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Artigo Original/Original Article

Avaliao da resistncia de Salmonella ao de desinfetantes cido peractico,


quaternrio de amnio e hipoclorito de sdio

The resistance of Salmonella strains to the biocides peracetic acid, quaternary


ammonium and sodium hypochlorite

RIALA6/1317

Tas Raquel Marcon MACHADO, Patrcia da Silva MALHEIROS*, Adriano BRANDELLI, Eduardo Cesar TONDO

*Endereo para correspondncia: Instituto de Cincia e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Av. Bento Gonalves, 9500, Porto Alegre, RS, Brasil. CEP 91501-970. Fone: 51 3308 6677. E-mail: patimalheiros@yahoo.com.br
Recebido: 20.05.2010 Aceito para publicao: 29.12.2010

RESUMO
Este estudo avaliou a resistncia de trs cepas de Salmonella frente aos desinfetantes cido peractico,
quaternrio de amnio e hipoclorito de sdio. S. Enteritidis (SE86), responsvel por mais de 90% dos surtos
alimentares ocorridos no Rio Grande do Sul (RS), foi comparada com S. Typhimurium e S. Bredeney, ambas
no envolvidas na ocorrncia de salmonelose. A resistncia aos desinfetantes foi avaliada por meio de teste
de suspenso, conforme preconizado pelo Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Todos os
desinfetantes avaliados, nas concentraes indicadas pelos fabricantes, foram capazes de inativar as trs
cepas de Salmonella, entretanto, SE86 apresentou maior resistncia ao hipoclorito de sdio a 400 ppm,
alm de ser a nica cepa bacteriana capaz de sobreviver por at 15 minutos de exposio a 200 ppm desse
desinfetante. Uma vez que o hipoclorito de sdio, nestas condies, empregado com frequncia como agente
de desinfeco em indstrias de alimentos e servios de alimentao, as caractersticas acima mencionadas
podem contribuir para que esse microrganismo seja responsvel pelos surtos de salmoneloses ocorridos no
RS. Em funo da importncia desses micro-organismos como agentes patognicos alimentares, cuidados
especiais devem ser tomados nos processos de desinfeco e contaminao cruzada por Salmonella.
Palavras-chave. Salmonella, cido peractico, hipoclorito de sdio, quaternrio de amnio.

ABSTRACT
The resistance of Salmonella strains to the biocides peracetic acid, quaternary ammonium and sodium
hypochlorite was assessed. S. Enteritidis (SE86), which is responsible for more than 90% of food-borne
outbreaks occurred in Rio Grande do Sul (RS) was compared to S. Typhimurium and S. Bredeney, both
not related to salmonellosis. The bacterial resistance to biocides was evaluated using the suspension test as
recommended by The Brazilian Agriculture Ministry. The three biocides were able to inactivate all of the
microorganisms tested, when the concentrations indicated by the manufacturers were used. However, SE86
was resistant to 400 ppm sodium hypochlorite, and survived for up to 15 minutes of exposure to 200 ppm
of this biocide, which was not demonstrated by the other bacteria strains. Since the sodium hypochlorite,
at such concentration and time of exposure, is frequently used at food industries and food services, and
owing to the above cited resistance characteristic, this condition could be contributing for the SE86 with
food-borne salmonellosis outbreak occurred in RS. In view of the importance of these microorganisms
as alimentary pathogens, special cares in the food disinfection processes and cross-contamination with
Salmonella must be taken.
Key words. Salmonella, peracetic acid, sodium hypochlorite, quaternary ammonium.

Rev Inst Adolfo Lutz. 2010; 69(4):475-81 475


Machado TRM, Malheiros PS, Brandelli A, Tondo EC. Avaliao da resistncia de Salmonella ao de desinfetantes cido peractico,
quaternrio de amnio e hipoclorito de sdio. Rev Inst Adolfo Lutz. So Paulo, 2010; 69(4):475-81.

