo G.E.M a
37C, con control de pH a 5,8
2 Curva de crecimiento de B. lactis Bb12 (Chr 52
Hansen) en caldo G.E.M a 37C (A) y 39C (B), con
control de pH a 5,8
3 Viabilidad de L rhamnosus E800, (VTT Technical 63
Research Centre of Finland), (T1), (A) y B. lactis
Bb12 (Chr Hansen), (T2), (B) durante el
almacenamiento a 25C y 40C
4 Interacciones entre las temperaturas de cmara y los das 64
de almacenamiento sobre la viabilidad de las cepas
probiticas
5 Recuento promedio de clulas viables de los 72
tratamientos con probiticos despus de los 60 das
de almacenamiento a 40C
6 Recuento de cultivos probiticos a los 60 das de 76
almacenamiento de la leche en polvo a 25C y
reconstituidas a 40C y 60C
7 Clulas viables de los cultivos probiticos por efecto de 77
la temperatura de reconstitucin
8 Promedio de los resultados de validacin del panel 84
sensorial de la leche en polvo en test triangular
9 Promedio de los resultados de evaluacin sensorial de la 86
leche en polvo a 60 min (A) y 180 min (B) de
reconstitucin en test triangular
10 Lectura de viscosidad en funcin de la velocidad de 92
rotacin, tratamientos y tiempo de reconstitucin 60 min
(A) y 180 min (B)
VI
NDICE DE ANEXOS
Anexo Pgina
1 Composicin del medio de fermentacin GEM utilizado 112
para el cultivo de L .rhamnosus E800 y B. lactis Bb12
2 Esquema general de propagacin y concentracin 113
3 Colonias de L. rhamnosus E800 en agar MRS 5,2 114
4 Colonias de B. lactis Bb12 en agar MRS- AB 115
5 Recuentos microbiolgicos de la leche en polvo 116
6 Programa para el entrenamiento de panelistas en 117

evaluacin sensorial implementado
7 Cuestionario de seleccin de panelistas 118
8 Ficha de evaluacin sensorial para el reconocimiento de 120

un sabor bsico
9 Concentracin de soluciones utilizadas para prueba de 121

reconocimiento de gustos bsicos
10 Ficha de evaluacin sensorial 122
11 Tabla de significacin estadstica para el test Triangular 123
12 Valores densidad ptica (600nm) y recuento bacteriano 124

de cultivo batch
12a Cepa L rhamnosus E800 124
12b Cepa B. lactis Bb12 tiempo 1 125
12c Cepa B. lactis Bb12 tiempo 2 125
VII
Anexo Pgina
13 Recuento de probiticos viables en leche en polvo (log 126
ufc/g + DE) almacenadas a 25C + 2C y reconstituida A
40C
ufc/g + DE) almacenadas a 25C + 2C y reconstituida A
60C
17 Determinacin del valor del tiempo de reduccin 130
decimal (D25 y D40) a partir de la recta de regresin (D=
1/K). Ejemplo de clculo
18 Anlisis estadstico para el recuento de probiticos 131
almacenados a 25C+2C y 40C+2C
almacenados A 25C + 2C
almacenados a 40C + 2C
viables en leche en polvo (log ufc/g + DE) almacenadas
a 25C + 2C y reconstituida a 40C + 2C y 60C + 2C
a 25C + 2C y reconstituida a 40C+ 2C
a 25C + 2C y reconstituida a 60C+ 2C
VIII
Anexo Pgina
24 Resultados de la validacin del panel sensorial de leche 141
en polvo en test triangular
24 Resultados test triangular para la evaluacin de leche en 141
polvo en comparacin con leche en polvo con cido
lctico incorporado
24b Resultados test triangular para la evaluacin de leche en 141
polvo en comparacin con leche en polvo oxidada con
sulfato de cobre incorporado
25 Resultados evaluacin sensorial de leche en polvo en 142

test triangular
25a Resultados tiempo 0 142
25b Resultados tiempo 30 143
25c Resultados tiempo 60 144
26 Anlisis de viscosidad de los tratamientos 145
27 Anlisis estadstico de viscosidad de los tratamientos 146
28 Descripcin tcnica del material de trilaminado de las 149

bolsas
1
RESUMEN
El objetivo de esta investigacin fue, cuantificar la supervivencia de las cepas

probiticas L. rhamnosus E800 (VTT Biotechnology) y B. lactis Bb12 (Chr.
Hansen) en leche en polvo durante su almacenamiento y evaluar el efecto de
dos condiciones de reconstitucin sobre la viabilidad de las cepas. La
suplementacin en seco de la leche en polvo se realiz a partir de cepas
comerciales de L. rhamnosus E800 y B. lactis Bb12, cultivadas y liofilizada en
los laboratorios del Instituto de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos
(ICYTAL, UACh).
Para el estudio se formularon tres tratamientos con tres repeticiones leche en

polvo: a) inoculada con L rhamnosus E800, b) con B lactis Bb12, c) con una
mezcla de ambas cepas en una proporcin de 1:1. Los tratamientos se
almacenaron a 25C y 40C y fueron envasados al vaco por dos meses, la
evaluacin de la viabilidad de las cepas se realiz quincenalmente. Para la
evaluacin del efecto de la temperatura de reconstitucin de la leche sobre la
viabilidad, el producto se reconstituy y mantuvo a 40C y 60C durante
10min. Tambin, se realiz la evaluacin sensorial de la leche a los 0, 30 y 60
das de almacenamiento. Para ello se reconstituy a 40C y se mantuvo a 20C
durante 60 y 180min.
Los resultados de los recuentos arrojaron para L. rhamnosus E800, una

concentracin inicial log 7,7 0,2 ufc/g y B. lactis Bb12 alcanz log 7,6 0,5
2
ufc/g y en la mezcla de ambos se obtuvo log 7,6 0,3 ufc/g y log 7,3 0,4
ufc/g respectivamente. La concentracin de ambas cepas hasta el da 60 se
mantuvo sobre log 6,0 ufc/g, cifra lmite para tener un efecto teraputico del
probitico. Se present una prdida de viabilidad durante el almacenamiento a
40C, siendo esta disminucin ms significativa (p<0,05) al ser reconstituida la
leche a 60C.
Hasta el da 60 del almacenamiento, las caractersticas sensoriales de la leche

en polvo con probiticos, almacenadas a 25C 2C, reconstituidas a 40C y
mantenidas a temperatura ambiente durante 60 y 180 min, no se vieron
afectadas significativamente (p>0,05) por la incorporacin de los probiticos
frente al control. Sin embargo, la acidez y la viscosidad fueron los parmetros
fsicos qumicos que presentaron diferencias (p<0,05) de los tratamientos
probiticos frente al control, pero que no actuaron en detrimento de su calidad.
Palabras clave: leche en polvo, probiticos, almacenamiento, reconstitucin.

3
SUMMARY
The objetive of the present research was to evaluate the viability of the
commercial probiotic strains L .rhamnosus E800 (VTT Biotechnology) and B.
lactis Bb12 (Chr. Hansen) in whole milk powder during storage and to
evaluate the effects of two reconstitution conditions. The dry supplementation
of milk powder with probiotics strains L rhamnosus E800 and B. lactis Bb12
was carried out from culture grown at fermenter scale and freeze dried in the
Instituto de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos laboratoty (ICYTAL,
UACh.
Three treatments were conducted with three replications each in milk powder:
a) with L rhamnosus E800, b) with B lactis Bb12, and c) with a mix of both
strains in a proportion of 1:1. The milk was stored under vacuum at 25C and
40C, for 60 days and the evaluation of the viability of the strains was
performed at days 0, 15, 30, 45 and 60. For the evaluation of the effect of the
reconstitution temperature of the milk on the viability of the probiotic strains,
the product was reconstituted and kept at 40C and 60C during 10 min.
Furthermore, sensory evaluation was performed after 0, 30 and 60 days of
storage. For the study the milk was dissolved in water at 40C and maintained
at 20C during 60 and 180 min.
The results showed that L rhamnosus E800 had an initial concentration of log
7,7 0,2 cfu/g and B. lactis Bb12 of log 7,6 0,5 cfu/g and in the mix of both
4
strains the counts were log 7,6 0,3 cfu/g and log 7,3 0,4 cfu/g respectively.
Probiotic bacteria remained viable during the 60 days of storage at 25C and
stayed over log 6,0 cfu/g, which is the minimum therapeutic concentration
recommended for probiotic bacteria, for both added separately or as a mix. A
greater loss of viability was found during storage at 40C. However, survival
of both strains decreased considerably (p<0,05) when the product was
reconstituted and kept at 60C during 10 min. On the other hand, in the
sensory evaluation the judges did not find a significant difference (p>0,05)
among the control without the added probiotic strains and milk powder with
the addition of strains. The physical and chemical characteristics were affected
significantly (p<0,05) by the incorporation of probiotic bacteria.
Key words: milk powder, probiotics, storage, reconstitution.

5
1. INTRODUCCIN
Entre los principales problemas nutricionales que persisten en la poblacin

infantil menor de cinco aos en Chile, se mencionan las enfermedades por
rotavirus, patologa que causan mayor morbilidad y baja mortalidad y alergias
en sus distintas formas de presentacin (eczema atpico, rinitis alrgica o
asma), disfuncin crnica de importancia creciente en los pases desarrollados.
Hoy se podra prevenir las enfermedades a travs del consumo de alimentos

probiticos. Estudios clnicos han demostrado que la utilizacin de ellos
tendran un rol en la prevencin y tratamiento de diarreas infantiles por
rotavirus o la asociada al tratamiento con antibiticos, reduccin de alergias
as como, beneficios nutricionales donde se incluye la absorcin de minerales.
Actualmente, existe en el mercado mundial una variada oferta de productos

con probiticos. El principal vehiculo de administracin de stos son los
productos lcteos, especialmente fermentados, aunque se pueden encontrar en
helados y queso Cottage. Productos de limitada vida til que requieren de una
cadena de fro lo cual influye en el costo.
La inclusin de probiticos viables en leche en polvo, producto de prolongada

vida til y conservacin a temperatura ambiente, permitira que los beneficios
para la salud del consumo de alimentos con probiticos estn disponibles en
una escala ms amplia en comparacin con los lcteos refrigerados. Adems,
6
como la leche en polvo es un alimento consumido especialmente por

individuos que pertenecen a las poblaciones ms sensibles, como son la
infantil y las embarazadas, podra incluso formar parte de los programas
destinados a cubrir las necesidades nutricionales entre la poblacin ms
vulnerable, como el Programa de Alimentacin Complementaria (PNAC) del
Ministerio de Salud de Chile.
Sin embargo, la efectividad de los microorganismos probiticos en los

alimentos deshidratados, est limitada al mantenimiento de la viabilidad de los
microorganismos durante el proceso de secado, el periodo de vida til y las
condiciones de reconstitucin del producto. Por ello se estima de inters
evaluar la metodologa de incorporacin de microorganismos probiticos en
seco a la leche en polvo y estudiar el efecto de las condiciones de
almacenamiento y reconstitucin sobre la viabilidad de estos
microorganismos.
1.1.- Hiptesis
Los microorganismos probiticos Lactobacillus rhamnosus y Bifidobacterium

lactis, incorporados en forma conjunta y en seco en la leche en polvo,
permanecen viables durante dos meses de almacenamiento del producto y en
nmero > 106 ufc/g (European Commissin, 2003), valor suficiente para ser
considerada una leche en polvo con probitico.
7
1.2.- Objetivo General
Cuantificar la supervivencia de las cepas Lactobacillus rhamnosus y

Bifidobacterium lactis suplementadas en seco a la leche en polvo, previo a su
almacenamiento y evaluar el efecto sobre la viabilidad y caractersticas
organolptica de la leche bajo determinadas condiciones de almacenamiento y
reconstitucin.
1.3.- Objetivos Especficos
Evaluar el efecto de dos temperaturas de almacenamiento y distintos

tiempos de almacenamiento de leche en polvo, sobre la supervivencia de L.
rhamnosus E800 y B. lactis Bb12.
Estudiar el efecto de la temperatura de reconstitucin sobre la viabilidad de

las cepas L. rhamnosus E800 y B. lactis Bb12 en leche en polvo
almacenada durante sesenta das.
Evaluar el efecto de L. rhamnosus E800 y B. lactis Bb12 sobre las

caractersticas sensoriales y fisicoqumicas de la leche en polvo
reconstituida.
8
2. REVISIN BIBLIOGRFICA
2.1. ALIMENTOS FUNCIONALES
Hasta finales del siglo XX, la meta en la alimentacin era asegurar un aporte
adecuado de energa y de nutrientes en la dieta. Hoy en da est naciendo un
nuevo concepto de nutricin, que procura, adems de los objetivos
tradicionales, la promocin de la salud y la prevencin de las enfermedades.
En este contexto, aparecen los alimentos funcionales, concepto que requiere
que su ingesta se efecte como componente habitual de la dieta y que ste
ejerza sus efectos en las cantidades ingeridas normalmente en una dieta
equilibrada.
El concepto fue desarrollado a principios de los aos 90 en Japn como:

"alimentos procesados que contienen ingredientes que ayudan a las funciones
corporales especficas, adems de ser nutritivos" creando adems un marco
regulatorio para su comercio y rotulado, conocida como Foods for Specified
Health Use, (FOSHU), (Amagase, 2008).
En Chile, el Instituto de Nutricin y Tecnologa de los Alimentos de la

Universidad de Chile (INTA), se refiere a los alimentos funcionales como
Aquellos alimentos que en forma natural o procesada, contienen
componentes que ejercen efectos beneficiosos para la salud, que van ms all
de la nutricin (Chile, Sernac, 2004).
9
El mercado mundial de alimentos funcionales est en crecimiento, alcanzando

en la actualidad los 47,6 billones de dlares, en tanto en 1995 este valor
alcanzaba los US$ 30 billones (Sloan, 2002). Estados Unidos ocupa el
segmento ms grande del mercado, alcanzando US$ 15 billones. Japn con
US$ 14 billones y luego le sigue la Comunidad Europea con US$ 10 billones.
Se estima que su crecimiento en el prximo quinquenio ser cercano a 15%
anualmente (Chile, Fundacin para la Innovacin Agraria, s/f).
La perspectiva europea de los alimentos funcionales difiere de la

norteamericana, que los incorpora en el grupo de Nutracuticos. En relacin
a que en Europa el concepto slo se aplica a alimentos que se constituyen
habitualmente parte de la dieta y excluye su consumo en forma de cpsulas,
comprimidos u otra forma farmacutica (Milner, 2000).
El Reglamento Sanitario de los Alimentos de Chile no posee un captulo

especfico referido a los alimentos funcionales, por lo que deben someterse a
las condiciones establecidas en el artculo 114, que seala que todas las
declaraciones de propiedades saludables, deben estar cientficamente
reconocidas, o consensuadas internacionalmente y enmarcadas en las normas
tcnicas sobre directrices nutricionales aprobadas por el Ministerio de Salud
(Chile, Ministerio de Salud, 2008a).
En la actualidad se conocen 12 clases de elementos o ingredientes

favorecedores de la salud, entre los cuales se cuentan la fibra diettica, las
vitaminas, las bacterias lcticas, los minerales, los cidos grasos poli-
insaturados como el Omega 3, fundamental para el desarrollo y
10
funcionamiento favorable del sistema nervioso central y los fitoesteroles

sustancias vegetales que al incluirlos en la dieta interactan con el colesterol
en el tracto intestinal reduciendo su absorcin y, por ende, provocan una
disminucin del colesterol sanguneo (Chile, Sernac, 2004).
En Chile, la entidad Chilealimentos que agrupa a las empresas de alimentos

chilena, desde el ao 2007, promueve el proyecto Chile Crece Sano, que
busca comprometer a las empresas de alimentos en la generacin de nuevas
formulaciones con menores contenidos de nutrientes crticos, menor energa y
mayor cantidad de nutrientes funcionales (Chilealimentos, 2007).
Dentro de los alimentos funcionales tienen un papel destacado, los probiticos

definidos por la Food and Agriculture Organization of the United Nations,
(FAO), como microorganismos vivos que administrados en adecuadas
cantidades ejercen un efecto beneficioso sobre el husped (FAO/OMS, 2001).
2.2. MICROORGANISMOS PROBITICOS
Los probiticos al ser ingredientes adicionados intencionalmente a los

alimentos podran ser clasificados dentro de la categora de aditivos de
alimentos o sustancias GRAS, (generalmente reconocidos como seguros),
(Mattia y Merker, 2008), esta ltima que otorga la Food Drug Administration
(FDA) a cepas utilizadas con fines especficos en los alimentos (Mogensen et
al., 2002).
11
El mercado de los productos con probiticos en el mundo est en plena

expansin y presenta una de las mayores tasas de crecimiento dentro del
mercado global de los alimentos funcionales. El mercado europeo de
alimentos probiticos factura ms de 1,4 billones de euros. Estimndose un
crecimiento sobre 7 a 8% anualmente para los prximos cinco aos (Saxelin,
2008).
Las bacterias de los gneros Lactobacillus y Bifidobacterium ocupan el lugar

ms destacado entre los microorganismos empleados con fines probiticos
asociados a sus efectos benficos en la salud (Ross et al., 2005). El gnero
Bifidobacterium no est relacionado filogenticamente con las bacterias
lcticas pero comparte con ella diversas propiedades fisiolgicas, bioqumicas
y ecolgicas (Aguirre y Collins, 1993).
Aunque todava no existe una normativa sobre los requisitos que deben
cumplir los probiticos que se incorporan a los alimentos. FAO/OMS (2002),
ha hecho unas recomendaciones acerca de los criterios de evaluacin de stos
incluyendo su identificacin intraespecfica, pruebas in vitro e in vivo para
constatar sus propiedades y efectividad y, gua sobre el etiquetado.
Dentro de la seleccin de una cepa potencialmente probitica establecen que

se debe basar, independientemente de su origen, en dos criterios
fundamentales: su capacidad para llegar viable y en nmero suficiente a su
lugar de accin y su efectividad real. Se evala su capacidad de resistir al pH
cido del estmago, a las enzimas digestivas y sales biliares del intestino y de
12
adherir al mucus o a las clulas epiteliales, todas propiedades que favorecen su

sobrevida y permanencia en el tubo digestivo (FAO/OMS, 2002).
La concentracin de probiticos viables que se estima que debe llegar al

intestino para obtener un efecto clnico es > 106 ufc/g en el intestino delgado y
>108 ufc/g en el colon. Sin embargo una ingesta de 105 ufc/g ha sido sugerida
como la mnima para proveer efectos teraputico (Roy, 2005). Una vez que
los microorganismos probiticos alcanzan el intestino, son capaces de
permanecer all durante un corto perodo de tiempo en estado no proliferativo.
Sin embargo, para establecerse como habitante permanente del tubo gastro
intestinal, deben adherirse a las clulas epiteliales intestinales o a la capa de
mucus. La adhesin a la mucosa intestinal es el primer paso en la
colonizacin, y muchos autores lo consideran un prerrequisito para ejercer
efectos beneficiosos en el husped, como la exclusin competitiva de bacterias
enteropatgenas o la inmunomodelacin (Bernet et al., 1993).
Otro de los criterios de evaluacin y seleccin incluyen la existencia de

actividades funcionales. Entre los principales podemos citar su contribucin
metablica, la inhibicin de patgenos y la inmunomodulacin, que hace
referencia a un amplio espectro de efectos sobre la inmunidad celular y
humoral (Daz, 2008).
Entre los beneficios nutricionales imputados al consumo de probiticos en

productos lcteos se incluye el aumento de la absorcin de minerales como el
calcio, zinc, hierro, manganeso, cobre y fsforo, debido a que la acidez del
medio facilita la ionizacin de stos y la formacin de sales solubles
13
asimilables. Igualmente, por la accin microbiana aumenta la digestibilidad de

la protena del yogurt y la bio-disponibilidad de vitaminas como la riboflavina,
facilitando la utilizacin de haciendo estos nutrientes. El consumo de bacterias
probiticas tambin contribuye, mediante la produccin de enzimas
especficos, al aprovechamiento de otros nutrientes en el intestino. Muchas
bifidobacterias poseen glicosidasas con capacidad para metabolizar
carbohidratos no digeribles de la dieta (Cummings et al., 2001 citado por
Diaz, 2008).
La concentracin mnima y/o frecuencia de consumo de microorganismos

probiticos necesarios para provocar un resultado benfico an no est clara.
Sin embargo, en la diarrea infecciosa aguda mayores dosis de probiticos dada
por corto tiempo son ms efectivas que dosis baja. En tanto en las
enfermedades inmunolgicas como las alergias, el efecto depende de la
duracin del tratamiento (Bertazzoni y Benini, 2008).
Roy (2005), seala que un producto fermentado debera contener 106 ufc de
bifidobacterias por gramo de producto al momento de ser consumido. Japn
desarroll un estndar para leches fermentadas y bebidas acidolcticas de 107
bifidobacteria por g o mL de producto para ser considerado un alimento
probitico (Ishibashi et al., 1993 citado por Prez, 2003).
Thompkinson y Kharb (2007), sealan que para una frmula infantil el

contenido de clulas viables a lo largo de la vida til recomendable, debera
ser 106 a 108 ufc/g de polvo de frmula.
14
Los productos probiticos comercializados actualmente se pueden dividir en

tres tipos:
a) los alimentos fermentados convencionales a los que se les adiciona
probiticos y que se consumen principalmente con fines nutritivos
(yogures, quesos, leches etc.)
b) las leches cultivadas y fermentadas, utilizadas bsicamente como,
vehculos de bacterias probiticas (leche acidfilas etc)
c) los suplementos dietticos o preparaciones farmacuticas liofilizadas
(Collado et al., 2003).
De la variedad de alimentos con probiticos disponibles en el mercado, la

mayor parte corresponde a lcteos principalmente leches y productos
fermentados como yogurt y bebida lctea, siendo el formato mas popular el de
dosis diaria facturando en Europa alrededor 1,2 billones de euros en ao
2003 (Saxelin, 2008).
En America latina el mercado de yogurt con probiticos tuvo un crecimiento

anual del 32% entre los aos 2005 y 2007. Se estima que el crecimiento del
mercado de alimentos con probiticos en Estados Unidos entre los aos 2006
y 2011 ser cercano al 5% (Champagne, 2009).
En Chile el primer producto alimenticio con probiticos fue el Uno al da, el

cual fue lanzado al comercio el ao 1998 por la empresa Soprole. En la
actualidad, todas las principales empresas de productos lcteos del pas
elaboran productos probiticos. La Tabla 1 muestra los productos probiticos
actualmente presentes en el mercado nacional. Cabe destacar que existen
15
varios productos en venta en farmacias que contienen bacterias lcticas

deshidratadas (generalmente por liofilizacin). Aunque algunas de ellas son
probiticos reconocidos, no son comercializados como tal sino como agentes
restauradores de la microbiota (Cceres y Gotteland, 2010).
Tabla 1. Alimentos con probiticos comercializados en Chile
Nombre del Empresa Tipo de Gnero/Especie (cepa Empresa