INTRODUO de sdio. Uma das vantagens desse desinfetante a no


produo de resduos txicos quando decomposto, no
Salmonella tem sido apontada como a principal causando danos ambientais14. O PAA age desnaturando
causa bacteriana de gastrenterites em diferentes partes protenas e enzimas, gerando aumento da permeabilidade
do mundo1,2. No Brasil, um significativo aumento na da parede celular pela ruptura das pontes sulfricas e
incidncia de salmoneloses causadas por S. Enteritidis sulfidrilas15. Para melhor eficcia desse composto, o pH
tem sido observado desde a dcada de 903-5. No Estado deve variar entre 3 a 7,516.
do Rio Grande do Sul (RS), anlises genotpicas de A ocorrncia de linhagens resistentes a desinfetantes
isolados de Salmonella revelaram que apenas uma cepa pode representar desafios econmicos para a indstria de
de S. Enteritidis (SE86) esteve envolvida em mais de alimentos e trazer implicaes para a sade pblica, ainda
90% das salmoneloses investigadas entre 1999 e 20066- mais quando se trata de micro-organismos com resistncia
9
. Embora muitos sorovares de Salmonella tenham cruzada a desinfetantes e a antibiticos. A resistncia varia
sido isolados de diferentes alimentos no RS, as razes de microrganismo para microrganismo e tipicamente
pelas quais SE86 vem causando a maioria dos surtos resulta de alteraes celulares que implicam em acmulo
alimentares so desconhecidas. de biocidas, incluindo alteraes do envelope celular que
Desinfetantes so substncias ou preparaes limita a absoro ou a expresso de mecanismos de efluxo.
qumicas capazes de destruir micro-organismos A expresso de genes de efluxo regulada via plasmdeos
patognicos, em curto espao de tempo, quando aplicados que podem sofrer mutaes cruzadas. de extrema
em objetos10. Sua escolha deve ser precedida de uma importncia salientar a adaptao aos desinfetantes que
anlise detalhada, levando-se em conta aspectos como uso seleciona micro-organismos intrinsecamente resistentes
autorizado do produto pela legislao, grau de toxicidade, ao composto desinfetante aplicado. A adaptao pode
poder corrosivo, efeito residual sobre os alimentos, efeito ocorrer em superfcies com enxague deficiente deixando
sobre o meio ambiente e o custo11. baixas concentraes de desinfetantes nas superfcies1,12.
O cloro e suas vrias formas, provavelmente, A resistncia de patgenos a desinfetantes
so os compostos mais comumente utilizados para a amplamente utilizados em empresas e indstrias de
desinfeco em indstrias de alimentos e servios de alimentos pode ser um dos fatores que contribuem com
alimentao. Tais compostos podem incluir cloro lquido, o envolvimento de micro-organismos especficos em
hipocloritos, compostos clorados orgnicos e inorgnicos surtos de origem alimentar. Em vista disso, esse trabalho
e tem apresentado amplo espectro germicida, devido teve como objetivo avaliar a resistncia de trs cepas de
sua ao sobre a membrana celular, inibio de enzimas Salmonella aos desinfetantes cido peractico, hipoclorito
envolvidas no metabolismo da glicose, danos no DNA e de sdio e quaternrio de amnio. Dentre estas cepas esto
oxidao de protenas celulares12. A quantidade de cloro SE86 envolvidas em muitas salmoneloses ocorridas no
livre que estar presente na soluo depender do pH. Em RS, e duas outras cepas no envolvidas em salmoneloses.
pH igual a 8,0, cerca de 22% do cloro esto na forma ativa,
enquanto que, em pH igual a 6,0, cerca de 96% do cloro MATERIAIS E MTODOS
estar na forma ativa13.
Os quaternrios de amnio (QUAT) so Culturas bacterianas
surfactantes catinicos amplamente utilizados como Foram utilizadas cepas de Salmonella enterica de
antisspticos e desinfetantes10. Como so compostos trs sorovares distintos. S. Enteritidis (SE86) foi isolada de
carregados positivamente, sabe-se que seu modo de ao repolho envolvido em um surto de salmonelose ocorrido
se d pela atrao por materiais carregados negativamente no Rio Grande do Sul, em 1999, e foi caracterizada
ou estruturas como as protenas bacterianas. So ativos primeiramente por Geimba et al6. Esta cepa apresentou
em uma ampla faixa de temperatura e apresentam melhor o mesmo perfil genotpico caracterizado por PCR-
atividade em pH alcalino, no tendo efeito corrosivo Ribotipificao, PFGE e confirmado pelo sequenciamento
sobre superfcies12. da regio ribossomal de mais de 90% das S. Enteritidis
O cido peractico (PAA), por sua vez, tem sido isoladas de salmoneloses investigadas pela Vigilncia
amplamente utilizado nas indstrias de alimentos, sendo Sanitria do RS, entre 1999 a 20062,7. As duas outras cepas
apontado como um potencial substituto do hipoclorito estudadas nesse trabalho foram de S. Typhimurium e S.