producto Alimento del probitico proveedora
incorporado del
probitico
Super Calo Calo Bebida lctea L. casei CRL431 Chr. Hansen
Vilib Colun Bebida lctea L. acidophilus NCFM Danisco
Activia Danone Yogurt y B. animalis spp.lactis Danone
Bebida lctea DN173 010
Bio Loncoleche Leche y yogurt B. animalis spp.lactis Bb12 Chr Hansen
BioOk Loncoleche Bebida lctea L. casei CRL431 Chr. Hansen
Chamyto Nestle Bebida lctea L johnsonii La1 Nestl
Nan Pro1 Nestle Frmula lctea B. animalis spp.lactis Bb12 Nestl
Nan HA
Nan Pro 2 y 3 Nestle Frmula lctea L rhamnosus GG Nestl
Nan 2 y 3 B. longum BB536
Nestum Nestle Cereal infantil B. animalis spp.lactis Bb12 Nestl
Nestum Plus
Nestum Nestle Leche en L paracasei ST11 Nestl
Nestum Plus polvo
Nido 1+3+y 5+
Yoplait Quillayes Yogurt L. acidophilus La5, B. Chr. Hansen
Bioplus Animalis spp.lactis Bb12
Linea Next Soprole Yogurt, leche y B. animalis spp.lactis Bb12 Chr. Hansen
bebida lctea
Uno al da Soprole Bebida lctea L rhamnosus HN 001 Danisco
(DR20)
Kaiku Surlat Yogurt L rhamnosus GG, B. Danisco/
Animalis spp.lactis Bb 420 Valio
Fuente: Cceres y Gotteland, 2010
16
No obstante, estudios han evidenciado que la supervivencia de las cepas

probiticas presentes en productos lcteos comerciales se afectan
negativamente durante su almacenamiento refrigerado. Es as como Collado
(2004), estudiando la viabilidad de las bacterias lcticas y bifidobacterias
presente en los productos fermentados comerciales refrigerados a 4C,
encontraron que sus recuentos disminuyeron paulatinamente hasta un 50-60%
de los recuentos iniciales al cabo de su fecha de caducidad, momento a partir
de cual se redujeron drsticamente, siendo los productos de pH ms cido los
que presentaron una disminucin ms acusada.
Segn Shah (2010), los factores responsable de la prdida de la viabilidad de

las bacterias probiticas son: la acidez y el H202 producido por las bacterias
del yogurt, la pos acidificacin, presencia de oxigeno disuelto, a la
permeabilidad al oxigeno del envase, la disponibilidad de nutrientes y
promotores de crecimiento, el nivel de inoculacin, tiempo de fermentacin,
temperatura de almacenamiento y el antagonismo entre las bacterias.
Al respecto Roy (2005), seala que en los productos fermentados pueden

ocurrir cuatro tipos de interacciones entre probiticos y cultivos iniciadores:
estimulacin, retraso e inhibicin o ningn efecto. Las interacciones pueden
ser mas intensas cuando los probiticos son agregados al mismo tiempo con
los cultivos iniciadores. Heller (2001), seala que se ha observado tales
efectos en el yogurt adicionado de agentes probiticos donde se ha encontrado
que el contenido de clulas viables de bifidobacterias decrece en presencia de
los cultivos iniciadores de aquel, posiblemente debido a sustancias inhibitorias
17
elaboradas por L. delbrueckii ssp bulgaricus y S. thermophilus, como cido

lctico y perxido de hidrgeno, este ltimo producido principalmente por
L. delbrueckii ssp. bulgaricus.
Cceres y Gotteland (2010), realizaron una revisin de las cepas probiticas

actualmente adicionadas a los productos lcteos comercializados en Chile,
encontrando que son 11 las cepas probiticas principalmente en productos
lcteos refrigerados donde se incluyen las cepas Lactobacillus casei CRL431,
L. acidophilus NCFM, L. johnsonii NCC533 (La1), L. acidophilus La5, L.
rhamnosus HN001 (DR20), B. animalis spp. lactis 430, B. animalis spp. lactis
DN173 010, L. rhamnosus GG, L. paracasei ST11, B. longum BB536 y
B. animalis spp. lactis Bb12 (Tabla 2).
La importancia de conocer las cepas se encuentra en que los efectos benficos

sobre la salud son cepa especfica, es decir, que una cepa determinada ejerce
slo algunas de las propiedades descrita para los probiticos (Cceres y
Gotteland, 2010).
La suplementacin de probiticos a las frmulas infantiles es la tendencia en

la elaboracin de frmulas de continuacin en el mercado espaol donde se
incluyen B. longum, St. thermophilus, B. lactis, L. rhamnosus GG. Con ello se
intenta promover el desarrollo de una flora intestinal compuesta, de forma
predominante, por bifidobacterias como las que existen en los lactantes con
lactancia materna y as, conseguir las ventajas que de ello se deriva sobre el
trnsito intestinal y la proteccin frente a los patgenos intestinales (Ferrer et
al., 2005).
18
Tabla 2. Principales beneficios sobre la salud de las cepas probiticas disponibles en Chile
L. L. L. L. L. L. L. B. B. B. B.
Beneficios para rhamnosus johnsonii acidophilus acidophilus casei rhamnosus paracasei lactis lactis lactis longums
la salud GG La1 NCFM La5 CRL431 HN 001 NCC2461 Bb12 DN173010 420 BB536
(DR20) ST11
Digestin de la no - si - si - - - - - -
lactosa
Inmuno- si si si - si si si si - si si
estimulante (modelo
animal)
Anti-bacteriano si si si - si si - si - - -
Anti-diarreico si - si si (colitis si - si si - - -
colagenosa)
Constipasin/ - - - - - - - si si - -
trnsito intestinal
Anti-inflamatorio si si - - - - - - - si -
Funcin si - - si - - si - - - -
intestinal de (modelo
barrera animal)
Anti-alrgico si - - - - si si si - si si
(modelo
animal)
Anticarcinognico si - si - - - - - si - si
Anti H. pylori no si . si (con - - - si - - -
Bb12) (con
La5)
Analgsico - - si - - - si - - - -
(modelo
animal)
Fuente: Cceres y Gotteland, 2010
19
Thompkinson y Kharb (2007), sealan que existen estudios donde se ha

demostrado que la flora gastrointestinal de los lactantes alimentados con
frmulas infantiles es diferente de aquellos que reciben leche materna. Al
respecto, Dubey y Mistry (1996), compararon muestras de fecas provenientes
de lactantes alimentados con leches maternizadas (frmulas infantiles), y de
alimentados con leche materna, donde se encontr una mayor presencia de
bifidobacterias en las ltimas. Lo anterior atribuido al factor bifidu
estimulante de la leche materna.
Los principales usos de los productos probiticos en la alimentacin infantil

son la prevencin y el tratamiento de diarreas, modulacin del sistema inmune
y promocin de mecanismos protectores del organismo para las dermatitis
atpicas y alergias (Ferrer y Dalmau, 2005).
2.3. EFECTO DE LOS PROBITICOS EN LA ALERGIA ATPICA

Y LA DIARREA POR ROTAVIRUS
2.3.1. Alergias atpicas
Las enfermedades alrgicas constituyen una causa importante de morbilidad
en los pases industrializados, habiendo crecido su incidencia en forma
alarmante durante las ltimas dcadas. Se generan como respuesta
inmunolgica frente a los alrgenos. La hiptesis de la higiene pretende
justificar su aumento asociado al drstico cambio que ha existido desde un
estilo de vida con alta exposicin a los microorganismos a otro actual con una
exposicin baja (Stone, 2003). En Chile, la dermatitis atpica afecta entre el 6
al 20% de los nios (Rojas, 2004).
20
La sintomatologa del cuadro alrgico se genera por la produccin de IgE

alrgeno especfico, la cual se une a receptores de alta afinidad en la superficie
de mastocitos y basfilos que tpicamente se localizan en las superficies
mucosales y perivasculares. El reencuentro de la IgE con el alrgeno provoca
la degranulacin de la clula que vierte mediadores proinflamatorios
preformados al ambiente extracelular, como histaminas, proteasas y
proteoglicanos. Dependiendo de los rganos afectados aparecen
manifestaciones diferentes como asma, rinitis, dermatitis atpica o sntomas
gastrointestinales (Marshall, 2004).
2.3.2. Diarreas por rotavirus

Las infecciones por rotavirus son la mayor causa de las diarreas graves
durante la infancia y la adolescencia. Desde el punto de vista clnico, la
mucosa intestinal se ve afectada y se modifica la composicin de la microbiota
intestinal, lo que da lugar a un episodio de diarrea osmtica seguida de un
crecimiento excesivo de alguna de las poblaciones bacterianas no dominantes
(Ciarlet y Estes, 2001).
La infeccin por rotavirus es responsable de alrededor de 600.000 muertes

anuales y aproximadamente 40% de las hospitalizaciones por diarrea en
menores de 5 aos de edad en todo el mundo, lo que la convierte en la causa
ms importante de diarrea en este grupo de poblacin. El rotavirus puede
provocar desde una infeccin asintomtica en menores de 3 meses, hasta una
diarrea grave con deshidratacin que puede ocasionar la muerte. En pases en
21
desarrollo, la tasa de infeccin ms alta ocurre entre los 3 y 11 meses de vida

y en los pases desarrollados durante el segundo ao de vida. Adems del
elevado costo social, los aspectos econmicos son importantes por la excesiva
demanda a los centros asistenciales debido a la alta tasa de morbilidad (OPS,
2007).
El Ministerio de Salud de Chile indic que hasta noviembre del 2008, por el
sistema de vigilancia epidemiolgica para rotavirus en hospitales centinelas en
menores de cinco aos, se han notificado 6.149 casos de diarreas, de ellas
26,5% fueron positiva a rotavirus (Chile, Ministerio de Salud; 2008b).
2.3.3. B. lactis Bb12 y L. rhamnosus

La cepa B. lactis Bb12 presenta estatus GRAS otorgado por la FDA a solicitud
de la empresa Nestl US para su incorporacin en alimentos para infantes y
nios (Mogersen et al., 2002). Varios estudios con B. lactis Bb12 evidencian
que la cepa presenta un efecto preventivo frente al desarrollo de diarrea aguda
en nios incluyendo la causada por rotavirus (Cceres y Gotteland, 2010). La
forma mencionada en que la cepa podra prevenir o aminorar la diarrea en
nios corresponde a la mejora de los mecanismos de defensa del tracto
gastrointestinal por el aumento de la produccin de moco y secrecin de IgA
(Kaila, et al., 1992). En este sentido Juntumen et al. (2001), observaron que la
adhesin de B. lactis Bb12 en infantes sanos fue 31% en comparacin de la
cepa L. acidophilus La-5 que present slo un 4%. Efecto que se potencia en
presencia de B. lactis Bb12 con L. rhamnosus del 31 a 39% en nios sanos. En
22
casos de diarreas por rotavirus se increment la adhesin al epitelio

gastroinstestinal del 26 a 44%.
Existe un gran nmero de estudios que avalan las propiedades de B. lactis

Bb12, en recin nacidos y en prematuros, lo cual apoya la inocuidad de esta
cepa. En prematuros con antibioterapia, la administracin de este probitico
result en una mayor ganancia de peso comparado con los nios del grupo
control, adems de una menor concentracin de calprotectina fecal (un
marcador de inflamacin), una mayor concentracin fecal de IgAs y de cidos
grasos voltiles y un pH fecal ms cido. Este probitico contribuye adems,
a regular la microbiota intestinal en estos nios (Mohan et al., 2008). Estas
observaciones podran explicar los resultados de ensayos clnicos que
muestran que su administracin previene la enterocolitis necrotizante en
prematuros de muy bajo peso (Cceres y Gotteland, 2010).
Por otra parte, las propiedades inmunoestimulantes de B. lactis Bb12 tanto

local como sistmicas han sido confirmadas en varios estudios (Cceres y
Gotteland, 2010). Dichas propiedades podran explicar su efecto positivo en
nios con alergia; la suplementacin de frmulas hidrolizadas con B. lactis
Bb12 resulta en una recuperacin ms temprana que en aquellos que reciban
la frmula control sin probiticos (2 meses vs. 6 meses), (Isolauri et al., 2000).
Dentro de las propiedades funcionales de la cepa de L rhamnosus E800, que

se encontraron en estudios disponibles, se menciona su actividad
23
antimicrobiana contra E. coli, S. aureus, B cereus y C. perfringes1 demostrada

en estudios in vitro, asi como favorecer la microbiota del colon (Kontula et al.,
2002).
Dentro de la especie Lactobacillus rhamnosus, la cepa L. GG es el probitico

ms estudiado, con ms de 100 ensayos clnicos publicados que han estudiado
sus efectos sobre la salud. Numerosos estudios han evaluado los efectos de
LGG sobre la diarrea. Un anlisis del efecto de LGG en el tratamiento de la
diarrea aguda, mostr que ste no afectaba el volumen de deposicin emitida
pero disminua significativamente la duracin de los episodios de diarrea,
particularmente en aquellos producidos por rotavirus, adems de disminuir el
riesgo de diarrea y la duracin de hospitalizacin. Por otra parte, la
administracin perinatal de LGG en lactantes con antecedentes familiares de
atopia redujo la incidencia de eczema atpico durante sus 4 primeros aos de
vida comparado con aquellos que no recibieron el probitico (Cceres y
Gotteland, 2010).
En un estudio realizado en nios alimentados con una frmula infantil

suplementada con la cepa L. rhamnosus LGG, durante los primeros seis meses
de vida se ha observado que el consumo de este podra mejorar la tasa de
crecimiento de los bebes (Vendt et al., 2006), lo cual puede estar relacionado
con una mayor eficiencia en la absorcin de nutrientes en estos nios.
Otra cepa perteneciente a la especie es Lactobacillus rhamnosus HN001

tambin llamada DR20, aislada a partir del queso Cheddar. Estudios clnicos
1 VTT Technical Research Centre of Finland. Hoja informativa. Lactobacillus rhamnosus VTT E 97800 a potencial novel probiotic
strain
24
donde se realizaba la administracin de HN001 a madres con antecedentes de

atopia durante el periodo de gestacin y luego a los lactantes durante 6 meses
result en una menor prevalencia de eczema comparado con aquellos que
recibieron el placebo (Cceres y Gotteland, 2010).
Una manera de llevarles estos beneficios a la poblacin infantil es mediante la

incorporacin de cepas probiticas a la leche en polvo, lo cual permitira su
masificacin ms an si contamos con sistemas de distribucin de alimentos
complementarios y un ahorro por concepto de costo de refrigeracin y de
mayor vida til. Aunque de acuerdo al catastro realizado por Cceres y
Gotteland, (2010) existen en el mercado nacional frmulas lcteas con
probiticos (Tabla 2), el precio oneroso por unidad no favorece un amplio
acceso a toda la poblacin chilena.
Otra va de prevenir el desarrollo de enfermedades atpicas es promoviendo el

desarrollo de Bifidobacterium en neonatos mediante el consumo prenatal con
probitico de las embarazadas. Un estudio realizado por Gueimonde et al.
(2006), concluy que el consumo de Lactobacillus GG en embarazadas, 2 a 4
semanas previo al nacimiento estimul el crecimiento de las especies B. breve
y B. infantis a los cinco das de nacido de los infantes en comparacin con el
grupo de embarazadas con placebo. La ventaja de la presencia de B. infantis es
que corresponde a una cepa que predomina en la leche materna y que secreta
polisacridos que favorecen su adherencia en el epitelio intestinal (Shah et al.,
2003).
25
2.4. LECHE EN POLVO
La leche en polvo, es un producto de fcil conservacin que presenta la

ventaja de contener todo el extracto seco de la leche en un volumen muy
reducido (Amiot, 1991). Se utiliza como materia prima en la fabricacin de
leche reconstituida y de alimentos para nios.
Los alimentos infantiles en polvo actualmente en el mercado mundial

comprenden un gran nmero de productos de distintas composiciones, que
pueden clasificarse en los siguientes grupos: leche entera normal en polvo,
leche entera en polvo con adicin de carbohidratos, leche fermentada, leche
maternizada y productos con almidn (Vagn Westergaard, 2004).
De acuerdo a antecedentes proporcionados por la Oficina de Estudios y

Polticas Agrarias (ODEPA) durante 2009, la produccin de leche en polvo de
nuestro pas superaron los 73.400 toneladas constituyendo la segunda forma
de consumo de lcteo en el pas (Chile, Odepa, 2010). Una valoracin del
consumo per cpita de leche en polvo en el ao 2007 efectuado por la
Fundacin para la Innovacin Agraria arroj 4 kilos (Chile, Fundacin para la
Innovacin Agraria, s/f).
En tanto, segn datos aportados por Ministerio de Salud (Chile, Ministerio de

Salud, s/f), durante el 2009 los kilos de leche distribuidos a los beneficiarios
del Programas Nacional de Alimentacin Complementaria fueron para Leche
Purita Fortificada 5.180 toneladas destinada a menores de 18 meses y para
nios prematuro 85.2 toneladas, donde se incluyen recin nacidos con peso de
26
nacimiento menor 1500 gr y/o prematuros menores de 32 semanas de

gestacin y hasta 12 meses de edad (Chile, Ministerio de Salud, 2003). La
leche Purita Mam fue 2.377,7 el total de toneladas distribuidos el ao 2009.
2.4.1. Incorporacin de cepas probiticas en la leche en polvo
La adicin de probiticos en la leche en polvo puede realizarse durante el

secado por pulverizacin de la leche; cuyo principio es convertir el producto a
secar en pequeas gotas de un tamao adecuado para posibilitar el secado de
las mismas, por contacto con una corriente de aire caliente. Debido al gran
tamao de la superficie de las gotas (1 L de concentrado ser atomizado en 1,5
x 1010 partculas de 50 con una superficie total de 120 m2), el agua es
evaporada casi instantneamente, transformando las gotas en partculas de
polvo (Vagn Westergaard, 2004). Sin embargo, durante este proceso se
producen daos en las clulas y una prdida de viabilidad del cultivo
probitico (Gardiner et al., 2000), afectando con ello las propiedades
tecnolgicas y benficas de los probiticos, lo que se atribuye a los parmetros
de proceso empleados como la temperatura del aire de salida, la presin del
aire y el contenido de slidos, entre otros (Desmond et al., 2002).
Diversos autores han comprobado una rpida disminucin de la viabilidad de

las bacterias durante el almacenamiento. Entre los factores que afectan la
sobrevivencia (recuento inicial de probiticos en la leche en polvo,
temperatura de almacenamiento, contenido de oxgeno, exposicin a la luz y
material de envasado), se reconoce en general que la temperatura es el factor
27
que afecta mayormente, ejerciendo una influencia inversamente proporcional

a la sobreviencia (Corcoran et al., 2004; Gardiner et al., 2000).
Espina y Packard (1979), estudiaron la supervivencia de L. acidophilus en el

proceso de pulverizacin para la elaboracin de un tipo de leche acidfila
conocida como Sweet Acidophilus utilizando diferentes temperaturas de
salida: 85, 80 y 75C y las relacionaron con la viabilidad despus de 30 das de
los cultivos almacenados a 4C. La temperatura de salida ptima fue 75C, ya
que result en una viabilidad ms alta, de 4,2% frente a 1,6% de los
pulverizados a 80C. Sin embargo, Gardiner et al. (2000), recomiendan no
utilizar temperaturas de salida mas baja de 70C, porque podran incrementar
el contenido de humedad del polvo deshidratado por encima del 5% y sto
podra ser perjudicial para mantener la calidad y actividad de los
microorganismos durante el almacenamiento. Por otra parte, Mauriello et al.
(1999) citado por Prez (2003), atribuyen la disminucin de la supervivencia a
la temperatura de entrada ya que al mantener la temperatura de salida
constante a 68C y trabajando a diferentes temperaturas de entradas: 160,
180 y 200C, obtuvieron los mximos valores de supervivencia a 160C.
La especie Bifidobacterium es sensible a la temperatura de secado por

pulverizacin. Al respecto, Selvamuthukumaran y Shankar (2006), al evaluar
las condiciones optimas de secado por pulverizacin para la elaboracin de
leche en polvo con B. bifidum, encontraron valores de reduccin en el nmero
de clulas viables que fluctuaron desde 0,48 hasta 1,38 unidades logartmicas
ufc/g al cabo del proceso de secado. Reportando que la mxima supervivencia
28
de las bacterias en la leche en polvo se obtuvieron bajo las condiciones de

proceso de temperatura del aire de entrada de 164 + 5C, y temperatura del
aire de salida 80 + 5C y presin de aire de 2,5 kg/cm2.
Un posible mecanismo de la prdida de viabilidad de la bacteria asociado al

stress trmico se atribuye al dao directo a nivel de los ribosomas por la
desnaturalizacin de las protenas o indirectamente a travs de la prdida de
magnesio. Los ribosomas son estructuras que contienen alrededor del 38% de
la protena lo que abarca la mayor parte del peso seco de la clula bacteriana
(Teixeira et al., 1997)
Existen estudios que ponen de manifiesto que adems de la mortalidad

provocada por el proceso trmico, los efectos no trmicos como la
deshidratacin o la prdida del agua ligada de la membrana citoplasmtica
provocan daos letales y subletales que afectan a la capacidad de resistencia
de las clulas bacteriana supervivientes impidiendo consecuentemente
mantener la viabilidad de los probiticos durante el tiempo de almacenamiento
a temperatura ambiente. En este sentido Texeira et al. (1995), demostraron
que despus del proceso de secado L. delbrueckii ssp bulgaricus es sensible a
la lizosima y al NaCl; ambos indicadores de dao a nivel de la pared y
membrana celular afectando con ello la viabilidad y las caractersticas del
probitico y consecuentemente reduciendo el tiempo de vida til del producto
(Roos et al., 2005). La fraccin lipdica de la membana celular es el sitio
primario de dao en la clula. Otros posibles sitios en la clula donde puede
ocurrir dao en el DNA asociado a la prdida de plsmidos o al incremento
29
de flujo de DNA asa dentro de la clula debido a la peroxidacin de los lpidos

de la membrana celular (Desmond et al., 2002).
El inconveniente de los mtodos tradicionales de incorporacin del probitico

por pulverizacin durante el secado ha llevado a utilizar nuevas estrategias
para asegurar la funcionalidad de los microorganismos priobiticos como usar
agentes protectores para potenciar la supervivencia de los probiticos como la
trehalosa, prebiticos y la fibra soluble (Desmond et al., 2002). Sin embargo,
existen estudios que demuestran que un aumento de la concentracin de los
agente protectores afecta negativamente la supervivenia de las celulas
bacterianas despus del secado, asociado a la disminucin de la actividad del
agua en la superficie de la particula y exceso de la temperatura del bulbo
humedo. Al respecto, Espina y Packard (1979), reportaron que la
supervivencia de L. acidophilus despus del secado fue superior con 25% v/s
40% de slidos no grasos concluyendo que la mayor concentracin de slidos
aumenta el tamao de las particulas atomizadas y consecuentemente el tiempo
de contacto con el aire caliente.
Actualmente, existe un proceso de secado para alimentos deshidratados que

contienen BAL que se ha patentado (ES 2167719T3) utilizando un aparato de
secado por pulverizacin con dos toberas e inyectndo CO2 y/o nitrgeno en el
cultivo justo antes que sea pulverizado ajustndo la temperatura de salida
entre 50 y 75C y el tiempo de residencia del cultivo de forma de obtener un
polvo con una actividad de agua del orden de 0,05 0,5 (Oficina Espaola de
Marcas y Patentes, 2002).
30
Las mejores supervivencias obtenidas estn generalmente unida a a la

presencia de un alto ttulo de clulas en el cultivo as como utilizar bacterias
lcticas resistentes a las altas temperaturas; para ello existen nuevas
tecnologas para producir bacterias liofilizadas que conservan un alto grado de
viabilidad durante el secado y almacenamiento mediante el mecanismos de la
respuesta al stress que favorece la adaptacin del microorganismo a las
condiciones hostiles en los productos alimenticios tales como alta temperatura,
pH bajo y alta concentracin osmtica (Ross et al., 2005).
Al respecto Sunny Roberts y Knorr (2008), evaluaron la respuesta de L

rhamnosus E800 bajo condiciones de estrs osmtico inducido por alta
concentracin de sucrosa no encontrando cambios significativos en la
morfologa de la clula ni en la funcionalidad de las enzimas citoplasmticas.
Se ha descubierto que otros factores que mejoran la habilidad de sobrevida de

los cultivos probiticos durante el secado y/o durante la conservacin del
producto, son el estado fisiolgico en que se encuentra el microorganismo
adicionado al momento del secado y la implementacin de pre-tratamientos
trmicos. Al respecto, Corcoran et al. (2004), encontraron que la L. rhamnosus
GG durante la fase estacionaria era menos susceptible a los efectos del
proceso de secado por pulverizacin. Por su parte, Prasad et al. (2003),
demostraron que el pretramiento trmico de la cepa L rhamnosus HN001 a
50C por 30 min y el agregado de NaCl (0,6mol/L), mejor la viabilidad de la
cepa durante el almacenamiento a 30C.
31
Simpson et al. (2005), reportaron variacin de la estabilidad entre especies de

Bifidobacterium y entre cepas, respecto a la temperatura encontrando que la
mayor parte de las especies estudiadas presentaron una baja tolerancia
trmica. Dentro de las especies que presentaron mayor tolerancia trmica, a
57C y 60C, se encontr a la cepa B. lactis Bb 12.
Corcoran et al. (2004), al comparar el comportamiento de las cepas

L. rhamnosus GG y L. rhamnosus E 800 no evidenciaron relacin entre la
tolerancia trmica y la supervivencia al secado por pulverizacin. En el
estudio aunque L. rhamnosus GG present una menor tolerancia trmica con
un valor D61 de 1,32 min en comparacin al L. rhamnosus E- 800 de D61 de
2,76 min, present una mejor supervivencia durante el secado por
pulverizacin, lo cual se asoci a los fenmenos no trmicos que ocurren
durante el proceso, tales como los efecto de la deshidratacin.
La manipulacin gentica parece ser una nueva estrategia (Ross et al., 2005).
Al respecto Suokko et al. (2004), encontraron que la cepa L. rhamnosus E800
contiene dos genes capaces de codificar la protena del estrs trmico ClpL1 y
ClpL2 transcriptasa cuya expresin es capaz de incrementar la tolerancia de
la cepa a alta temperatura, donde la mxima expresin de la protena ClpL1,
ocurri despus de la aplicacin de 50C por 30 min. En el estudio se
evidenci adems, que la expresin de la protena ClpL2 se produca bajo
condiciones de tratamiento con perxido de hidrgeno. Por su parte, Park et
al., (2002) citado por Simpson et al., (2005), identificaron al gen rpoD para la
cepa B. animalis ssp lactis.
32
Segn Chavez y Ledeboer (2007), una opcin para mejorar la sobrevida de los
probiticos contenidos en el alimento es combinando los procesos de secado
por pulverizacin y vaco, de forma de disminuir la temperaturas del proceso
iniciando el proceso por pulverizacin a una temperatura de entrada y salida
de 80C y 48C, respectivamente, seguido por un proceso bajo vaco a 45C
con presin reducida de 10 mbar durante 24h.
Otro factor que reduce la vida til de los probiticos son la actividad de agua
(aw) o contenido de humedad de la matriz del alimento que lo contiene. En
este sentido Texeira et al. (1995), evidenciaron que la viabilidad de las
bacterias cido lctica es particularmente afectada cuando la actividad de agua
es superior a 0,25. Una tcnica especializada para otorgar estabilidad a los
microorganismos probiticos en entorno medioambientales de humedad asi
como de acidez y presencia de oxgeno, es el microencapsulamiento que busca
crear micro-ambientes en el cual la bacteria pueda sobrevivir. Ello facilita la
manufacturacin de productos fermentados con probiticos, ya que
proporciona, condiciones ms costantes (Anal y Smith, 2007). Sin embargo,
estudios con L rhamnosus GG incorporados en una frmula infantil en forma
encapsulada utilizando suero de protena como material de encapsulamiento,
han evidenciado que este ltimo procedimiento no asegura la supervivencia de
los mismo dentro de la cpsula (Weinbreck et al., 2010). Segn Anal y Smith
(2007), la eficiencia del microencapsulado esta en directa relacin con las
propiedades fisico-qumicas de los materiales de la pared como alginina,
carragenato, suero de protena, chitosan entre otros, del mtodo de
microencapsulacin empleados como secado por aspersin o secado por
33
congelamiento, recubrimiento en lecho fluidificado, extrusin y coacervacin

entre otros y tamao de la cpsula donde valores superiores pueden afectar
negativamente la textura y la evaluacin sensorial del alimento que los
contiene.
Un mtodo alternativo de incorporacin de los probiticos a la leche en polvo

que evita la exposicin a los daos de la clula asociado al proceso de secado
y asegura una mayor supervivencia, es mediante la metodologa de
incorporacin de la cepa al final del secado de la leche en polvo. Vendt et
al.(2006), incorporaron la cepa L. rhamnosus GG al final del secado de la
leche en polvo, mantenindose niveles de recuentos de 107 ufc/mL al final de
la vida til de la frmula.
Fumiaki et al. (2009), mezclaron en seco una frmula infantil comercial con la
cepas B. longum BB536, B. breve M -16V y B. infantis M63 con niveles de
incorporacin de recuento de 1010ufc/g, obteniendo al cabo de 24 meses a
30C valores de recuentos de 107ufc/g, atribuyendo los valores a la actividad
de agua del producto aw 0,25, lo que evidenci adems, la mejor estabilidad en
la cepa B. longum BB536.
Existe una tecnologa patentada (W02008/48731), que extiende la vida til de

frmula nutricionales que contienen microorganismos probiticos por al
menos 15 meses asociada al uso de envases que contenga un material
absorbente de humedad como un desecante logrando reducir la actividad del
agua (aw) y la humedad residual del producto hasta valores 0,16 y 2,1%,
respectivamente (WIPO, 2008).
34
2.5. CARACTERSTICAS DE LOS PROBITICOS DEL ESTUDIO
2.5.1. B. lactis Bb12

Esta cepa de origen animal corresponde a una bacteria Grampositiva, no
mvil, no esporulada, pleomrfica presentndose en forma aislada, en cadena,
empalizada o en forma de V, Y, T. Es anaerbica, ligeramente tolerante al
oxgeno. Su rango de temperatura y pH ptimo va entre 37 y 40C2 y 6,5 - 7,0
respectivamente (Scardovi, 1984). No crece a pH de 4,5 ni 8,5, degrada
hexosas exclusivamente y produce cido lctico L (+), cido actico y cido
frmico (Salminen y Wright, 1998).
Dentro de las caractersticas bioqumicas de la especie se mencionan, que las

hexosas son degradadas exclusivamente por la ruta de la fructosa-6-fosfato,
caracterizada por la presencia de la enzima fructosa-6-fosfato fosfocetolasa
(F6PPK) tpica de este gnero. Esta va metablica conduce a la formacin de
cido lctico y actico en una proporcin 2:3, sin produccin de CO2. Son
negativas en la reduccin de nitrato, la formacin de indol, la licuefaccin de
gelatina y no producen cidos a partir de la ramnosa (Scardovi, 1984).
Es un microorganismo exigente, ya que requiere factores especficos para su

crecimiento, entre estos se destacan amino azcares, extracto de levadura,
manganeso y magnesio, la cistena o cistina es fuente importante de nitrgeno
para su crecimiento.
2 Christian Hansen's Laboratorium (P1 / Sept. 2006). Hoja informativa. F DVS BB 12 Probiot Tec - Informacin de producto
35
Es una de las cepas ms ampliamente utilizada en el mundo. Adems de su

uso en productos lcteos fermentados, ha sido incorporada tambin en leche
en polvo y en frmulas infantiles (Cceres y Gotteland, 2010).
2.5.2. L. rhamnosus E800

Esta especie, por mucho tiempo fue clasificada taxonmicamente como sub-
especie de la especie Lactobacillus casei, basado en la similitud de sus perfiles
de fermentacin y variaciones fenotpicas dentro de la especie. Comparada
con L. casei, la bacteria L. rhamnosus presenta habilidades para producir
cido a partir de la ramnosa y de crecer a 45C, lo que explica su cambio al
grupo taxonmico de especie (Curry et al., 2003). Ello fue posible gracias a la
evidencia de homologa del DNA determinado mediante la tcnica molecular
del Reaccin de polimerasa en cadena (PCR) y del DNA polimrfico
aleatoriamente amplificado (RAPDs).
Es un bacilo que tiende a formar cadenas, adems es inmvil, no esporulado,

catalasa negativo. Se caracteriza por crecer a 15C y 43C, el crecimiento es
lento bajo los 35C y es nulo a 15C. Dentro de su propiedad
hererofermentativa facultativa se caracteriza por transformar las hexosas
bajos condiciones limitantes hasta cido L(+) lctico, actico, frmico y
etanol; y las pentosas hasta cido L(+) lctico y actico (Curry y Crow, 2003).
La cepa L. rhamnosus E 800, corresponde a una cepa de coleccin que

presenta fines de investigacin, no comercial (Saarela, 2008)3. Siendo el
3 Comunicacin personal. Mara Saarela 7 /10 / 2008. VTT Technical Research Centre of Finland.
36
organismo a cargo el Centro de Investigacin Tcnica VTT (VTT Technical

Research Centre of Finland). Corresponde a una cepa aislada desde las fecas
de individuos adultos sanos (Kontula et al., 2002). Son anaerobios
aerotolerantes4 y su crecimiento se ve favorecido por la anaerobiosis o por
tensiones reducida de oxgeno equivalente a 10 - 15% de un organismo
aerbico (Jyoti et al., 2004) y por medios con glucosa, lactosa y sus derivados
transformndolas en cido lctico y en menor proporcin en actico (Kontula
et al., 2002).
Para su crecimiento Liew et al. (2005), estimaron que la concentracin de

extracto de levadura es el factor ms importante, atribuido a que sta es una
excelente reserva de vitaminas del complejo B.
Un aspecto importante dentro de su uso en los productos lcteos se relaciona a

su habilidad para resistir altas temperaturas y concentracin de oxgeno.
Tolerar ambientes hostiles en los productos alimenticios tales como: baja
humedad, pH bajos y altas concentraciones de azcar (Sunny Robert y
Knorr, 2008).
Cabe mencionar que dentro de la especie existen cepa como L rhamnosus RW

9595 M, que presenta la habilidad de producir exopolisacridos (EPS) de
gran importancia por su efecto tecnolgico en la mejora de la textura y
viscosidad de productos fermentados (Peant et al., 2005) y a la produccin de
componentes del aroma como diacetilo y acetona (Jyoti et al, 2004).
4 VTT Technical Research Centre of Finland. Ficha Tcnica de Lactobacillus rhamnosus VTT E 97800 a potencial novel probiotic
strain
37
3. MATERIALES Y MTODOS
3.1 LUGAR Y DURACIN DE LA INVESTIGACIN

La investigacin se llev a cabo en la Universidad Austral de Chile (UACh)
en la Facultad de Ciencias Agrarias, Instituto de Ciencia y Tecnologa de los
Alimentos. (ICYTAL).
La etapa experimental se realiz durante los meses de abril a diciembre de
2009.
3.2 MATERIALES
3.2.1 Materias primas
3.2.1.1 Cepas utilizadas. Los microorganismos que se utilizaron para este
estudio correspondieron a cultivos liofilizados del tipo DVS (Direct Vat Set):
de L. rhamnosus E8005 y B. lactis Bb126. Los criterios tecnolgicos de
seleccin fueron sus tolerancias intrnsecas trmica y al oxgeno (Corcoran et
al., 2004; Simpson et al., 2005), la mantencin de elevados niveles de
viabilidad y estabilidad de sus propiedades en los productos deshidratados y la
resistencia a la liofilizacin, caractersticas importantes para el desarrollo de
los cultivos7.
5 Lactobacillus rhamnosus E97-800, VTT Biotechnology. Technical Research Centre of Finland, Espoo
6 Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12, Chr. Hansen, Argentina.
7 VTT Technical Research Centre of Finland. Hoja informativa. Lactobacillus rhamnosus VTT E 97800 a potencial novel probiotic
strain
38
3.2.1.2 Sustrato para la inoculacin de las cepas. Se utiliz leche en

polvo 26% de materia grasa (MG)8.
3.2.1.3 Material de empaque del producto terminado: Bolsas utilizadas
para envasar la leche en polvo. Se utilizaron bolsas de material flexible
trilaminado9 (Anexo 28), con recubrimiento metlico de aluminio que
cumplen con las especificaciones de la Federacin Internacional de la Leche
300 (IDF/FIL, 1995), de espesor superior a 74.
3.2.2 Equipos
3.2.2.1 Unidad de liofilizado marca Labconco modelo Triad Kansas City,
USA.
3.2.2.2 Mquina envasadora con sistema de barrido marca Multivac
modelo C100.
3.2.2.3 Cmaras de almacenamiento de leche, termoreguladas a 25C+2 y
40C+2.
3.2.2.4 Cmara de congelacin marca NuAire modelo -86C Ultra Low
Freezers, USA.
3.3 METODOLOGA DE TRABAJO

3.3.1 Obtencin de cultivo celular en fermentador
La experiencia se realiz en un fermentador modular10, bajo condiciones
controladas de laboratorio y bajo la modalidad de cultivo batch. Se trabaj con
8 Donacin de Prolesur S.A. Planta Osorno

9 Donacin de Cooperativa Agrcola y Lechera de la Unin, Coln. La Unin, Chile
10 Fermentador modular Gallenakamp, England, 1 L con equipos adicionales agitador magntico Thermolyne, bao termoregulado
Haake
39
el caldo de fermentacin GEM (Anexo 1) estril ajustados a pH 6,5; a una

temperatura de 37C+2 y agitacin (50 rpm). En el Anexo 2 se muestra
esquemticamente la propagacin de las cepas, la que se realiz segn el
protocolo descrito por Matto et al. (2006).
3.3.2 Control del cultivo celular

3.3.2.1 Determinacin de absorbancia. Se tomaron muestras cada hora y
la lectura de la densidad ptica11 se realiz a 630 nm para B. lactis Bb12,
(Matto et al., 2006) y a 600 nm para L. rhamnosus E800, (Saarela et al.,
2005). Se utiliz como blanco una muestra de caldo de fermentacin (GEM).
3.3.2.2 Neutralizante hidrxido de amonio al 20% (NH4OH).
3.3.2.3 Control microscpico de los cultivos12 Se realiz cada hora
mediante frotis con tincin simple (azul de metileno), para evidenciar la
morfologa del cultivo y realizar el seguimiento de la densidad.
3.3.2.4 Recuento de microorganismos probiticos. Se realiz cada cuatro
horas. Para la siembra de L. rhamnosus E800 se utiliz el agar MRS basado en
el caldo de Man Rogosa Sharpe (MRS13) a pH 5,2 ajustado con HCl 1,0 M
(Tharmaraj y Shah, 2003), (Anexo 3) y se incub a 43C durante 72 h. En
tanto, para la enumeracin del B. lactis Bb12 se siguieron las
recomendaciones del fabricante del cultivo liofilizado14, adicionando a un litro
de medio base MRS, los siguientes compuestos: 5 mL de una solucin
antibitica, constituda por dicloxacilina15 (Sigma Chemical CO, USA)
11 Espectrofotmetro Genesys 5. Spectronic Instruments.

12 Olympus CX21 Microscopy
13 Difco, Laboratories Inc. Detroit
14 Christian Hansen's Laboratorium (2007). Hoja informativa. Alternative method for enumeration of Bifidobacteria in fermented milk
products Guideline Technical bulletin P-12
15 Donacin del laboratorio Valtek S.A, Diagnostics. Chile
40
disuelta en agua destilada y preparada con una concentracin de 0,01% (p/v).

Adems, se incorpor 10 mL de una solucin de cloruro de litio (Merck AG,
Darmstadt) preparada al 11,11% (p/p) para finalmente aadir 5 mL de una
solucin de L-cistena-HCI preparada al 10% (p/v). Tanto la solucin de
dicloxacilina como la de cloruro de litio fueron esterilizadas empleando filtros
de 0,45 m (Millipore Corporation, USA) y se incub a 37C durante 48 h
(Anexo 4). Por su parte, la solucin de L-cistena-HCI fue esterilizada en
autoclave a 121C por 15 minutos. Todas estas operaciones fueron realizadas
con anterioridad a la incorporacin de tales soluciones al agar.
El antibitico impide el crecimiento de L. rhamnosus, permitiendo con ello la

enumeracin selectiva de bifidobacterias (Sozzi et al., 1990). Segn Lapierre
et al.(1992), el cloruro de litio es una sustancia comnmente usada en
microbiologa para el aislamiento de bifidobacterias dado que suprime el
crecimiento de las bacterias lcticas. En tanto, la cistena es considerada como
aminocido esencial para el crecimiento de bifidobacterias por su contribucin
en la reduccin del potencial redox (Hoover, 2000).
Para las diluciones, se utiliz la tcnica de siembra en superficie descrita por

APHA(1992), y se emple como diluyente el MRD16. Para ello se disolvi 1 g
de proteosa peptona (Difco Laboratories Inc., Detroit) y 8,5 g de cloruro de
sodio por litro de agua destilada, ajustando su pH a 7,0 + 0,2 con NaOH 0,1N,
medio que presenta la ventaja de otorgar un efecto protector aportado por sus
componentes, el cual favorece la recuperacin de los microorganismos por su
condicin isotnica (Bridson, 2006).
16 Maximun Recovery Diluent. Bridson . (2006)
41
3.3.3 Liofilizacin de los cultivos celulares.

La metodologa de trabajo comprendi diversos pasos, los cuales sern
detallados a continuacin.
3.3.3.1 Concentracin celular.
A partir del cultivo (3.3.1) se realiz la concentracin celular que consisti en
la centrifugacin17 por 10 min de la suspensin de bacterias contenidas en el
caldo GEM en tubos Falcn estriles a 4C (9720 rpm) (L. rhamnosus E800) y
4000 rpm (B. lactis Bb12), (Matto et al., 2005). Posteriormente se realiz la
suspensin del pellet obtenido en 40 mL de leche en polvo descremada,
previamente reconstituida al 10% de slidos no grasos y tindalizada (95C por
30 min durante tres das consecutivos a fin de eliminar las esporas). Se mezcl
la leche con el pellet celular en el agitador Vortex por tres minutos.
3.3.3.2 Congelacin.
Las muestras (3.3.3.1) en un volumen de 40 mL se mantuvieron a -80C18
durante 12 h. Posteriormente se descongelaron, dispersaron en el envase
(shell freezing) y se congelaron a 196C en nitrgeno lquido.
3.3.3.3 Liofilizacin.
Se llev a cabo en el Laboratorio de Bioinsumos del Instituto de Produccin y
Sanidad Vegetal. Para ello, los frascos se introdujeron al equipo y se
liofilizaron durante 48 a 72h (Labconco, USA), hasta observar una apariencia
seca homognea sin adherencia en las paredes.
3.3.3.4 Refrigeracin.
Las muestras se mantuvieron a temperatura < 5C hasta el inicio del estudio.
17 Centrifuga refrigerada Hitachi modelo Himac CR 21GII, Japn

18 Nuaire. Inc. Ultralow freezer. Plymouth,U.S.A.
42
3.3.4 Control posterior al proceso de liofilizacin

3.3.4.1 Recuento microbiolgico de cada cultivo, sobre agar MRS
correspondiente a cada cepa, mediante la tcnica de siembra en superficie
descrita por APHA (1992). Para la enumeracin de los microorganismos, 0,1 g
del liofilizado se reconstituy en 9,9 mL del diluyente MRD19, previamente
entibiada en un bao mara20, a 37+ 2C, lo que constituy la dilucin 10-2.
3.3.4.2 Anlisis de la humedad mediante el secado a peso constante en
estufa regulada a 102 + 1C segn el mtodo para la Determinacin del
Contenido de Agua de la Federacin Internacional de la Leche 26 (FIL/IDF,
1964) citado por Pinto (1998). El resultado fue expresado en gramo de
humedad por 100 g de polvo.
3.3.5 Inoculacin, mezcla y homogeneizacin de las cepas

liofilizadas en la leche en polvo y almacenamiento a temperatura
ambiente.
Como sustrato de inoculacin se utiliz leche en polvo entera a la cual, antes
de la inoculacin se realiz un control microbiolgico, que se compar con las
especificaciones del Reglamento Sanitario de los Alimentos (Chile, Ministerio
de Salud, 2008a), donde se evidenci la ausencia tanto de los patgenos
Salmonella en 25 g y S. aureus en 10 g, as como de inhibidores (Anexo 5).
Para el estudio de viabilidad de las cepas lcticas, se pes un gramo de cada

probitico liofilizado (3.3.3.3), para 100g de leche en polvo, segn el mtodo
19 Maximun Recovery Diluent