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Bredeney, isoladas em 1999, a partir de fezes de sunos e de Teste de susceptibilidade aos desinfetantes com as
um embutido, respectivamente. SE86 foi gentilmente cedida clulas em suspenso
pela Profa. Dra. Mercedes Passos Geimba, da Faculdade de Os micro-organismos foram incubados em Caldo
Biocincias da PUC/RS, enquanto que S. Typhimurium e S. Nutriente a 37C, por aproximadamente 18 horas. Em
Bredeney foram gentilmente cedidas pela Profa. Dra. Marisa seguida, as culturas foram diludas em gua peptonada
Itapema Cardoso, do Departamento de Medicina Preventiva 0,1% (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil) at atingirem uma
da Faculdade de Veterinria da UFRGS. concentrao de aproximadamente 106 UFC/mL.
Durante os experimentos, os micro-organismos Os desinfetantes concentrados foram diludos em
foram armazenados em gar Nutriente (NA) (Merck, gua destilada estril at a maior concentrao indicada pelo
Darmstadt, Alemanha) a 4C. Para a realizao dos fabricante, adicionado de 10%, conforme preconizado pela
inculos, as trs cepas foram cultivadas em Caldo Portaria 101/93, do Ministrio da Agricultura Pecuria e
Nutriente (NB) (Synth, So Paulo, Brasil) a 37C, por Abastecimento17. Tambm foram avaliadas concentraes
aproximadamente 18 horas. menores que as indicadas pelos fabricantes, como demonstrado
Desinfetantes na Tabela 1. Em seguida, 9 mL de cada desinfetante foram
Foram avaliados trs desinfetantes comerciais com colocados assepticamente em tubos de ensaio estreis, aos
as seguintes caractersticas: quais foi adicionado 1 mL de soluo de albumina bovina
Produto a base de PAA composto de gua, perxido srica a 1% (Oxoid, Hampshire, Inglaterra), totalizando 10
de hidrognio, cido actico glacial e cido peractico mL por tubo. Inculos de 0,1 mL de cada cultura bacteriana
(cido peractico 14,5%); foram adicionados, separadamente, aos tubos contendo cada
Produto a base de cloreto de alquil dimetil benzil desinfetante, sendo o tempo cronometrado, a partir desse
amnio, bicarbonato de sdio, carbonato de sdio, procedimento. Aps 5, 10, 15 e 20 minutos de exposio, uma
EDTA e gua (20% de cloreto de alquil dimetil benzil alquota de 10 L das suspenses foi retirada e transferida
amnio); para tubos contendo meio de cultura BHI (Merck, Darmstadt,
Produto a base de hipoclorito de sdio (4,0% de Alemanha). Para avaliar a resistncia dos sorovares de
cloro ativo). Salmonella frente aos desinfetantes, esses tubos foram
Antes dos experimentos, o valor do pH dos incubados por 96 horas, a 37o C, verificando-se a turvao dos
desinfetantes foi medido por meio de pHmetro TM 125 mesmos a cada 24 horas. No caso de turvao dos tubos, os
(Schott) e as concentraes utilizadas esto demonstradas micro-organismos foram considerados resistentes, conforme
na Tabela 1. preconizado pela Portaria 101/93/MAPA17.