20 Bao de agua: Memmert
43
descrito por Vendt et al.(2005)21. Para la mezcla y homogeneizacin en seco se

utiliz agitacin manual por 10 min, con el fin de asegurar una distribucin
homognea de los cultivos en la leche en polvo entera.
Para el estudio organolptico se agreg cinco gramos de cada probitico

liofilizado (3.3.3.3), a 500g de leche en polvo. Para el control negativo se
prepararon bolsas con la misma cantidad de leche en polvo sin inocular.
Todas las muestras de leches en polvo suplementadas en seco con los

probiticos y los controles se envasaron bajo vaco y se conservaron
almacenadas a dos temperatura ambiente (25C + 2C y 40C+ 2C), durante
dos meses. La temperatura de las cmaras de almacenamiento se control y
registr diariamente.
3.3.6 Evaluacin del efecto de la temperatura de almacenamiento

de la leche en polvo, sobre la supervivencia de L. rhamnosus E800 y B.
lactis Bb12.
Para valorar la viabilidad de las bacterias almacenadas a 25C + 2C y 40C+
2C, se realizaron recuentos de bacterias probiticas en muestras del producto
mantenido en bolsas de trilaminado en las siguientes etapas: a)
inmediatamente despus de inocular el cultivo liofilizado a la leche en polvo
(tiempo cero), b) durante el tiempo de almacenamiento del producto a los 15,
30, 45 y 60 das.
21 Comunicacin Personal, Vendt, N. 8/ 9/ 2008. Department of Pediatrics, University of Tartu, Estonia

44
Para la siembra se utiliz la metodologa descrita para leche en polvo por la

Federacin Internacional de la Leche 122C (IDF/FIL, 1996). Se pesaron 10 g
de leche en una bolsa del homogeneizador Stomacher22, y se agregaron en 90
mL del diluyente MRD23, calentado a 40+ 1C.
Con el objeto de evidenciar la estabilidad de la leche en polvo frente al
deterioro, al final del almacenamiento se realiz el control de la actividad de
agua (aw) 24
3.3.7 Evaluacin del efecto de la temperatura de reconstitucin de

la leche sobre la viabilidad de las cepas L. rhamnosus E800 y B. lactis
Bb12.
El objetivo de este anlisis fue determinar la viabilidad de los probiticos en
los medios de reconstitucin agua y MRD sometidos a dos temperaturas de
reconstitucin: 40C y 60C. Los anlisis microbiolgicos se realizaron el da
0, 30 y 60 a partir de la leche en polvo entera almacenada a 25C.
3.3.8 Evaluacin del efecto de las cepas probiticas sobre las

caractersticas organolptica de la leche reconstituida, sometida a dos
tiempos de reconstitucin.
Con el objeto de conocer si la mantencin a temperatura ambiente, durante 60
y 180 min de la leche reconstituida, afectaba sus caractersticas organolptica,
se realiz un estudio de evaluacin sensorial de las muestras de leche en polvo
22 Stomacher. Seward Medical, London

23 Maximun Recovery Diluent
24 Paw kit water activity meter, Decagon
45
con y sin la incorporacin de la mezcla de cepas probiticas (L. rhamnosus

E800 y B. lactis Bb12). Para ello se cont con un panel entrenado segn
programa de entrenamiento de panelistas (Anexo 6) y validado en evaluacin
de leche en polvo constituido por 10 jueces, seis pertenecientes al Icytal y
cuatro a alumnos de la carrera de Ingeniera de Alimentos de la UACh, los
cuales fueron previamente reclutados y seleccionados mediante la aplicacin
de un cuestionario (Anexo 7) y un test de reconocimiento de sabores bsicos,
respectivamente (Anexo 8), (Watts et al., 1992).
La prueba de reconocimiento de sabores bsicos se desarroll en dos sesiones,

en la cual se presentaron diferentes concentraciones umbrales para cada sabor
bsico. En el Anexo 9 se puede observar los componentes y concentraciones
utilizadas para la elaboracin de las soluciones. Para esta prueba de seleccin
se utiliz el test Triangular descrito por Watts et al. (1992).
La etapa de entrenamiento (Anexo 6) se llev a cabo en 6 sesiones terico-

prcticas de una hora de duracin cada una. Las dos primeras sesiones se
dedicaron a discutir el rol de los jueces y el test a utilizar. Las cuatro
siguientes se destinaron a la evaluacin y discusin de las caractersticas
sensoriales tpicas de la leche en polvo. El entrenamiento se efectu
presentando a los jueces leche en polvo con diferentes grados de deterioro o
cambios que pudieran presentarse en la leche en polvo al ser inoculadas las
cepas probiticas, utilizando para ello muestra estndar para sabor oxidado,
rancidez, amargo y acidez, las cuales fueron preparadas segn el protocolo de
Hought et al. (1992). Se realizaron evaluaciones en base a sabor, para crear
46
memoria sensorial sobre los defectos en leche en polvo entera y familiarizar al

juez con el test triangular a emplear (Anexo 10). Dicho test consiste en
presentar al panelista tres muestras, de las cuales dos son iguales y una
diferente, este test permite determinar mnimas diferencias entre las muestras.
Para llevar a cabo la etapa de validacin se realizaron tres sesiones de

evaluacin sensorial. En ellas se aplic el test triangular para diferenciar
muestras de leche en polvo reconstitudas adicionadas de cido lctico y
sulfato de cobre en su umbral medio segn protocolo de Hought et al. (1992).
El objetivo que se persegua al preparar estas soluciones, fue que el producto
adquiriera un sabor cido y metlico (oxidado), aludiendo a posibles cambios
que pudieran presentarse en el producto al ser inoculados con cepas
probiticas. Adems permita verificar que el panelista fuese capaz de percibir
e identificar estos cambios.
Las muestras de leche en polvo utilizadas para el estudio se reconstituyeron

segn la metodologa descrita por Federacin Internacional de la Leche 99B
(IDF/FIL, 1995). La disolucin se realiz mediante agitacin manual y se dej
en reposo. Se ajust la temperatura a 20C + 2C y se mantuvo la leche a esa
temperatura hasta el momento de la degustacin a los 60 y 180 min. Cada
sesin de degustacin correspondiente a los 60 y 180 minutos de la
reconstitucin se realiz desfasada en 48 h de forma de evitar juicios
inconsistentes por errores de tipo psicolgico como cansancio o
desmotivacin. El panel se realiz a los tiempos cero, 30 y 60 das. Al inicio
47
del estudio se realizaron 6 sesiones terico/prctica preliminares de una hora,

con el objeto de estandarizar conceptos del mtodo de evaluacin y atributos
del producto.
En cada sesin de degustacin se evalu un set de muestras segn la

metodologa de test triangular (Watts et al., 1992). Entre estas muestras se
incluy el control. Las condiciones de evaluacin fueron en cabinas
independientes con luz blanca pertenecientes al Laboratorio de Anlisis
Sensorial del ICYTAL, provistas de tres vasos de plstico tapados
conteniendo las muestras codificadas, un vaso de agua potable a temperatura
ambiente, toalla nova, galletas tipo cracker, lpiz y ficha de evaluacin
(Anexo 10). Las pruebas se realizaron en la tarde, entre las 16:00 a 17:00 h. Al
inicio de la degustacin las muestras correspondientes al mayor tiempo desde
su reconstitucin (180 min) se encontraban en cada cubculo y posteriormente
durante la degustacin simultneamente a cada panelista y en un orden
seleccionado al azar (Watts et al., 1992), se entregaban las muestras con 60
min post reconstitucin.
La evaluacin se realiz en triplicado. La interpretacin de las respuestas se

realiz utilizando la tabla de significacin estadstica para el test Triangular
(Anexo 11), (Wittig de Penna, s/f), en la cual se identifica si existe diferencia
significativa, relacionando el nmero total de panelistas que participan en la
prueba y el nmero de panelistas que eligi correctamente la muestra
diferente.
48
3.3.9 Evaluacin fsico qumica

Con el objeto de detectar efectos atribudos a las cepas en estudio, se
realizaron paralelamente las siguientes mediciones:
3.3.9.1 Viscosidad: mediante un viscosmetro rotacional25 se determin la
viscosidad de la leche en polvo reconstituida, a una temperatura de 20 +2C,
utilizando un husillo nmero 2.
3.3.9.2 Acidez: la determinacin de la acidez titulable de la leche en
polvo reconstituida se realiz al tiempo cero y cada 15 das durante los dos
meses de almacenaje de la leche, usando el mtodo establecido por la Norma
Chilena 1678. 1979 (Chile, INN, 1979).
3.4. Diseo Experimental y Anlisis estadstico
Se estudiaron tres tratamientos con tres repeticiones cada uno. Las variables
estudiadas fueron: viabilidad de los probiticos (0, 15, 30, 45 y 60 das) y,
caractersticas fsico-qumicas y sensoriales de la leche en polvo con
probiticos (0, 15 y 30 das).
Tratamiento 1: Leche en polvo inoculada con L. rhamnosus E800.

Tratamiento 2: Leche en polvo inoculada con B. lactis Bb12.
Tratamiento 3: Leche en polvo inoculada con una mezcla de ambos
probiticos en una proporcin de 1:1 de L. rhamnosus E800 y B. lactis Bb12.
25 Viscosmetro Visco Star R de Fungilab S.A.

49
Tabla 3. Diseo experimental
Variable Nivel Respuesta estudiada

Viabilidad de los probiticos segn 0, 15, 30, 45 y 60 Recuentos microbiolgicos
temperatura de almacenamiento de das. para cada probitico.
la leche en polvo
Viabilidad de los probiticos segn 0, 15, 30, 45 y 60 Recuentos microbiolgicos
temperatura de reconstitucin de la das. para cada probitico.
leche en polvo
Caractersticas 0, 30, y 60 das. Test Triangular
Sensoriales del producto
Caracterstica 0, 30 y 60 das Acidez titulable y
Fsica qumica del producto Viscosidad
Los resultados de las pruebas fsicas y microbiolgicas se analizaron mediante

un anlisis de Varianza Multivariado. Se realiz el test de Levene para realizar
el supuesto de homogeneidad de varianzas. En caso de existir diferencias
significativas p<0,05 entre tratamientos, repeticiones y das, se realiz el test
de Tukey como anlisis de comparacin mltiple para identificar los
tratamientos estadsticamente diferentes. Los anlisis anteriormente descritos
se realizaron mediante el software estadstico Statgraphics Plus versin 5.1.
Para el anlisis de datos sensoriales obtenidos a partir del test Triangular se
utiliz la tabla de significancia (Anexo 11), especfica para este test, a fin de
determinar diferencias significativas entre las muestras presentadas a un nivel
de confianza de un 99%.
50
4. PRESENTACIN Y DISCUSIN DE RESULTADOS
El estudio se inici con la fermentacin del cultivo a escala de laboratorio para

obtener el volumen de clulas de las cepas probiticas (L. rhamnosus E800 y
B. lactis Bb12) necesario para la inoculacin a la leche en polvo, con el fin de
evaluar la viabilidad de las cepas probiticas en sta.
4.1- CULTIVO CELULAR DE CEPAS PROBITICAS

A continuacin se presentan los resultados obtenidos en las fermentaciones
realizadas para cada una de las cepas en estudio. En las Figuras 1 y 2 se
observa el desarrollo de bacterias expresados como logaritmo natural de la
densidad ptica (ln DO) y logaritmo (log ufc/mL), a lo largo del tiempo de
crecimiento observado. Los valores de densidad ptica y recuentos
microbianos se presentan en detalle en el Anexo 12a.
4.1.1 Crecimiento de L. rhamnosus E800 en caldo GEM

La curva de crecimiento de la cepa L. rhamnosus E800 se presenta en la
Figura 1, donde se observa que el crecimiento ocurri en forma diauxica
mostrando dos etapas distintas de crecimiento exponencial 1 a las 3 h y 2 a
las 9 h separadas por un perodo de reposo debido a que en el primer tiempo se
consumi la glucosa y en el segundo tiempo el lactato; similar a lo encontrado
por Jyoti et al. (2004). El desarrollo alcanz un mximo de 9,70 log ufc/mL
despus de 14 h de fermentacin. Este tiempo coincide con la fase de
51
crecimiento exponencial tardo (Jyoti et al.,2004). Ello representa un

incremento de aproximadamente 2,6 unidades logartmicas en el recuento
bacteriano inicial.
2,5 12
log Recuento en placa (ufc/mL)

ln Densidad Optica (600 nm)
2
y = 0,0884e0,4562x 2 11
1,5 2
R = 0,9368
1 10
0,5
0 9
-0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
8
-1 1
-1,5 7
-2
-2,5 6
Tiempo (h)
ln D .O . log Rcto .
Figura 1. Curva de crecimiento de L. rhamnosus E800, (VTT Technical

Research Centre of Finland) en caldo GEM a 37C, con control
de pH a 5,8.
4.1.2- Crecimiento de B. lactis Bb12 en caldo GEM

El cultivo de clulas para la cepa B. lactis Bb12 se realiz en dos
oportunidades a dos temperaturas distintas. Al visualizar las curvas de
crecimiento de la cepa se observa que los recuentos bacteriano alcanzaron un
valor de 10,11 log ufc/mL despus de 10 h (tiempo 1) durante su crecimiento
exponencial, (Figura 2A) y 11,03 log ufc/mL despus de 12 h de
fermentacin, (tiempo 2), concordante con su perodo de crecimiento
exponencial tardo, (Figura 2B). Ello representa un incremento entre 2 y 3
unidades logartmicas, respectivamente en relacin al recuento bacteriano
52
inicial. La diferencia en los niveles de desarrollo se atribuye a un aumento de

temperatura (39C) del cultivo en el tiempo 2, debido a que el control de
temperatura no era automatizado.
2,5 12

2
A
ln Densidad ptica (630nm)
0,2027x 11
1,5 y = 0,1377e
1 R2 = 0,995 10
0,5
0 9
-0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
8
-1
-1,5
7
-2
-2,5 6
Tiempo (h)
ln D . O. log Rcto .
2,5 12

2 0,1965x
B y = 0,9708e 11
ln Densidad ptica (630nm)
1,5 2
R = 0,9398
1
10
0,5
0 9
-0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
8
-1
-1,5
7
-2
-2,5 6
Tiempo (h)
ln D . O. log Rcto .
Figura 2. Curvas de crecimiento de B. lactis Bb12 (Chr Hansen) en caldo

GEM a 37C (A) y 39C (B), con control de pH a 5,8
53
Debido a que los controles del cultivo de las cepas probiticas seguido
mediante mediciones de densidad ptica y gasto de hidrxido de amonio al
20% (NH4OH) presentaron un descenso al cabo de 14 h (L. rhamnosus E800),
(Anexo 12a) 13 h y 11 h (B. lactis Bb12), (Anexo 12b y 12c) se procedi a
finalizar el proceso de fermentacin.
Los tiempos de fermentacin para llegar a la fase exponencial tarda y

estacionaria segn el protocolo de Matto et al. (2006), fueron 15 h y 20 h,
respectivamente. Estos valores fueron superiores a los obtenidos en el presente
estudio bajo condiciones similares, con excepcin del uso de nitrgeno
gaseoso para otorgar condiciones de anaerobiosis. Probablemente tales
diferencias en los tiempos de produccin del cultivo se pueden atribuir a las
condiciones de aerobiosis. Esto se explica por el metabolismo microaerfilo y
anaerbico ligeramente tolerante al oxigeno de las especie L. rhamnosus E800
(Jyoti et al., 2004), y B. lactis Bb12 (Simpson et al., 2005), respectivamente.
El tiempo de crecimiento de 13 h, concuerda con el obtenido por Saarela et al.

(2003), para L. rhamnosus E800, bajo condiciones de aerobiosis a 37C,
utilizando caldo MRS con glucosa como fuente de carbono, quienes
alcanzaron la fase estacionaria al cabo de 13 h.
La importancia del estado fisiolgico exponencial tardo en que se encuentra

el microorganismo probitico adicionado en una etapa posterior del estudio,
adems de la obtencin de un mayor recuento celular radica, en que le
confiere ventajas a las cepas probiticas en cuanto a su mayor resistencia
durante el liofilizado y almacenamiento a temperatura de refrigeracin y
54
ambiente. Al respecto Saarela et al. (2005), no encontraron diferencias

significativas en la viabilidad de cepas obtenidas durante la fase exponencial y
estacionaria, lo cual se atribuy a que los cultivos jvenes son ms sensibles a
la liofilizacin y al almacenamiento que los cultivos en su fase exponencial
tarda y estacionaria.
Los valores cinticos, calculados a partir de los datos de D.O de cada uno de
los cultivos durante su fase exponencial, se presentan en la Tabla 4. La
velocidad especfica de crecimiento (), que se define como la pendiente de la
curva de crecimiento logartmico en la fase de crecimiento exponencial, se
obtuvo mediante la ecuacin de la recta de regresin de una grfica que
representa la masa celular del cultivo en funcin del tiempo de incubacin
(Figuras 1 y 2). En tanto, el valor del tiempo de duplicacin se calcul de la
expresin, como refieren Shuler et al. (2002).
td = ln 2

Tabla 4. Parmetros cinticos obtenidos con las cepas probiticas en los
distintos cultivos celulares en caldo GEM a pH 5,8
Cepa Velocidad especfica Tiempo de duplicacin
Probitica de crecimiento
(h-1) tD (h)
L. rhamnosus E800 (*) 0,5 1,4
( 1crecimiento exponencial auxitico)
L. rhamnosus E800 (*) 0,21 3,3
(2 crecimiento exponencial auxitico)
B. lactis Bb12 (**), (37C) 0,20 3,4
B. lactis Bb12 (**), (39C) 0,19 3,0
(*)VTT Technical Research Centre of Finland
(**)Chr Hansen
55
El desarrollo de las cepas a 37C se produjo a velocidades de crecimiento

diferentes, la cepa L. rhamnosus E800 durante su primera etapa de
crecimiento exponencial, creci ms rpido, llegando a una velocidad de
crecimiento mxima de 1 = 0,5 h-1, cerca de 2,5 (tiempo 1) y 2,6 (tiempo 2)
veces superior al cabo de las tres horas a la correspondiente a B. lactis Bb12,
lo cual puede estar relacionado con la mayor sensibilidad de B. lactis Bb12 a
las condiciones de aerobiosis.
Madigan et al.(1997), sealan que la tasa de crecimiento exponencial se ve

influenciado por las condiciones ambientales similares de crecimiento como
temperatura, aerobiosis y composicin del medio, as como las caractersticas
de los microorganismos. Gonzlez et al. (2004), estudiando el crecimiento de
B.infantis a 37C, bajo condiciones de aerobiosis y anaerobiosis en un medio
que contena dentro de su composicin peptona de soya y glucosa,
concluyeron que la presencia de oxgeno, aunque no afecta la produccin de
biomasa, si afecta negativamente la velocidad de crecimiento (), donde el
menor valor fue hallado en los cultivos operados en condiciones de aerobiosis
(<0,71h-1) y el mayor en condiciones anaerbicas (0,96 h-1).
La temperatura de crecimiento de B. lactis Bb12 concuerda con la temperatura

ptima de crecimiento (37C a 40C) sealadas por el proveedor Chr Hansen
(2006)26, en la cual el crecimiento es mucho ms rpido con menor tiempo de
generacin (Tabla 4).
26 Christian Hansen's Laboratorium (P1 / Sept. 2006). Ficha Tcnica. F DVS BB 12 Probiot Tec - Informacin de producto
56
4.2 EFECTO DEL PROCESO DE LIOFILIZADO SOBRE LA

VIABILIDAD DE LAS CEPAS PROBITICAS
Debido al lapso de tiempo transcurrido (12 h) entre el fin del cultivo celular e
inicio del proceso de liofilizacin, los cultivos de L. rhamnosus E800 y B.
lactis Bb12 fueron mantenidos a -80C, con el objeto de acortar los tiempos en
el liofilizador y lograr una adecuada dispersin del cultivo en el envase (shell
freezing) stas se descongelaron y seguidamente se congelaron a 196C en
nitrgeno lquido, previo a la liofilizacin. Luego de completar el proceso los
frascos son sellados en ausencia de vaco y conservados bajo refrigeracin.
En la Tabla 5 se presentan los resultados de viabilidad expresado como

porcentaje de sobrevivencia y la humedad residual, obtenidos inmediatamente
despus del liofilizado. Se observa que la humedad residual en los cultivos de
la cepa B. lactis Bb12 mostraron gran diferencia entre si, con valores de 7,3%
(tiempo 2) y 6,1% (tiempo 1).
Tabla 5. Efecto del liofilizado en la viabilidad de las cepas probiticas.

Reduccin
en ciclo log
Humedad Cultivo Cultivo pos
de la
Cepas residual del inicial liofilizacin Sobrev. log
viabilidad
liofilizado (log ufc/g) (log ufc/g) (%)
durante el
(%)
liofilizado
L. rhamnosus
6,70 9,70 9,30 96,3 0,36
E800 (*)
B.lactis Bb12,
6,10 10,11 10,0 98,9 0,11
(Tiempo 1),(**)
B. lactis Bb12,
7,30 11,03 10,56 96,0 0,47
(Tiempo 2), (**)
(**)Chr Hansen
57
Se evidencia que la reduccin logartmica por efecto de la liofilizacin

alcanz valores superiores a los encontrados por Saarela et al. (2005), para B.
lactis Bb12, quienes sealan que al trmino de la liofilizacin la reduccin
debe ser igual o inferior a 0,04 log ufc/g, parmetro que ninguna de las cepas
estudiadas cumpli. No obstante, el valor de reduccin de 0,47 unidades de
log ufc/g obtenido concuerda con los obtenidos por Yi Chich et al. (2004),
para las cepas B. longum (0,41 unidades de log ufc/g) y B. infantis (0,51
unidades de log ufc/g) en leche de soya.
La prdida de clulas viables durante la liofilizacin pudo haber ocurrido

durante la etapa de congelacin y descongelacin. El protocolo usado (2.4) y
los resultados obtenidos (Tabla 5) reflejan esta posibilidad. Al respecto,
Martin (1983), estudiando dos mtodos de congelamiento en la viabilidad del
cultivo concentrado de L. acidophilus, seala que se ha comprobado que la
repetida congelacin y descongelacin destruyen a las bacterias por la ruptura
de las membranas celulares. Adems, se ha demostrado que cuan ms rpida
es la descongelacin mayor es el nmero de bacterias sobrevivientes. La
importancia de la congelacin radica en que puede desestabilizar las clulas y
hacerlas ms susceptibles al proceso de deshidratacin (Johnson y Etzel,
1995). Zamora (2003), al comparar los efectos de la metodologa de
congelacin y liofilizado en las propiedades celulares de varias cepas lcticas
encontr que el porcentaje de supervivientes al proceso de liofilizacin
(reduccin de 100 al 48%), fue para la mayora de las cepas inferior al nmero
de supervivientes al proceso de congelacin (-80C), (reduccin de 100 al
58
88%), lo que sugiere el efecto probablemente aditivo, de las dos etapas

incluidas en la liofilizacin.
El ndice de supervivencia de los cultivos liofilizados est relacionado con el

nmero inicial de clulas y con la edad de los cultivos (Costa et al., 2000). En
general cuanto mayor es el recuento inicial, mayor es el porcentaje de
recuperacin obtenido y los cultivos muy jvenes o muy viejos son ms
susceptibles a tratamientos a bajas temperaturas que aquellos que se
encuentran al final de la fase de crecimiento exponencial o al inicio de la fase
estacionaria. En este estudio se utilizaron cultivos de las cepas que se
encontraban en la fase exponencial tarda (L. rhamnosus E800 y B. lactis
Bb12- tiempo 2) y la concentracin de los cultivos antes de ser sometidos a la
liofilizacin, era del orden de 109 ufc/mLy 1011 ufc/mL, respectivamente.
Para el liofilizado de las cepas se utiliz como agente crioprotector leche en

polvo descremada reconstituida. Al respecto, Carvalho et al.(2004), sealan
que sus ventajas asociadas son: (a) impedir el dao celular mediante la
estabilizacin de la membrana celular, (b) crear una estructura de poros en el
liofilizado que hace ms fcil la rehidratacin y (c) proporcionar las protenas
como una capa protectora de las clulas bacterianas.
En un estudio realizado por Miao et al. (2008), se concluy que el cultivo

liofilizado de L. rhamnosus GG con leche en polvo descremada al 15%
alcanz una reduccin de 0,2 unidades de log ufc/g (desde log 9,15 a 8,97 log
ufc/g) y un porcentaje de sobrevivencia de 98% al cabo de 38 das. Aunque
los valores de prdida de biomasa fueron menores a los encontrados en esta
59
investigacin, se puede relacionar a que las propiedades de sobrevivencia son

distintas a pesar de que estas dos cepas pertenezcan al mismo gnero
(Lactobacillus) y a la misma especie (rhamnosus). Al respecto Gardiner et
al.(2000), evidenciaron que al igual como ocurre en la mayora de las tcnicas
de preservacin, la supervivencia que se obtiene con la liofilizacin vara entre
cepas de la misma especie.
Miao el al. (2008), compararon la leche descremada en polvo reconstituida al

15% con los azcares trealosa, maltosa y sucrosa, como agentes
crioprotectores en el proceso de liofilizacin de L. rhamnosus GG,
concluyendo que los azcares permitan la mxima recuperacin de clulas
viables. Chvez y Ledeboer. (2007), sealan que al utilizar azcares,
especialmente los disacridos como crioprotectores extracelulares, estos
pueden sustituir el agua molecular cuando es removida y adems preservar la
estructura de la membrana. La efectividad de los crioprotectores extracelulares
se basa en permitir un flujo reversible de solutos durante el congelamiento y
descongelamiento celular.
4.3 EFECTO DE LA TEMPERATURA DE ALMACENAMIENTO

SOBRE LA VIABILIDAD DE LAS CEPAS PROBITICAS
INOCULADAS EN LA LECHE EN POLVO ENTERA
El objetivo central del estudio fue evaluar la viabilidad de dos cepas
probiticas en leche polvo, almacenadas a dos temperaturas durante dos
meses. Se simularon las condiciones de almacenamiento con temperaturas
controladas, de acuerdo a las especificaciones tcnicas para los productos que
60
distribuye el Ministerio de Salud, que corresponde a 25C (Chile, Cenabast,

2009) y una temperatura ambiental extrema (40C), para simular las
condiciones de almacenamiento que pueden ocurrir a nivel del consumidor o
en bodegas de almacenamiento de leche en polvo.
En la Tabla 6 se presenta la evolucin de los recuentos de los cultivos

probiticos durante las etapas previa al almacenamiento a temperatura
ambiente de la leche en polvo adicionada con los probiticos. Se observa que
los cultivos iniciales con mayor recuento, coincidente con la fase de
crecimiento exponencial tarda, presentaron la mayor estabilidad a lo largo de
las etapas de almacenamiento refrigerado.
Tabla 6. Evolucin de los probiticos viables hasta la adicin a la leche

en polvo
Cultivo
Leche en
refrigerado
polvo
Cultivo pre Cultivo pos pre adicin a
adicionada
Cepas liofilizacin liofilizacin la leche en
con cultivo
(log ufc/Ml) (log ufc/ g) polvo
(log ufc/g),
(log ufc/g),
(tiempo 0)
(tiempo)
L. rhamnosus
9,70 9,3 9,30 (1 mes) 7,70
E800 (*)
B.lactis Bb12,
10,11 10,0 9,52 (4 meses) 7,33
(Tiempo 1),(**)
B. lactis Bb12,
11,03 10,56 9,71 (4 meses) 7,57
(Tiempo 2), (**)
(**)Chr Hansen
Debido al tiempo transcurrido (4 meses) entre fin del proceso de liofilizacin

de las cepas B. lactis Bb12 mantenidas bajo condiciones de refrigeracin e
61
inicio de la fase de inoculacin de las cepas a la leche en polvo, se evidenci

una mayor reduccin en su tiempo 2 (0,85 unidades de log ufc/g ) al comparar
con su tiempo 1 (0,48 unidades de log ufc/g).
Dentro de los factores que probablemente afectaron negativamente la

mantencin de la viabilidad de las cepas durante el almacenamiento
refrigerado, previo a su inoculacin en la leche en polvo, se encuentra el
envasado del liofilizado sin vaco y el nivel de humedad de los cultivos
liofilizados (Tabla 5). Segn Hunter y Belt. (1996), un contenido de humedad
residual dentro de un lmite (2 -3%), sera el ptimo para mantener la
estabilidad de los microorganismos liofilizados sin mayores prdida de
viabilidad. En tanto Gardiner et al. (2000), recomendaron para el sustrato de
leche descremada que no sea superior a 5%, para as prolongar la vida til y
estabilidad del producto deshidratado durante el almacenamiento.
El efecto de la humedad tambin se refleja en los valores de actividad de agua

de los cultivos (aw) determinados al final del estudio. Donde, el valor fue de
0,36 para B. lactis Bb12 y 0,42 para L. rhamnosus E800 almacenados a 4C.
Al respecto, Teixeira et al. (1995), encontraron que valores de aw entre 0,11 y
0,23 previenen la muerte de los cultivos durante el almacenamiento.
Sobre el almacenamiento refrigerado de B. lactis Bb12 sin aplicacin de vaco

Chavez et al. (2007), indican que el almacenamiento de la cepa en presencia
de aire acelera su mortalidad atribuido a su condicin de microorganismo
anaerbico.
62
A consecuencia de la dilucin de las cepas al ser adicionadas a la leche en

polvo (1:100) los recuentos en promedio para las cepas L. rhamnosus E800 y
B. lactis Bb12 se redujeron en 1,61 unidades log ufc/g y 2,16 unidades log
ufc/g, respectivamente; lo que en trminos porcentuales corresponde a 17,4%
(L. rhamnosus E800) y 22,5% (B. lactis Bb12) de disminucin al recuento
inicial.
El recuento de incorporacin en seco de la especie L. rhamnosus sobre el nivel

log 9,0 as como su proporcin de incorporacin (1g de cepa: 100g de leche),
fueron semejantes a los utilizado por Vendt et al. (2006)27, quienes realizaron
un estudio clnico para evaluar el efecto de L. rhamnosus GG incorporado en
una frmula infantil, sobre el crecimiento de infantes durantes sus primeros
seis meses de vida. En tanto, los recuentos iniciales del estudio fueron
similares a los obtenidos por Prez (2003), (7,88 log ufc/g), quien realiz un
estudio para caracterizar la viabilidad de la cepa B. longum incorporada a una
frmula infantil durante su perodo de consumo de 14 das.
A continuacin se presentan los resultados obtenidos para el estudio del efecto

de tratamientos, temperaturas, das de almacenamiento y repeticiones, sobre la
viabilidad de las cepas probiticas. El efecto de las repeticiones (Anexos 18,
19 y 20), se atribuye a las condiciones propias del diseo experimental
correspondiente a bloques completamente al azar.
27 Comunicacin Personal, Vendt, N. 8/ 9/ 2008. Department of Pediatrics, University of Tartu, Estonia

63
Los resultados de la viabilidad de las cepas probiticas en el tiempo (Figura

3), arrojaron una diferencia en la viabilidad entre 25C y 40C, y a su vez los
tratamientos mostraron diferencias entre si.
A L. rhamnosus E800
8
7
log ufc/g
4
0 15 30 45 60
Tiempo de almacenamiento (das)
25C 40C
B B. lactis Bb12
8
7
log ufc/g
4
0 15 30 45 60

25C 40C
Figura 3. Viabilidad de L. rhamnosus E800 (VTT Technical Research

Centre of Finland), (T1), (A) y B. lactis Bb12 (Chr Hansen),
(T2), (B) durante el almacenamiento a 25C y 40C.
64
La viabilidad de las cepas probiticas disminuy con el incremento de la

temperatura y los das de almacenamiento. Paralelamente, a una misma
temperatura de almacenamiento el nmero de clulas viables de las cepas
probiticas disminuy en el tiempo.
En general, los tratamientos con la cepa probitica L. rhamnosus E800

presentaron mejor viabilidad, con un promedio de 6,61 log ufc/g, en cambio la
menor viabilidad se vio para los tratamientos que contenan B. lactis Bb12 con
un promedio de log 6,40ufc/g.
El anlisis de varianza arroj diferencias estadsticamente significativas

(p<0,05) entre las dos temperaturas con el efecto ms negativo a 40C, lo que
concuerda con la interaccin observada entre tiempo de almacenamiento y
temperatura (Figura 4 y Anexo 18).
Grfico de Interaccin
7,9 Tiempo_das
0
7,5 15
log ufc g
7,1 30
45
6,7 60
6,3
5,9
5,5
25C 40C
Tmperatura cmara
Figura 4. Interacciones entre las temperaturas de cmara y los das de
almacenamiento sobre la viabilidad de las cepas probiticas.
65
Mediante la combinacin de los tres factores (tratamientos, temperatura y das

de almacenamiento) se pudo comprobar el efecto independiente de cada factor
y la existencia de interacciones entre stos, lo cual se manifest en variaciones
sobre la viabilidad. Las interacciones significativas (p<0,05) fueron entre los
factores temperatura y das de almacenamiento (Figura 4). Sin embargo, no se
evidenciaron para el factor tratamiento. La temperatura ejerci un efecto
negativo, estadsticamente significativo (p<0,05) sobre la viabilidad, ms
acentuado a los 15 y 30 das, pero con una tendencia clara a ser desfavorable
en el tiempo.
En la Tabla 7, se presentan los datos promedio, de las tres repeticiones, de los

recuentos poblacionales de las dos cepas L. rhamnosus E800 y B. lactis Bb12
a lo largo del perodo de almacenamiento a temperaturas de 25C.
Tabla 7. Evolucin de probiticos viables en leche en polvo (log ufc/g +

DE) almacenados a 25C + 2C
Cepas de Probitico
Mezcla
L. rhamnosus B.lactis L. rhamnosus B. lactis
E800 Bb12 E800 Bb12
Etapa (T1) (T2) (T3a) (T3b)
Da 0 7,7+0,2*a**A*** 7,6+0,3aA 7,6+0,5aA 7,3 + 0,4aA
Da 15 6,8+0,4aB 6,9+0,4aB 7,2+0,0aB 6,9+0,6aB
Da 30 6,7+0,3aBC 6,7+0,2aBC 6,6+0,2aBC 6,5+0,0aBC
Da 45 6,7+0,3aC 6,6+0,1aC 6,6+0,3aC 6,5+0,0aC
Da 60 6,7+0,3aC 6,4+0,1aC 6,6+0,3aC 6,3+0,2aC
*Los recuentos corresponden al promedio de las tres repeticiones.
**Letras minsculas distintas en una misma fila indican diferencias estadsticamente significativas entre
tratamientos al 5% segn el Test de Tukey. *** Letras Maysculas en una columna, diferencia entre tiempos
66
Al observar la Tabla 7 y el Anexo 18 se evidencia que no hubo diferencias

significativas (p>0,05) entre tratamientos, por lo tanto cada cepa por si sola o
en combinacin se mantuvo sin variaciones. Sin embargo, en relacin al
recuento inicial se observaron diferencias significativas (p <0,05) en el tiempo
con prdida de clulas viables para ambos probiticos a partir del da 15 de
almacenamiento de la leche y un posterior descenso, para todos los
tratamientos entre los 30 y 45 das, luego de lo cual no hubo mayor reduccin
en el nmero de clulas viables. Lo cual corrobora que ambas cepas
presentaron semejantes porcentaje de sobrevivencia 87% (L. rhamnosus E800)
y 86% (B. lactis Bb12), (Tabla 8).
Segn Prez (2003), quien realiz un estudio similar, para evaluar la

viabilidad de la cepa B. longum incorporada en seco a una frmula infantil,
encontr que a partir del da quinto de almacenamiento la existencia de
diferencias significativas (p <0,05), las cuales se mantuvieron en el tiempo
con una reduccin en el nmero de clulas viables de hasta 0,7 unidades
logartmicas ufc/g al cabo de 14 das en relacin al recuento inicial (7,88 log
ufc/g), valores de reduccin superior al obtenido en nuestro estudio al cabo del
da 15 (Tabla 7). Al evaluar los factores asociados a la prdida de la
viabilidad de los probiticos como el pH y humedad de la leche se
encontraron con diferencias significativas (p<0,01), no obstante, no afectaron
el valor de la dosis recomendada para una leche en polvo con probiticos por
el Scientific Committee on Food de la Unin Europea (> 106 ufc/g),
(European Commissin, 2003).
67
Lankaputhra et al., 1996 citado por Prez (2003), sealan como causa
importante de deterioro en la viabilidad de bifidobacterias a los valores
obtenidos de pH, as reportan que el nivel de prdida de viabilidad puede
alcanzar hasta 82% para la cepa B. infantis presente en productos fermentados
con pH de 4,3.
Tabla 8 Efecto de tiempo de almacenamiento a 25 + 2C en la

viabilidad de las cepas probiticas
L. rhamnosus B.lactis
E800 (*) Bb12(**)
Reduccin Reduccin
en ciclo log en ciclo log
Cultivo Cultivo
de la Sobreviv. de la Sobreviv.
Das inicial inicial
viabilidad log (%) viabilidad log (%)
(log ufc/g) (log ufc/g)
durante el durante el
almacen. almacen.
0 7,68 0 100 7,33 0 100
15 7,21 0,47 94 6,95 0,38 95
30 6,65 1,03 87 6,57 0,76 89
45 6,66 1,02 87 6,50 0,83 88
60 6,60 1,08 87 6,29 1,04 86
(**)Chr Hansen
Pese a disminuir, se mantuvieron sobre el orden de log 6,0 por lo tanto, para
las condiciones de este estudio las cepas L. rhamnosus E800 y B. lactis Bb12
cumplieron con los requisitos de un probiticos en leche en polvo entera.
Thompkinson y Kharb. (2007), sealan que para frmula infantil el contenido
de clulas viables recomendable a lo largo de la vida til debera ser >106
ufc/g de polvo de frmula. Sin embargo, Shah y Lankaputhra. (2003), sealan
que, independiente de la dosis administrada para que el probitico pueda
68
ejercer el efecto que se le presupone en el organismo, ste debe sobrevivir en

el alimento que lo transporta. La viabilidad est ntimamente relacionada con
los tratamientos tecnolgicos. As, la supervivencia de la cepa depende del pH
del alimento, de la presencia de microorganismos competitivos, de la
temperatura y de la presencia de inhibidores microbianos en el alimento
(cloruro de sodio y H2O2).
Los mayores niveles de recuento celular para L. rhamnosus E800 se pueden

asociar al perodo ms corto de almacenamiento (1 mes) de esta cepa previo a
su inoculacin en la leche (Tabla 6).
En relacin a los factores que favorecieron la estabilidad durante el

almacenamiento a 25C, Corcoran et al. (2004) y Simpson et al. (2005),
mencionan las caractersticas intrnsecas de tolerancia trmica y aerotolerancia
de las cepas L rhamnosus E800 y B. lactis Bb12, respectivamente, as como el
efecto de la dilucin. Al respecto, Hunter et al. (1996), sealan que la humedad
residual de los cultivos liofilizados es una variable importante en la estabilidad
de su viabilidad durante el almacenamiento, correspondiendo su ptimo a 2
3%. No obstante, el efecto de la humedad residual de los cultivos liofilizados
sobre la viabilidad disminuye en la medida que se mezcla en seco con leche en
polvo que posee un porcentaje de humedad residual de menor valor (3,5%),
atribuido esto al efecto de la dilucin. Por lo tanto, la dilucin del cultivo en la
leche en polvo (1:100) disminuy el efecto nocivo de la alta humedad (Tabla
5), sobre la estabilidad de los microorganismos liofilizados.
69
El efecto de dilucin tambin se refleja en los valores de actividad de agua

(aw) determinados al final del estudio, donde, el valor de la leche en polvo sola
fue 0,36 y de los cultivos fluctu entre 0,36 (B. lactis Bb12) y 0,42 (L.
rhamnosus E800). En tanto, los valores de los tres tratamientos de leche en
polvo adicionada con cultivos, fueron 0,33. Valores que estaran por encima
de lo sealado por otros estudios como causa importante de deterioro de la
viabilidad de las cepas probiticas. Al respecto Teixera et al. (1995), sealan
que la sobrevivencia de la clula es particularmente afectada cuando el
alimento matriz presenta un valor de aw> 0,25.
Ello concuerda con los resultados obtenidos por Fumiaki et al. (2009), quienes
incorporaron las cepas B. longum, B. breve y B. infantis a una frmula infantil,
mantenindose niveles de recuento de 107 ufc/g al final del almacenamiento a
30C durante 24 meses, lo que se atribuy al bajo valor de aw< 0,25 del
producto.
Actualmente, hay poca informacin en la literatura donde se compare los

efectos de los mtodos de incorporacin de cultivos liofilizados a leche,
durante el secado y/o mezcla en seco con fines industriales de elaboracin de
un producto lcteo en polvo. Slo hay informacin con fines de produccin y
conservacin de cultivos probiticos en polvo. Datos disponibles de
Fundacin para la Innovacin Agraria evidencian que la evolucin tecnolgica
de los preparados a base de leche, leche en polvo o preparados de leche en
polvo utilizando aditivos (A23C 009/13), ha evidenciado un crecimiento
70
sostenido con 110 patentes de invencin (Chile, Fundacin para la Innovacin

Agraria, s/f).
Aunque los valores de recuentos finales obtenidos en el presente estudio con

la metodologa en seco fueron inferiores a los obtenidos por Prez (2003) y
Vendt et al. (2006), quienes obtuvieron valores de recuentos de 107 ufc/g al
cabo de 14 das y 6 meses, respectivamente. No obstante, son superiores a los
obtenidos por Simpson et al. (2005), quienes utilizaron la metodologa de
incorporacin de atomizacin para la cepa B. lactis Bb12 y almacenamiento
bajo condiciones semejante (25C), donde obtuvieron una reduccin de 1,26
unidades de log ufc/g al cabo de 30 das. Ello se puede atribuir a los daos
letales y subletales producidos durante el stress trmico de la atomizacin.
La mayora de los estudios de incorporacin de bifidobacterias en leche en

polvo encontrados en la bibliografa cientfica se refieren a la especie B.
longum. Ello se explicara por los resultados obtenidos en los estudios de
Fumiaki et al. (2009) al comparar B. longum, B. breve y B. infantis y Prez
(2003), al comparar B. longum con B. bifidum concluyeron que la especie B.
longum, se caracteriza por presentar mejor estabilidad para usar en frmula
infantil. En este estudio se emple B. lactis Bb12 como microorganismo
probitico, en base a su caractersticas intrnsecas (3.2.2.1).
Al analizar el almacenamiento a 40C de las cepas probiticas (Tabla 9), se

observa una reduccin importante de su viabilidad. Esta disminucin depende
del tiempo de almacenamiento y oscil entre log 1,95 ufc/g (T1) y log 1,5 c/g
(T3), (Tabla 9).
71
En la Tabla 9, se observa que los recuentos fueron ms bajos a 40C en

comparacin a 25C (Tabla 7), y que la disminucin a partir del da 30 fue
mucho ms significativa hasta alcanzar recuentos inferiores a log 6,0 ufc/g
(Figura 5), por lo que es de manifiesto que para las condiciones de este
estudio las cepas L. rhamnosus E800 y B. lactis Bb12 sometidas a temperatura
de almacenamiento de 40C a partir del da treinta no cumplen con los
requisitos de un producto probitico.