Tabela 1. Concentrao e pH dos desinfetantes cido peractico, hipoclorito de sdio e quaternrio de amnio utilizados neste estudo

cido peractico pH Hipoclorito de sdio pH Quaternrio de amnio pH

0,1% (150ppm) 3,5 0,05% (20ppm) 6,0 0,1% (200ppm) 5,5

0,2% (300ppm) 3,5 0,1% (40ppm) 6,0 0,2% (400ppm) 5,5

0,3% (450ppm) 3,0 0,3% (120ppm) 6,0 0,3% (600ppm) 6,0

0,5% (750ppm) 3,0 0,5% (200ppm) 6,5 1% (2000ppm) 8,0

1,0% (1500ppm)* 3,0 1% (400ppm) 6,5 2% (4000ppm)* 9,0

- - 2% (800ppm)* 7,0 - -

*Concentraes de uso recomendadas pelo fabricante


As concentraes so apresentadas em porcentagens e seu equivalente em ppm encontra-se entre parntesis

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RESULTADOS sensveis, bem como com a metade dessa concentrao


(1% ou 2000 ppm). Nas concentraes de 0,1% (200
cido Peractico ppm), 0,2% (400 ppm) e 0,3% (600 ppm), os trs micro-
Na concentrao de uso indicada pelo fabricante organismos foram resistentes, sobrevivendo ao longo
(1% ou 1500 ppm) e na metade dessa concentrao (0,5% de 20 minutos de exposio.
ou 750 ppm), todos os micro-organismos demonstraram
sensibilidade nos tempos avaliados. S. Bredeney foi sensvel Hipoclorito de sdio
a esse composto tambm nas concentraes de 0,3% (450 Na concentrao de 2% (800 ppm), recomendada
ppm) e 0,2% (300 ppm) o que no ocorreu com as cepas de pelo fabricante, todas as cepas de Salmonella foram
S. Typhimurium e S. Enteritidis. Na menor concentrao sensveis ao hipoclorito de sdio. J na metade da
testada (0,1% ou 150 ppm), S. Bredeney apresentou concentrao indicada pelo fabricante (1% ou 400 ppm),
crescimento apenas at 5 minutos de exposio, enquanto SE86 demonstrou resistncia nos 5 e 10 primeiros minutos,
que as demais cepas demonstraram crescimento em todos o que no ocorreu com as outras cepas. Na concentrao
os tempos avaliados, sendo consideradas resistentes. de 0,5% (200 ppm), pode-se observar que todas as cepas
apresentaram resistncia por algum tempo, porm SE86
Quaternrio de amnio permaneceu vivel por at 15 minutos de contato. Os
Na concentrao indicada pelo fabricante demais micro-organismos sobreviveram apenas nos
(2% ou 4000 ppm), as trs cepas de Salmonella foram primeiros 5 minutos.

Tabela 2. Suscetibilidade dos trs sorovares de Salmonella frente aos componentes cido Peractico, Hipoclorito de Sdio e Quaternrio de Amnio

Concentrao dos Compostos S. Enteritidis (SE86) S. Typhimurium S. Bredeney


cido Peractico
1% (1500 ppm) S S S
0,5% (750 ppm) S S S
0,3% (450 ppm) R R S
0,2% (300 ppm) R R S
0,1% (150 ppm) R R R
Hipoclorito de sdio
2% (800 ppm) S S S
1% (400 ppm) R S S
0,5% (200 ppm) R R R
0,3% (120 ppm) R R R
0,1% (40 ppm) R R R
0,05% (20 ppm) R R R
Quaternrio de amnio
2% (4000 ppm) S S S
1% (2000 ppm) S S S
0,3% (600 ppm) R R R
0,2% (400 ppm) R R R
0,1%(200 ppm) R R R