DE) almacenados a 40C + 2C
Mezcla
L. rhamnosus B. lactis L. rhamnosus B. lactis
E800 Bb12 E800 Bb12
T1 T2 T3a T3b
Da 0 7,6+0,5*a**A*** 7,0+0,6*bA 7,5+0,4*abA 7,4+ 0,3* bA

Da 15 6,3+0,5aB 6,2+0,5bB 6,2+0,2abB 6,4+0,5 bB
Da 30 6,2 +0,5aBC 5,8+0,2bBC 5,9+0,2abBC 5,5+0,3 bBC
Da 45 5,7+0,0aC 5,5+0,2bC 5,8+ 0,1abC 5,3+0,1 bC
Da 60 5,7+0,1aC 5,5+0,5bC 5,7+ 0,2abC 5,5+0,3bC
72
8
7
6
5
log ufc/g
4 ab b
a b
3
2
1
0
L. rhamnosus B. lactis L. rhamnosus E800 B. lactis
E800 Bb12 en mezla Bb12 en mezcla
T2 T3a T3b
Figura 5. Recuento promedio de clulas viables de los tratamientos con

probiticos a los 60 das de almacenamiento a 40C. Las
Las letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05) entre tratamientos
Segn los resultados del anlisis estadstico (Anexo 20), la viabilidad a los 60
da de almacenamiento a 40C en las dos cepas dependi tanto del tiempo de
almacenamiento, de la cepa y de la repeticin (p<0,05). No existe interaccin
entre la temperatura y tratamientos, es decir, la evolucin de la viabilidad con
el aumento de los das de almacenamiento muestra un comportamiento similar
en las dos cepas estudiadas.
Al observar la Tabla 9 se evidencia que la cepa B. lactis Bb12 en mezcla fue

ms sensible al almacenamiento de 40C, lo cual se muestra en trminos de
prdidas de clulas viables ya que la viabilidad decreci 1,9 unidades
logaritmica ufc/g , mientras que la cepa B. lactis Bb12 sola se redujo 1,5
unidades logaritmica ufc/g. La mayor sensibilidad de la cepa se puede atribuir
73
a que la cepa durante su cultivo no alcanz su fase exponencial tarda; la cual

le confiere mayor estabilidad durante el almacenamiento (Saarela, 2005).
Aunque la cepa L. rhamnosus E800 present un elevado recuento final la

muestra de L rhamnosus E800 en mezcla evoluciona de forma semejante a las
muestras de B. lactis Bb12 en combinacin y sola, ello slo podra explicarse
por una distribucin no homognea del probitico en la muestra.
Gardiner et al. (2000), estudiaron la viabilidad de las cepas de L. paracasei

NFBC 338 y L. salivarius UCC 118 inoculadas en leche en polvo descremada
reconstituida al 20% y envasada en bolsas de polietileno durante dos meses a
30C, donde encontraron menos viabilidad, con una reduccin de 4,0
unidades logartmica ufc/g (de 9,0 a 5,0 log ufc/g), para ambas cepas. Valor
superior al encontrado en esta investigacin (Tabla 9).
La Tabla 10, refleja el efecto global de la estabilidad de los distintos

tratamientos en el almacenamiento por un perodo de 60 das, y corroboran lo
sealado por la literatura en cuanto que la temperatura ambiente ejerce una
influencia inversamente proporcional en la sobrevivencia de los probiticos
evidenciando que a mayor temperatura de almacenamiento la viabilidad de los
cultivos decrece ms rpidamente (Corcoran et al., 2004; Desmond et al., 2002,
Gardiner et al., 2000).
74
Tabla 10. Efecto global del almacenamiento en la viabilidad de las cepas

probiticas adicionadas a la leche en polvo, despus de 60 das
de almacenamiento
Almacenamiento
25C 40C
Reducc. Reducc.
Cultivo Cultivo Cultivo Cultivo
Tratamiento en ciclo en ciclo
inicial : final : inicial : final :
log de la log de la
Da 0 Da 60 Da 0 Da 60
Prdida viabilid Prdida viabilid
(log (log (log (log
% durante % durante
ufc/g) ufc/g) ufc/g) ufc/g)
almacen almacen
L. rhamnosus
E800 7,69 6,7 12,8 0,99 7,64 5,69 25 1,95
(T1) (*)
L. rhamnosus
E800 7,68 6,6 7,55 5,73
(T3a) (*) 12,4 1,14 25 1,82
Bifidobacterium
Bb12 7,57 6,41 7,02 5,52
(T2), (**)
15,0 1,16 21 1,50
Bifidobacterium
Bb12 (T3b),(**) 7,33 6,29 14,0 1,04 7,38 5,51 25 1,87
(**)Chr Hansen
A partir de la prdida de la viabilidad de los cultivos durante el

almacenamiento se procedi a calcular el tiempo de reduccin decimal (D) de
cada una de las cepas y se utilizaron como indicadores de la vida til
aproximado de los cultivos.
La estimacin del tiempo necesario para que L rhamnosus y Bb12 disminuya en

un orden logartmico durante su almacenamiento a 25C fue 52 y 55 das para la
cepa sola y en mezcla, respectivamente. Mientras que para 40C los valores
fueron 36 y 28 das, para la cepa sola y en mezcla, respectivamente. En el Anexo
17 se presenta el calculo del valor D a partir de las rectas de regresin (D= 1/K).
75
Los valores D corroboran que todas las cepas del estudio bajo la temperatura de
almacenamiento de 25C tendran una vida til ms prolongada y una menor
variabilidad que a 40C. En tanto, a 40C se evidencia la mayor tolerancia trmica
de la cepa L. rhamnosus E800 (36 das) en relacin a B. lactis Bb12 (28 das).
Los valores D deben considerarse como una estimacin aproximada de la
viabilidad de los cultivos, pero el hecho que se cumpla esta prediccin estar en
funcin directamente con la humedad y esta a su vez estar relacionada con el tipo
de envase utilizado (con efecto barrera).
4.4 EFECTO DE LA TEMPERATURA DE RECONSTITUCIN DE

LA LECHE EN POLVO SOBRE LA VIABILIDAD DE LAS
CEPAS PROBITICAS
Con el fin evaluar el efecto de la temperatura de reconstitucin de la leche

almacenadas a 25C durante dos meses, se simularon las condiciones de
manipulacin de la leche en polvo a nivel consumidor. Para ello se
reconstituyeron de acuerdo a la pauta referida por el fabricante (40C) y
condiciones extremas de reconstitucin (60C), conservando la leche a
temperatura ambiente.
76
Temperatura de reconstitucin
8
6
log ufc/g
a a a a
4
2
A A
B B
0
L. rhamnosus B. lactis L. rhamnosus E800 B. lactis Bb12 en
E800 Bb12 en mezcla mezcla
Tratamientos
40C 60C
Figura 6. Recuento de cultivos probiticos a los 60 das de

almacenamiento de la leche en polvo a 25C y reconstituidas a
40C y 60C
Letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05) entre tratamientos a 40C. Letra
mayscula: indican diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos a 60C
En las Figuras 6 y 7 se muestran los recuentos de L rhamnosus E800 (T1) y

B.lactis Bb12 (T2), 10 mins despus de la reconstitucin a 40C y 60C.
En la Figura 7, se evidencia que durante los 60 das de almacenamiento los

recuentos de ambas cepas por separado fueron superiores a la temperatura de
reconstitucin de 40C. Adems, se puede observar que la forma de la curva
varia fuertemente en funcin de la temperatura de rehidratacin y del tiempo
de almacenamiento.
77
Temperatura de reconstitucin
7
40C
log ufc/g
3
60C
1
Recuento
0 10 min 15 30 45 60
inicial de del da
leche con cero. Tiempo de almacenaiento (das)
cultivo
L. rhamnosus E800 a 60C B.lactis Bb12 a 60C

L. rhamnosus E800 a 40C B.lactis Bb12 a 40C
Figura 7. Clulas viables de los cultivos probiticos por efecto de la

temperatura de reconstitucin
Al realizar el anlisis estadsticos de ambas cepas a la temperatura de

reconstitucin de 40C. (Anexos 21 y 22) no se observ diferencias
significativas (p>0,05) entre los tratamientos pero si se presentan diferencias
significativas atribuida al tiempo de almacenamiento del producto en polvo
(p<0,05) entre los das 0, 15 y hasta 30. En la Figura 7 se observa que ambas
cepas se mantuvieron estables y con alta viabilidad hasta los 15 das. A partir
de ese momento muestran la misma tendencia de disminucin hasta el da 30 y
despus se mantienen dentro del mismo orden durante los 30 das restantes de
almacenamiento. Los resultados concuerdan con lo sealado por Ishibashi et
al. (1985), quienes estimaron una temperatura entre 30 y 40C como adecuada
para mantener la mxima recuperacin de clulas viables de B. longum y L.
acidophilus.
78

DE) a los 60 das de almacenamiento de la leche en polvo a
25C y reconstituidas a 40C+ 2C
Cepas de Probitico
Cepas Individuales Cepas en mezcla
L. rhamnosus B.lactis L. rhamnosus B. lactis
E800 Bb12 E800 Bb12
Etapa (T1) (T2) (T3a) (T3b)
Da 0 7,2+0,2*a**A*** 7,5+0,2aA 7,4+0,3aA 7,6 + 0,3aA
Da 15 6,9+0,4aB 7,4+0,3aB 6,7+0,0aB 7,0+0,4aB
Da 30 6,6+0,3aC 6,6+0,1aC 6,4+0,1aC 6,8+0,3aC
Da 45 6,6+0,3aC 6,5+0,1aC 6,5+0,2aC 6,6+0,3aC
Da 60 6,4+0,3aC 6,4+0,1aC 6,5+0,2aC 6,5+0,2aC
Al observar la Tabla 11 y el Anexo 22 se evidencia que no hubo diferencias

significativas (p>0,05) entre tratamientos, por lo tanto cada cepa por si sola o
en combinacin se mantuvo sin variaciones. Sin embargo, se observaron
diferencias significativas (p <0,05) en el tiempo con prdida de clulas viables
para ambos probiticos en relacin al recuento inicial a partir del da 15 de
almacenamiento de la leche, lo que continu en descenso, para todos los
tratamientos a los 30 das, posteriormente se mantuvo la tendencia, no hubo
mayor reduccin en el nmero de clulas viables. Lo cual corrobora los
resultados obtenidos en la Tabla 7 y Anexo 18.
En contraposicin, la reconstitucin a 60C y mantencin por 10 min, (Anexo

23) de ambas cepas, que al inicio del estudio tenan una poblacin del orden
logaritmo 7,0 ufc/g (Tabla 6), presentan a partir del da cero un descenso
79
progresivo hasta llegar a una concentracin del orden de 2,5 log ufc/g (L.
rhamnosus E800) y 1,5 log ufc (B. lactis Bb12) donde se mantiene constante.

DE) a los 60 das de almacenamiento de la leche en polvo a
25C y reconstituidas a 60C + 2C
Probitico
Cepas individuales Cepas en mezcla
L. rhamnosus B. lactis L. rhamnosus B. lactis
E800 Bb12 E800 Bb12
Etapa T1 T2 T3a T3b
Da 0 2,6+0,5*a**A*** 2,2+ 0,3 bA 2,7+0,5aA 2,9+1,2bA
Da 15 2,6+0,2aAB 1,5+0,5 bAB 2,4+0,5aAB 1,4+0,4bAB
Da 30 2,6+0,1aB 1,2+0,3 bB 2,3+0,3aB 1,4+0,4bB
Da 45 2,6+0,2aB 1,5+0,2 bB 2,4+ 0,1aB 1,4+0,4bB
Da 60 2,5+0,2aB 1,2+0,3bB 2,3+ 0,1aB 1,5+0,4bB
En la Tabla 12, se observa que los recuentos fueron ms bajos en leche

reconstituida a 60C en comparacin a 40C (Tabla 7), y que la disminucin
fue significativa a partir del da cero hasta alcanzar recuentos inferiores a log
2,5 ufc/g.
Al comparar los resultados obtenidos con Concoran et al. (2004), quienes

estudiaron la tolerancia trmica de la cepa L rhamnosus E800 en leche
descremada al 20% evaluando el efecto de las temperaturas (58, 60 y 61C) y
tiempos de exposicin (1, 2, 3 y 4 min.) sobre la viabilidad de la cepa, la
evolucin de la poblacin a travs del tiempo mostr la misma tendencia de
disminucin obtenida en el presente estudio. Los valores de reduccin
80
obtenidos al cabo de cuatro minutos fueron 0,4, 1,0 y 1,59 unidades

logartmicas con respecto al recuento inicial para las temperaturas de 58C,
59C y 60C.
En tanto, Simpson et al. (2005), utilizando las temperaturas de 57 y 60C por

cinco minutos en caldo MRS evidenciaron que el porcentaje de sobrevida de
B. lactis Bb12 fluctu entre 66- 61% y 1,2 - 1,3%, respectivamente. Valor
similar con el obtenido en esta investigacin y corrobora, que aunque la cepa
presenta una alta tolerancia trmica; la temperatura de 60C fue crtica en la
viabilidad de la bacteria.
El anlisis de varianza confirm que la cepa L rhamnosus E800 sola y en

mezcla reconstituida a 60C almacenada por 10 min. presentaba una viabilidad
significativamente superior (p< 0,05) a la de la cepa B. lactis Bb12.
Al comparar los efectos de los medios de rehidratacin (agua y MRD) en la

recuperacin de clulas viables de la cepa L. rhamnosus E800 reconstituda a
40C y mantenida por 10 min en su tiempo cero con respecto al recuento
inicial de inoculacin (7,7 log ufc/g), se encontr que cuando el medio era
MRD, la recuperacin fue superior en 0,5 unidades logartmicas ufc/g con
respecto al agua; presentando este ltimo medio una mayor variabilidad en la
recuperacin de las clulas viables. La mayor recuperacin asociada al medio
de rehidratacin MRD se explicara a su composicin que induce una mayor
actividad del cultivo.
81
Estos resultados tambin concuerdan con los de un estudio homlogo

realizado por Desmond et al. (2002), donde se compar la viabilidad de la
cepa L. paracasei NFBC 338 inoculada en leche en polvo reconstituida al
20% y en caldo MRS, exponiendo los cultivos durante 10 minutos a la
temperatura de 60C, donde se encontr diferencias significativas (p<0,05)
dado que las cepas en caldo MRS disminuyeron en 2,5 ciclo de logaritmo a los
30 segundos de preparada. La mayor viabilidad en leche en polvo
reconstituida al 20% se explicara por el mayor nivel de slidos totales y al
efecto protector de las protenas de la leche durante el calentamiento de sta.
Aunque los porcentajes de viabilidad en este estudio no fueron muy elevados,

los recuentos se mantuvieron sobre la dosis mnima efectiva. Esto podra ser
debido a las ventajas que presenta la leche en polvo sobre otros productos
lcteos. Las principales ventajas asociadas son a) conservacin a temperatura
ambiente b) escasa humedad del producto c) la estabilidad en el pH d)el
envasado en atmsfera protectora con gas inerte hasta el momento de su
apertura y e) el envasado en material no permeable al oxgeno, en
conformidad con lo observado por Prez (2003).
Finalmente se logr establecer que la metodologa de incorporacin de

cultivos a la leche en polvo en seco junto con el almacenamiento a 25C y
reconstitucin a 40C, es un mtodo adecuado para preparar productos a base
de leche que contengan probiticos, dado que permiten mantener un nmero
suficiente de bacterias viables en el polvo al cabo de dos meses de
almacenamieto (Tabla 7). De esta forma se evitara los daos letales y
82
subletales producido durante el stress trmico de la atomizacin. No obstante

es recomendable tener altos recuentos iniciales para mantener sobre 106 ufc/g
al da 60 de almacenamiento a 25C.
4.5 EVALUACIN DE LAS CARACTERSTICAS SENSORIALES Y

FSICO QUMICA DE LOS TRATAMIENTOS SOBRE LA
LECHE EN POLVO CON PROBITICO
Con el fin de evaluar el efecto de las cepas probiticas sobre las caractersticas
sensoriales y fsico-qumicas de la leche reconstituda, se simularon las
condiciones de manipulacin a nivel del consumidor (preparacin de
mamaderas). Para ello la leche se reconstituy de acuerdo a la pauta referida
por Federacin Internacional de la Leche 99B (IDF/FIL, 1995), y se mantuvo
a temperatura ambiente durante 60 y 180 min. Como control se utiliz leche
en polvo sin incorporacin de probiticos.
4.5.1 Evaluacin sensorial

De las 15 personas reclutadas, 12 fueron seleccionadas por su disponibilidad a
participar en el estudio y por superar la prueba de sensibilidad para llegar a
emplear sus sentidos como herramientas de trabajo. Este grupo fue sometido a
una etapa de entrenamiento especfico (Anexo 6) para detectar sabores
extraos en leche en polvo entera, defecto considerado como deterioro
segn la Federacin Internacional de la Leche 99B (IDF/FIL, 1995).
83
Los resultados de la validacin se presentan en la Figura 8. Se observa que

los panelistas N 6, 9, 10, 11 y 12 no fueron capaces de percibir e identificar
alguna diferencia en el producto preparado, lo que se atribuy, en el caso de
los panelistas n 6 y 10 a su ausencia durante una sesin de validacin. El
panelista 9 no fue capaz de percibir la muestra metlica en una ocasin
atribuido a su ausencia durante dos sesiones de entrenamiento. Mientras que
los panelistas 11 y 12 presentaron dificultad para percibir las muestras
diferentes. Por esta razn no participaron en este estudio. No se descartaron
los panelistas 6 y 10 debido a que en este tipo de pruebas sensoriales de
diferencia, a medida que participan ms panelistas aumentan la confiabilidad y
sensibilidad de la prueba (Watts et al., 1992).
Al analizar la tabla de significancia de dicho test (Anexo 11), se encontr que

para las evaluaciones en que se compararon muestra de leche en polvo con
cido lctico incorporado las muestras eran significativamente diferente a un
nivel de significancia al 0,1% reflejando que 10 de los 12 panelistas fueron
capaces de identificar la muestra diferentes en las tres ocasiones. Mientras que
en las evaluaciones en que se compar leche en polvo oxidada con sulfato de
cobre incorporado indica una diferencia significativa al 1%, concluyendo que
9 de los 12 panelistas percibieron las diferencias detectables entre las muestras
en las tres repeticiones realizadas (Anexo 24). A pesar de que los panelistas
nmero 11 y 12 presentaron habilidades y aptitudes sensoriales en las pruebas
bsicas de seleccin, no participaron en el estudio debido al hecho de que sus
juicios durante la validacin del panel distaban del promedio del resto del
84
grupo, se us como el criterio que predomin para ser eliminados del panel, ya
que tales panelistas podran desviar los resultados y proporcionar datos poco
confiables.
Resultados de la validacin
4
Puntaje
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Panelistas
Sabor cido Sabor metlico
Figura 8. Promedio de los resultados de validacin del panel sensorial de

leche en polvo, en test triangular
Con los resultados obtenidos el panel definitivo qued conformado por

titulares por su habilidad para discriminar todas las concentraciones evaluadas
durante la validacin y entrenamiento, estos panelistas fueron los nmeros 1,
2, 3, 4, 5, 7, 8 y 10; y dos reemplazantes estos panelistas fueron los nmeros 6
y 9 que demostraron capacidad de discriminacin en un nivel menor. Al
respecto, Watts et al (1992), indica que para la seleccin de un panel
entrenado definitivo se debe incluir al menos ocho panelistas que tengan una
buena capacidad de discriminacin en la prueba a realizarse.
85
Cabe mencionar que aunque los panelista no presentaron dificultad para

sealar sabores distintos presentaron dificultad para percibir los sabores
principalmente en el caso del sabor oxidado. La mayor facilidad para detectar
el sabor cido se podra asociar a la mayor distribucin de los receptores para
el sabor cido en el costado de la lengua lo que facilita su percepcin (Witting
de Penna, s/f). En tanto la dificultad para la deteccin de sabor oxidado se
podra atribuir a que no existe un sabor oxidado bien definido sino
terminaciones de acuerdo a su intensidad sabor seboso, metlico y seboro
(Shipe et al., 1978).
Dentro del estudio, al final de los das 0, 30 y 60 de almacenamiento a 25C,

las leches fueron reconstitudas y presentadas a los 10 jueces entrenados y
validados (7 mujeres y 3 hombres), con una edad media de 33 aos. Los
resultados obtenidos en la evaluacin sensorial con el panel validado se
muestran en el Anexo 25.
Los resultados de la evaluacin sensorial (Figura 9), arrojaron que las

muestras correspondientes a las cepas en mezcla fueron percibidas con mayor
facilidad que las muestras individuales con las cepas de L. rhamnosus E800 y
B. lactis Bb12 por separado, lo cual se acenta en muestras con el mayor
tiempo de de almacenamiento post reconstitucin (180 min), previamente
almacenadas por 60 das.
86
Resultados evaluacin sensorial, al tiempo de reconstitucin 60

A min
10
9
Puntaje promedio de
respuestas correctas
8
7
6
5
4
3
2
1
0 30 60
L rhamnosus E800 B. lactis Bb12 Mezcla
Resultados evaluacin sensorial, al tiempo de reconstitucin

B 180 min.
10
9
Puntaje promedio de
respuestas correctas
8
7
6
5
4
3
2
1
0 30 60
Tiempo de almacenamiento
L rhamnosus E800 B. lactis Bb12 Mezcla
Figura 9. Promedio de los resultados de evaluacin sensorial de la leche

en polvo a 60 min (A) y 180 min (B) de reconstitucin a 40C
en test triangular
La tabla de significancia para el test triangular respecto a las respuestas

correctas de los panelistas correspondiente a la identificacin de la muestra
87
distinta, seal que no existieron diferencias significativas entre las muestras

reconstituidas a los 60 y 180 min (p>0,05), ya que el nmero de respuestas
correctas fue menor que el lmite de confianza al 5%.
Este resultado indican que no existen diferencias perceptibles entre las

muestra de leche en polvo entera con y sin incorporacin de cepas probiticas,
lo cual es concordante con los resultados de acidez total obtenidos (4.5.1). No
obstante algunos panelistas, que detectaron diferencias entre las muestras
manifestaron una leve acidez lo cual se podra asociar a la habilidad de
ambas cepas de transformar la lactosa en cido lctico L (+). Al respecto,
Curry et al. (2003), mencionan que la ventaja de la forma de L(+) para los
infantes se asocia a que es mas fcilmente metabolizada al comparar con la
forma D (-) del cido lctico.
Sin embargo, aunque no se presentan significancias estadisticas se evidencia

una tendencia que se acentu con el tiempo, la cual fue percibida por los
panelistas titulares que evidenciaron durante el estudio mejor sensibilidad para
percibir e identicar los sabores. Uno de los factores que contribuyeron a la
sensibilidad gustativa de los panelistas fueron la uniformidad de las muestras,
presentacin de muestra al azar y la realizacin de entrenamiento y la
codificacin de las muestras que permitieron minimizar los errores de
estmulo, sesgo posicional y el error de expectacin, respectivamente
(Larmond, 1977).
88
Aunque las muestras de leche en polvo entera (26% de grasa) mantenidas a

temperatura ambiente, son susceptible a la oxidacin se descartara en este
estudio la presencia de deterioro por oxidacin de las muestras asociado a los
valores de actividad de agua de aw 0,33, obtenidos al final del estudio. Al
respecto, Stapelfeldt et al. (1991), estudiaron el comportamiento de leche en
polvo a distintas aw e informaron que la oxidacin aumenta con el incremento
de la humedad de la leche en polvo, donde la velocidad mnima de reaccin
oxidativa se da a una actividad del agua entre 0,30 y 0,35. Otro factor que
afecta la oxidacin es el tiempo de almacenamiento. Al respecto, USDEC
(2005) seala que se requiere entre seis y nueves meses para evidenciar
cambios en el sabor del producto. Mientras que Carunchia et al. (2007),
estipulan tres meses. Valores superiores al tiempo del estudio correspondiente
a dos meses.
La presencia de compuestos aromticos asociados a las cepas no fueron

percibidos por el panel. Al respecto, un estudio realizado por Ostlie et al.
(2005), en leche con 1,5% de grasa concluy que la cepa B. lactis Bb12
produce la mayor cantidad de acetoina despus de 48 h de incubacin a 30C y
la menor cantidad despus de 24h incubadas a 45C. Mientras L. rhamnosus
GG produce la menor y mayor cantidad entre las 8 y 48 h de incubacin a
20C y al cabo de 48 h a 20C, respectivamente.
89
4.5.2 Acidez titulable

En la Tabla 13, se muestra la evolucin de la acidez total en los productos con
poblaciones de L. rhamnosus E800, B. lactis Bb12, mezcla y control durante
el tiempo de reconstitucin de las leches con probiticos almacenadas a 25C
y reconstituidas a 40C, luego, conservadas a temperatura de 20C+2C por 60
y 180 min.
Todas las pruebas que se describen se realizaron por triplicado
El anlisis de varianza (Anexo 20) aplicado para evaluar el efecto de los

tratamientos, das de almacenamiento y temperatura de reconstitucin sobre el
valor de acidez titulable, muestran diferencias significativas entre los
tratamientos (p<0,05), siendo el efecto en orden creciente para L. rhamnosus
E800, mezcla de organismos y B. lactis Bb12.
La diferencia en los valores de acidez se explican porque aunque el L.