R: resistente; S: sensvel
As concentraes so apresentadas em porcentagens e seu equivalente em ppm encontra-se entre parntesis

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DISCUSSO sunos no RS, frente ao quaternrio de amnio. O teste


foi realizado em suspenso e as concentraes utilizadas
Diferentes tipos de micro-organismos apresentam foram de 0,3 e 0,6 mg/L (15 g/100 mL de composto ativo).
respostas variadas a ao de antisspticos e desinfetantes10. No trabalho destes autores foi demonstrado que os isolados
Patgenos alimentares ao sobreviver aos processos de de S. Typhimurium apresentaram resistncia nas duas
desinfeco utilizados em uma indstria de alimentos concentraes, em cinco minutos de exposio. Em 15
ou servio de alimentao podem ocasionar diversos minutos de contato, nenhuma amostra foi resistente.
problemas de sade pblica. importante salientar que tais resultados foram obtidos
O PAA tem sido amplamente utilizado como sem a adio de matria orgnica aos tubos avaliados. Por
um eficiente desinfetante hospitalar e no tratamento outro lado, Kich et al20 avaliaram a atividade do QUAT
da gua13, sendo que, em 1993, a Portaria N122 da frente a amostras de S. Typhimurium isoladas de sunos,
ANVISA 18 autorizou a utilizao desse desinfetante na presena e ausncia de matria orgnica. Os autores
tambm nas indstrias de alimentos. Esse composto, concluram que na presena de matria orgnica o QUAT
alm de ser utilizado como desinfetante para superfcies teve prejuzo de sua atividade, uma vez que, na ausncia
que entram em contato com alimentos, tambm pode de matria orgnica esse composto demonstrou ser capaz
ser utilizado na desinfeco do prprio alimento19. Os de inativar Salmonella.
resultados do presente trabalho demonstraram que, na O Food and Drug Administration16 recomenda
concentrao recomendada pelo fabricante e na metade o uso do hipoclorito de sdio como agente desinfetante
dessa concentrao, o PAA foi eficaz na inativao das para superfcies que entram em contato com alimentos em
trs cepas de Salmonella avaliadas (Tabela 2). No entanto, concentraes acima de 200 ppm. Concentraes entre
as concentraes de 0,3%, 0,2% e 0,1% indicaram maior 100 e 200 ppm tm sido recomendadas para desinfeco
resistncia dos micro-organismos S. Typhimurium e S. de utenslios e equipamentos no Brasil21 e outros pases.
Enteritidis. Kich et al20 obtiveram 4 log de reduo de S. No presente estudo, os resultados indicaram que o
Typhimurium isoladas de sunos do RS, aps 15 minutos hipoclorito de sdio foi capaz de inativar as trs cepas de
de contato com o cido peractico (composto ativo: 15%, Salmonella quando concentraes bem maiores foram
diluio: 1:3000). Kunigk e Almeida14 avaliaram a ao do utilizadas. Entretanto, na concentrao de 400 ppm, SE86
cido peractico sobre as bactrias E. coli e S. aureus em foi a nica cepa a apresentar resistncia. Na concentrao
suspenso. Uma soluo de 60 ppm de cido peractico de 200 ppm, todos os micro-organismos demonstraram
foi capaz de inativar 8 log de E. coli, em 3,1 minutos, e 40 resistncia por 5 minutos, sendo que SE86 sobreviveu
ppm reduziram a suspenso bacteriana de S. aureus em 8 por at 15 minutos de exposio. A ampla utilizao do
log, aps 4 minutos de contato. hipoclorito de sdio pode ser atribuda, dentre vrias
Segundo Andrade e Macedo21, as concentraes de razes, devido ao seu baixo custo e amplo espectro de
PAA utilizadas nas indstrias de alimentos variam de 300 a ao. Segundo a Portaria 78/2009, que entrou em vigor
700 ppm. Nas concentraes de 300 e 450 ppm, o presente recentemente no Estado do Rio Grande do Sul25, para
estudo demonstrou que apenas S. Bredeney foi sensvel a desinfeco de alimentos hortifrutigranjeiros, deve-se
esse desinfetante. Contudo, na concentrao de 750 ppm, utilizar soluo clorada entre 100 e 250 ppm, por 15
todos os micro-organismos avaliados foram inativados. minutos. Concentraes de aproximadamente 200 ppm,
A Resoluo da Diretoria Colegiada RDC No 14, de por 15 minutos, tm sido recomendadas e utilizadas
28 de fevereiro de 2007, da ANVISA22, autoriza os QUAT na desinfeco de panos de limpeza25, equipamentos
para o uso nas indstrias de alimentos. Segundo Andrade e utenslios, desde que enxaguadas com gua potvel,
e Macedo 21 as concentraes comumente utilizadas aps aplicao do desinfetante. Sendo assim, patgenos
nessas indstrias variam de 300 a 400 ppm. Entretanto, alimentares, como SE86, resistentes a tais processos de
em ambientes hospitalares, a concentrao de uso dos desinfeco assumem grande importncia. Alm da
QUAT pode ser de 2000 ppm23. No presente estudo, na maior resistncia ao hipoclorito de sdio demonstrado
concentrao indicada pelo fabricante (2% ou 4000 ppm) pela SE86 neste trabalho, demais estudos tm ressaltado
e na metade dessa concentrao, todos os sorovares foram caractersticas importantes dessa cepa. Por exemplo,
sensveis. Borowsky et al24 avaliaram a sensibilidade e Malheiros et al15 demonstraram que SE86 apresentou maior
resistncia de 96 cepas de S. Typhimurium isoladas de resistncia trmica e maior capacidade de adaptao cida