rhamnosus E800 es heterofermentativo, produce bsicamente cido lctico, a
diferencia de B. lactis Bb12 que es heterofermentativo y produce cido
actico y cido lctico en una proporcin 2:3. No obstante, segn estudios
realizados por Ostlie et al. (2005), sobre el comportamiento de B. lactis Bb12
inoculada en leche, el mayor nivel de cido actico se produce al cabo de 24 y
48 h de incubacin a 20C, 30, 37 y 45C.
90
Tabla 13. Promedio de acidez titulable de los tratamientos al inicio,

mitad y fines del almacenamiento a 25C + 2C despus de
60 y 180 min de reconstitucin de la leche
L. rhamnosus B. lactis
E800 Bb12
(T1) (T2)
Tiempo 60 min 180 min 60 min 180 min
0 0,105 +
0,01*ac**A***
0,105 + 0,01acA 0,116 + 0,01bA 0,116 + 0,01bA
30 0,106 + 0,01acA 0,106 + 0,01acA 0,108 + 0,0bA 0,108 + 0,0bA
60 0,113 + 0,01acA 0,113 + 0,01acA 0,122 + 0,0bA 0,122 + 0,0bA
Mezcla Leche en polvo
(T3) (T4)
Tiempo 60 min 180 min 60 min 180 min
0 0,116 + 0,01bcA 0,12 + 0,01bcA 0,1 + 1aA 0,103 + 0,01aA
30 0,108 + 0,0bcA 0,108 + 0,0bcA 0,103 + 0,01aA 0,103 + 0,01aA
60 0,123 + 0,0bcA 0,123 + 0,0bcA 0,103 + 0,01aA 0,106 + 0,01aA
* Promedio de tres repeticiones
**Letra minscula indican diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos (p<0,05).
***Letra mayscula: indican diferencias estadsticamente significativas entre tiempos de reconstitucin (p<0,05).
Los tratamientos con L. rhamosus E800, B. lactis Bb12 y mezcla, mantuvieron

al cabo de 60 da de almacenamiento porcentaje de acidez menores a 0,15%
hasta los 180 min. Valores que se encuentran dentro del rango para leche en
polvo reconstituida de calidad. Al respecto Amiot (1991), seala que la acidez
de la leche reconstituida puede variar entre 0,11 y 0,15% en equivalente de
acido lctico y si el porcentaje es mayor quiere decir que la leche es de mala
calidad
Al evaluar los tiempos de reconstitucin se observa que los valores de acidez

de las cepas se mantuvieron en todos los casos menor a 0,15%. Ellos se
explica por el lento crecimiento de B.lactis Bb12 en la leche sumado al corto
tiempo de reconstitucin. Al respecto, Dubey et al. (1996), al caracterizar la
91
habilidad de acidificacin de cuatro especies de bifidobacterias (B. longum, B.

bifidum, B. infantis y B. breve) en frmula infantil basada en leche, observ
variacin siendo menor para B. longum y B. breves y mayor para B. bifidum y
B. infantis. Encontrndose para B longum un rango de <0,1% a las 4h hasta
0,6% al cabo de las 24h.
4.5.3 Viscosidad
Al evaluar la viscosidad en unidades de centipoises (cP) de los tres
tratamientos de leche en polvo con probiticos y leche polvo sola al cabo de 0,
30 y 60 das de almacenamiento (Figura 10 y Anexo 26), se observ que
todas las muestras tuvieron el mismo comportamiento incrementando los
valores a medida se aumentaban las RPM, concordante con las caractersticas
de los fluidos no newtonianodilatantes (shear thickening) fenmeno de
espesamiento (Ibarz, 1999).
El anlisis de varianza (Anexo 27) aplicado para evaluar el efecto de los

tratamientos, das de almacenamiento, tiempo de reconstitucin y RPM sobre
el valor de viscosidad muestra en todos, diferencias significativas (p<0,05).
Observndose adems, una interaccin entre los factores cepas con das de
almacenamiento y cepas con RPM.
El efecto de los tratamientos (p<0,05), en orden decreciente fue L. rhamnosus

E800; mezcla y B. lactis Bb12. En el anlisis de tiempo de reconstitucin
p<0,05), se obtiene una relacin inversa: a mayor tiempo menor nivel de
92
viscosidad. Al evaluar el efecto de los das de almacenamiento se evidencia

diferencias significativas (p<0,05), entre los dias 0, 30 y 60 das.
Viscosidad de Leche en polvo recosntituida a 60 min

A
30
25
Viscosidad (cP)
20
15
10
0
20 30 40 50 60 70 80 90 100
RPM
L. rhamnosus E800 B. animalis subsp lactis Bb12
Leche en polvo Mezcla de cepas probioticas
Viscosidad de leche en polvo reconstituida a 180 min

B
A30
25
Viscosidad (cP)
20
15
10
0
20 30 40 50 60 70 80 90 100
RPM
L. rhamnosus E800 B. animalis subsp. lactis Bb12

Mezcla de cepas probiticas Leche en polvo
Figura 10. Lectura de viscosidad (20C) en funcin de la velocidad de .

rotacin, tratamientos y tiempo de reconstitucin 60 min (A) y
180 min (B)
Media de tres repeticiones
93
En base a estos resultados, se confirma que tanto el tiempo de almacenamiento

as como el tipo de cepa, contribuyen a la obtencin de mayor viscosidad
mientras que el tiempo de reconstitucin la disminuye no encontrando una
explicacin tcnica para esta ltima situacin.
Segn Smit (2000), la viscosidad de la leche presenta un comportamiento

newtoniano donde la caseina y la grasa son los factores que la afectan
principalmente y en menor proporcin la protena del suero. Las acciones
mecnicas a las que se somete la leche durante los procesos de
homogeneizacin y secado por pulverizacin, modifican la estructura de los
glbulos grasos reduciendo su dimetro y modificando las caractersticas
fsico-qumica de las membranas de los glbulos grasos favoreciendo con ello
la adsorcin de las micelas de casena y de las protenas solubles. Al respecto,
Mahaut et al. (2004), sealan que cuando se reduce el tamao de los glbulos
grasos se aumenta su nmero, su superficie especfica y consecuentemente la
viscosidad de la leche. En tanto Fox (1997), describe que el aumento de la
viscosidad (medida a 25C) de la leche descremada mantenida a temperatura
sobre 85C incrementa el tamao de las micelas de casena asi como la
atraccin entre micelas, ambos cambios atribuido a la asociacin entre las
protenas desnaturalizadas del suero y la casena.
En este ensayo, las muestras de leche en polvo con L. rhamnosus E800

resultaron ser ms viscosas que la cepa B. lactis Bb12 y la mezcla, incluso a
baja RPM pero luego se estabilizan con lecturas similares a estos dos ltimos.
El aumento de la viscosidad en la cepa de L. rhamnosus se debe a la
94
produccin de exopolisacridos. Segn Walstra (1999), algunas tipos de

bacterias lcticas producen tal cantidad de polisacridos que aumentan
considerablemente la viscosidad de las leches fermentadas atribuyendo el
aumento a la unin de las micelas de casena al glicocalix.
Los resultados obtenido en el estudio son similares a los encontrados por

Dupont (2000), donde L. rhamnosus E800 cultivada en leche semidescremada
alcanz despus de 12h de fermentacin un valor de viscosidad aproximado
de 20 cP. Mientras que los valores aproximados de recuento bacteriano y pH
obtenido fueron 9,0 log ufc/mL y 6,0; respectivamente. En otro ensayo
realizado a 37C realizado en leche descremada reconstituida, se observ que
la viscosidad de la leche aumentaba gradualmente a medida que disminua el
pH desde 6,5 hasta 4,5; con lo cual se logra en las leches con las cepas
L.rhamnosus ATCC 9595M y L. rhamnosus R, una elevada viscosidad despus
de 24h de fermentacin manteniendo niveles por encima de 400 cP a pH 5,0.
El valor de pH coincide con la desestabilizacin de las micelas de casenas
debido a la solubilizacin del calcio micelar.
4.5.4 Textura
Visualmente se observ que a temperaturas de 25C, la textura del polvo
hacia el final del estudio permanece sin cambios. No obstante a 40C se
evidenci en tiempo cercano a los dos meses un aspecto apelmazado y un
descenso de la aw a 0,26. Alteracin fsica conocida como cristalizacin de la
lactosa, asociado a la exposicin de la leche en polvo a la alta temperatura en
95
donde la lactosa amorfa metaestable, formada durante el secado por

atomizacin, cristaliza deteriorando la calidad del producto, lo cual se asocia
con la reaccin de Maillard y la disminucin de la capacidad de
reconstitucin (Thomsen et al., 2005).
Segn Fox (1997), una temperatura de conservacin superior a la temperatura

de transicin vtrea, a la cual el material cambia de un estado vtreo a gomoso,
incrementa la movilidad molecular lo cual favorece la cristalizacin. Walstra
(1984), seala que la lactosa a mayor temperatura comienza a cristalizar a aw
ms baja.
Al respecto, Knudsen et al.(2002), hacen un estudio donde estiman que la

temperatura de transicin vtrea (Tg) de la leche en polvo entera almacenada a
22C y con aw de 0,23, corresponde a 40,4C + 0,2. Valores concordantes con
la condiciones del estudio.
Al cabo del estudio se logr evidenciar que el producto leche en polvo 26%
MG mezclado en seco con los microorganismos probiticos L. rhamnosus
E800 y B. lactis Bb12, es un producto que al ser almacenado a 25C y
reconstituido a 40C presenta un nmero suficiente de bacterias viables al
cabo de los dos meses y que al ser comparado con una leche en polvo
prototipo no presenta diferencias fisico- qumica ni sensoriales que sean
perceptibles por un panel entrenado.
96
5. CONCLUSIONES
De acuerdo a los anlisis realizados en esta investigacin se acepta la

hiptesis que los microorganismos probiticos L. rhamnosus E800 y B.
lactis Bb12 adicionados a la leche en polvo 26% MG, permanecen
viables y en nmero superior a 106 ufc/g durante dos meses de
almacenamiento a 25C.
Durante el almacenamiento a 25C no se observaron diferencias

significativas (p>0,05) en la viabilidad entre ambas cepas probiticas,
no obstante hubo una reduccin significativa (p<0,05) en relacin al
recuento inicial para ambas cepas a los 15 y 45 das de almacenamiento.
Durante el almacenamiento a 40C ambas cepas probiticas, a partir del

da 15 de almacenamiento presentaron una reduccin significativa
(p<0,05) en los recuentos bacterianos inciales.
97
La temperatura de reconstitucin a 60C por 10 min redujo

significativamente (p<0,05) la viabilidad de ambas cepas no as la
reconstitucin a 40C por 10 min que no afect significativamente
(p>0,05) la viabilidad de ambos probiticos.
Se encontr que ambas cepas hasta el da 60 del almacenamiento a

25C, no tuvieron efecto sobre las caractersticas sensoriales de la leche
en polvo durante el tiempo de reconstitucin de 60 y 180 min en leches
reconstituidas a 40C.
La acidez y la viscosidad son los parmetros fsico qumicos que

presentan diferencias de los tratamientos probiticos frente al control,
pero que no actan en detrimento de su calidad.
98
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112
ANEXO 1
Composicin del caldo de fermentacin GEM utilizado para el cultivo de

L. rhamnosus E800 y B. lactis Bb12
Ingrediente g/L
Peptona de soya28 30
Extracto de levadura29 7,0
Glucosa30 20
MgSO4 x 7H2031 1,0
K2HPO432 1,70
KH2PO433 1,36
Fuente: Saalera et al. (2006)
28 SoyTone: Difco Laboratorios, Detroit, Mi

29 Difco
30 Oxoid
31 Winkler
32 Baker
33 Baker
113
ANEXO 2
Esquema general de propagacin
Agar MRS + cys Liofilizado comercial
72h
37C+ 1C
Inoculacion
con asa de
una colonia
50 mL
Caldo MRS 24 h
+cys 37C+ 1C
Inoculacion
2%
18 h
Suspensin 37C+ 1C
20 mLGEM
Inoculacion
2%
pH 5,8
15 h
Suspensin 37C+ 1C
1L Agitacin suave
GEM (50 rpm)
Fuente: Matto et al. (2006)

114
ANEXO 3
Colonias de L. rhamnosus E800 en agar MRS 5,2
Colonias convexas, blancas, de 2 mm, brillantes y bordes lisos. Incubada a

anaerobiosis a 43C por 48 horas.
Vista al microscopio con Tincin de Gram
Bacilos gram (+), largos, tiende a formar cadenas.

115
ANEXO 4
Colonias de B. lactis Bb12 en agar MRS- AB
Colonias convexas, blancas crema, de diversos tamaos, bordes lisos.

Incubada a anaerobiosis a 37C por 72 horas.
Vista al microscopio con Tincin de Gram
Gram (+), bacilos de varias formas, cortos, suavemente bifurcados, extremos

redondeados, pueden estar dispuestos en forma de V.
116
ANEXO 5
Recuentos microbiolgicos de la leche en polvo utilizada
TRATAMIENTO MTODOS ANALTICOS RESULTADOS

Recuento mesfilas ISO 4833.2003 6,0 x 102 ufc/g
Coliformes totales NCh 2635/1. Of2001 <3 coliformes/g
Bacillus cereus FDA/BAM on line 2001 <1,0 x 101 ufc/g
Staphylococcus aureus ISO 6888-3:2003 <3 S aureus/g
Salmonella spp ISO 6785:2001 IDF93:2001 Ausencia en 25g
Inhibidores Delvotest SP Negativo
117
ANEXO 6
Programa para el entrenamiento de panelistas de evaluacin sensorial
implementado
Sesin Temas a tratar Mtodo Objetivo
Presentacin del objetivo de la Presentacin en Informar al panelista

1 tesis mesa redonda con sobre el estudio
Inicio de Presentacin del objetivo sensorial apoyo en power
Entrenamiento Presentacin de las condiciones y point
programa de entrenamiento
2 Presentacin en Recordar conceptos y
Rol de Jueces entrenados mesa redonda con motivar al panelista en su
apoyo en power participacin del estudio
point
3 Presentacin en
Tcnica Familiarizacin del Test a utilizar mesa redonda con Recordar conceptos
sensorial a apoyo en power
utilizar point
Factores que
influyen en los
juicios sensoriales
4 Caractersticas y atributos Se prepararon Familiarizar al panel con el
Caractersticas sensoriales de la LP y de los muestras de producto y sus
organolptica relevantes en el estudio referencias para que caractersticas sensoriales
del producto Caractersticas de los defectos en el panelista prototipo y referenciales
viscosidad y sabor reconociera sabores
bsicos:
acidez/amargor
5 Anlisis y aplicacin Verificar la capacidad
Degustacin y Degustacin de producto del test triangular discriminatoria de los
evaluacin prototipo y referenciales panelista para leche en
sensorial polvo
Verificar la coherencia de
respuesta de los panelistas
6 Degustacin de producto Anlisis y aplicacin Verificar la capacidad
Degustacin y prototipo y referenciales del test triangular discriminatoria de los
evaluacin panelista para leche en
sensorial polvo
Verificar la coherencia de
respuesta de los panelistas
118
ANEXO 7
Cuestionario de seleccin de panelistas
DATOS A PANELISTAS.
Por favor, complete y conteste las siguientes preguntas:
1. Datos personales
Nombre:
__________________________________________________________
Lugar de Residencia
__________________________________________________________
Ocupacin:
__________________________________________________________
Fecha:
__________________________________________________________
Edad:
___________________________________________________________
Telfono:
___________________________________________________________
e-mail:
___________________________________________________________
Disponibilidad (entrenamiento) Junio_______ Julio_______

Curs Ud., el ramo Evaluacin Sensorial? :
SI ___ NO ___
2. Le gustara colaborar en los trabajos de este proyecto, evaluando

sensorialmente algunos productos?
SI ___ NO ___
119
Continuacin Anexo 7
3. Usted presenta algn problema de salud o intolerancia a la lactosa,
que pueda afectarle al participar en paneles de evaluacin sensorial?
SI ___ NO ___
Cules?
_______________________________________________________________
4. Le gusta la leche en polvo ?

SI ___ NO ___
5. Cada cuanto tiempo usted consume leche en polvo ?

_______________________________________________________________
6. Podra usted dedicar un pequeo tiempo (20-30 min), con cierta frecuencia
(2 veces a la semana durante el entrenamiento y 3 veces a la semana durante
evaluacin sensorial para apoyar este proyecto?
SI ___ NO ___
Si su respuesta es si, indique por favor los das y horarios que ms le

acomodaran:
_______________________________________________________________
7. Ha participado en paneles sensoriales? Si No
8. Ha participado en algn panel entrenado? Si No

Cul ?..
9. Ha realizado las Prueba de reconocimientos bsico? Si No
10. Fuma? Si No
cuntos cigarrillos fuma habitualmente?
Hasta 8 cigarrillos diarios Ms de 8 cigarrillos diarios
Gracias !!!
FUENTE: Adaptado de STONE and SIDEL (1985)
120
ANEXO 8
FICHA DE EVALUACIN SENSORIAL PARA RECONOCIMIENTO

DE UN SABOR BSICO.
Tipo: Diferencia Nombre: ___________________

Mtodo: Triangular Fecha: ____________________
Producto: ____________________ Hora: ______________________
Por favor, deguste cada una de las tres muestras que se presentan. En cada set
hay dos muestras idnticas y una diferente. Marque con un circulo la
diferente. Enjuguese la boca con agua antes de degustar y entre cada
muestra. Se permite volver a degustar
Set Muestras cdigos Anotaciones

1 ____ ____ ____ ______________________
Gracias por su colaboracin !
Fuente: Wittig de Pena (s/f)

121
ANEXO 9
Concentracin de soluciones utilizadas para prueba de reconocimiento de

gustos bsicos
Gustos Bsicos Compuestos Concentraciones

Dulce Sacarosa 2% 0.8% 0.4%
Salado Cloruro de sodio 0.2% 0.15% 0.08%
cido cido ctrico 0.7% 0.03% 0.02%
Amargo Cafena 0.7% 0.03% 0.02%
FUENTE: Wittig de Penna (s/f)

122
ANEXO 10
Ficha de evaluacin sensorial
Tipo: Diferencia Nombre: ______________________
Mtodo: Triangular Fecha: ________________________
Nmero: _______________Hora: _________________________
Por favor, deguste cada una de las tres muestras que se presentan.
En cada set hay dos muestras idnticas y una diferente. Marque con
un circulo la diferente. Enjuguese la boca con agua antes de
degustar y entre cada muestra. Se permite volver a degustar
Set Muestras cdigos Anotaciones
1 ____ ____ ____ ______________________
2 ____ ____ ____ _______________________
3 ____ ____ ____ _______________________
4 ____ ____ ____ ________________________
5 ____ ____ ____ ________________________
6 ____ ____ ____ _________________________
Gracias por su colaboracin!
Fuente: Wittig de Pena (1981)

123
ANEXO 11
Tabla de significacin estadstica para el test Triangular
TABLA Significacin para Test Triangular (p = 1/3)
Nmero de Mnimo de juicios correctos Nmero Mnimo de juicios correctos para

juicios para establecer diferencias de juicios establecer diferencias significativas
(set x significativas (set x
jueces) P = .05 p = .01 p = .001 jueces) p = .05 P = .01 p. = .001
5 4 5 5 57 27 29 31
6 5 6 6 58 27 29 32
7 5 6 7 59 27 30 32
8 6 7 8 60 28 30 33
9 6 7 8 61 28 30 33
10 7 8 9 62 28 31 33
11 7 8 9 63 29 31 34
12 8 9 10 64 29 32 34
13 8 9 10 65 30 32 35
14 9 10 11 66 30 32 35
15 9 10 12 67 30 33 36
16 10 11 12 68 31 33 36
17 10 11 13 69 31 34 36
18 10 12 13 70 32 34 37
19 11 12 14 71 32 34 37
20 11 13 14 72 32 35 38
21 12 13 15 73 33 35 38
22 12 14 15 74 33 36 39
23 13 14 16 75 34 36 39
24 13 14 16 76 34 36 39
25 13 15 17 77 34 37 40
26 14 15 17 78 35 37 40
27 14 16 18 79 35 38 41
28 15 16 18 80 35 38 41
29 15 17 19 81 36 38 41
30 16 17 19 82 36 39 42
31 16 18 19 83 37 39 42
32 16 18 20 84 37 40 43
33 17 19 20 85 37 40 43
La Tabla B ha sido reproducida de la Tabla de E.B. Roessler, J. Warren y J.F. Guymon,
publicada en Food Research, 13, 503-505 (1948).
Fuente: Wittig de Pena (1981)

124
ANEXO 12
Valores de densidad ptica (600 nm) y recuento bacteriano de cultivo

batch.
Anexo 12a. Cepa L rhamnosus E800

Tiempo D.O. Rcto. ln D.O. log Rcto.
0 0,102 8,0x10E6 -2,2 6,9
1 0,115 -2,1
2 0,183 -1,7
3 0,275 -1,3
4 0,512 1,7x10E7 -0,67 7,2
5 0,992 0,01
6 1,275 0,24
7 1,812 1,11
8 3,43 9,2x10E8 1,23 8,89
9 3,912 1,36
10 5,047 1,62
11 6,256 1,83
12 7,62 2,0
13 8,66 2,16
14 8,02 4,6x10E9 2,1 9,7
125
Continuacin Anexo 12
Anexo 12b. Cepa B. lactis Bb12 tiempo 1
Tiempo D.O. Rcto Ln D.O. log Rcto

0 0,102 1,2x10E8 -2,12 8,07
1 0,163 -1,81
2 0,19 -1,66
3 0,27 -1,3
4 0,307 2,7x10E8 -1,18 8,43
5 0,392 -0,93
6 0,451 -0,79
7 0,571 -0,56
8 0,701 1,5x10E9 -0,3 9,17
9 0,952 0,04
10 2,172 0,78
11 2,128 1,3x10E10 0,755 10,11
Anexo 12c. Cepa B. lactis Bb12 tiempo 2
Tiempo D.O. Rcto Ln D.O. log Rcto

0 0,103 1,0x10E8 -2,27 8,00.
1 0,188 -1,67
2 0,206 -1,57
3 0,375 -1,98
4 0,648 1,2x10E9 -0,43 9,07
5 0,805 -0,21
6 1,332 0,28
7 2,716 0,999
8 4,288 3,5x10E10 1,45 10,54
9 6,093 1,807
10 7,62 2,03
11 7,997 2,07
12 9,996 2,3
13 9,49 1,08x10E11 2,25 11,03
130
ANEXO 17
Determinacin del valor del tiempo de reduccin decimal (D25 y D40) a
partir de la recta de regresin (D= 1/K). Ejemplo de clculo
Anexo 17a. L. rhamnosus E800

L. rhamnosus E800
y = -0,0199x + 7,714
R2 = 0,8039
7
log ufc/g
6
y = -0,0223x + 7,036
R2 = 0,7678
5
0 10 20 30 40 50 60 70
Dias de almacenamiento
25 40C Lineal (25) Lineal (40C)
25C 40C
K 0,0199 0,0225
D 50 44
Anexo 17b. Cepa B. lactis Bb12

B. lactis Bb12
y = -0,0185x + 7,324
7 2
R = 0,9299
log ufc/g
6
y = -0,0351x + 7,306
2
R = 0,7623
5
0 10 20 30 40 50 60 70
Dias de almacenamiento
25C 40C Lineal (25C) Lineal (40C)
25C 40C
K 0,0185 0,0351
D 54 28
131
ANEXO 18
Anlisis estadstico para el recuento de probiticos almacenados a 25C+2C y
40C+2C
Supuestos Anlisis de homogeneidad de varianzas para Recuento de probiticos
Test de Levene: 0.196767 P-valor = 0.898413
Analysis of Variance for log - Type III Sums of Squares
--------------------------------------------------------------------------------
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:Tratamientos 1,685 3 0,561668 6,44 0,0005 *
B:Temperatura cma 15,3713 1 15,3713 176,23 0,0000 *
C:Das de almacena 34,9927 4 8,74817 100,30 0,0000 *
D:Repeticin 1,92112 2 0,960559 11,01 0,0001 *
INTERACTIONS
AB 0,299326 3 0,0997752 1,14 0,3358 ns
AC 1,4693 12 0,122442 1,40 0,1789 ns
BC 3,32064 4 0,830161 9,52 0,0000 *
RESIDUAL 7,85008 90 0,0872231
--------------------------------------------------------------------------------
TOTAL (CORRECTED) 67,4171 119
--------------------------------------------------------------------------------
All F-ratios are based on the residual mean square error.
Multiple Range Tests for log by Tratamientos

--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95,0 percent Tukey HSD
Tratamientos Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
M (Bb) 30 6,36367 0,0539207 Xb
Bb 30 6,40033 0,0539207 Xb
Lb 30 6,61006 0,055286 Xa
M (Lb) 30 6,627 0,0539207 Xa
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Contrast Difference +/- Limits
--------------------------------------------------------------------------------
Bb - Lb *-0,209726 0,202152
Bb - M (Bb) 0,0366667 0,19961
Bb - M (Lb) *-0,226667 0,19961
Lb - M (Bb) *0,246393 0,202152
Lb - M (Lb) -0,0169402 0,202152
M (Bb) - M (Lb) *-0,263333 0,19961
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
132
Continuacin Anexo 18.
Multiple Range Tests for log by Temperatura cmara

--------------------------------------------------------------------------------
Level Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
40C 60 6,14186 0,0382765 Xb
25C 60 6,85867 0,0382765 Xa
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
25C - 40C *0,716814 0,107274
--------------------------------------------------------------------------------
Multiple Range Tests for log by Das de almacenamiento

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
60 22 6,0089 0,0641239 Xc
45 26 6,11243 0,0584207 Xc
30 24 6,21708 0,0602851 Xc
15 24 6,67667 0,0602851 Xb
0 24 7,48625 0,0602851 Xa
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
0 - 15 *0,809583 0,237333
0 - 30 *1,26917 0,237333
0 - 45 *1,37382 0,233692
0 - 60 *1,47735 0,245006
15 - 30 *0,459583 0,237333
15 - 45 *0,564241 0,233692
15 - 60 *0,667767 0,245006
30 - 45 0,104658 0,233692
30 - 60 0,208184 0,245006
45 - 60 0,103526 0,241854
--------------------------------------------------------------------------------
denotes a statistically significant difference.
133
ANEXO 19
Anlisis estadstico para el recuento de probiticos almacenados A 25C +
2C
Test de Levene: 0,140324 P-valor = 0,935427

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:Repeticin 1,13409 2 0,567047 5,54 0,0077 *
B:Tratamientos 0,484574 3 0,161525 1,58 0,2103 NS
C:Das de almacena 8,57074 4 2,14269 20,95 0,0000 *
INTERACTIONS
BC 0,329495 12 0,0274579 0,27 0,9910
RESIDUAL 3,88709 38 0,102292
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
M (Bb) 15 6,71467 0,0755563 X ns
Bb 15 6,85467 0,0755563 X ns
Lb 15 6,91332 0,0793364 X ns
M (Lb) 15 6,96 0,0755563 X ns
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
Bb - Lb -0,0586581 0,302306
Bb - M (Bb) 0,14 0,29484
Bb - M (Lb) -0,105333 0,29484
Lb - M (Bb) 0,198658 0,302306
Lb - M (Lb) -0,0466752 0,302306
M (Bb) - M (Lb) -0,245333 0,29484
--------------------------------------------------------------------------------
134
ANEXO 20
Anlisis estadstico para el recuento de probiticos almacenados a 40C +
2C
Test de Levene: 0,250209 P-valor = 0,860852
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:Tratamientos 1,53659 3 0,512198 4,39 0,0095 *
B:Das de almacena 28,1268 4 7,03171 60,27 0,0000 *
C:repeticin 1,20849 2 0,604246 5,18 0,0103 *
INTERACTIONS
AB 1,34736 12 0,11228 0,96 0,4996 ns
RESIDUAL 4,43372 38 0,116677
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
M (Bb) 15 5,972 0,0881955 Xb
Bb 15 5,97533 0,0881955 Xb
M (Lb) 15 6,26067 0,0881955 XXab
Lb 15 6,32585 0,0904287 Xa
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
Bb - Lb *-0,350513 0,339385
Bb - M (Bb) 0,00333333 0,335116
Bb - M (Lb) -0,285333 0,335116
Lb - M (Bb) *0,353846 0,339385
Lb - M (Lb) 0,0651795 0,339385
M (Bb) - M (Lb) -0,288667 0,335116
--------------------------------------------------------------------------------
135
ANEXO 21
Anlisis estadstico para el recuento de probiticos viables en leche

en polvo (log ufc/g + DE) almacenadas a 25C + 2C y reconstituida a
40C + 2C y 60C + 2C
Supuestos Anlisis de homogeneidad de varianzas para Recuento de

probiticos
Test de Levene: 0,881846 p-valor = 0,452878

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:repeticiones 1,37891 2 0,689453 7,36 0,0013*
B:Temperatura de r 570,734 1 570,734 6090,84 0,0000*
C:Tratamiento 7,08981 3 2,36327 25,22 0,0000*
D:Da de almacenam 0,026 4 2,50651 26,75 0,0000*
INTERACTIONS
AB 1,56847 2 0,784236 8,37 0,0006*
AC 1,14364 6 0,190607 2,03 0,0724
AD 1,64148 8 0,205185 2,19 0,0385*
BC 12,0024 3 4,00081 42,70 0,0000*
BD 0,102757 4 0,0256893 0,27 0,8937
CD 1,54382 12 0,128652 1,37 0,1997
RESIDUAL 6,55926 70 0,0937037

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
136
Multiple Range Tests for log by Tratamiento
--------------------------------------------------------------------------------
Tratamiento Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
M (Bb) 29 4,18411 0,0653398 Xb
Bb 29 4,21492 0,0653398 Xb
M (Lb) 29 4,62747 0,0653398 Xa
Lb 29 4,73219 0,0670155 Xa
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
M (Bb) - M (Lb) *-0,443361 0,241688
M (Bb) - Bb -0,0308056 0,241688
M (Bb) - Lb *-0,548079 0,244654
M (Lb) - Bb *0,412556 0,241688
M (Lb) - Lb -0,104718 0,244654
Bb - Lb *-0,517273 0,244654
--------------------------------------------------------------------------------
Multiple Range Tests for log by Da de almacenamiento

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
60 22 4,14489 0,0760305 Xc
45 26 4,24516 0,0692526 Xc
30 24 4,23417 0,0714558 Xc
15 24 4,62333 0,0714558 Xb
0 20 4,95082 0,0807978 Xa
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
0 - 15 *0,327482 0,30055
0 - 30 *0,716649 0,30055
0 - 45 *0,705655 0,297472
0 - 60 *0,805929 0,307304
15 - 30 *0,389167 0,281579
15 - 45 *0,378173 0,277272
15 - 60 *0,478446 0,290732
30 - 45 -0,010994 0,277272
30 - 60 0,0892798 0,290732
45 - 60 0,100274 0,287056
137
ANEXO 22

40C + 2C

probiticos
Levene's test: 1.40875 P-Value = 0.249803
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:repeticiones 0,0313239 2 0,0156619 0,24 0,7842 ns
B:Tratamiento 0,430666 3 0,143555 2,24 0,0990 ns
C:Dias 7,37448 4 1,84362 28,80 0,0000 *
INTERACTIONS
BC 0,866219 12 0,0721849 1,13 0,3677 ns
RESIDUAL 2,43233 38 0,0640086
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
138
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
M (Lb) 15 6,67467 0,0653241 Xa
Lb 15 6,72707 0,0669781 Xa
M (Bb) 15 6,81867 0,0653241 Xa
Bb 15 6,896 0,0653241 Xa
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
M (Bb) - M (Lb) 0,144 0,248211
M (Bb) - Bb -0,0773333 0,248211
M (Bb) - Lb 0,0915983 0,251374
M (Lb) - Bb -0,221333 0,248211
M (Lb) - Lb -0,0524017 0,251374
Bb - Lb 0,168932 0,251374
Multiple Range Tests for log by Dias
--------------------------------------------------------------------------------
Dias Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
60 11 6,45059 0,0776852 X c
45 13 6,51241 0,0707758 Xc
30 12 6,595 0,0730346 Xc
15 12 6,93917 0,0730346 Xb
0 12 7,39833 0,0730346 Xa
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
0 - 15 *0,459167 0,295745
0 - 30 *0,803333 0,295745
0 - 45 *0,885919 0,291208
0 - 60 *0,947746 0,305306
15 - 30 *0,344167 0,295745
15 - 45 *0,426752 0,291208
15 - 60 *0,488579 0,305306
30 - 45 0,0825855 0,291208
30 - 60 0,144412 0,305306
45 - 60 0,0618269 0,301379
139
ANEXO 23
60C + 2C
probiticos
Levene's test: 0.247577 P-Value = 0.862689

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:repeticiones 1.92216 2 0.961079 5.74 0.0060 *
B:Tratamiento 18.1379 3 6.04595 36.08 0.0000 *
C:Da de almacenam 3.86642 4 0.966606 5.77 0.0008 *
RESIDUAL 7.70757 46 0.167556

--------------------------------------------------------------------------------
TOTAL (CORRECTED) 31.1539 55
--------------------------------------------------------------------------------

--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95.0 percent Tukey HSD
--------------------------------------------------------------------------------
Bb 14 1.53986 0.110082 Xa
M (Bb) 14 1.54986 0.110082 Xa
M (Lb) 14 2.602 0.110082 Xb
Lb 14 2.75787 0.110798 Xb
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
M (Bb) - M (Lb) *-1.05214 0.412422
M (Bb) - Bb 0.01 0.412422
M (Bb) - Lb *-1.20801 0.413676
M (Lb) - Bb *1.06214 0.412422
M (Lb) - Lb -0.155863 0.413676
Bb - Lb *-1.21801 0.413676 .
140
Multiple Range Tests for log by Da de almacenamiento
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
60 11 1.8303 0.123961 Xb
30 12 1.87333 0.118165 Xb
45 13 1.96821 0.113951 Xb
15 12 2.3075 0.118165 XXab
0 8 2.58265 0.150673 Xa
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
0 - 15 0.275148 0.543633
0 - 30 *0.709314 0.543633
0 - 45 *0.614437 0.540418
0 - 60 *0.752351 0.549226
15 - 30 0.434167 0.474441
15 - 45 0.33929 0.466059
15 - 60 0.477203 0.486216
30 - 45 -0.0948771 0.466059
30 - 60 0.0430366 0.486216
45 - 60 0.137914 0.479949
--------------------------------------------------------------------------------
141
ANEXO 24
Resultados de la validacin del panel sensorial de leche en polvo en test
triangular
Anexo 24a. Resultados test triangular para la evaluacin de leche en

polvo en comparacin con leche en polvo con cido lctico incorporado
PANELISTA R1 R2 R3
1 1 1 1
2 1 1 1
3 1 1 1
4 1 1 1
5 1 1 1
6 A 1 1
7 1 1 1
8 1 1 1
9 1 1 1
10 1 A 1
11 A A 0
12 1 0 0
Total Respuesta 10 9 10
correctas
A: ausente
R: repeticin
Anexo 24b. Resultados test triangular para la evaluacin de leche en

polvo en comparacin con leche en polvo oxidada con sulfato de cobre
incorporado
PANELISTA R1 R2 R3
1 1 1 1
2 1 1 1
3 1 1 1
4 1 1 1
5 1 1 1
6 A 1 1
7 1 1 1
8 1 1 1
9 1 1 0
10 1 A 0
11 A A 1
12 0 0 0
Total Respuesta 9 9 9
correctas
A: ausente
R: repeticin
149
ANEXO 26
Anlisis de viscosidad de los tratamientos

Leche en polvo sola L rhamnosus (T1) B. lactis Bb12 (T2) Mezcla de cepas probiticas
Da 0 60 min 180 min 60 min 180 min 60 min 180 min 60 min 180 min
20 rpm 0 0 0 0 0 0 0 0
30 rpm 0 0 4,7 + 8,1 0 0 0 0 0
50 rpm 15,3+ 0,577 14,3 + 0,577 18 +0,577 18 + 0,577 18 + 0,577 17 +1 17 + 1 17 + 0,577
60 rpm 16,6+ 0,577 15,6+0,577 19 + 0,577 19 + 0,577 19 + 2 19 + 1 19 + 1,527 19 + 0
100 rpm 18,3+ 0,577 18+1 23,3 +1,527 22,6 + 1,527 22,3 +1,154 22 +1 22,3 + 1,54 21,6+ 0,577
Leche en polvo sola L rhamnosus (T1) B. lactis Bb12 (T2) Mezcla cepas probiticas
20 rpm 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0
30 rpm 0+0 0+0 5 +8,660 0 0 0 0 0
50 rpm 18 17 +1 19 + 1 17,6 + 2,1 18,6 + 0,6 18 + 1 18,6 + 0,6 17 + 1
60 rpm 19,3 + 0,6 18,6 + 1,2 21 + 1,73 19,3 + 2,3 20 + 1 19 +1 20,3 + 0,6 19 + 1
100 rpm 21 + 0 21,6 + 1,2 24,3 + 2,31 22,3 + 1,53 23 + 1,53 21,6 + 1,53 23 + 1 22 + 1
Leche en polvo sola L rhamnosus (T1) B. lactis Bb12 (T2) Mezcla cepas probiticas
20 rpm 0 0 0 0 0 0 0 0
30 rpm 0 0 0 0 0 0 0 0
50 rpm 18,3 +0,57 17,6 + 0,57 19 + 0 18,6 +0,57 18,3 +0,57 18+ 0 18 +0 18+0
60 rpm 20,3 + 0,57 19 + 0 21 + 0 20 + 0 21 + 0 20 + 0 21 + 0 19 + 0
100 rpm 22,6 + 0,57 22 + 0 24,6 + 0,57 23,6 + 0,57 23 + 0 23 + 0 23,6 + 0,57 22,3 + 0,57
149
ANEXO 27
Anlisis estadstico de viscosidad de los tratamientos
Supuesto: Anlisis de homogeneidad de varianzas para viscosidad
Test de Levene: 0,151924 p-valor = 0,9282
Anlisis de la Varianza para Viscosidad

Analysis of Variance for cP - Type III Sums of Squares
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:dias 53.2217 2 26.6108 44.33 0.0000*
B:rpm 25218.4 4 6304.61 10503.16 0.0000*
C:tiempo de recons 5.71429 1 5.71429 9.52 0.0022*
D:tratamiento 70.1695 3 23.3898 38.97 0.0000*
INTERACTIONS
AB 36.6436 8 4.58045 7.63 0.0000*
AC 0.816667 2 0.408333 0.68 0.5072
AD 27.8246 6 4.63743 7.73 0.0000*
BC 8.79167 4 2.19792 3.66 0.0062*
BD 62.8126 12 5.23438 8.72 0.0000*
CD 0.171644 3 0.0572145 0.10 0.9626
RESIDUAL 188.481 314 0.600258

--------------------------------------------------------------------------------
TOTAL (CORRECTED) 35127.1 359
--------------------------------------------------------------------------------
149
Multiple Range Tests for cP by tratamiento
--------------------------------------------------------------------------------
tratamiento Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
Leche polvo 90 11.0944 0.0884368 Xc
Bb 12 90 11.9418 0.0884368 Xb
Mezcla 90 11.9455 0.0884368 Xb
L rhamnosus 90 12.3293 0.0884368 Xa
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
Bb 12 - L rhamnosus *-0.3875 0.305204
Bb 12 - Leche polvo *0.847396 0.305204
Bb 12 - Mezcla -0.00364583 0.305204
L rhamnosus - Leche polvo *1.2349 0.305204
L rhamnosus - Mezcla *0.383854 0.305204
Leche polvo - Mezcla *-0.851042 0.305204
--------------------------------------------------------------------------------
Multiple Range Tests for log by tiempo de reconstituci

--------------------------------------------------------------------------------
180 min. 144 11.6611 0.089462 Xa
60 min. 216 11.9944 0.054784 Xb
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
180 min. - 60 min. *-0.333333 0.212566
--------------------------------------------------------------------------------
149
Multiple Range Tests for cP by dias
--------------------------------------------------------------------------------
dias Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
0 dias 120 11.3083 0.0707259 Xa
30 das 120 11.9333 0.115133 Xb
60 das 120 12.2417 0.0707259 Xb
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
0 dias - 30 das *-0.625 0.318191
0 dias - 60 das *-0.933333 0.235535
30 das - 60 das -0.308333 0.318191
--------------------------------------------------------------------------------
Multiple Range Tests for cP by rpm

--------------------------------------------------------------------------------
rpm Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
30 rpm 72 0.0 0.0913067 Xd
20 rpm 72 0.0 0.0913067 Xd
50 rpm 72 17.625 0.108677 Xc
60 rpm 72 19.3403 0.108677 Xb
100 rpm 72 22.1736 0.108677 Xa
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
100 rpm - 20 rpm *22.1736 0.389425
100 rpm - 30 rpm *22.1736 0.389425
100 rpm - 50 rpm *4.54861 0.382652
100 rpm - 60 rpm *2.83333 0.382652
20 rpm - 30 rpm 0.0 0.354267
20 rpm - 50 rpm *-17.625 0.389425
20 rpm - 60 rpm *-19.3403 0.389425
30 rpm - 50 rpm *-17.625 0.389425
30 rpm - 60 rpm *-19.3403 0.389425
50 rpm - 60 rpm *-1.71528 0.382652
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
149
ANEXO 28
Descripcin tcnica del material de trilaminado de las bolsas
MATERIA MICRAS GRAMAJE TOLERANCIA

PRIMA +-
Sustrato Bopp natural 20,00 12,28 0,91
Sustrato Aluminio 9,00 24,39 1,22
Sustrato Polietileno Natural 50,00 46,25 2,31

Adicion Cepas Lacticas Probioticas en Leche en Polvo 26mg% Uach

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Universidad Austral de Chile

Facultad de Ciencias Agrarias

ADICIN DE CEPAS LCTICAS PROBITICAS EN

PATRICIA CABEZN PALOMINOS

Tesis presentada a la Facultad de Ciencias Agrarias de la

PATRICIA CABEZN PALOMINOS

INFORME DE APROBACIN TESIS DE MAGISTER

La Comisin Evaluadora de Tesis comunica al Director de la Escuela de

PATRICIA CABEZN PALOMINOS

Ha sido aprobada en el examen de defensa de Tesis rendido el da 10 de Enero

Deseo expresar mis agradecimientos sinceros a todas aquellas personas que

Profesora Renate Schbitz por su orientacin y valiosas sugerencias a travs del

Profesora Carmen Brito, por su constante apoyo con su vasto conocimiento en el

A la Cooperativa Agrcola y Lechera de la Unin (Coln), Prolesur S.A. (Soprole), y

Dr Heriberto Fernndez, Ricardo Fuentes, Luigi Ciampi, Lus Cristi, Miguel

A Cristian Pinargote y Mnica Obando por su compaerismo. A mis amigos

2 Esquema general de propagacin y concentracin 113

3 Colonias de L. rhamnosus E800 en agar MRS 5,2 114

4 Colonias de B. lactis Bb12 en agar MRS- AB 115

5 Recuentos microbiolgicos de la leche en polvo 116

6 Programa para el entrenamiento de panelistas en 117

7 Cuestionario de seleccin de panelistas 118

8 Ficha de evaluacin sensorial para el reconocimiento de 120

9 Concentracin de soluciones utilizadas para prueba de 121

10 Ficha de evaluacin sensorial 122

11 Tabla de significacin estadstica para el test Triangular 123

12 Valores densidad ptica (600nm) y recuento bacteriano 124

25 Resultados evaluacin sensorial de leche en polvo en 142

26 Anlisis de viscosidad de los tratamientos 145

27 Anlisis estadstico de viscosidad de los tratamientos 146

28 Descripcin tcnica del material de trilaminado de las 149

El objetivo de esta investigacin fue, cuantificar la supervivencia de las cepas

Para el estudio se formularon tres tratamientos con tres repeticiones leche en

Los resultados de los recuentos arrojaron para L. rhamnosus E800, una

Hasta el da 60 del almacenamiento, las caractersticas sensoriales de la leche

Palabras clave: leche en polvo, probiticos, almacenamiento, reconstitucin.

Key words: milk powder, probiotics, storage, reconstitution.

Entre los principales problemas nutricionales que persisten en la poblacin

Hoy se podra prevenir las enfermedades a travs del consumo de alimentos

Actualmente, existe en el mercado mundial una variada oferta de productos

La inclusin de probiticos viables en leche en polvo, producto de prolongada

como la leche en polvo es un alimento consumido especialmente por

Sin embargo, la efectividad de los microorganismos probiticos en los

Los microorganismos probiticos Lactobacillus rhamnosus y Bifidobacterium

1.2.- Objetivo General

Cuantificar la supervivencia de las cepas Lactobacillus rhamnosus y

1.3.- Objetivos Especficos

Evaluar el efecto de dos temperaturas de almacenamiento y distintos

Estudiar el efecto de la temperatura de reconstitucin sobre la viabilidad de

Evaluar el efecto de L. rhamnosus E800 y B. lactis Bb12 sobre las

2.1. ALIMENTOS FUNCIONALES

El concepto fue desarrollado a principios de los aos 90 en Japn como:

En Chile, el Instituto de Nutricin y Tecnologa de los Alimentos de la

El mercado mundial de alimentos funcionales est en crecimiento, alcanzando

La perspectiva europea de los alimentos funcionales difiere de la

El Reglamento Sanitario de los Alimentos de Chile no posee un captulo

En la actualidad se conocen 12 clases de elementos o ingredientes

funcionamiento favorable del sistema nervioso central y los fitoesteroles

En Chile, la entidad Chilealimentos que agrupa a las empresas de alimentos

Dentro de los alimentos funcionales tienen un papel destacado, los probiticos

2.2. MICROORGANISMOS PROBITICOS

Los probiticos al ser ingredientes adicionados intencionalmente a los

El mercado de los productos con probiticos en el mundo est en plena

Las bacterias de los gneros Lactobacillus y Bifidobacterium ocupan el lugar