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aps exposio a pH subletais. Malheiros et al26 estudaram 6. Geimba MP, Tondo EC, de Oliveira FA, Canal CW, Brandelli
A. Serological characterization and prevalence of spvR genes in
o crescimento dessa mesma cepa em salada de batata Salmonella isolated from foods involved in outbreaks in Brazil. J
com maionese caseira, alimento considerado como o Food Protec. 2004; 67 (6): 1229-33.
principal veculo de salmoneloses no RS, e comprovaram 7. Oliveira FA, Frazzon APG, Brandelli A, Tondo EC. Use of PCR-
crescimento mais rpido nas seis primeiras horas de ribotyping, RAPD, and antimicrobial resistance for typing of
cultivo do que cepas de S. Bredeney e S. Typhimurium. Salmonella Enteritidis involved in food-borne outbreaks in
Southern Brazil. J Infect Developing Countries. 2007; 1 (2):170-6.
Tais caractersticas podem estar contribuindo com a
8. Oliveira FA, Geimba MP, Pasqualotto AP, Brandelli A, Pasquali
permanncia de S. Enteritidis como patgeno causador G, Silva WP et al. Clonal relationship among Salmonella enterica
de diversos surtos alimentares no RS. serovar Enteritidis involved in foodborne outbreaks in southern
Brazil. Food Control. 2009; 20(6): 606-10.
CONCLUSO 9. Paula CMD. Avaliao da sorologia e susceptibilidade a
antimicrobianos de linhagens de Salmonella sp envolvidas em
surtos alimentares ocorridos no Rio Grande do Sul entre 2003
Os desinfetantes PAA, QUAT e hipoclorito de e 2006 [monografia]. Porto Alegre: Universidade Federal do Rio
sdio, nas concentraes indicadas pelos fabricantes, Grande do Sul. 2006.
foram capazes de inativar as trs cepas de Salmonella, 10. McDonnel G, Russell AD. Antiseptics and disinfectants: activity,
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and peracetic acid as sanitizing agents for stainless steel food
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